Summary
Questo documento fornisce una descrizione dettagliata di come costruire un modello animale della fase anepatica (ischemia epatica) nei ratti per facilitare la ricerca di base sulle lesioni da ischemia-riperfusione dopo il trapianto di fegato.
Abstract
Il trapianto di fegato ortotopico (OLT) nei ratti è un modello animale provato e collaudato utilizzato per studi preoperatori, intraoperatori e postoperatori, tra cui lesioni da ischemia-riperfusione (IRI) di organi extraepatici. Questo modello richiede numerosi esperimenti e dispositivi. La durata della fase anepatica è strettamente correlata al tempo in cui sviluppare l'IRI dopo il trapianto. In questo esperimento, abbiamo usato cambiamenti emodinamici per indurre danni extraepatici agli organi nei ratti e determinato il tempo massimo di tolleranza. Il tempo fino alla lesione d'organo più grave variava per diversi organi. Questo metodo può essere facilmente replicato e può anche essere utilizzato per studiare l'IRI degli organi extraepatici dopo il trapianto di fegato.
Introduction
La lesione da ischemia-riperfusione (IRI) è una complicazione comune dopo il trapianto di fegato. L'IRI epatico è un processo patologico che coinvolge danni cellulari mediati dall'ischemia e deterioramento anomalo della riperfusione epatica. L'IRI epatico e la risposta immunitaria innata locale possono essere suddivisi in IRI caldo e freddo, in base alle differenze nell'ambiente clinico1. L'IRI caldo è indotto da lesioni alle cellule staminali, di solito a seguito di trapianto di fegato, shock e trauma2. L'IRI freddo è una complicazione del trapianto di fegato causata da cellule endoteliali e circolazione periferica3. I rapporti clinici hanno dimostrato che l'IRI epatico è associato al 10% dei fallimenti precoci degli organi e può aumentare l'incidenza delrigetto acuto e cronico 4,5. Inoltre, l'IRI epatico può anche indurre sindromi multiple di disfunzione degli organi o sindrome da risposta infiammatoria sistemica, con alta mortalità6. I pazienti con coinvolgimento di organi extraepatici tendono a rimanere più a lungo in ospedale, spendere più soldi e avere una prognosi peggiore7. Lo sviluppo di complicanze è strettamente correlato alla durata della fase anepatica del trapianto di fegato8.
Il trapianto ortotopico di fegato (OLT) nei ratti è stato segnalato per la prima volta dal professore americano Lee nel 1973. L'operazione sperimentale ha simulato le fasi del trapianto clinico di fegato e l'anastomosi dei vasi sanguigni e il comune condotto biliare (CBD) utilizzando il metodo di sutura. La procedura è difficile e richiede molto tempo con un basso tasso di successo9. Nel 1979, Kamada et al. Nello stesso anno, Zimmermann propose il "metodo dello stent biliare unico". Sulla base del lavoro di Lee, Zimmermann ha utilizzato tubi di polietilene per anastomosi direttamente il CBD del donatore e del ricevente, ha semplificato la ricostruzione del CBD e conservato la funzione dello sfintere, e questo metodo è diventato lo standard per la ricostruzione biliare dei modelli OLT11. Nel 1980, Miyata et al. Tuttavia, c'è il rischio di distorsione della cannula con questo metodo, che può portare all'ostruzione del reflusso di vena cava inferiore12. Nel 1983, il "metodo a due polsini" è stato proposto utilizzando il metodo cuff per l'anastomosi del fotovoltaico e dell'IVC, ma adottando il metodo di sutura per l'SVC13. Questo metodo è stato adottato dagli studiosi di tutto il mondo per stabilire modelli OLT. Da allora, i passaggi di anastomosi del polsino sono stati migliorati per accorciare la fase anepatica e migliorare il tasso di sopravvivenza deiratti 14. Allo stesso modo, nella pratica clinica vengono utilizzati metodi migliorati per abbreviare la fase anepatica15. Tuttavia, la ricerca di base sull'IRI dopo il trapianto di fegato ha dimostrato che il tasso di sopravvivenza è inversamente correlato al grado di lesione agli organi extraepatici. Pertanto, sono necessarie ulteriori ricerche ed è necessario un modello animale semplice e riproducibile per simulare l'IRI dopo il trapianto di fegato.
Sulla base della definizione della fase anepatica, abbiamo simulato i cambiamenti emodinamici nel trapianto di fegato con conseguente IRI di organi extraepatici nei ratti. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di come costruire un modello animale della fase anepatica (ischemia epatica) nei ratti per facilitare la ricerca di base sull'IRI dopo il trapianto di fegato.
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Protocol
Il Comitato etico animale ha approvato l'esperimento della Guangxi Medical University (No20190920). Tutti gli animali sono stati forniti dall'Animal Experiment Center della Guangxi Medical University. Abbiamo usato ratti Sprague Dawley maschi SPF (200-250 g, 10-12 settimane), mantenuti sotto la temperatura ambiente di 25 ± 2 °C e umidità di 50 ± 10%. L'alimentazione è stata interrotta 24 ore prima dell'operazione; tuttavia, l'acqua è stata fornita.
NOTA: Un operatore può eseguire tutte le operazioni senza una base di microchirurgia o un microscopio chirurgico.
1. Operazione
- Dopo la pesatura, anestetizzare i ratti con isoflurane (5%) utilizzando una macchina per l'anestesia animale.
- Dopo 1-2 minuti, bloccare delicatamente le dita dei piedi del topo con una pinzetta. Se il topo non risponde dopo aver pizzicato, è entrato in uno stato di anestesia. Utilizzare unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Utilizzare lampade per il riscaldamento degli animali per mantenere la temperatura corporea dei ratti a 37-38 °C.
- Dopo la disinfezione addominale (soluzione di iodio povidone), fissare il topo sulla tabella della dissezione animale. Fare un'incisione mediana di 3 cm sotto il processo xifoide usando forcep e forbici.
- Aprire la cavità addominale, esporre il fegato usando un riavvolgitore e mobilitare il legamento epatogastrico. Utilizzare tamponi di cotone per capovolgere delicatamente il lobo centrale del fegato e girarlo verso l'alto per esporre la porta hepatis. Identificare il CBD, il fotovoltaico e l'HA.
- Spingere l'intestino tenue verso la cavità addominale inferiore sinistra usando tamponi di cotone, coprirlo con garza bagnata e spostare la vena cava intraepatica nella vena renale destra.
- Isolare la vena porta, l'arteria epatica e la vena cava inferiore sopra la vena renale destra con una lente intraoculare e forcep contrassegnate con filo di seta 3-0, ognuna con un nodo slip.
- Aprire la pelle degli arti inferiori sinistro e destro ed esporre la vena femorale usando le forcep oftalmiche. Iniettare lentamente eparina a basso peso molecolare 625 UI/kg attraverso la vena femorale per eparinare tutto il corpo.
- Legare la vena porta, l'arteria epatica e la vena cava inferiore sopra la vena renale destra con suture n. 3-0, della durata di 45 minuti(Figura 1). Sostituire l'intestino tenue nella cavità addominale e coprirlo con una garza. Ridurre l'anestesia per inalazione durante questi periodi.
- Dopo 45 minuti, rilasciare la vena portale, l'arteria epatica e la vena cava inferiore sopra la vena renale destra.
- Suturare il muscolo e la pelle, strato per strato, e terminare l'anestesia inalatoria. Fornire analgesia postoperatoria utilizzando morfina sottocutanea di 5 mg/kg ogni 4 ore.
- Osservare il topo fino a quando non è sveglio e nutrirsi a una temperatura di 25 ± 2 °C e umidità di 50 ± 10%. Sono necessarie lampade per il riscaldamento degli animali.
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Representative Results
Tolleranza dei ratti all'ischemia epatica
In questo modello animale, i siti in cui i vasi sanguigni sono stati legati durante il funzionamento sono mostrati nella figura 1. I ratti sono stati divisi casualmente in 5 gruppi per ischemia per 15 minuti (gruppo I15), 30 minuti (gruppo I30), 45 minuti (gruppo I45), 60 minuti (I60) e gruppo sham, con 10 ratti in ogni gruppo. Il tasso di sopravvivenza di ogni gruppo è stato osservato 14 giorni dopo l'operazione. Tutti i ratti sopravvissero nel gruppo I15, nel gruppo I30 e nel gruppo sham. Otto sopravvissero per 14 giorni nel gruppo I45, e solo 2 sopravvissero nel gruppo I60. Questi risultati suggeriscono che i ratti potrebbero tollerare la fase anepatica per un massimo di 45 minuti(tabella 1).
Effetti della legatura vascolare sulla circolazione nei ratti
Durante l'esperimento, Biosystems ha registrato la frequenza cardiaca e la pressione sanguigna (intubazione dell'arteria carotide interna destra) prima e dopo la fase anepatica. La Corte ha riscontrato che la frequenza cardiaca e la pressione arteriosa media (MAP) dei ratti sono cambiate radicalmente dopo la legatura vascolare (Figura 2).
Effetti sugli organi extraepatici
La congestione epatica dell'ischemia e l'edema sono stati trovati nell'intestino, nelle varici gastriche e nella splenomegaly dopo la legatura. Ottanta ratti sono stati divisi casualmente in 8 gruppi per ischemia per 45 minuti (T0), riperfusione per 6 ore (T6), 12 ore (T12), 24 ore (T24), 48 ore (T48), 72 ore (T72), 7 giorni (D7) e 14 giorni (D14). Dopo che i ratti sono stati sacrificati, i tessuti del rene, del pancreas, dell'intestino tenue, del cuore e del polmone sono stati presi e macchiati di ematossilina-eosina (HE). L'intero processo di colorazione consiste in cinque fasi: decerazione, colorazione, disidratazione, trasparenza e sigillatura. Ad eccezione del cuore, i punteggi patologici sono stati assegnati come descrittoin precedenza 16,17,18,19.
Il tempo fino alla massima lesione agli organi extraepatici variava; erano 6-24 ore dopo l'operazione per il pancreas e 24-48 ore per i polmoni. Il tratto intestinale e il rene sono stati feriti più gravemente dopo 45 minuti di ischemia. Non c'era alcuna anomalia evidente della mucosa intestinale 24 ore dopo l'operazione e i reni si sono ripresi dopo 48 ore. Dopo la riperfusione, la necrosi cellulare miocardica locale, la frammentazione e la dissoluzione cellulare, l'infiltrazione cellulare infiammatoria e la vasodilatazione e congestione locali sono state trovate nel cuore entro 24-48 ore dall'operazione (Figura 3).
Polmoni
L'infiltrazione di neutrofili è stata trovata nel tessuto polmonare dopo l'ischemia. Con l'aumento del tempo di riperfusione (T0,T6), il muco del lume bronchiale poteva essere visto anche nel tessuto polmonare. L'infiltrazione cellulare infiammatoria si è verificata nella parete alveolare, che si è gravemente addensata. Il collasso alveolare e la scomparsa della cavità alveolare potrebbero essere trovati anche in alcuni tessuti. Non c'era edema alveolare significativo o congestione capillare nelle pareti alveolari. Sono rimasti gravemente feriti 24-48 ore dopo l'operazione, con alcuni ratti che hanno mostrato dispnea e altre manifestazioni 7 giorni dopo l'operazione. I risultati della colorazione HE hanno suggerito linfoadenite nelle vie aeree, lieve infiltrazione cellulare infiammatoria nella parete alveolare ed emorragia locale (Figura 3A, Figura 4).
Reni
Una piccola quantità di sostanza eosinofila è stata trovata nei tubuli renali dopo l'ischemia nella fase T0, ma non sono state osservate infiltrazioni cellulari infiammatorie e altre anomalie. Tuttavia, cellule epiteliali tubolari renali gonfie, citoplasma poroso o vacuolato, cellule necrotiche in pochi lumen, cariopilicnosi, frammentazione, perdita di bordo del pennello e gruppo acido a forma di tubo in molti lumen sono stati visti 6-48 ore dopo l'operazione. Inoltre, un piccolo numero di cellule epiteliali tubolari renali sono state osservate con degenerazione granulare e citoplasma poroso e leggermente macchiato visto 48 ore dopo l'operazione. È stata riscontrata una telangiectasia interstiziale significativa, ma non è stata riscontrata una grave infiltrazione cellulare infiammatoria (Figura 3B, Figura 5).
Intestino tenue
L'intestino tenue è stato ferito più gravemente dopo l'ischemia (T0). Ci fu una grave infiltrazione cellulare infiammatoria, lo spargimento di epitelio della mucosa e la telangiectasia. Con l'aumento del tempo di riperfusione, la lesione guarì rapidamente. L'epitelio mucoso è stato ripristinato completamente 24 ore dopo l'operazione e si è vista solo una lieve infiltrazione cellulare infiammatoria(Figura 3C, Figura 6).
Pancreas
Gravi cellule infiammatorie si sono infiltrate intorno al tessuto pancreatico nella fase T0. Tuttavia, le lesioni pancreatiche non erano uniformi. Sei su 10 avevano necrosi pancreatica e infiltrazioni infiammatorie 24 ore dopo l'intervento chirurgico, e gli altri 4 non avevano anomalie apparenti. Ventiquattro ore dopo l'operazione, oltre all'infiltrazione di cellule infiammatorie, c'era edema, ampliamento dello spazio interlobulare, emorragia, necrosi di un piccolo numero di cellule acinari, demarcazione poco chiara delle cellule, frammentazione e dissoluzione nucleare e lieve infiltrazione cellulare infiammatoria nel campo visivo. Quindi, l'infiammazione è scomparsalentamente (Figura 3D , Figura 7 ).
Cuore
Per fase T0, i miociti cardiaci erano disposti regolarmente con demarcazione chiara, morfologia cellulare normale, congestione interstiziale locale e deposizione di pigmenti giallo-marrone. Inoltre, l'infiltrazione cellulare infiammatoria è stata osservata nelle regioni interstiziali e perivascolari miocardiche. Con l'aumento del tempo di riperfusione, necrosi cellulare miocardica locale, frammentazione e dissoluzione cellulare, infiltrazione cellulare infiammatoria, vasodilatazione locale e congestione sono stati trovati nei tessuti 24-48 ore dopo l'operazione. Dilatazione ventricolare, struttura porosa, aumento dell'interstizio miocardico e lieve infiltrazione cellulare infiammatoria sono stati osservati in alcuni esemplari. Dopo 48 ore, i cardiomiociti locali scomparvero e furono sostituiti da una piccola quantità di tessuto connettivo fibroso con lieve infiltrazione cellulare infiammatoria. A quel punto non si sono osservate altre anomalie evidenti(figura 8).
Effetti dei cambiamenti emodinamici su fegato, reni, pancreas e indici sierologici cardiaci
Il siero è stato raccolto, e i livelli di alanina aminotransferasi(ALT),aspartato aminotransferasi(AST), creatinina e amilasi sono stati rilevati da un analizzatore biochimico automatico. Tutti gli indicatori hanno raggiunto il picco di 24-48 ore, a differenza dei cambiamenti patologici. Sebbene questi livelli fossero normali 48 ore dopo l'operazione, i danni patologici continuarono(figura 9).
Figura 1: Posizione della legatura: PV, HA, IVC superiore della vena renale destra. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
| Gruppo | N | sopravvivenza a 24 ore, n (%) | sopravvivenza a 7 d, n (%) | sopravvivenza a 14 d, n (%) |
| Sham | 10 | 10 | — | — |
| I 15 min | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| I 30 min | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| I 45 min | 10 | 8/10 | 8/10 (80) | 8/10 (80) |
| I 60 min | 10 | 2/10 | 2/10 (20) | 2/10 (20) |
Tabella 1: Tolleranza dei ratti all'ischemia epatica
Figura 2: Cambiamenti emodinamici nel gruppo I45 min. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.
Figura 3: Decine di istologia d'organo. (B) rene; (C) intestino; (D) pancreas; *Statisticamente significativo rispetto al gruppo fittizio(P < 0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Cambiamenti patologici nei polmoni dopo l'operazione. (A) Gruppo Sham; (B) Gruppo ischemia (gruppo T0); (C) Gruppo di riperfusione 6 ore (T6); (D) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (E) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (F) Gruppo di riperfusione 24 ore (T24); (G) Gruppo di riperfusione 48 ore (T48); (H) Gruppo di riperfusione di 7 giorni (D7); (I) Gruppo di riperfusione di 14 giorni (D14) (scala 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Alterazioni patologiche dei reni dopo l'operazione. (A)Gruppo Sham; (B) Gruppo ischemia (gruppo T0); (C) Gruppo di riperfusione 6 ore (T6); (D) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (E) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (F) Gruppo di riperfusione 24 ore (T24); (G) Gruppo di riperfusione 48 ore (T48); (H) Gruppo di riperfusione di 7 giorni (D7); (I) Gruppo di riperfusione di 14 giorni (D14) (scala 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: Cambiamenti patologici nell'intestino tenue dopo l'operazione. (A) Gruppo Sham; (B) Gruppo ischemia (gruppo T0); (C) Gruppo di riperfusione 6 ore (T6); (D) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (E) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (F) Gruppo di riperfusione 24 ore (T24); (G) Gruppo di riperfusione 48 ore (T48); (H) Gruppo di riperfusione di 7 giorni (D7); (I) Gruppo di riperfusione di 14 giorni (D14) (scala 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 7: Cambiamenti patologici nel pancreas dopo l'operazione. (A) Gruppo sham; (B) Gruppo ischemia (gruppo T0); (C) Gruppo di riperfusione 6 ore (T6); (D) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (E) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (F) Gruppo di riperfusione 24 ore (T24); (G) Gruppo di riperfusione 48 ore (T48); (H) Gruppo di riperfusione di 7 giorni (D7); (I) Riperfusione 14 giorni (D14) gruppo(scala A e D 50 μm; Scala BCEFGHI 50 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 8: Cambiamenti patologici nel cuore dopo l'operazione. (A) Gruppo Sham; (B) Gruppo ischemia (gruppo T0); (C) Gruppo di riperfusione 6 ore (T6); (D) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (E) Gruppo di riperfusione 12 ore (T12); (F) Gruppo di riperfusione 24 ore (T24); (G) Gruppo di riperfusione 48 ore (T48); (H) Gruppo di riperfusione di 7 giorni (D7); (I) Gruppo di riperfusione di 14 giorni (D14)(scala A 50 μm; Scala BCDEFGHI 100 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 9: Cambiamenti di ALT, AST, creatinina (Cr) e amilasi in ciascun gruppo; *Statisticamente significativo rispetto al gruppo sham(P<0,05). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'OLT nei ratti è un modello ideale per studiare la conservazione degli organi nel trapianto di fegato, nell'IRI, nel rigetto dei trapianti, nella tolleranza immunitaria, nella patologia e farmacologia dei trapianti, nell'omotrapianto e nello xenotrapianto. Attualmente, è ampiamente utilizzato nella ricerca sperimentale del trapianto di fegato.
Durante gli studi pilota abbiamo somministrato per la prima volta l'anestesia intraperitoneale al sodio pentobarbitale e abbiamo scoperto che ciò ha portato ad un'elevata mortalità postoperatoria e a una breve tolleranza ai cambiamenti emodinamici. Pertanto, abbiamo usato l'anestesia per inalazione nelle prove successive per un rapido inizio dell'azione e una rapida esclusione delle caratteristiche in vitro. Il passaggio all'anestesia per inalazione ha migliorato significativamente il tempo di tolleranza e la sopravvivenza postoperatoria dei ratti. Gli investigatori dovrebbero prestare attenzione alla respirazione e alla frequenza cardiaca del ratto per evitare di sovradosare l'anestetico. I biosistemi possono essere utilizzati per monitorare la frequenza cardiaca e la pressione sanguigna. Abbiamo anche osservato l'impatto dello spessore della sutura chirurgica sulla legatura dei vasi sanguigni. Sebbene le linee più piccole di 3-0 potessero legare perfettamente i vasi sanguigni, erano difficili da allentare e possono portare alla rottura dei vasi sanguigni. Al contrario, linee superiori a 3-0 possono comportare un'occlusione vascolare incompleta, che impedisce cambiamenti emodinamici. Questi problemi materiali saranno migliorati negli esperimenti futuri. Ci sono alcune limitazioni al nostro protocollo. Le lampade termiche non sono raccomandate per il mantenimento della temperatura a causa del loro potenziale di surriscaldamento; suggerimenti di riscaldamento alternativi, come il ricircolo delle coperte d'acqua, sono raccomandati a beneficio dell'animale.
Ci sono molte ragioni per la lesione distale dell'organo dopo l'OLT. In primo luogo, la lesione può essere causata dalla conservazione a freddo del fegato donatore in vitro20. In secondo luogo, l'IRI può verificarsi e causare danni ai tessuti quando l'apporto di sangue ritorna ai tessuti (riperfusione) dopo un lungo periodo di ischemia. L'ischemia è la principale causa di lesione e la riperfusione è il processo in cui si verifica la lesione. Dopo aver bloccato contemporaneamente l'IVC e il PV durante la fase anepatica, si è verificata una grande quantità di stasi del sangue negli arti inferiori e negli organi interni. Il volume circolante effettivo (ECV) è diminuito drasticamente e il MAP è diminuito. Tuttavia, a causa della stimolazione nervosa del vago, non c'è stato alcun aumento compensativo della frequenza cardiaca nei ratti. In questo esperimento, abbiamo scoperto che i ratti hanno subito significativi cambiamenti emodinamici entro 5 minuti dalla legatura e dal rilascio dei vasi, che hanno soddisfatto la definizione della sindrome ischemia-riperfusione.
L'ischemia si è verificata in alcuni tessuti al di fuori del fegato. Dopo la fase anepatica, l'ECV è aumentato. Map tornò alla normalità dopo lo sblocco dell'IVC e del fotovoltaico, con lesioni che si verificavano al di fuori del fegato dopo la riperfusione. Inoltre, l'IRI del fegato del donatore ha prodotto mediatori infiammatori (TNF-α, interleuchina-1, interleuchina-6, interleuchina-8) che hanno attaccato gli organi distale21. In questo esperimento, è stata simulata l'emodinamica durante la fase anepatica, che ha causato la congestione passiva dell'IVC e del rene, danni alla barriera gastrointestinale, traslocazione batterica, ischemia degli organi (ad esempio, polmone, cuore, pancreas, rene, ecc.) in cui si trova l'SVC e IRI agli organi extraepatici.
I risultati patologici hanno mostrato che il picco della lesione ischemica e il tempo di recupero erano diversi in ogni organo. Sebbene la conservazione a freddo e i danni causati da fattori immunitari non possano essere simulati in questo studio, l'IRI anepatico può essere replicato e confrontato con altri modelli animali per ricercare lesioni extraepatiche dell'organo. Il nostro modello e il nostro modello OLT possono essere confrontati e osservati per fornire una base per la ricerca sulla lesione extraepatica degli organi. Inoltre, il nostro modello è simile ad alcune operazioni cliniche del fegato, come quello per il colanocarcinoma hilar. Il colanocarcinoma hilar è un tumore maligno che spesso invade il fotovoltaico o l'IVC e spesso richiede il bloccaggio fotovoltaico durante l'interventochirurgico 22. Fu eseguita la ricostruzione del portale epatico; quando il tumore invade l'IVC, è richiesto anche il bloccaggio intraoperatorio dell'IVC e i cambiamenti emodinamici risultanti sono coerenti con il nostro modello.
Per riassumere, il nostro modello nei ratti è facile da usare e diretto, senza microchirurgia, e fornisce la base per la ricerca fondamentale sull'IRI degli organi extraepatici dopo l'ischemia epatica.
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Disclosures
Gli autori di questo manoscritto non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo riconoscere gli utili suggerimenti forniti dal Dr. Wen-tao Li e dal Dr. Ji-hua Wu del Secondo Ospedale Affiliato della Guangxi Medical University. Gli autori ringraziano i nostri compagni di squadra per i commenti e le discussioni utili. Gli autori vorrebbero anche ringraziare i revisori anonimi e gli editori di JoVE per i loro commenti. Un ringraziamento speciale dovrebbe andare ai genitori del dottor Yuan per il loro continuo sostegno e incoraggiamento. Il lavoro è stato sostenuto dalla Ningbo Natural Science Foundation (2014A610248).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde solution | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd | P804536 | |
| air drying oven | Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd. | BPG | |
| Alanine aminotransferase (ALT)Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K235-S | |
| ammonia | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10002118 | |
| amylase Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K005-M | |
| anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 100092183 | |
| Animal anesthesia machine | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | R640 | |
| aspartate aminotransferase (AST)kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03040 | |
| automatic biochemical analyzer. | SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd. | 2400 | |
| Biosystems (when nessary) | Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd. | BL-420F | |
| Centrifuge | Baiyang Medical Instrument Co., Ltd. | BY-600A | |
| cover glass | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd | 10212432C | |
| creatinine Kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03076 | |
| dewatering machine | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Donatello Series 2 | |
| embedding machine | Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd. | KH-BL1 | |
| frozen machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| hematoxylin-eosin dye solution | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| high-efficiency paraffin wax | Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd | Q/YSQN40-91 | |
| hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10011018 | |
| intraocular lens (IOL)forceps | Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd. | JTZRN | |
| Isoflurane | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | — | |
| micro Scissors(when nessary) | Shanghai Surgical Instrument Factory | WA1010 | |
| needle holders | Shanghai Surgical Instrument Factory | J32010 | |
| neutral gum | Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd. | — | |
| normal optical microscope | Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd | Nikon Eclipse CI | |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | J3CO30 | straight |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | JD1060 | bending |
| ophthalmic Scissors | Shanghai Surgical Instrument Factory | J1E0 | |
| pathological slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| pipettes | Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd. | 7010101008 | |
| retractors | Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd. | JNT-KXQ | |
| scanner | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Pannoramic 250 | |
| slide | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G6004 | |
| xylene | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 1330-20-7 |
References
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