Summary
本論文では、肝移植後の虚血再灌流傷害に関する基礎研究を容易にするために、ラットにおける肝相(肝虚血)の動物モデルを構築する方法を詳しく説明する。
Abstract
ラットにおける正体異形肝移植(OLT)は、肝外器官の虚血再灌流傷害(IRI)を含む術前、術中および術後の研究に使用される実証済みの動物モデルである。このモデルには、数多くの実験とデバイスが必要です。肝相の持続時間は、移植後にIRIを発症する時間と密接に関連している。本実験では、血行力学的変化を用いてラットの肝外臓器損傷を誘発し、最大許容時間を決定した。最も重度の臓器損傷までの時間は、異なる器官のために変化した。この方法は、容易に複製することができ、また、肝臓移植後の肝外器官のIRIを研究するために使用することができる。
Introduction
虚血再灌流傷害(IRI)は、肝臓移植後の一般的な合併症である。肝疾患は、虚血媒介性細胞損傷および肝再灌流の異常な悪化を伴う病理学的プロセスである。肝性IRIと局所的な自然免疫応答は、熱と冷間のIRIに分けることができる、臨床環境の違いに応じて1。ホットIRIは、通常、肝臓移植、ショック、および外傷2の結果として、幹細胞傷害によって誘発される。冷たいIRIは、内皮細胞および末梢循環によって引き起こされる肝臓移植の合併症である3.臨床報告によると、肝性IRIは初期臓器不全の10%に関連しており、急性および慢性拒絶反応4,5の発生率を増加させる可能性がある。また、肝性のIRIはまた、多臓器不全症候群または全身性炎症反応症候群を誘発し、高死亡率6を有する。肝外臓器の関与を有する患者は、病院に長く滞在し、より多くのお金を費やし、より悪い予後7を持っている傾向があります。合併症の発症は、肝臓移植8の肝相の長さと密接に関連している。
ラットにおける異形性肝移植(OLT)は、1973年にアメリカの教授リーによって最初に報告された。実験手術では、縫合法を用いて、臨床肝移植のステップと血管の吻合と共通胆管(CBD)をシミュレートした。この手順は難しく、時間がかかり、成功率が低い9.1979年、KamadaらのラットのOLTは、26分以内に動脈性相を制御する門脈の吻合に対する「ツーカフ法」を創造的に用いることで、ラットのOLTを大幅に改善した。同年、ツィンマーマンは「単一胆管ステント法」を提案した。リーの研究に基づいて、ツィンマーマンは、直接ドナーとレシピエントのCBDを吻合するためにポリエチレンチューブを使用し、CBDの再構築を簡素化し、括約筋の機能を維持し、この方法は、OLTモデル11の胆道再建のための標準となった。1980年、宮田らは、門脈静脈(PV)、上皮性大静脈(SVC)、および肝内大静脈(IVC)がカフ法によって吻合された「三カフ法」を提案した。しかし、この方法ではカニューレの歪みが生じるおおありで、これは、下の大静脈逆流12の閉塞を招く可能性がある。1983年には、PVとIVCの吻合にカフ法を用いて「ツーカフ法」が提案されたが、SVC13には縫合法を採用した。この方法は、OLTモデルを確立するために世界的に学者によって採用されました。それ以来、カフ吻合のステップは、肝相を短くし、ラット14の生存率を向上させるために改善された。同様に、改善された方法は、アン肝相15を短縮するために臨床現場で使用される。しかし、肝臓移植後のIRIに関する基礎研究は、生存率が肝外器官への傷害の程度に反比例することを示している。そのため、さらなる研究が必要であり、肝臓移植後のIRIをシミュレートするためには、簡単で再現性の高い動物モデルが必要です。
肝相の定義に基づいて、ラットの肝外器官のIRIをもたらす肝臓移植における血行力学的変化をシミュレートした。本明細書では、肝臓移植後のIRIの基礎研究を容易にするために、ラットにおけるアン肝相(肝臓虚血)の動物モデルを構築する方法の詳細な説明を提供する。
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Protocol
動物倫理委員会は広西医科大学(No20190920)の実験を承認した。すべての動物は広西医科大学動物実験センターから供給された。SPF雄のスプレイグ・ドーリーラット(200〜250g、10〜12週間)を使用し、室温25±2°C、湿度50±10%の下に保ちました。給餌は、操作の24時間前に停止しました;しかし、水が提供されました。
注:1人のオペレータは、マイクロ手術ベースまたは手術顕微鏡なしですべての操作を実行することができます。
1. 操作
- 体重を量った後、イオブルランでラットを麻酔(5%)動物麻酔装置を使用して。
- 1~2分後、ラットのつま先をピンセットで軽くクランプします。ラットがつまんでも反応しない場合、麻酔状態に入った。乾燥を防ぐために目に獣医軟膏を使用してください。ラットの体温を37~38°Cに保つには、動物用暖房ランプを使用してください。
- 腹部消毒(ポビドンヨウ素溶液)に続いて、ラットを動物解剖テーブルに固定する。鉗子およびはさみを使用してxiphoidプロセスの下に3cmの中央部の切開を作る。
- 腹腔を開き、レトラクターを使用して肝臓を露出させ、肝胃靭帯を動員する。綿棒を使用して肝臓の中央葉をそっとひっくり返し、上に回してポルタヘパティスを露出させます。CBD、PV、および HA を識別します。
- 綿棒を使用して左下腹腔に向かって小腸を押し、濡れたガーゼで覆い、肝内静脈を右腎静脈に移動します。
- 右腎静脈の上の門脈、肝動脈、下静脈を、3-0シルク糸でマークされた眼内レンズと鉗子で分離し、それぞれスリップノットを有する。
- 左と右下肢皮膚を切り開き、眼用鉗子を使用して大腿静脈を露出させる。低分子量ヘパリン625 IU/kgを大腿静脈からゆっくりと注入し、全身をヘパリン化する。
- 門脈、肝動脈、および3-0縫合糸で右腎静脈の上の下の静脈をリゲートし、45分間続いた(図1)。腹腔内の小腸を交換し、ガーゼで覆います。これらの期間中に吸入麻酔を減らします。
- 45分後、門脈、肝動脈、右腎静脈の上の下静脈を解放する。
- 筋肉と皮膚を縫合し、層ごとに、吸入麻酔を終了する。4時間ごとに5mg/kgの皮下モルヒネを使用して術後鎮痛を提供する。
- 目が覚めてから25±2°C、湿度50±10%の温度でラットを観察してください。動物の暖房ランプが必要です。
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Representative Results
ラットの肝臓虚血に対する耐性
この動物モデルでは、手術中に血管が結紮された部位を図1に示す。ラットを15分間の虚血(I15群)に対して無作為に5群に分け、30分(I30群)、45分(I45群)、60分(I60)、およびシャム群を各群に10匹ずつ含む。各群の生存率は、手術後14日目に観察された。すべてのラットはI15群、I30群、およびシャム群で生存した。8人はI45グループで14日間生き残り、I60グループで生き残ったのはわずか2人でした。これらの結果は、ラットが最大45分間の無肝相を許容できることを示唆している(表1)。
ラットの循環に及ぼす血管結紮の影響
実験中、バイオシステムズは、無肝期の前後に心拍数と血圧(右内頸動脈挿管)を記録した。我々は、ラットの心拍数と平均動脈圧(MAP)が血管結紮後に劇的に変化することを発見した(図2)。
肝外器官への影響
肝虚血の鬱血と浮腫は、結紮後に腸、胃静脈瘤、および脾腫で発見された。80匹のラットを45分間の虚血(T0)について無作為に8群に分け、6時間(T6)、12時間(T12)、24時間(T24)、48時間(T48)、72時間(T72)、7日間(D7)、および14日間(D14)を再灌流した。ラットを屠殺した後、腎臓、膵臓、小腸、心臓、肺からの組織を採取し、ヘマトキシリン・エオジン(HE)で染色した。全体の染色プロセスは、脱蝋、染色、脱水、透明性、およびシールの5つのステップで構成されています。心臓を除いて、病理学的スコアは、前述の16、17、18、19に記載されたように割り当てられた。
肝外器官への最大傷害までの時間は様々であった。膵臓の手術後6~24時間、肺に対して24~48時間であった。腸管と腎臓は、虚血の45分後に最も重傷を負った。手術後24時間で腸粘膜の明らかな異常はなく、腎臓は48時間後に回復した。再灌流後、局所心筋細胞壊死、細胞の断片化および溶解、炎症細胞浸潤、および局所血管拡張および鬱血が手術後24〜48時間までに心臓で発見された(図3)。
肺
好中球浸潤は虚血後の肺組織で発見された。再灌流時間の増加(T0,T6)に伴い、気管支内腔の粘液も肺組織に見られる。炎症細胞浸潤は肺胞壁に発生し、ひどく肥厚した。歯槽の崩壊と歯槽腔の消失は、いくつかの組織でも見つかる。歯槽壁には有意な肺胞浮腫や毛細血管の混雑はなかった。手術後24~48時間で最も重傷を負い、手術後7日後に呼吸困難やその他の症状を示すラットもいた。HE染色結果は、気道におけるリンパ管炎、肺胞壁内の軽度の炎症性細胞浸潤、および局所出血を示唆した(図3A、図4)。
腎臓
T0期の虚血後の腎尿細管には少量の好酸球性物質が見つかったが、炎症性細胞浸潤やその他の異常は見られなかった。しかし、腫れ血尿細管上皮細胞は、多孔質または空胞体細胞質、数ルーメンにおける壊死細胞、核生物細胞、断片化、ブラシ境界損失、及びチューブ状の酸性基を多くの内腔で6〜48時間経過した。また、細粒状変性を有する少数の尿細管上皮細胞が見られ、手術後48時間後に多孔質と軽く染色された細胞質が見られた。有意な間質性血管拡張症は、まだ重篤な炎症性細胞浸潤は見つからなかった(図3B、図5)。
小腸
小腸は虚血(T0)後に最も重傷を負った。重篤な炎症細胞浸潤、粘膜上皮脱落、および血管拡張症があった。再灌流時間の増加に伴い、怪我はすぐに治癒した。粘膜上皮は手術後24時間完全に回復し、軽度の炎症性細胞浸潤のみが見られた(図3C、図6)。
膵臓
重篤な炎症細胞は、T0期に膵臓組織の周りに浸透した。しかし、膵臓病変は均一ではなかった。10人中6人は手術後24時間に膵臓壊死と炎症性浸潤を有し、残りの4人は明らかな異常を持っていなかった。手術後24時間、炎症細胞の浸潤に加えて、浮腫、眼間腔の拡幅、出血、少数のアシナル細胞の壊死、細胞の不明確な境界、核の断片化と溶解、および軽度の炎症性細胞浸潤があった。その後、炎症はゆっくりと消失した(図3D、図7)。
心
相T0により、心臓筋細胞は、明確な境界、正常な細胞形態、局所的な間質的輻輳、および軽度の褐色黄色色素沈着を伴って定期的に配置された。また、炎症細胞浸潤は心筋間質および血管内領域において観察された。再灌流時間の増加に伴い、局所心筋細胞壊死、細胞の断片化および溶解、炎症細胞浸潤、局所血管拡張、および鬱血が手術後24〜48時間後に組織で発見された。心室拡張、多孔質構造、心筋間質の増加、および軽度の炎症性細胞浸潤がいくつかの標本で見られた。48時間後、局所心筋細胞は消失し、軽度の炎症性細胞浸潤を伴う少量の線維結合組織に置き換えられた。それまでに、他の明らかな異常は見られなかった(図8)。
肝臓、腎臓、膵臓、心臓血清学的指標に及ぼす血行力変化の影響
血清を採取し、アラニンアミノトランスビシエーゼ(ALT)、アスパラギン酸アミノトランスビシエーゼ(AST)、クレアチニン、アミラーゼの濃度を自動生化学分析装置で検出した。すべての指標は、病理学的変化とは異なり、24〜48時間でピークに達した。これらのレベルは手術後48時間経って正常であったが、病的損傷は続いた(図9)。
図1: 右腎静脈のPV, HA, IVC上方の位置 。
| グループ | N | 24時間、n(%) | 7 d で生存,n (%) | 14 d、n (%) |
| 偽 | 10 | 10 | — | — |
| 15分 | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| I 30分 | 10 | 10/10 | 10 (100) | 10 (100) |
| I 45分 | 10 | 8/10 | 8/10 (80) | 8/10 (80) |
| 私 60分 | 10 | 2/10 | 2/10 (20) | 2/10 (20) |
表1:ラットの肝虚血に対する耐性
図3: 臓器組織学のスコア( A)肺;(B) 腎臓;(C) 腸;(D) 膵臓;*統計的に有意なシャムグループ(P <0.05)と比較して。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:手術後の肺の病理学的変化(A) シャムグループ;(B) 虚血群 (T0群);(C) 再灌流 6時間 (T6) 群;(D) 再灌流 12時間 (T12) 群;(E) 再灌流 12時間 (T12) 群;(F)再灌流24時間(T24)群;(G)再灌流48時間(T48)群;(H) 再灌流 7日 (D7) グループ;(I) 再灌流 14日(D14)群 (スケール 50 μm)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5: 手術後の腎臓の病理的変化(A)シャムグループ;(B) 虚血群 (T0群);(C) 再灌流 6時間 (T6) 群;(D) 再灌流 12時間 (T12) 群;(E) 再灌流 12時間 (T12) 群;(F)再灌流24時間(T24)群;(G)再灌流48時間(T48)群;(H) 再灌流 7日 (D7) グループ;(I) 再灌流 14日(D14)群 (スケール 50 μm)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図6:手術後の小腸の病理的変化(A)シャム群;(B) 虚血群 (T0群);(C) 再灌流 6時間 (T6) 群;(D) 再灌流 12時間 (T12) 群;(E) 再灌流 12時間 (T12) 群;(F)再灌流24時間(T24)群;(G)再灌流48時間(T48)群;(H) 再灌流 7日 (D7) グループ;(I) 再灌流 14日(D14)群 (スケール 50 μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図7:手術後の膵臓の病理学的変化(A)シャム群;(B) 虚血群 (T0群);(C) 再灌流 6時間 (T6) 群;(D) 再灌流 12時間 (T12) 群;(E) 再灌流 12時間 (T12) 群;(F)再灌流24時間(T24)群;(G)再灌流48時間(T48)群;(H) 再灌流 7日 (D7) グループ;(I) 再灌流 14日 (D14) グループ(AおよびDスケール 50 μm;BCEFGHIスケール50μm)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図8: 手術後の心臓の病理学的変化 (A) シャムグループ;(B) 虚血群 (T0群);(C) 再灌流 6時間 (T6) 群;(D) 再灌流 12時間 (T12) 群;(E) 再灌流 12時間 (T12) 群;(F)再灌流24時間(T24)群;(G)再灌流48時間(T48)群;(H) 再灌流 7日 (D7) グループ;(I) 再灌流 14日 (D14) グループ (A スケール 50 μm; BCDEFGHI スケール100 μm)。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図9:各グループにおけるALT、AST、クレアチニン(Cr)およびアミラーゼの変化*統計的に有意なシャムグループ(P<0.05)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ラットのOLTは、肝臓移植、IRI、移植拒絶反応、免疫寛容、移植病理学および薬理学、ホモ移植、異種移植における臓器保存を研究するための理想的なモデルです。現在、肝臓移植の実験研究に広く用いられている。
パイロット研究の間、我々は最初にペントバルビタールナトリウム腹膜内麻酔を投与し、これが高い術後死亡率と血行力学的変化に対する短い耐性につながったことを発見した。このように、我々は、その後の試験で吸入麻酔を使用して、作用の急速な開始と インビトロ 特性の迅速な排除を行った。吸入麻酔への切り替えは、ラットの許容時間と術後生存時間を有意に改善した。麻酔薬の過剰な処理を防ぐために、研究者はラットの呼吸と心拍数に注意を払う必要があります。生体システムは、心拍数と血圧を監視するために使用することができます。また、外科的縫合の厚さが血管の結紮に及ぼす影響も観察した。3-0より小さい線は血管を完全にリゲートすることができたが、それらは緩むのが難しく、血管の破裂につながる可能性がある。逆に、3-0より大きいラインは不完全な血管閉塞をもたらし、血行力学的変化を防ぐ。これらの物質的問題は今後の実験で改善されるであろう。プロトコルにはいくつかの制限があります。ヒートランプは過熱の可能性があるため、温度維持には推奨されません。水毛布の再循環などの代替加熱提案は、動物の利益のために推奨されます。
OLT後の遠位臓器損傷には多くの理由があります。まず、傷害は 、インビトロ20におけるドナー肝臓の冷間保存によって引き起こされ得る。第二に、血液供給が長期間の虚血の後に組織に戻ったとき(再灌流)、IRIが発生し、組織損傷を引き起こす可能性があります。虚血は傷害の主な原因であり、再灌流は傷害が起こるプロセスである。同時に、麻酔期中にIVCとPVを遮断した後、下肢および内臓に大量の血液スタシスが生じた。有効循環容積(ECV)は急激に減少し、MAPは減少した。しかし、迷走神経刺激のために、ラットの心拍数の補償的な増加はなかった。この実験では、ラットがライゲーションおよび血管放出の5分以内に有意な血行力変化を起こし、虚血再灌流症候群の定義を満たしていることを発見した。
虚血は肝臓の外のいくつかの組織で発生しました。.無肝相後、ECVは増加した。MAPはIVCとPVがブロック解除された後に正常に戻り、再灌流後に肝臓の外で怪我が起こった。さらに、ドナーの肝臓のIRIは、遠位器官21を攻撃した炎症性メディエーター(TNF−α、インターロイキン-1、インターロイキン-6、インターロイキン-8)を産生した。この実験では、IVCと腎臓の受動的な鬱血、消化器のバリア障害、細菌転位、臓器の虚血(例えば、肺、心臓、膵臓、腎臓など)を生じた、麻酔期の血行力学を模擬し、また、SVCが位置する臓器の虚血、および、肝外器官へのIRIを生じた。
病理的知見は、虚血性損傷のピークと回復時間が各器官で異なっていることを示した。この研究では、冷蔵や免疫因子による損傷をシミュレートすることはできませんでしたが、アンパラティックIRIを複製し、他の動物モデルと比較して肝外臓器損傷を研究することができます。我々のモデルとOLTモデルを比較し、肝外臓器損傷に関する研究の基礎を提供するために観察することができる。さらに、私たちのモデルは、ヒラル胆管癌のようないくつかの臨床肝臓手術に似ています。ヒラル胆管癌は、PVまたはIVCに頻繁に侵入する悪性腫瘍であり、手術22の間にPVクランプを必要とすることがよくあります。肝門脈再建が行われた。腫瘍がIVCに侵入すると、IVCの術中クランプも必要であり、結果として生じる血行力学的変化は我々のモデルと一致する。
要約すると、ラットのモデルは、マイクロサージャリーなしで使いやすく、簡単であり、肝虚血後の肝外器官のIRIに関する基礎研究の基礎を提供する。
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Disclosures
この原稿の著者は、開示する利益相反はありません。
Acknowledgments
広西医科大学第二付属病院のウェンタオ・リー博士とJi-hua Wu博士の有益な提案を認めたいと思います。著者たちは、チームメイトの皆様に有益なコメントやディスカッションをしてくれたことに感謝したいと思います。著者はまた、彼らのコメントのためにJoVEの匿名のレビュー担当者と編集者に感謝したいと思います。特別な感謝は、彼らの継続的なサポートと励ましのために元博士の両親に行く必要があります。寧波自然科学財団(2014A610248)の支援を受けた。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% paraformaldehyde solution | Shanghai Macklin Biochemical Co.,Ltd | P804536 | |
| air drying oven | Shanghai Binglin Electronic Technology Co., Ltd. | BPG | |
| Alanine aminotransferase (ALT)Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K235-S | |
| ammonia | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10002118 | |
| amylase Kit | Elabscience Biotechnology Co.,Ltd | E-BC-K005-M | |
| anhydrous ethanol | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 100092183 | |
| Animal anesthesia machine | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | R640 | |
| aspartate aminotransferase (AST)kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03040 | |
| automatic biochemical analyzer. | SIEMENS AG FWB:SIE, NYSE:SI Co., Ltd. | 2400 | |
| Biosystems (when nessary) | Chengdu Taimeng Electronics Co., Ltd. | BL-420F | |
| Centrifuge | Baiyang Medical Instrument Co., Ltd. | BY-600A | |
| cover glass | Jiangsu Shitai Experimental Equipment Co. Ltd | 10212432C | |
| creatinine Kit | Rayto Life and Analytical Sciences Co., Ltd. | S03076 | |
| dewatering machine | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Donatello Series 2 | |
| embedding machine | Hubei Xiaogan Kuohai Medical Technology Co., Ltd. | KH-BL1 | |
| frozen machine | Wuhan Junjie Electronics Co., Ltd | JB-L5 | |
| hematoxylin-eosin dye solution | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G1005 | |
| high-efficiency paraffin wax | Shanghai huayong paraffin wax co., Ltd | Q/YSQN40-91 | |
| hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 10011018 | |
| intraocular lens (IOL)forceps | Guangzhou Guangmei Medical Equipment Co., Ltd. | JTZRN | |
| Isoflurane | Shenzhen Ruiwode Life Technology Co. Ltd | — | |
| micro Scissors(when nessary) | Shanghai Surgical Instrument Factory | WA1010 | |
| needle holders | Shanghai Surgical Instrument Factory | J32010 | |
| neutral gum | Shanghai Huashen Healing Equipment Co.,Ltd. | — | |
| normal optical microscope | Nikon Instrument Shanghai Co., Ltd | Nikon Eclipse CI | |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | J3CO30 | straight |
| ophthalmic forceps | Shanghai Surgical Instrument Factory | JD1060 | bending |
| ophthalmic Scissors | Shanghai Surgical Instrument Factory | J1E0 | |
| pathological slicer | Shanghai Leica Instrument Co., Ltd | RM2016 | |
| pipettes | Dragon Laboratory Instruments Co., Ltd. | 7010101008 | |
| retractors | Beijing Jinuotai Technology Development Co.,Ltd. | JNT-KXQ | |
| scanner | Hungary 3DHISTECH Co.,Ltd | Pannoramic 250 | |
| slide | Wuhan Saiwell Biotechnology Co., Ltd | G6004 | |
| xylene | Sinopharm Chemical Reagents Co. Ltd | 1330-20-7 |
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