Summary
면역 요법 및 단일 세포 게놈 프로파일링 시대에 암 생물학은 적절한 시공간 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위한 새로운 시험관 내 및 전산 도구를 필요로 합니다. 우리는 2D 및 3D 설정에서 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하기 위한 프로토콜을 설명하며, 세포 기능의 동적 다중 매개변수 모니터링과 호환됩니다.
Abstract
복잡한 질병 모델에는 생리학적, 병리학적으로 관련성이 있고 실행 가능한 통찰력을 제공하고 다른 방법으로는 보이지 않는 프로세스를 공개할 수 있는 최첨단 도구가 필요합니다. 생체 내 풍경을 밀접하게 모방한 고급 세포 분석은 암의 진행에 영향을 미치는 양방향 종양-숙주 상호작용을 시각화하고 측정하는 새로운 방법으로 자리 잡고 있습니다. 여기에서는 자연 및 치료 유발 면역 감시 하에서 종양 미세 환경(TME)의 복잡성을 모방하여 마이크로 장치에서 고도로 제어 가능한 2D 및 3D 공동 배양을 재현하는 두 가지 다목적 프로토콜에 대해 설명합니다. 섹션 1에서는 명시야 타임랩스 현미경으로 부착 종양 세포와 부유 면역 집단 간의 누화를 모니터링하기 위한 실험 설정이 제공됩니다. 적용 시나리오로서, 우리는 면역 세포의 모집 및 활성화에 대한 소위 면역 원성 암세포 사멸 유도제와 같은 항암 치료의 효과를 분석합니다. 섹션 2에서는 3D 종양 면역 미세 환경이 경쟁력 있는 레이아웃으로 조립됩니다. 차등 면역 침윤은 최대 72시간의 형광 스냅샷으로 모니터링되어 병용 치료 전략을 평가합니다. 두 설정 모두에서, 과다한 면역 세포 파라미터(예를 들어, 면역 세포 이동 및 상호작용, 치료제에 대한 반응)를 추출하기 위한 이미지 처리 단계가 예시된다. 이러한 간단하고 강력한 방법은 암, 기질 및 면역 세포 아형의 이질성과 가소성뿐만 아니라 암 진화의 동인으로서의 상호 상호 작용을 포함하는 TME의 복잡성을 시뮬레이션하기 위해 추가로 맞춤화될 수 있습니다. 빠르게 진화하는 기술을 라이브 셀 고함량 이미징과 함께 사용하면 대규모 정보 데이터 세트가 생성되어 새로운 문제가 발생할 수 있습니다. 실제로 삼각형 ''공동 배양/현미경/고급 데이터 분석'은 맞춤형 치료 프로토콜을 지원할 수 있는 정확한 문제 매개변수화를 향한 경로를 설정합니다. 우리는 고처리량 처리를 위한 인공 지능과 암 면역 온어칩의 향후 통합이 정밀 및 개인화된 종양학을 위한 예측 및 전임상 도구로서의 기능을 활용하는 데 있어 큰 진전을 이룰 것으로 기대합니다.
Introduction
실험 분야로서의 다양한 의학 분야의 진화는 통제된 조건 하에서 세포 집단과 장기 기능을 조작하는 능력에 달려 있다1. 이러한 능력은 우리 몸에서 일어나는 과정을 요약할 수 있는 측정 가능한 모델의 가용성에 뿌리를 두고 있습니다.
면역요법 및 단세포 게놈 프로파일링 2의 시대에, 암 생물학은 적절한 시공간적 맥락에서 종양-면역 인터페이스를 조사하기 위해 새로운 시험관 내 및 전산 모델을 활용해야 합니다 2,3.
종양미세환경4(TME)는 암세포가 다른 세포(면역, 기질 및 내피 세포) 및 비세포(세포외 기질, ECM) 구성 요소와 지속적으로 상호 작용하고 동적으로 공동 진화하는 복잡한 조직입니다. 이 복잡한 환경의 역동적인 특성은 면역 세포가 악성 세포의 친구 역할을 하는지 아니면 적으로 작용하는지 여부를 결정하여 질병 진행과 치료에 대한 반응 모두에 큰 영향을 미칩니다. 오늘날, 종양 면역학자, 생물 정보학자 및 시스템 생물학 전문가들의 많은 노력이 공간(즉, 뚜렷한 종양 영역)과 시간(즉, 뚜렷한 종양 진행 단계)5,6에서 암 이질성5,6의 임상적 중요성을 다루고, 단일 세포 수준에서 암과 면역 세포 표현형과 기능을 특성화하기 위해 수렴되고 있습니다. 이러한 시너지 효과의 예로서, 진보된 컴퓨터 비전 기술은 이제 조직학적 샘플에서 면역 침윤물의 공간 매핑을 위해 일상적으로 사용된다 7,8.
실험 모델의 전면에서 동물 연구와 전통적인 체외 방법을 연결하는 미세 유체 공학 및 공동 배양 기술의 발전은 오가노이드, 미세 생리학적 시스템 9,10,11(MPS) 및 장기 칩12,13,14과 같은 다양한 종류의 미세 공학 세포 모델에 대한 액세스를 제공합니다 (OOC)입니다. 이들은 세포 생태계에 대한 '큰 그림'을 확대하고 미시 환경 요인을 제어하기 위해 체외 잠재력을 확장하는 동시에 고함량 현미경15 및 이미지 처리 접근 방식을 활용하는 공통된 특성을 공유합니다.
오늘날 최첨단 MPS 및 OOC 시스템은 염증성 질환, 상처 치유, 점막 면역, 독소 또는 일상 식품에 대한 반응과 같은 다양한 과정을 탐색하고 측정하기 위해 기존 조직 및 공동 배양에 다양한 면역 세포 하위 유형을 통합하는 면역학적 측면을 포함하기 시작했습니다16. TME-on-a-chip 모델 10,11,12,13,14,15,16,17은 또한 관류 가능한 미세 혈관 18,19,20,21과 통합되어 세포 유형 의존적 상호 작용, 물리적 및 화학적 섭동 및 세포 독성 활성을 조사하기 위해 개발되었습니다. 침윤성 림프구22 및 임상적으로 관련된 면역조절제23.
여기에서는 칩에 세포를 로딩하는 것부터 이미지 처리 도구에 이르기까지 다양한 프로토콜을 제공하여 2D(섹션 1) 및 3D(섹션 2) 설정(16)에서 고급 종양 면역 미세유체 공동 배양을 활용하며, 동적 다중 매개변수24 모니터링 및 세포 기능 시각화와 호환됩니다. 이는 샘플 관리 및 데이터 분석 모두에서 사용 용이성과 유연성을 유지하여 피지 프리웨어 소프트웨어와 해당 도구 상자25,26을 활용하여 달성됩니다.
섹션 1에 설명된 미세유체 장치는 부착성 암과 부유 면역 세포의 2D 공동 배양을 수행하도록 설계되었습니다. 이 플랫폼은 유전적 돌연변이27 및/ 또는 면역 결핍28의 존재 하에서 면역 세포 행동의 시험관 내 측정을 위해 검증되었다. 여기에서는 Trackmate(피지 소프트웨어에 구현된 플러그인)를 기반으로 하는 반자동 방법을 활용하여 타임랩스 명시야 이미지에서 면역 세포를 추적하는 단계를 설명합니다. 이 절차는 면역원성 세포 사멸 유도제( 27 )로 치료되거나 치료되지 않은 표적 암세포에 대한 면역 이동(29) 및 반응(즉, 상호작용 시간)의 운동학적 설명자의 추출을 가능하게 한다.
중요한 것은 시계열 이미지에서 추출된 이러한 매개변수가 고급 수학 기계로 처리될 수 있다는 것입니다. 이 접근법의 잠재력에 대한 예로서, 우리 그룹은 최근 확률 론적 과정과 통계 역학의 수학적 방법을 기반으로 한 분석을 발표하여 세포 네트워크 속성을 모델링하고 면역 세포 행동에 대한 매개 변수화 된 설명을 제공합니다 (즉, 편향되거나 상관 관계가 없는 랜덤 워크, 고도로 조정되거나 조정되지 않은 움직임30,31).
두 번째 섹션에서 제공되는 3D 설정은 공동 배양 프로토콜을 기반으로 하여 서로 다른 세포 유형과 약물 조합을 사용하여 두 개의 겔 영역에 내장된 보다 복잡한 면역 적격 TME를 경쟁력 있는 방식으로 재현합니다. 여기서, 이미지 처리 단계는, 상이한 시점에서, 마트리겔 내에서 배양된 인간 A375M 흑색종 세포에서 염색된 면역 세포의 침윤을 측정하여, 항종양제 조합을 평가하기 위한 것이다32. A375M 계통은, 고도의 전이성 표현형을 특징으로 하는 A375P 유래 세포주를 면역세포의 존재 하에서 이들의 전이능을 평가하기 위해 선택하였다32.
기술된 모델은 상이한 세포 공급원(쥐 및 인간 불멸화 또는 1차 세포주, 오가노이드, 이종이식 등)과 완전히 호환될 수 있다. 우리 연구실의 최근 연구에서, 고함량 비디오 현미경과 이미지 분석을 결합하여, 경쟁력 있는 3D 레이아웃을 적용하여 조사하였다: i) 항종양성(항체 의존성 세포 매개 세포독성, ADCC) 면역 반응 및 HER2+ 유방암 온칩 모델33에서 트라스투주맙 요법에 대한 내성에서 섬유아세포의 역할 해부; ii) 종양 회피 및 T 세포 모집 메커니즘에서 골수 세포(즉, 암 관련 대식세포)의 작용34; iii) 콜라겐 매트릭스에서 약물 처리된 결장암 세포로 배양된 인터페론-α 조절 수지상 세포(IFN-DC)를 기반으로 하는 면역요법 요법의 효능 및 효율적인 운동 및 후속 식균 작용 사건을 평가하기 위한35; iv) 골수 유래 호산구의 IL-33 처리 또는 처리되지 않은 흑색종 세포로의 화학주성 이동36.
이러한 고급 모델은 암 전이 및 내성 메커니즘에서 면역 조직 구성의 역할을 이해하기 위한 관찰 창 역할을 할 수 있지만, 연구 결과를 임상으로 변환하여 기초 연구와의 격차를 좁히기 위한 노력이 필요합니다37.
새로운 시나리오로서, 보다 생리학적으로 관련성이 높은 마이크로시스템의 사용과 결합된 자동화된 고함량 현미경의 기능을 활용하는 것은 단일 실험 캠페인에서 생성할 수 있는 수백, 수천 기가바이트의 다중 매개변수 데이터를 처리, 처리 및 해석하는 데 있어 새로운 잠재적 과제를 제시하고 있습니다. 이는 OOC 실험과 인공 지능 38,39,40,41,42 (AI) 기반 알고리즘 모두의 직접적인 연결을 의미하며, 고급 자동화 분석 및 암-면역 상호작용의 인실리코 모델(in silico model)을 차례로 공급할 수 있는 특징의 생성(43)과 예측 약물 스크리닝 분석(predictive drug screening assay)44의 개발과 같은 흥미진진한 새로운 응용 분야가 지평선에 있습니다.
끊임없이 확장되는 노력의 흐름은 단일 세포 다중 오믹스 판독을 통해 대규모 섭동 스크리닝을 구현하기 위한 전략의 최적화와 함께 질병 모델의 설계에 초점을 맞추고 있습니다. 이것은 의심할 여지 없이 면역 장애 및 암 전파 메커니즘에 대한 새로운 통찰력을 얻기 위한 체계적인 onco-immunology-on-a-chip 접근 방식의 적절한 수준의 방법 표준화와 함께 임상 구현에 도움이 될 것입니다.
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Protocol
1. 부착 및 부유 세포 2D 공동 배양을 위한 칩 설계
참고: 2D 공동 배양 레이아웃(그림 1A-C)은 두 세트의 마이크로채널 어레이(500 x 12 x 10μm 3, L×W×H)로 상호 연결된3개의 챔버(높이 100μm)가 특징입니다. 중간 챔버는 로딩 단계 2.5 동안 종양 부위로 넘쳐 흐르는 부유 면역 세포를 차단하는 두 개의 폐쇄된 막다른 구획을 형성합니다. 이 장치 유형은 단일 세포(부착 또는 부유) 운동성 및 세포-세포 상호 작용(16,27,28,30,31)의 실시간 2차원 측정에 유용합니다. 전형적인 세포 이동 연구(몇 시간에서 며칠까지 수행됨)는 획득된 이미지 시퀀스를 수치적 특징(25)으로 변환하기 위해 생세포 현미경과 이미지 처리 알고리즘(45)을 결합한다. 이동 패턴에 기초하여, 세포의 변위와 속도, 면역 세포 및 표적 세포 상호작용의 지속 기간과 같은 몇 가지 생물물리학적 지표를 추정할 수 있다24.
- 암 및 PBMC 세포의 제조
- 암세포 배양
참고: MDA-MB-231 삼중 음성[에스트로겐 수용체(ER)-, 프로게스테론 수용체(PR)-, 및 인간 표피 성장 인자 수용체 2(HER2)-] 인간 유방 선암 세포는 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 100IU mL-1 페니실린 G 나트륨 염 및 100μg mL-1 스트렙토마이신 설페이트(성장 배지)가 보충된 Roswell Park Memorial Institute(RPMI) 1640 배지에서 일상적으로 성장합니다. 표준 배양 조건(37°C 및 5%CO2) 하에서.- 세포 배양 성장을 최적화하기 위해, MDA-MB-231 세포를 1 × 10 6 세포 mL-1의 밀도로 75 cm2 플라스크 중의12 내지15 mL의 성장 배지에 플레이트한다.
- 세포가 합류점의 75-80%에 도달하면 성장 배지를 버리고 미리 데워진 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척하여 FBS를 완전히 제거한 다음 미리 예열된 트립신(37°C에서 1-2분)으로 분리합니다.
- 트립신 효소 활성을 비활성화하고 분리된 세포를 수집하기 위해 성장 배지를 추가합니다. 세포를 실온(RT)에서 1,100 x g에서 5분 동안 두 번 세척합니다.
- Trypan Blue 염료 배제 테스트를 통해 세포 계수 슬라이드에서 세포를 계수한 다음 유지 배양(해동에서 6 계대 이내) 또는 실험 절차를 위해 다시 시드합니다.
- 미세유체 실험의 경우, 3mL의 성장 배지에서 6웰 플레이트에 시드 1 × 106개의 세포를 처리하고 대조군으로 25μM 독소루비신(DOXO) 또는 동일한 부피의 DOXO 용매(PBS)로 처리합니다.
- 4 내지 6시간 후, DOXO-처리된 세포를 RT에서 1,100 x g에서 5분 동안 예열된 PBS로 2회 세척한다.
- DOXO-처리된 대조군 세포와 PBS-처리된 대조군 세포를 위와 같이 계수하고(단계 1.1.1.5 참조), 미세유체 장치에서 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 공동 배양하도록 설정하였다.
- PBMC 절연
- 건강한 지원자로부터 정맥 전혈(약 10mL)을 헤파린화된 바이알에 채취하고 튜브를 2-4회 뒤집어 부드럽게 혼합합니다(47).
- PBS로 혈액을 1:1로 희석하고 50mL 튜브에 밀도 구배 배지 Lymphoprep 10mL 위에 겹칩니다.
알림: 혈액과 림프프렙이 두 개의 별개의 층을 형성하도록 매우 부드럽고 천천히 레이어링을 수행해야 합니다. - 브레이크가 없는 스윙 아웃 버킷에서 4°C에서 400 x g에서 30분 동안 원심분리기 튜브. 4개의 별개의 층이 형성됩니다: (i) 상단의 혈장, (ii) PBMC를 포함하는 흰색 및 흐린 층, (iii) 림프전막 및 (iv) 적혈구 및 과립구의 펠릿.
- 2mL 피펫으로 PBMC를 부드럽게 흡인하고 즉시 따뜻한 성장 배지(1.1.1단계에서 사용된 것과 동일)에 재현탁하고 RT에서 1,100 x g에서 5분 동안 두 번 세척합니다.
- 위와 같이 펠렛 PBMC를 계산하고(1.1.1.5단계 참조) 실험 절차에 사용하거나 장기 보관을 위해 동결합니다.
- 암세포 배양
- 2D 칩에 셀 도금
참고: PBMC는 이 프로토콜에서 염색되지 않습니다. 특정 표현형 온칩을 특성화하기 위해, 면역 세포 하위집단은 면역자기 비드 선택에 의해 분리되고, 형광 세포 추적자로 염색되고, 표지되지 않은 나머지 분획과 재혼합되고, 따라서 Vacchelli et al.27 및 Racioppi et al.34에 기술된 온-칩 실험에서 보고된 바와 같이 표적 암세포와 대면할 수 있다.- 공동 배양 실험을 시작하기 전에 시약의 첨가를 용이하게 하기 위해, 몇 초 동안 산소 플라즈마 처리에 의해 저장된 칩을 활성화시킨다. 즉시 저장조에 탈이온수 또는 PBS를 채워 도금 단계까지 PDMS(폴리디메틸실록산) 표면을 친수성으로 유지합니다.
알림: PDMS는 본질적으로 소수성이므로 작동에 어려움이 있고 마이크로 채널에서 기포가 갇힐 수 있습니다. 산소 플라즈마 활성화에 대한 세부 정보를 제공하는 보충 파일의 7단계를 참조하십시오. - UV 캐비닛 아래에서 20분 동안 소독하고 신선한 PBS로 2-3회 세척한 다음 배양 배지로 1시간 동안 배양합니다. 도금 단계를 수행 할 때까지 칩을 인큐베이터에 보관하십시오.
- 6 개의 저수지 모두에서 초과 매체를 배출하십시오. 주 배양실에서 미디어를 빨아들이지 않도록 주의하십시오.
- 왼쪽 상단 저장소의 10-20 μL의 성장 배지에 재현 탁 된 1 × 105 개의 암세포를 천천히 적용한 다음 하단 웰에 적용합니다 (그림 1A, 저장소 1 및 2). 세포가 종양 챔버에 부착될 때까지 5분 동안 기다립니다. 일부 세포는 저장소에 침전되어 부착됩니다.
알림: 채널 개구부 옆에 셀룰러 서스펜션을 삽입합니다. 이 절차는 MDA-MB-231 암세포에 적용되며, 다른 라인은 세포 밀도 최적화가 필요합니다. 암세포 부착을 개선하기 위해, 표면의 코팅 기능화(예를 들어, 폴리-L-라이신, 피브로넥틴)가 수행될 수 있다. 코팅 단계16, 48,49,50에 대해 이전에 발표된 프로토콜을 참조하십시오. - 오른쪽에서 1 ×10 6 PBMC를 50 μL의 성장 배지에 웰 3 및 4에 재현탁하여 부드럽게 피펫합니다(그림 1A, 저장소 3 및 4 참조).
참고: 유동 후 PBMC는 중간 챔버로 분배되어 실험의 시작점을 나타내는 "전면"을 생성합니다. - 6개의 저장소를 모두 최대 100-150 μL의 성장 배지로 채웁니다. 현미경으로 그림 1D-E에 묘사된 대로 세포가 배양 구획에 올바르게 분포되어 있는지 확인합니다. 최종 부피는 저수지의 크기에 따라 달라질 수 있습니다. 모든 우물에서 부피를 동일하게 조정하십시오.
- 타임랩스 기록 전에 시스템을 안정화하기 위해 약 1시간 동안 칩을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 증발 손실이 발생할 수 있으므로 3 일마다 새로운 배지를 추가하십시오.
참고: 이 시스템은 조건화된 배지의 생/사세포 분석 및 동적 다중 사이토카인 분비 프로파일링과 모두 호환됩니다. 케모카인 분석의 경우, 각 구획의 두 저장소에서 배지를 수집하여 최대 200-250 μL의 상층액 분취량에 접근할 수 있습니다. 기존 ELISA 및 Luminex 사이토카인 프로파일링 분석에는 약 50μL의 상층액이 필요합니다. OOC 모델에서 사이토카인 프로파일링을 수행하는 다른 실험실의 연구 사례 51,52개를 참조하십시오.
- 공동 배양 실험을 시작하기 전에 시약의 첨가를 용이하게 하기 위해, 몇 초 동안 산소 플라즈마 처리에 의해 저장된 칩을 활성화시킨다. 즉시 저장조에 탈이온수 또는 PBS를 채워 도금 단계까지 PDMS(폴리디메틸실록산) 표면을 친수성으로 유지합니다.
- 표지되지 않은 암 및 면역 세포의 타임랩스 획득
참고: 일반적으로 3개의 칩이 단일 현미경 슬라이드에 배열됩니다(1D 칩의 경우 그림 2A, 4D 칩의 경우 그림 3B 참조). 4개의 슬라이드를 할당하는 스테이지 홀더를 사용하여 공동 배양은 자동화된 고함량 현미경으로 모니터링하여 대량의 실험 조건을 분석하는 데 적합할 수 있습니다. 칩은 고해상도 컨포칼 이미징을 위해 두께가 1mm 또는 170미크론인 슬라이드(플라스틱 또는 유리 커버슬립, 6웰 광학 바닥 멀티웰)에 쉽게 장착할 수 있습니다.- 배양 시스템이 장착된 비디오 현미경 설정을 통해 표지되지 않은 세포의 명시야 이미지 시리즈를 기록합니다.
참고: 여기에서 시계열 데이터 세트(시간 창: 48시간, 프레임 속도: 2분)는 표준 세포 배양 인큐베이터에 맞도록 최적화된 4x 대물렌즈와 CMOS 1.3M 픽셀이 장착된 형광 현미경으로 획득되었습니다. - 획득을 시작하기 전에 현미경을 37°C 및 5%CO2로 평형화하기 위해 적어도 2시간 동안 예열한다.
- 종양과 중앙 구획 사이의 미세 채널 어레이를 중앙에 배치하여 관찰 창을 선택합니다. 이를 통해 면역 침윤의 역학과 암세포가 파종되는 영역 내의 상호 작용을 시각화 할 수 있습니다.
- 암과 면역 세포의 조명 강도와 초점을 조정합니다.
- 타임랩스 획득을 시작하려면 실험 및 연구 중인 세포 유형에 따라 프레임 속도와 지속 시간을 최적화합니다.
알림: 좋은 신호 대 잡음비(SNR)를 유지하면서 과도한 광 노출을 방지하기 위해 이미징 조건을 최적화해야 합니다. 면역 세포는 매우 운동성이 있기 때문에, 획득 프레임 속도는 관심있는 동적 과정을 따르고 쉬운 추적(53)을 가능하게하기에 충분히 높아야한다. 추적 알고리즘, 결과 데이터 세트 크기와의 호환성, 관찰된 세포의 생존력, 밀도 및 운동성 간에 절충안이 이루어져야 합니다. - 타임랩스가 끝나면 ImageJ 소프트웨어의 Import Image Sequence 및 Save as example(이미지 시퀀스 가져오기 함수) 및 Save as(다른 이름으로 저장) 함수를 사용하여 프레임 데이터셋을 25fps 비압축 비디오 파일로 변환합니다.
참고: 생성된 비디오 파일은 이제 세포 추적 분석에 사용할 준비가 되었습니다. 여기서는 RGB(1280x1024픽셀) 이미지를 1.33μm/픽셀의 공간 해상도로 수집했습니다. 단일 시야각(FOV)의 24시간 길이의 동영상(3.5GB 스택)은 각 조건에 대해 720프레임으로 구성됩니다.
- 배양 시스템이 장착된 비디오 현미경 설정을 통해 표지되지 않은 세포의 명시야 이미지 시리즈를 기록합니다.
- 데이터 분석: Trackmate에 의한 표지되지 않은 면역 트랙의 반자동 추출
참고: 여기에서 레이블이 지정되지 않은 2D 타임랩스 이미지의 면역 운동성 분석은 TrackMate를 사용하여 수행됩니다54, Fiji/ImageJ 소프트웨어 번들(https://imagej.nih.gov/ij/)에서 사용할 수 있는 오픈 소스 도구 상자입니다. 자동화된 단일 입자 추적을 수행하기 위해 여러 알고리즘이 제공됩니다55(SPT) 반점과 같은 구조. 그것들은 높은 SNR을 가진 어두운 배경 위에 물체가 밝은 형광 이미지에 효율적으로 적용되었습니다(즉, 저해상도 형광 반점, 라벨이 붙은 교통 소포, 핵)1,25,56,57,58. SPT는 주로 두 가지 순차적 단계를 기반으로 합니다. 첫째, 객체는 여러 프레임에서 식별된 위치로 현지화됩니다(분할),그림 2. 두 번째 단계(입자 연결)에서는 감지된 스폿을 연속적인 프레임에 연결하여 움직임을 추정하고 궤적을 트랙 모양으로 재구성합니다(그림 3). 시간 경과에 따라 추출된 각 X, Y, Z 좌표 배열에서 수치적 특징을 계산할 수 있습니다. 확장 설명서는54뿐만 아니라 온라인(http://imagej.net/TrackMate), TrackMate 시작하기 자습서를 따릅니다. 프로세스의 정확성을 즉시 검사할 수 있으며, 사용자가 모든 단계에서 설정을 재조정할 수 있는 직관적인 그래픽 사용자 인터페이스(마법사와 같은 GUI)를 처리할 수 있습니다. 다음 부분에서는 가시광선 이미지에 적용되는 이미지 처리 및 정량화 단계에 Trackmate를 사용하는 방법을 간략하게 설명합니다.- 풀타임 비디오/이미지 스택을 피지 도구 모음에 끌어다 놓습니다.
- 보정 스택 설정(그림 2A).
- 차원을 확인하고 Image> Properties를 선택하여 이미지 속성을 할당합니다. 길이 단위(Unit of length), 픽셀 치수(Pixel dimensions) 및 프레임 간격(Frame interval) 상자를 채웁니다.
알림: 보정을 수행하려면 알려진 길이의 마이크로채널(500μm, 그림 1C)을 사용하고 해당 측정 길이(픽셀)로 나눕니다. 2D 시계열의 경우 1을 입력하는 Z/T 필드를 z-슬라이스로 바꾸고 올바른 수의 동영상 프레임을 스왑해야 합니다. 달성되지 않으면 Trackmate 정량적 출력 및 매개변수가 픽셀 단위 및 시간 프레임으로 보고됩니다.
- 차원을 확인하고 Image> Properties를 선택하여 이미지 속성을 할당합니다. 길이 단위(Unit of length), 픽셀 치수(Pixel dimensions) 및 프레임 간격(Frame interval) 상자를 채웁니다.
- 이미지 전처리.
- 노이즈가 있는 배경에서 면역 세포의 올바른 식별을 강화하려면 명시야 이미지를 사전 처리하여 아티팩트를 보정합니다. 데이터 세트가 8비트 TIFF 이미지(밝기 범위: 0-255)로 구성되어 있는지 확인합니다.
참고: 불균일한 조명, 낮은 SNR 및 가시광선 이미지의 작은 파편 입자에 의한 오염은 세포 추적 프로세스의 성공을 저해할 수 있습니다. 여기서 시계열 데이터 세트는 배경 빼기, 밝기/대비 조정 기능, 원본 이미지에서 가우시안 흐림의 로컬 이미지 빼기를 통해 사전 처리됩니다. ImageJ에는 EGT(Empirical Gradient Threshold)59를 포함하여 위상차 또는 명시야 이미지의 처리 및 분할을 위해 사용할 수 있는 다른 분석 툴킷이 있습니다.
- 노이즈가 있는 배경에서 면역 세포의 올바른 식별을 강화하려면 명시야 이미지를 사전 처리하여 아티팩트를 보정합니다. 데이터 세트가 8비트 TIFF 이미지(밝기 범위: 0-255)로 구성되어 있는지 확인합니다.
- 첫 번째 보정 패널(그림 2A)
- 이미지 스택을 선택한 상태에서 Trackmate (Plugins>Tracking)를 시작합니다. 데이터의 차원과 시간 창(예: 픽셀 너비 및 프레임 간격)을 수정/확인합니다.
알림: TrackMate는 이미지 속성 상자를 자동으로 읽어 보정된 물리적 단위(예: μm 및 분)로 최종 추적 결과를 제공합니다. - 면역 트랙의 추출을 계산하기 위해 관심 영역을 정의하고, 수동으로 값을 삽입하거나 활성 이미지 위에 닫힌 영역을 그린 다음 Refresh source 버튼을 누릅니다. 글로벌 면역 이동 경로를 추출하려면 마이크로채널의 오른쪽(중앙 챔버, 그림 1E)과 왼쪽(종양 챔버, 그림 1D)에서 각각 직사각형 영역을 선택합니다. 암과 면역 핫스팟 간의 상호 작용을 분석하려면 ROI 도구를 사용하여 원형 하위 영역을 그립니다(선택 → 편집 → 지정으로 이동).
참고: 새로운 생물학적 응용 프로그램에서 이 도구 상자를 처음 실행하는 경우 트랙 재구성을 위한 설정을 최적화하는 데 필요한 시간을 할애하십시오.
참고: 세포 궤적(약 50-100개 세포)을 수동으로 추적하여 경험적으로 올바른 구성을 찾고 다음으로 움직임 자동 추출의 신뢰성을 벤치마크로 검증합니다. 또한 선택한 매개변수의 정확성을 쉽게 확인할 수 있도록 처음에는 더 작은 영역에서 작업합니다.
- 이미지 스택을 선택한 상태에서 Trackmate (Plugins>Tracking)를 시작합니다. 데이터의 차원과 시간 창(예: 픽셀 너비 및 프레임 간격)을 수정/확인합니다.
- 면역반점 검출 단계(도 2B)
- 기본 LoG(Laplacian of Gaussian) 검출기를 선택합니다. LoG 검출기는 밝고 물방울 모양의 둥근 물체를 찾고 중간 스폿 크기(직경 5-20픽셀)에 맞게 조정된 이미지에 가우시안 라플라시안 필터를 적용합니다.
- 예상 Blob 직경(여기서는 10-13μm)에 예상 스폿 크기보다 약간 큰 값을 입력합니다. 개체 기능을 제거하지 않고 추가 스퓨리어스 배경 스폿이 줄어들 때까지 임계값(여기서는 1-3μm) 값을 늘립니다. 임계값 미만의 검색(품질 메트릭 기반)은 후속 분석에서 삭제됩니다. 중앙값 필터와 서브픽셀 위치 파악 확인란을 선택하여 스팟 감지 품질을 개선합니다.
- 미리보기 버튼을 사용하여 이미지에 자홍색 원으로 겹쳐진 식별된 면역 세포를 보고 빠르게 검사할 수 있습니다.
알림: 감지 중 실수는 연결 프로세스에 상당한 영향을 미칩니다. 다른 원치 않는 검출들은 후속 메뉴들에서 사용자 정의 필터들에 의해(즉, 스폿 강도, 크기, 또는 위치에 의해) 정정될 수 있다.
- 선택에 만족하면 다음을 누르십시오.
참고: 이러한 설정은 실험 설정 및 획득 이미징 양식(예: FOV, 대물렌즈 배율, 명시야 또는 형광 이미지), 세포 유형(부착 세포 또는 부유 세포), 느리거나 빠른 운동성, 세포 행동의 종류(상호 작용 여부) 및 관찰 영역의 저밀도/중밀도/고밀도. - 계속 진행하고 초기 임계값 설정 메뉴를 건너뜁니다. Hyperstack Displayer 창을 선택합니다.
- 스폿 패널에 필터를 설정합니다(그림 2C).
- 선택: 균일한 색상. 그림 2C와 같이 필터를 추가하여 히스토그램으로 표시된 피처 값이 있는 레이블이 지정된 스폿을 가역 임계값보다 높거나 낮게 유지할 수 있습니다.
- 트래커 선택 단계(그림 3A). 세 개의 필드를 채우도록 요청하는 파티클 연결 알고리즘으로 Simple LAP tracker를 선택합니다(이 경우 "연결 최대 거리": 30-50 μm, "갭 닫힘 최대 거리": 25-50 μm, "갭 닫힘 최대 프레임 간격": 4-6). 이 감지기는 각각의 거리만을 기준으로 비용 연결 계산을 통해 갭 폐쇄 이벤트를 관리합니다.
참고: 최대 허용 연결 거리는 후보 일치 지점에 대한 공간 검색 범위를 제한하며, 이는 두 개의 후속 프레임 사이에서 이동하는 최대 허용 변위에 해당합니다(그림 3D).- 운동성이 높은 입자의 트랙 조각화가 감지될 때 더 큰 최대 변위 값을 제공합니다.
알림: 프레임 간 이동이 주어진 최대 거리 값보다 크면 두 개의 링크가 연결되지 않습니다. 세그먼트가 두 개의 서로 다른 셀을 심하게 연결하는 경우 최대 변위 값을 줄입니다. - "간격 닫기를 위한 최대 거리"와 "최대 프레임 간격"의 값을 변경하여 누락된 지점을 다시 연결해 보십시오.
참고: 이 매개변수는 인접하지 않은 프레임에서 간격 닫기 이벤트를 처리합니다. 스폿 소실은 일부 프레임에서 발생할 수 있습니다(즉, 초점이 맞지 않는 입자, FOV에서 세포가 빠져나가고, 노이즈가 있는 이미지에서 분할 실패).
참고: 분할 또는 병합 이벤트를 처리하려면 연결 비용 매트릭스 페널티를 도입하는 감지기로 LAP 링커를 선택합니다.
- 운동성이 높은 입자의 트랙 조각화가 감지될 때 더 큰 최대 변위 값을 제공합니다.
- 다음을 클릭하여 추적 계산을 실행합니다. 다음을 누릅니다.
- 트랙 필터링 패널 (그림 3B) 드롭다운 메뉴에서 "트랙 ID" 또는 기타 트랙 기능을 선택하여 면역 경로의 색상을 변경합니다. 이 시점에서 선택적으로 대화형 필터 기능을 설정하여 결과의 품질을 개선하고 절차를 다시 방문하도록 선택합니다.
참고: 스퓨리어스 스팟은 이미지의 노이즈와 피처 품질의 손실로 인해 발생합니다. 이렇게 하면 짧은 세그먼트가 생성되고 관심 있는 셀은 여러 프레임에서 추적할 수 있습니다.- 짧은 경로를 제거하려면 포함된 스팟 수에 따라 필터링해 보세요. 또한 트랙 변위, 트랙 지속 시간 또는 최소/평균/최대속도와 같은 옵션 조합을 사용하여 트랙을 정렬하여 추가 후처리에서 거짓 또는 원치 않는 트랙(전체 타임랩스 지속 시간에 대해 더 적은 프레임 또는 더럽거나 움직이지 않는 파티클 포함)을 제외합니다.
알림: 필터 선택은 특정 응용 분야 및 생물학적 시스템에 따라 달라질 수 있습니다.
- 짧은 경로를 제거하려면 포함된 스팟 수에 따라 필터링해 보세요. 또한 트랙 변위, 트랙 지속 시간 또는 최소/평균/최대속도와 같은 옵션 조합을 사용하여 트랙을 정렬하여 추가 후처리에서 거짓 또는 원치 않는 트랙(전체 타임랩스 지속 시간에 대해 더 적은 프레임 또는 더럽거나 움직이지 않는 파티클 포함)을 제외합니다.
- 디스플레이 옵션 인터페이스에서 모든 트랙을 검사하고, 시간을 스크롤하고, 정확한 트랙이 셀 이동 경로와 얼마나 일치하는지 확인합니다. 드롭다운 메뉴는 여러 양식(예: 운동 매개변수, 강도, 시간 또는 공간 위치)으로 쉽게 시각화하고 필터링할 수 있도록 스폿 및 경로에 대한 색상 코드를 제공합니다.
참고: 고밀도 배양 또는 운동성이 높은 세포를 추적하려면 획득 프레임 속도를 높여 연속 시간 간격으로 이동하는 세포 변위를 최소화합니다. - 세그멘테이션 및 연결 실수의 수동 수정(그림 3E).
- 결과의 품질을 더욱 향상시키려면 종양-면역 상호작용 ROI를 분석할 때 수동으로 스팟(파편 입자, 고정 세포)을 편집하고 검출된 종양 경계에서 파생된 잘못된 트랙을 제거합니다.
- 먼저 ImageJ 도구 모음에서 TrackMate 도구를 선택합니다. 전체 스택에서 기존 스폿을 제거하려면 Shift 키를 누르고 마우스 커서로 대상 스폿 위에 ROI 마스크(녹색 원으로 편집됨)를 만든 다음 DEL 키를 누릅니다.
- 새 스폿을 추가하려면(스폿이 사라져 트랙이 누락된 경우) A 키를 누르고 마우스를 뾰족한 위치에 놓습니다. 이 단계 후에 트랙 연결 계산 프로세스를 반복합니다.
- 만족스러우면 디스플레이 옵션 패널에서 분석을 선택하여 세 개의 텍스트 파일을 생성합니다(그림 3C 및 3F). "트랙 통계의 스팟"의 표는 면역 스팟의 시공간 좌표(관련 프레임 및 트랙 번호로 레이블이 지정된 세포의 X-Y-Z 위치)를 제공합니다. "트랙 통계의 링크" 및 "트랙 통계"에는 트랙 지속 시간, 감지된 간격 또는 스팟 수, 트랙 초기 및 정지 프레임 등 트랙과 관련된 정보가 포함됩니다. 각 데이터 세트에 대해 저장하고 내보냅니다.
참고: 결과 창 내에서 행을 클릭하면 육안 검사를 위해 타임랩스 비디오 내에서 해당 지점, 링크 또는 트랙이 활성화됩니다. 필터링 단계를 반복하여 트랙을 선택/제거합니다. 나중에 내보낸 모든 데이터가 업데이트됩니다. 팁: 초기 및 정지 프레임을 추적하고 지속 시간 값을 추적하여 상호 작용의 ROI를 처리할 때 암과 면역 세포 간의 접촉 시간을 계산할 수 있습니다. - 저장 버튼을 눌러 모든 매개 변수 값, 이미지 경로 및 시간별 스폿 위치를 포함하는 결과 XML 파일을 생성합니다. ''TrackMate 파일 로드'' 명령(플러그인> 트래킹)은 각 동영상 파일에 대한 전체 프로세스 세션을 개별적으로 복원합니다.
- 작업 선택이라는 GUI의 마지막 패널로 이동합니다. 목록에서 Captureoverlay > Execute 기능을 사용하여 트랙이 오버레이된 비디오를 생성합니다. 팁: "N-spot 대 시간 도표" 옵션을 사용하여 ROI에서 면역 세포의 공간 밀도를 계산할 수 있습니다(그림 6B, 오른쪽 패널).
- 후처리 분석 및 마이그레이션 통계
- Trackmate에서 직접 원시 위치 데이터를 분석하거나 데이터를 내보내 포괄적인 운동 매개변수(29)(즉, 총 궤적 길이, 유클리드 거리, 감금 비율, 평균 제곱 변위(56), 평균 또는 순간 트랙 속도, 정지 계수, 이동 각도의 분포, 전방 이동 지수, 평균 직선 속도)를 계산하여 면역 세포 이동 거동(예: 지향성 또는 확산 운동(30), 31) 표적 암세포에 대한 반응(예를 들어, 치료 대 대조군)을 포함한다.
참고: Chemotaxis 및 Migration Tool(http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/)과 같은 유용한 추가 플러그인은 다양한 그래프(예: 그림 6에 표시된 Rose 또는 섹터 플롯)와 실험 마이그레이션 및 화학주성 데이터의 고급 분석 및 시각화를 위한 통계 테스트를 제공합니다. 세포 추적 및 세포 분할 알고리즘(24,25,45)을 결합하는 것은 단일-세포 레벨(즉, 세포 표면적, 장축 및 단축 길이, 및 세포 종횡비)에서 형태학적 메트릭의 측정을 가능하게 할 수 있다.
- Trackmate에서 직접 원시 위치 데이터를 분석하거나 데이터를 내보내 포괄적인 운동 매개변수(29)(즉, 총 궤적 길이, 유클리드 거리, 감금 비율, 평균 제곱 변위(56), 평균 또는 순간 트랙 속도, 정지 계수, 이동 각도의 분포, 전방 이동 지수, 평균 직선 속도)를 계산하여 면역 세포 이동 거동(예: 지향성 또는 확산 운동(30), 31) 표적 암세포에 대한 반응(예를 들어, 치료 대 대조군)을 포함한다.
2. 경쟁 분석에서 3D 면역 적격 암 온칩 모델
참고:그림 4에 묘사된 3D 칩 설계는 부유 면역 세포 섭취를 위한 중앙 구획, 하이드로겔 매트릭스(150-250μm 높이)에 종양 세포를 삽입하기 위한 두 개의 측면 영역 및 배지 관류 챔버의 5가지 주요 구획으로 구성됩니다. 면역 및 종양 챔버는 마이크로채널의 좁은 배열의 두 세트로 연결됩니다(200×12×10μm3, L×W×H, 그림 4E). 규칙적으로 100μm 간격의 사다리꼴 이등변 마이크로필러(각 측면 겔 영역에 대해 약 25-30개의 계면, 그림 4C)는 주입 동안 겔 용액을 가두는 장벽으로 작용하여 표면 장력과 모세관력 사이의 균형을 이용합니다(60,61) 겔-액체 계면을 설정하기 위해 종양 영역을 두 개의 측면 추가 배지 챔버에 연결합니다(그림 5). 3D 경쟁 분석의 자세한 기능은 그림 4에 나와 있습니다. 서로 다른 치료를 받은 종양 세포를 호스팅하는 두 개의 하이드로겔 구획으로 면역 세포의 우선적인 이동을 모니터링하고 정량화할 수 있습니다. 특정 경쟁 레이아웃은 다양한 암 생물학 표현형(예: 약물 내성 대 공격적, 1차 또는 전이성, 반응자 대 비반응자)을 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 추가적으로, 겔 포매 영역은 상이한 세포 집단과 용이하게 통합되어, 기질 성분(섬유아세포, 내피 세포)23을 포함하는 보다 이질적인 TME를 재생성하거나, 약물 내성 및 종양 회피의 기전을 해부하기 위한 특정 면역억제 환경(34)(예를 들어, 대식세포)을 시뮬레이션할 수 있다.
참고: Nguyen et al.33에 보고된 바와 같이 Live/dead 분석용 상용 키트(예: Thermo Fisher Scientific, Incucyte 시약)를 사용하여 핵 및 활성 카스파제 염색을 구현하여 유사분열 또는 세포사멸 사멸 사건을 평가할 수 있습니다.
- 세포가 있는 매트릭스 용액의 준비 및 장치에 로딩
참고: 다음 실험 설정에서, 두 겔 영역은 매트릭스 용액(예: Matrigel)에서 성장하고, 단일 요법 또는 조합으로 사용되는 치료제에 노출된 인간 A375M 흑색종 세포주의 혼합물을 포함합니다. 이 설정을 통해 우리는 경쟁적인 방식으로 단일 약물에 대한 두 가지 약물 조합의 효능을 평가하고 PBMC를 유치하는 능력을 정량화할 수 있었습니다.- 실험 하루 전에 4°C 냉장고에 넣어 얼음 위에 놓음으로써 매트릭스 용액(예를 들어, Matrigel)의 스톡을 해동한다.
알림: 제품이 "덩어리"가 되므로 여러 번의 동결-해동 주기에 노출시키지 마십시오. 다른 합성 또는 천연 히드로겔 프로토콜이 이러한 환경에서 사용되기에 적합할 수 있다. 콜라겐 매트릭스에서 암세포의 준비에 대해서는 33,34,35를 참조하십시오. - 매트릭스 용액(2mg mL-1)에서 생호환 PKH67 녹색 형광 세포 링커로 염색한 A375 인간 흑색종 세포를 재현탁합니다. 지시된 경우, DAC로 지칭되는 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC; 2.5 μM) 및/또는 IFN으로 지칭되는 IFN-α2b를 적절한 용량으로 첨가한다32.
알림: 매트릭스 병 사양 시트의 Lot #과 일치합니다. 농도에 따라 최대 2mg mL-1을 만드는 데 필요한 배지의 부피를 계산합니다. 관심 있는 응용 분야에 따라 최적의 단백질 농도와 암세포 현탁액 농도를 조정하십시오. - 기포가 생기지 않도록 조심스럽게 위아래로 피펫을 끼우십시오. 원치 않는 중합을 방지하기 위해 혼합하는 동안 미세 원심분리기 튜브를 얼음 위에 두십시오.
- 멸균 후, 세포 로딩의 전체 절차 동안 매트릭스 용액 응고를 피하기 위해 장치를 얼음 위에 놓으십시오 (얼음 양동이와 뚜껑 사용).
- 콜드 팁을 사용하여 두 개의 IFN 및 DAC/IFN Matrigel/종양 세포 혼합물(2-4μL)을 각각 10μL 마이크로피펫을 사용하여 왼쪽 및 오른쪽 겔 포트에 천천히 주입합니다(그림 5A). 부드러운 압력을 가하여 한쪽에서 반대쪽에 도달할 때까지 매트릭스 용액을 밀어냅니다.
참고: 매트릭스 용액의 부피는 인접 채널로 넘치지 않도록 선택되었습니다. 용액이 매체 및 중앙 채널로 누출되는 것을 방지하기 위해 과도한 피펫팅 압력을 가하지 마십시오. 로딩 중에 겔 경로가 채널을 따라 막히면 겔 프런트가 만날 때까지 다른 입구에서 용액을 삽입하십시오. 입구에서 마이크로 피펫을 제거 할 때 플런저를 잡으면 음압이 매트릭스 용액을 흡인합니다. - 매트릭스 용액의 겔화가 일어날 수 있도록 37°C 및 5%CO2에서 30분 동안 직립 위치의 인큐베이터에 장치를 배치합니다(그림 5B). 겔 채널에서 누출되는 것을 방지하기 위해 중합되지 않은 젤이 내장된 조심스럽게 칩을 다루십시오.
- 그 동안 PKH67 표지 PBMC(1x106 세포)를 완전한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 10μL에 재현탁합니다.
- 매트릭스 겔화 후, 칩에서 겔 건조를 방지하기 위해 6개의 저장소 모두에서 동일한 분취량의 배양 배지(50-100 μL)로 배지 채널을 채웁니다. 면역 세포 현탁액이 파종 될 때까지 인큐베이터에 보관하십시오.
참고: 현미경으로 겔 내 종양 세포의 정확하고 균일한 분포와 중합된 겔 장벽의 무결성을 확인하십시오. 혼합물의 부분적으로 또는 균일하지 않은 겔화 영역 또는 기포는 압력 초기 변동으로 인해 실험 시작점에서 겔 매체 채널에서 PBMC의 조기 흐름을 유발합니다. - 6개의 웰에서 배지를 흡인하고 팁을 배지 채널의 입구 근처에 위치시켜 중간 압력의 PBMC 세포 현탁액을 부드럽게 주입합니다. 로딩 시간 시퀀스는 그림 5C에 나와 있습니다.
- PBMC를 10 μL 배지에 담아 상부 중앙 웰에 넣습니다.
- 50-100 μL 배지를 측면 채널의 4개 웰 각각에 넣습니다.
- 40-90 μL 배지를 상부 중앙 웰에 넣습니다.
- 50-100 μL 배지를 하부 중앙 웰에 넣습니다.
- 현미경으로 PBMC 분포가 로딩 단계 후 중앙 챔버에 갇혀 있는지 확인합니다. (그림 7A).
알림: 최적이 아닌 경우 필요한 경우 농도를 조정하고 깨끗한 칩을 사용하여 파종 단계를 반복합니다. 계획된 실험 조건의 부피를 계산할 때 잠재적인 오류 및 조정을 고려하여 초과 칩 수(15-20%)를 참조하십시오. 부피와 농도는 특정 용도에 따라 최적화되어야 합니다. - 후속 형광 이미징 획득을 위해 37°C 및 5%CO2에서 인큐베이터의 평평한 표면에 조립된 장치를 놓습니다. 떠 다니는 면역 세포를로드 한 후 조심스럽게 칩을 다루십시오.
알림: 2-3일마다 매체를 교체하여 저장소의 부피 증발 손실을 보상합니다. 케모카인 프로파일링의 경우 배양 구획의 두 웰 각각에서 최대 100μL를 흡인할 수 있습니다(2.7단계의 1단계 참조).
- 실험 하루 전에 4°C 냉장고에 넣어 얼음 위에 놓음으로써 매트릭스 용액(예를 들어, Matrigel)의 스톡을 해동한다.
- ImageJ의 단일 채널 형광 이미지에서 모집된 PBMC의 자동 계수
참고: 컨포칼 고분해능 이미징을 위한 면역형광의 고전적인 방법은 종말점 측정으로 온칩 작업에 적용할 수 있습니다. 기본 염색 절차에는 세포 온칩 고정, 투과화, 차단, 항체 결합, 핵 염색 및 그 사이의 세척 단계가 포함됩니다. 암 미세 환경이 내장된 3D 겔 영역에 침윤된 표지되지 않은 면역 세포를 원하는 시점에 고정하고 활성화/고갈/성숙의 발현 마커를 위해 염색할 수 있습니다(예: CD8 세포의 경우 CD69, CD95, PD1, TIM3 마커 모니터링). Parlato et al.35, SW620 세포사멸 세포의 식균 작용은 170μm 두께의 커버슬립에 장착된 장치를 사용하여 공초점 현미경으로 평가되었습니다. IFN-DC는 온칩 항-인간 HLA-DR-FITC Ab 분취량을 첨가하여 염색하였다.
경쟁 신호로 인해 침윤된 형광으로 염색된 살아있는 면역 세포의 정도를 계산하기 위해 일반적인 이미지 분석 워크플로우는 다음과 같이 설정됩니다(그림 7D-지):- 특정 시간 종말점에서 단일 또는 약리학적 영역의 조합에 각각 노출된 종양 세포를 포함하는 왼쪽 및 오른쪽 겔 영역의 위상차 및 적색/녹색 채널 형광 현미경 사진을 획득합니다.
참고: 여기에서 이미지는 세포 로딩 후(0시간), 48시간 후 및 72시간 배양 후(그림 7A-B) EVOS-FL 형광 현미경으로 캡처되었습니다. 4x-10x 배율은 중앙 챔버, 마이크로 채널 어레이 및 A375 플러스 IFN 및 A375 플러스 DAC/IFN을 포함하는 두 개의 병치된 측면 채널을 획득하는 데 사용되었습니다.- 수집 작업을 수행할 때 측정할 파라미터를 고려하고 계산할 피처의 포화를 방지합니다. 최적의 분할 결과는 생물학적 샘플 자체의 가변성, 염색 품질 및 사용자 지향 응용 분야에 사용되는 현미경 기술로 인해 획득한 이미지의 특성에 따라 달라집니다.
- 형광 단일 채널 데이터(이 경우 빨간색 = PBMC)를 기본 창으로 드래그하여 피지에서 로드합니다(그림 7D). 최종 분할까지 전처리 필터를 선택하는 동안 원시 데이터를 덮어쓰지 않도록 이미지를 복제합니다.
- 이미지가 컬러 이미지(RGB)인 경우 이미지 > 유형 8 또는 16비트를 눌러 그레이스케일로 변환합니다. 변환 시 편집 > 옵션 > 변환s가 배율로 설정되어 있는지 확인합니다.
- 노이즈 및 아티팩트 정리를 통한 원시 데이터 전처리.
- Process > Subtract Background 메뉴로 이동하여 롤링 볼 알고리즘을 적용하여 강도의 공간적 변화가 큰 고르지 않은 노이즈 배경을 보정합니다. 반지름을 최소한 가장 큰 전경 입자의 크기로 설정합니다. 최적의 결과를 얻기 위해 시행 착오 절차에 대한 미리보기 상자를 선택합니다. 값이 너무 작으면 관심 있는 구조가 잘못 제거될 수 있습니다.
- [밝기 및 대비] 명령에서 최소/최대 슬라이더를 드래그하여 히스토그램의 강도 범위를 변경합니다. 최대 슬라이더를 왼쪽으로 이동하면 세척 기능 없이 밝기를 높일 수 있습니다. [최소] 슬라이드를 오른쪽으로 이동하여 이미지의 대비를 높여 배경에서 잘 보이지 않는 특징이 사라지지 않도록 합니다. 적용을 클릭하여 변경 사항을 수정합니다.
- 이미지 향상.
- 필터 처리(Process > Filters)로 이동하여 이미지에서 중앙값, 가우스 필터를 실험합니다(그림 7E).
참고: 사전 필터링 반경은 이미지 노이즈 픽셀에 맞게 조정되어야 합니다. 비선형 중앙값 필터는 픽셀 값을 이웃의 중앙값으로 대체하여 소금과 후추 노이즈를 줄입니다. "Gaussian Blur"는 픽셀을 주변 픽셀의 가중 평균으로 대체하여 디지털 사진을 매끄럽게 하는 데 사용됩니다. 가중치는 가우스 확률 분포에서 나오므로 가장 가까운 픽셀이 더 영향력이 있습니다. - 선택적으로 Process > Math > Gamma(선택 가능한 미리 보기) 상자로 이동하여 대비를 높입니다.
알림: B&C 패널에 설정된 강도는 두 개의 최소 및 최대 한계 사이에서 조정됩니다. 값 1.0< 낮은 강도 간의 차이를 강조하는 반면 값 1.0> 높은 강도 간의 차이를 강조합니다. 감마 보정은 표시 범위를 찾는 기능으로, 가장 밝은 물체를 포화시키지 않고 가장 희미한 물체를 보여줍니다.
- 필터 처리(Process > Filters)로 이동하여 이미지에서 중앙값, 가우스 필터를 실험합니다(그림 7E).
- 이진 이미지 마스크 만들기.
- Image(이미지)로 이동하여 Adjust > Threshold> 선택합니다. 임계값을 결정하기 위해 가장 간단하게 사용되는 방법은 그림 7F와 같이 강도 수준의 히스토그램 분석에 의존합니다. 드롭 메뉴에서 다른 전역 임계 값 설정 방법으로 재생하십시오 (이 경우 Otsu가 적용됨).
- 히스토그램 패널에서 알려진 픽셀 강도 범위를 수동으로 스크롤하거나 입력하고 실제 셀 영역과 거의 유사한 이미지를 오버레이하는 빨간색 패턴의 변화를 관찰합니다. 재설정 버튼은 오버레이를 제거합니다. 만족스러우면 적용을 클릭하여 이미지의 이진 버전을 생성합니다. Process > Binary > Options를 선택하여 임계값이 있는 이미지가 표시되는 방식과 입자 분석기에서 물체를 식별하는 방법을 제어합니다.
- Process/Binary/Watershed Particles 메뉴 커맨드를 사용하여 임계값 동안 부분적으로 겹치거나 병합된 부분을 나눕니다. Watershed는 종종 1픽셀 두께의 선을 추가하여 정확하게 구분할 수 있습니다. 팽창 또는 침식 작업과 같은 형태학적 작업을 수행하여 과소 또는 과포화 픽셀에서 픽셀을 늘리거나 제거합니다.
참고: 자세한 내용은 메뉴 명령 섹션을 참조하거나 이진 데이터를 처리하기 위한 수학적 형태학을 기반으로 하는 통합 라이브러리인 MorphoLibJ를 참조하십시오. - 정량적 이미지 기능 설명.
- 만족스러운 객체 인식이 이루어지면 Analyze > Analyze Particles(입자 분석)에서 Particle Analyzer(파티클 분석기)를 엽니다. 입자는 픽셀 또는 보정된 측정 단위로 표현되는 크기와 원형도에 따라 제외할 수 있습니다(이미지 > 속성에서 현미경 설정을 기준으로 올바른 배율을 확인하십시오). 모든 항목을 포함하려면 기본값인 0-무한대와 원형도 기본 범위를 0.00 - 1.00(0 = 직선, 1 = 완벽한 원)으로 유지합니다.
- 작은 "노이즈" 픽셀 또는 관심 없는 기능을 필터링하려면 최소 및 최대 범위를 설정합니다. 창 필드에서 Include Holes(구멍 포함), Show(표시), Outline(윤곽선) 및 Display Results(결과 표시) 옵션을 선택합니다. 가장자리에서 제외(Exclude on Edges)는 이미지 테두리에서 감지된 파티클을 버립니다. 관리자에 추가는 입자의 위치 정보를 유지하면서 추가 분석을 위해 얻은 선택 항목을 ROI 관리자에 추가합니다.
참고: "ROI 관리자"에서 자동 분할 기록 출력(분할 셀 병합, 병합된 셀 분할)을 수정할 수 있습니다. Fiji Toolbar의 선택 도구를 사용하여 암세포가 내장된 두 젤 영역 내부의 ROI를 선택하여 면역 침윤을 추정합니다.
- 얻은 값을 스프레드시트로 내보내 그림 7G와 같이 통계 분석을 수행합니다. "결과"는 식별된 번호가 매겨진 윤곽선이 있는 입자 특성과 관련된 데이터 테이블을 나열합니다. "요약"은 이미지 이름, 총 개수 및 전체 이미지에 대한 기타 정보가 포함된 창을 엽니다.
- 측정 분석 > 설정으로 이동하여 다양한 파라미터를 포함합니다.
- 선택적으로 매크로를 기록하여(플러그인 > 매크로 > 기록 선택) 처리 워크플로를 자동화하고 대규모 데이터 세트에 대한 분석 시간을 절약합니다.
- 동일한 처리 루틴을 사용하여 3D 영역에서 종양 세포의 형태학적 변화를 분석하기 위해 동일한 영역에서 녹색 형광 채널을 분석합니다16
- 특정 시간 종말점에서 단일 또는 약리학적 영역의 조합에 각각 노출된 종양 세포를 포함하는 왼쪽 및 오른쪽 겔 영역의 위상차 및 적색/녹색 채널 형광 현미경 사진을 획득합니다.
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Representative Results
종양 면역 침윤은 숙주 항종양 반응의 파라미터이다. 종양은 침윤 백혈구의 구성, 밀도, 위치 및 기능적 상태에서 이질적이며, 암세포와의 상호 작용은 질병 경과 및 치료에 대한 반응을 예측하기 위해 임상적으로 관련된 정보의 기초가 될 수 있습니다. 이러한 의미에서 미세유체 기술은 종양의 면역 조직을 탐색하고 항암 요법에 대한 반응을 모니터링하기 위한 보완적이고 특권적인 체외 도구로 사용될 수 있습니다. 미세유체 분석, 생세포 이미징 및 추적 소프트웨어의 결합은 면역 세포가 다양한 맥락에서 이동 패턴을 조정하는 방법을 정량화하기 위한 신뢰할 수 있는 정량화 방법을 확립할 수 있습니다. 이 장에서는 표준 소프트 리소그래피 절차로 실현된 임시 미세 유체 장치에서 면역 및 표적 암세포의 다목적 2D 또는 3D 공동 배양을 설정하는 단계를 보고했습니다. 섹션 1에서는 부착성(MDA-MB-231 암세포)과 비부착성(PBMC) 집단 간의 화학적 및 물리적 접촉을 허용하기 위해 미세유체 장치를 사용했습니다. 일부 화학요법제(예를 들어, 다른 것들 중의 안트라사이클린)는 악성 세포의 "면역원성" 아폽토시스를 유도할 수 있고, 따라서 면역적격 숙주에서 그의 가시성을 향상시킨다. 암 면역원성 세포 사멸(ICD)은 죽어가는 세포에 의해 전달되는 막 결합 및 가용성 신호의 방출을 특징으로 하며, 면역 세포에 대한 경보 역할을 합니다. ICD 반응의 정량적 검증을 제공하기 위해 우리는 백혈구가 적절하게 구축된 미세채널 브리지를 통해 표적 세포를 향해 이동할 수 있는 미세유체 플랫폼에서 수집된 데이터를 사용합니다. 타임랩스 기록은 건강한 기증자(WT, 야생형)의 PBMC를 안트라사이클린 DOXO로 전처리하거나 전처리하지 않은 인간 MDA-MB-231 유방암 세포와 함께 로드한 후 수행되었습니다. 현미경 사진은 24시간 및 48시간의 두 연속 시간 간격 동안 2분마다 생성되었습니다. 영화 S1 0-24시간 간격). 죽어가는(DOXO 처리) 또는 살아있는(PBS 처리) 암세포로 챌린지된 개별 PBMC의 추적 분석은 다음에서 볼 수 있듯이 Trackmate 플러그인을 사용하여 수행되었습니다. 그림 6A (왼쪽 패널). 관련 chemotaxis 값 및 마이그레이션 플롯은 에 자세히 설명된 대로 Chemotaxis 및 Migration Tool을 사용하여 자동으로 생성되었습니다.62. 세포 궤적은 모두 시간 24 h에서 (x, y) = 0으로 외삽되었습니다. 결과는 DOXO 또는 PBS에 노출된 유방암 세포와 함께 로드될 때 면역 세포의 다른 이동 프로필을 나타냅니다. PBMC가 세포사멸 암세포와 마주했을 때, 그들은 죽어가는/죽은 세포(그러나 처리되지 않은 세포는 살지 않음)를 향해 마이크로채널을 교차했습니다. 마이그레이션 X/Y 스파이더 및 장미 플롯(왼쪽 패널에 표시됨) 그림 6B-C, 면역 역학의 차이에 대한 면역원성 유도제 제제의 영향을 강조하기 위해 매핑되고 비교되었습니다. 로즈 플롯은 PBMC가 대조군 실험에서 주로 거의 모든 방향으로 이동했음을 보여주며, 무시할 수 있는 부분만이 증식하는 암세포에 의해 생성된 구배로 안내됩니다. 반대로, 개별 세포의 경로는 세포사멸 유방암 세포의 방향(음의 x 방향)을 따라 강한 편향 이동을 강조합니다. DOXO-처리된 또는 PBS-처리된 암세포로의 유도된 면역 세포 이동을 평가하기 위해, 다음을 포함하는 몇 가지 화학주성 파라미터가 계산된다: a) 질량 중심 (모든 종점의 공간 평균점); b) 방향성; c) 전방 이동 지수 (즉, 우리의 경우, 표적 종양 부위를 향한 관심 방향으로의 평균 세포 변위). 후자의 값은 주어진 화학 주성 자극 방향으로 이동하는 세포의 효율성 측정을 나타냅니다. 좌측 챔버에 도달 한 후, 24-48 h에 걸쳐 밀도가 증가한 백혈구의 일부가 DOXO 처리 된 MDA-MB-231과 장기간 (>60 분) 접촉을 나타냈다. PBMC는 살아있는 암세포와의 장기적이고 지속적인 상호 작용을 대량으로 이동하고 참여하지 못합니다(PBMC에 접근하는 대표적인 현미경 사진에서 볼 수 있듯이). 그림 6A, 오른쪽). 종양-면역 상호작용의 차이를 정량화하기 위해 종양 영역을 "핫스팟"이라고 하는 직경 20-80미크론 범위의 고정된 원으로 묘사했습니다. 대표적인 FOV의 정량화 및 분석은 다음과 같습니다. 그림 6 (오른쪽 패널, B-C).
섹션 2에서는 후성유전학적 약물 32(DAC/IFN 대 IFN 단독)의 항암 조합에 대한 반응으로 면역 세포의 모집을 정량화하기 위해 새로운3D 면역 적격 종양 모델을 설명하여 A375 흑색종 세포의 두 가지 다른 치료 조건을 동시에 비교할 수 있습니다. 따라서, PKH67 녹색 형광 염료로 표지된 A375M 흑색종 세포는 DAC 및/또는 IFN의 존재 하에 매트리겔 매트릭스에 각 겔 챔버에 매립된 반면, PKH26 적색 표지 PBMC는 시작점에서 중앙 유체 챔버에 균질하게 분포되었습니다(그림 7A). 우리는 PBMC를 유인하는 능력에 대해 3D 매트릭스에서 두 종양 덩어리를 동시에 비교했습니다. 48시간 및 72시간에서 PBMC는 그림 7B에서 관찰된 바와 같이 우측 마이크로채널로 대량으로 안내됩니다.
IFN 처리가 아닌 DAC/IFN 처리된 흑색종 부위를 포함하는 겔 매트릭스를 향한 PBMC의 우선적인 귀환이 명확하게 관찰된 반면, 단일 처리에 노출된 A375 세포(왼쪽 칩 측면)에 대해 불량한 이동률이 보였습니다. 경쟁 설정은 다양한 암 생물학 표현형(예: 약물 내성 대 공격적, 원발성 또는 전이성(예: A375P 대 A375M 흑색종 세포), 반응자 대 비반응 자)을 조사하는 데 적용할 수 있습니다. 겔 챔버는 악성 세포와 내피 세포, 면역 세포 및 섬유아세포와 같은 다수의 비암성 종양 관련 세포의 복잡한 공동 배양으로 구성될 수 있다(33)는 TME-수준의 약물 반응을 특성화한다. 암세포의 유사분열 및 세포사멸의 사건은 살아있는 염료(33)로 염색함으로써 모니터링할 수 있다. 3D 미세유체 장치 상의 면역염색 절차는 공초점 현미경(confocal microscopy)에 의해 종양 부위에서 침윤된 면역 세포의 활성화 상태를 평가하기 위해 적용될 수 있다35. 이러한 의미에서 이러한 3D 미세유체 시스템은 복잡한 종양 구조와 다세포 상호작용을 모방할 수 있으므로 보다 신뢰할 수 있는 전임상 약물 테스트를 위한 귀중한 플랫폼입니다.
그림 1. 2D 종양 면역 공동 배양을 조립하기 위한 미세유체 장치의 평면계. (A) 단일 현미경 슬라이드에 조립된 3개의 칩의 실제 현미경 사진. 저장소는 로딩 순서에 따라 번호가 매겨지며 범례에 나열된 해당 배양실로 색상으로 구분됩니다. 스케일바, 6mm. (B) 마이크로홈으로 연결된 3개의 주요 세포 배양 영역으로 구성된 칩의 3D CAD. C) 암세포에 맞는 치수 및 PBMCs 크기를 보여주는 좁은 미세 홈 브리지의 세부 사항. D-E) 가시광선 현미경 사진은 타임랩스 시작 전에 획득되었으며, 좌측과 중간 챔버에서 각각 암세포와 PBMC의 분포를 보여줍니다. 스케일바, 500μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 시계열 이미지에서 면역 반점의 위치를 파악하기 위한 Trackmate 분석 파이프라인. A) 상단 패널: Trackmate 이미지 보정 메뉴의 스크린샷. 하단 패널: 피지 "이미지 속성 메뉴"는 시간 및 공간 단위를 설정합니다. B) 상단 패널: Trackmate "스팟 감지" 메뉴의 스크린샷. 하단 패널: "Threshold"의 다른 값이 적용된 출력 이미지입니다. C) 상단 패널: 일부 필터를 보여주는 Trackmate "스팟 필터링" 메뉴의 스크린샷. 하부 패널: 중간 챔버에서 X를 따라 위치별로 필터링된 면역 반점을 묘사하는 예시적인 타임랩스 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 시계열 이미지 시퀀스에서 면역 트랙을 재구성하기 위한 Trackmate 분석 파이프라인입니다. A-C) 트랙 구축, 트랙 필터링 및 최종 데이터 내보내기를 위한 Trackmate 메뉴의 스크린샷. D) 연결 감지기 설정을 변경하는 사전 처리된 타임랩스 이미지에서 생성된 트랙의 예. E) 종양 세포 경계의 검출로부터 파생된 거짓 추적 및 불량 링크의 예. F) 트랙은 결과의 파일 .txt에서 행을 선택하여 녹색으로 강조 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. 3D 면역 적격 종양 칩에 대한 개략도. A) 미세구조화된 실리콘 마스터의 예. PDMS용 스탬프는 전자빔 및 광학 리소그래피가 장착된 클린룸 시설에서 SU-8 네거티브 레지스트로 패터닝되었습니다. B) PDMS 복제본은 표준 소프트 리소그래피 방법으로 제작되었습니다. 중앙 유닛은 패널 D에 묘사된 칩의 3D 렌더링으로 그려진 것과 같이 색상이 지정된 챔버를 가지고 있습니다. C) 하이드로겔 용액 포획에 적합한 마이크로필러 어레이의 주사 전자 현미경(SEM) 확대도. D) 마이크로 홈과 로딩 웰로 연결된 챔버를 보여주는 3D CAD. 점선 상자는 세부 사항의 SEM 사진(패널 C 및 E)을 참조합니다. E) 10μm 높이의 연결 마이크로홈의 SEM 사진. F) 미세 구조의 치수를 묘사하는 2D CAD 레이아웃. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. 3D 공동 배양을 조립하기 위한 주요 로딩 프로토콜 단계의 개략적인 워크플로. A) 상부 패널: 각 겔 측면 영역에 Matrigel 용액의 주입 단계 개략도. 하부 패널: 로딩 단계 동안 채널을 따라 젤 전면 전진을 보여주는 칩의 실제 사진. B) Matrigel 중합 단계의 개략도. 하부 패널: 겔화 단계 후에 형성된 겔-공기 계면의 위상차 현미경 보기. 스케일바, 100μm. C) 상부 패널: 프로토콜에 사용된 예시적인 부피로 세포 및 배지의 로딩을 묘사한 도면. 하단 패널: 0h에서 조립된 공동 배양의 4X 위상차 이미지가 표시됩니다. 스케일바, 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6. 24-48시간의 시간 창에서 죽어가는/살아있는 종양 챔버에 대한 PBMC의 이동 프로필 및 상호 작용 행동 분석. 왼쪽 패널. A) Trackmate가 추출한 면역 색상 트랙으로 오버레이된 타임랩스 사전 처리된 이미지의 스크린샷. 면역 경로는 중간 챔버에서 24 내지 48 시간 간격으로 지시된 실험 조건에서 단일 FOV에 의해 얻어진다. B-C) 두 가지 다른 조건에서 배양된 PBMC의 대표적인 이동 추적 및 장미 플롯(n = 1550 PBMC 대 DOXO 처리된 암세포, DOXO+ 또는 n = 1434 PBMC 대 대조군 암세포, DOXO-). xy 플롯 내의 각 라인은 단일 PBMC 궤적을 나타내고 각 원은 초기 위치에 대한 단일 셀의 최종 위치를 나타냅니다. 시작점은 좌표 변환을 사용하여 (0,0)으로 설정됩니다. 세포 이동의 질량 중심의 좌표 및 변위는 표시된 실험 조건에서 표시된다. 질량 중심 좌표와 변위(X 및 Y 성분에 대한 평균 유클리드 거리로 계산됨)는 세포 그룹이 주로 이동한 평균 방향과 조건 그룹에서 전체 세포 이동의 크기를 나타냅니다. 파란색 및 녹색 선은 각각 임계값(100μm)보다 크거나 작은 유클리드 거리 값으로 개별 트랙을 표시합니다. D) 셀 트랙에 의해 추출된 수치 데이터의 체계. E-F) 각각 방향성을 묘사하는 Box & Whiskers 플롯 (p<0,0001 Unpaired t test with Welch's correction) 및 FMI (p<0,0001 Unpaired t test with Welch's correction). 상자의 수평선은 중앙값을 나타냅니다. FMI 값은 각 조건 그룹의 모든 세포 트랙에 대한 평균입니다. 오른쪽 패널. A) PBMC와 DOXO 또는 PBS 처리 암세포 간의 차등 상호 작용을 보여주는 Trackmate 추출 ROI의 스크린샷. B) DOXO 치료 또는 대조군 MDA-MB-231 암세포 주변의 PBMC의 시간 밀도. 각 조건에 대해 암세포 주변의 선택된 ROI에 존재하는 PBMC의 수. 보고된 값은 단일 타임랩스 FOV에서 선택한 9개 이상의 ROI에 대한 평균입니다. 암 핫스팟은 ROI(직경 80μm)로 정의됩니다. 해당 밀도 히트맵이 표시됩니다. 점은 표시된 시점에서 9개의 암 핫스팟에 대해 계산된 평균 세포 수를 나타냅니다. C) 각 실험군에 대한 접촉 횟수(분)의 분포. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 경쟁력 있는 3D 면역 적격 흑색종 온칩 모델에서 DAC와 IFN 약물 조합에 대한 반응으로 PBMC의 우선 모집. A) 미세 유체 장치의 중앙 챔버에 초기에 로드된 PBMC의 분포. 현미경 사진은 0-72시간 간격 동안 EVOS-FL 형광 현미경으로 획득합니다. 적색 형광(PKH67 표지 세포)은 건강한 기증자의 PBMC를 나타냅니다. 단일 또는 이중 조합 처리를 포함하는 Matrigel에 포매된 PKH67 표지된(녹색) 인간 흑색종 세포를 측면 챔버에 도말했습니다. B) 왼쪽이 A375 셀과 IFN 대 오른쪽이 A375 및 DAC/IFN. 형광 이미지는 공동 배양 72시간에서 나타났습니다. 단종된 노란색 상자는 A375와 DAC/IFN 측에서 눈에 띄게 대규모 모집을 나타냅니다. C) PBMC는 IFN 챔버 와 DAC +IFN 챔버의 4가지 다른 ROI를 계산합니다. 히스토그램은 세포 수 +/- S.D.를 나타냅니다. 각 ROI의 히트맵 열거형 값입니다. 스케일바, 200μm. D-G) 단일 채널 형광 이미지에 적용된 겔 매트릭스에서 침윤된 PBMC의 분할 및 정량화 단계 개략도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일. 미세 가공 프로토콜 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 동영상 1. 2D 종양 면역 온칩 공동 배양에서 타임랩스 시퀀스. 현미경 사진은 표준 세포 배양 인큐베이터에 배치된 소형 현미경을 사용하여 0-24시간의 시간 간격으로 2분마다 획득되었습니다. 왼쪽 패널. MDA-MB-231 대조군 유방암 세포로 도금된 건강한 기증자(WT, 야생형)의 PBMC 동영상. 오른쪽 패널. MDA-MB-231 DOXO 처리 암세포가 로드된 칩 챔버로 PBMC WT의 대규모 이동 동영상. 2D 칩 레이아웃은 프로토콜의 섹션 1에 자세히 설명되어 있으며 그림 1에 나와 있습니다. 이 영화를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
설명된 방법은 보다 관련성이 높은 시험관 내 모델의 채택으로 이점을 얻을 수 있는 종양 면역학 분야의 두 가지 중요한 측면을 조정 가능한 복잡성으로 요약하기 위한 일반적인 접근 방식을 설계하려고 합니다. 첫 번째는 종양 세포 집단 측면과 관련이 있으며, 단일 세포 특성을 다루면 치료에 대한 내성, 전이에 대한 성향, 줄기 세포 및 분화 등급을 포함하여 이질성과 상관관계가 있는 생물학적 및 임상적 중요성에 대한 더 나은 설명으로 이어질 수 있습니다. 이야기의 다른 측면은 질병의 특성과 치료63, 특히 면역 요법에 대한 개인의 반응을 심오하게 형성할 수 있는 비암성 구성 요소(면역 및 기질 세포, 혈관) 및 화학적/물리적 환경(ECM 구성 요소, 케모카인 및 기타 용해성 인자 방출)을 포함하는 TME로 대표됩니다. 설명된 접근 방식을 다른 연구 분야로 내보내려면 새로운 모델의 개발 및 채택으로 인한 한계와 과제에 대한 깊은 이해가 필요합니다.
엔지니어링 모델링에 적용된 격언을 인용하면("시스템이 아닌 문제를 모델링하라"), 전체 실험에서 생물학적으로 적절하고 안정적인 온칩 모델을 만드는 데 필요한 (세포, 물리적, 화학적) 구성 요소 및 조건의 최소 수인 최적화가 필요합니다. 따라서 세포 유형/미세 환경/실험 설정의 모든 조합은 단일 실험과 세션마다 정확하게 선택, 평가 및 지속적으로 모니터링되어야 합니다. 이러한 검사에는 프로토콜 섹션에서 언급했듯이 습도 조건 또는 광원의 가열에 의해 수정될 수 있는 미세유체 장치의 부피, 제어되지 않은 액체 드리프트를 유발하는 단계의 가능한 움직임 및 비평면성과 같은 매개변수의 엄격한 제어뿐만 아니라 세포 상태, 생존력 및 표현형 특성화에 대한 일부 종말점 검증도 포함됩니다. 한 가지 중요한 단계는 관류 시스템을 사용하여 혈관화된(유사한) 구조를 생성하거나 온칩 약물 전달(33)을 위한 결정에 관한 것인데, 이는 복잡성 증가, 세포 배양 기간 및 면역 세포와 같은 부유 세포의 존재 하에서 화학적 인자의 조절 측면에서 실험에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
다음에서는 실험 환경과 가장 최근의 문헌에서 발견되는 주요 중요하고 관련성 있는 문제를 요약합니다.
ECM 및 화학적 경관 정의
TME는 또한 주변 63, 66의 기계적특성(64,65) 에 의해서도 깊은 영향을 받는다. 이러한 이유로, 배양 매트릭스의 선택은 특히 특정 조건에서 매트릭스 자체에서 방출되는 신호에 반응할 수 있는 면역 세포를 다룰 때 기본입니다. 향후 미래에는 새로운 재료 및 하이드로겔(다른 매개변수 중에서 다양한 강성, 다공성, 용해성 인자의 존재 등을 특징으로 함)의 설계 및 개발에서 관련 발전이 예상되며, 이는 오늘날 다른 조직, 내일 다른 환자의 특이성을 모방하여 점점 더 정교하고 제어 가능한 ECM을 가능하게 합니다. 다른 한편으로는 ECM의 다양한 세포 집단에 의해 유도된 변화를 모니터링하고 이 정보를 동적 및 표현형 분석에 포함시키기 위한 전략을 정의하는 것도 중요합니다.
데이터 관리
임상 워크플로에서 종양 온칩 기술을 배포하는 경로는 여러 방향에서 진행되고 있는 거대한 실험 작업의 이점을 누릴 것입니다. 많은 체외 기술과 마찬가지로 장기 온 칩 모델은 적어도 잠재적으로 높은 처리량 / 높은 함량 측정을 수행하는 데 기능적입니다. 양성 및 음성 대조군을 포함한 실험 조건과 기술적/생물학적 복제의 병렬화는 동일한 플레이트에 여러 칩을 통합함으로써 가능합니다. 정량적 처리량의 증가는 면역 요법을 위한 빠른 약물 또는 유전자 스크리닝 파이프라인에서 이러한 시스템을 번역하고 검증하는 데 중요한 역할을 합니다. 실제로, 몇몇 회사들은 이미 멀티웰 포맷으로 플랫폼을 개발했으며, 많은 수의 장치들을 동시에 모니터링할 수 있도록 다양한 이미징 접근법들이 테스트되고 있다14. 위에서 설명한 프로토콜에서 우리는 표준 현미경 멀티 슬라이드 트레이를 사용하여 최대 12개의 실험 조건을 병렬로 시각화할 수 있는 최대 3개의 칩을 할당하는 현미경 슬라이드를 사용했습니다. 이 설정은 수동 피펫팅과 호환되며 미세 가공 시설에서 수행되는 맞춤형 지향 조정에 적합합니다. 반대로, 강력한 병렬화가 필요한 경우(다중 스크리닝 테스트 및 제어), 더 높은 수준의 자동화(즉, 피펫팅 로봇, 플라스틱 멀티웰 사용)를 설정하기 위한 설정 최적화가 필요합니다.
실험을 설계할 때 공간 해상도와 시간 해상도 간의 균형을 고려해야 합니다.
고함량 현미경으로 생성되는 방대한 양의 데이터는 저장, 전송 및 분석 측면에서 제한 요소를 구성합니다. 이러한 문제는 기계 학습 도구 및 하드웨어/소프트웨어 리소스를 구현하는 전산 접근 방식으로 해결되고 있으며, 이는 치료 전략을 선택할 때 온칩/인실리코 실험(67,68)을 연결할 수 있는 미래 가능성을 촉진할 수 있으며 이는 야심적이지만 연기할 수 없는 기회를 나타냅니다.
형광 이미징을 넘어서
염료 또는 리포터 유전자에 의한 형광 표지는 높은 특이성으로 인해 공동 배양 조건에서 다양한 세포 집단을 식별하고 높은 SNR로 분자 특성을 분해하는 황금 표준 방법을 나타냅니다. OOC 모델에서 이 접근법은 일반적으로 참조로 사용되며 특히 이질적인 종양 온 칩 미세 환경에서 침윤 및 상호 작용하는 면역 세포의 표현형을 특성화하는 데 유용할 수 있습니다.
그럼에도 불구하고, 형광단, 힘든 염색 절차 및 조명 루틴에 의해 유도된 효과가 모니터링되어야 하고 최소화되어야 한다는 증거가 증가하고 있다69 왜냐하면 세포 거동 및 상태에 깊은 영향을 미칠 수 있기 때문이다70,71. 이 위험은 면역 세포72,73과 같은 취약한 시스템에 특히 해당됩니다. 광독성 반응은 높은 공간 및 시간 해상도에서 모니터링할 때 살아있는 세포의 시간적 창 획득을 정의하는 데 한계를 도입할 수 있습니다. 또한, 다양한 면역 하위 집단의 풍부함은 현미경에서 일반적으로 사용할 수 있는 필터의 수가 제한되어 있다는 점을 고려할 때 형광 염색만으로 이들을 구별하는 것을 불가능하게 만듭니다.
이 문제를 해결하기 위해, 도구적 관점에서, 홀로그램(56) 또는 초분광 현미경(57)과 같은 새로운 라벨 프리 현미경(74) 기술이 현재 무대에 등장하고 있다. 형광을 넘어 고급 세포 공정 분류 전략을 약속하며 민감한 시료를 연구하는 데 특히 유용할 수 있습니다. 데이터 분석의 관점에서, 딥 러닝 알고리즘(75)(형광 이미지 데이터 세트에 의해 훈련됨)을 기반으로 하는 진보된 계산 접근법은 소위 "인실리코 라벨링(in silico labeling)"76,77)을 수행하기 위한 문을 여는 것이다. 이들은 명시야 이미지(78)로부터 형광 마커를 예측하는 데 성공적으로 적용되어 세포를 염색하지 않고 표지된 이미지를 생성함으로써 명시야 현미경 정보 능력을 증가시킨다. 이 전략은 다른 마커에 대한 시간과 형광 채널을 절약하는 데에도 유용할 수 있습니다. 우리는 OOC 커뮤니티가 세포 집단 상호 작용에 대한 덜 침습적인 연구를 가능하게 하는 이러한 새로운 기술의 혜택을 받을 것이라고 믿습니다.
데이터 분석
면역 암세포와 표적 암세포 사이의 상호 작용 메커니즘은 세포 이동 추적을 통해 조사 할 수 있습니다28,79. 복잡하고 이질적인 공동 배양에서의 타임랩스 추적 실험은 세포 이동 패턴, 형태학적 및 상태 변화, 포괄적인 계통 정보를 추출하는 데 매우 중요합니다. 수동 분석을 수행하는 것은 실제로 세포가 거의 없는 짧은 시퀀스에만 가능하며 처리량이 높고 체계적인 실험에는 적합하지 않습니다. 결과적으로, 완전히 또는 부분적으로 자동화된 세포 추적을 위한 계산 도구의 개발은 이미지 분석에서 중요한 연구 분야이다24. 일반적으로 기존의 세포 추적은 분할 작업을 올바르게 수행하기 위해 상대적으로 높은 빈도의 샘플링과 공간 분해능이 필요하며, 이는 많은 실험 조건에서 어려울 수 있습니다. 세포를 위치파악하기 위해, 이 프로토콜에 제시된 바와 같이 이용 가능한 오픈 액세스 세그멘테이션 및 추적 도구(예를 들어, ImageJ 소프트웨어(22)) 또는 전용 독점 소프트웨어가 있다. 대규모 연구에서 우리는 로마의 Tor Vergata 대학에서 개발한 Cell Hunter16,31이라는 독점 소프트웨어를 적용하여 다중 집단 맥락에서 암과 면역 세포를 완전 자동 방식으로 구별했습니다. 머신 러닝 및 신경망 접근법(80,81,82)에 기초한 맞춤형 솔루션들은 SNR 개선으로부터 중요한 획득 파라미터 또는 세그멘테이션 단계들을 관리하는 것에 이르기까지, 현미경 소프트웨어 패키지들(83)에서 오늘날 구현되기 시작한다. 기계 학습은 미세 환경 요인에 대한 생물학적 반응을 특성화하기 위해 일반적인 세포 패턴(예: 모션 스타일)을 인식하는 데 활용될 수 있습니다.
Comes et al.41에서는 사전 훈련된 딥 러닝 컨볼루션 신경망 아키텍처를 적용하여 면역 세포의 운동성을 "마커"로 사용하여 암세포가 약물 치료에 노출되었는지 여부를 분류했으며, 마이크로 디바이스의 콜라겐 매트릭스에서 유방암 세포와 PBMC의 공동 배양에 대한 시간 경과 데이터에서 추적했습니다. 33에 설명 된대로.
Single-cell omics 분석법 및 온톨로지 개발
우리는 단세포 오믹스 기술(84)(예를 들어, 단백질체학, 대사체학, 유전체학)과 온칩 방법 사이의 전략적 제휴의 필요성을 지적한다: 기능적 동적 정보에 결합된 분자 세부 특성화는 기본 메커니즘 및 임상 설명의 이해를 향상시킬 수 있다. 이 경우 두 세계를 연결하는 새로운 도구는시작 85입니다. 첫 번째 과제는 종양 면역학 칩(22)에 직접 단일 세포 오믹스 접근법을 구현하는 것입니다. 또한, 장기 칩은 게놈 및 단백질체학 분석에 의해 확인된 잠재적 표적을 테스트하기 위한 플랫폼으로 활용될 수 있습니다(86,87). 두 번째 연결 도구는, 여전히 많이 빠져 있지만, 측정된 시스템 결과(88,89)에 주석을 달고 저장하는 구조화되고 표준화된 방법이다. 그러나 이것이 바로 세포 정량적 결과와 측정된 특성에 대한 체계적인 데이터베이스를 구축하고, 이를 채굴하고, 추론하고, 고유한 생물학적 정보와 연관시키기 위해 미래에 필요한 것입니다. 한마디로 이기종 실험 데이터셋의 표준화와 체계적인 분석의 필요성은 온톨로지 프레임워크를 요구한다.
모델 개인화
장기 온칩 기술은 개인화(personalization)12에 적합한데, 그 이유는 단일 환자(또는 환자 부류)의 세포 및 조직이 통제된 조건 하에서 장치에서 사용될 수 있고, 임상적으로 관련된 판독값을 이끌어 낼 수 있고, 치료 또는 예방 전략을 알리는 데 유용하기 때문이다. 몇 가지 예가 문헌90에 나타나기 시작했습니다. 물론, 종양-온-칩 모델의 경우, 이 도전은 해결해야 할 몇 가지 기술적, 과학적 질문(36 )을 제기한다(산소 농도, 사이토카인 구배 등과 같은 TME 특성 제어와 같은). 중요한 것은 종양학 및 종양 면역학 요법을 보다 효과적으로 만드는 동시에 각 환자에 대한 유해한 영향을 줄이는 전망이 의료 자원의 최적화와 같은 삶의 질 관점에서 매력적이라는 것입니다.
결론적으로, 이 분야는 진정한 학제 간 분야이므로 연구자, 임상의, 산업뿐만 아니라 다른 분야(공학, 생물학, 데이터 과학, 의학, 화학) 간의 공통 언어와 공유 목표를 수립하는 데 많은 노력이필요합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다. AS는 Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 # 18418) 및 Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273)의 지원을 받고 있습니다. GS 및 FM은 이탈리아 암 연구 협회(AIRC) 번호 21366에서 GS의 지원을 받습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture materials | |||
| 50 mL tubes | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS430828 | centrifuge tubes |
| 5-aza-2'-deoxycytidine DAC | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | A3656 | DNA-hypomethylating agent |
| 6-well plates | Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO | CLS3506 | culture dishes |
| 75 cm2 cell culture treated flask | Corning, New York, NY | 430641U | culture flasks |
| A365M | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | CVCL_B222 |
human melanoma cell line |
| Doxorubicin hydrochloride | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | D1515 | anthracycline antibiotic |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM0728L | Culture medium for SK-MEL-28 cells |
| Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB4004L | saline buffer solution |
| Fetal Bovine Serum | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECS0180L | ancillary for cell culture |
| Ficoll | GE-Heathcare | 17-1440-02 | separation of mononuclear cells from human blood. |
| hemocytometer | Neubauer | Cell counter | |
| Heparinized vials | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Vials for venous blood collection | |
| interferon alpha-2b | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | SRP4595 | recombinant human cytokine |
| L-Glutamine 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3000D | ancillary for cell culture |
| Liquid nitrogen | |||
| Lympholyte cell separation media | Cedarlane Labs, Burlington, Canada | Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation | |
| Lymphoprep | Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway | ||
| Matrigel | Corning, New York, NY | 354230 | growth factor reduced basement membrane matrix |
| MDA-MB-231 | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA | HTB-26 | human breast cancer cell line |
| Penicillin/ Streptomycin 100X | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECB3001D | ancillary for cell culture |
| Pipet aid | Drummond Scientific Co., Broomall, PA | 4-000-201 | Liquid handling |
| PKH26 Red Fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH26GL | red fluorescent cell dye |
| PKH67 Green fluorescent cell linker | Millipore-Sigma; St. Louis, MO | PKH67GL | green fluorescent cell dye |
| RPMI-1640 | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM2001L | Culture medium for MDA-MB-231 cells |
| serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) | Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO | CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 | Liquid handling |
| sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 | tips for micropipette |
| Timer | |||
| Trypan Blue solution | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 15250061 | cell stain to assess cell viability |
| Trypsin | EuroClone Spa, Milan, Italy | ECM0920D | dissociation reagent for adherent cells |
| Cell culture equipment | |||
| EVOS-FL fluorescence microscope | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | Fluorescent microscope for living cells | |
| Humified cell culture incubator | Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA | 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 | Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2 |
| Juli Microscope | Nanoentek | ||
| Laboratory refrigerator (4 °C) | FDM | ||
| Laboratory Safety Cabinet (Class II) | Steril VBH 72 MP | Laminar flow hood | |
| Optical microscope | Zeiss | ||
| Refrigerable centrifuge | Beckman Coulter | ||
| Thermostatic bath | |||
| Microfabrication materials | |||
| 3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) | Sigma Aldrich | A3648 | silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip |
| Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ | MB W&A, Germany | optical masks for photolithography | |
| Glass coverslip, D 263 M Schott glass, (170 ± 5 µm) | Ibidi, Germany | 10812 | |
| Hydrogen Peroxide solution 30% | Carlo Erba Reagents | 412081 | reagents for piranha solution |
| Methyl isobutyl ketone | Carlo Erba Reagents | 461945 | PMMA e-beam resist developer |
| Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm | Sail Brand | 7101 | substrates for bonding chips |
| Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm | Tedpella | dermal biopsy punches for chip reservoirs | |
| PMMA 950 kDa | Allresist,Germany | AR-P. 679.04 | Positive electronic resists for patterning optical masks |
| Polymer untreated coverslips | Ibidi, Germany | 10813 | substrates for bonding chips |
| Prime CZ-Si Wafer, 4”, (100), Boron Doped | Gambetti Xenologia Srl, Italy | 30255 | |
| Propan-2-ol | Carlo Erba Reagents | 415238 | |
| Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) | Sigma Aldrich | 484431-4L | SU-8 resists developer |
| SU-8 3005 | Micro resist technology,Germany | C1.02.003-0001 | Negative Photoresists |
| SU-8 3050 | Micro resist technology,Germany | C1.02.003-0005 | Negative Photoresists |
| Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm | Tedpella | 15111-40, 15111-60, 15111-80 | dermal biopsy punches for chip reservoirs |
| Sulfuric acid 96% | Carlo Erba Reagents | 410381 | reagents for piranha solution |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit | Dowsil, Dow Corning | 11-3184-01 | Silicone Elastomer (PDMS) |
| Trimethylchlorosilane (TMCS) | Sigma Aldrich | 92360-100ML | silanizing agent for SU-8 patterned masters |
| Microfabrication equipment | |||
| 100 kV e-beam litography | Raith-Vistec EBPG 5HR | ||
| hotplate | |||
| Optical litography system | EV-420 double-face contact mask-aligner | ||
| Reactive Ion Etching system | Oxford plasmalab 80 plus system | ||
| Vacuum dessicator |
References
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