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Immunology and Infection

Modelos de Co-Cultura Microfluídica para Dissecar a Resposta Imune em Microambientes Tumorais in vitro

Published: April 30, 2021 doi: 10.3791/61895
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, 3,4, 1
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

Summary

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única, a biologia do câncer requer novas ferramentas in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado. Descrevemos protocolos para explorar co-culturas microfluídicas imunes a tumores em cenários 2D e 3D, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico de funções celulares.

Abstract

Modelos complexos de doenças exigem ferramentas de ponta capazes de fornecer insights fisiologicamente e patologicamente relevantes e acionáveis e desvendar processos invisíveis de outra forma. Ensaios avançados de células imitando de perto o cenário in vivo estão se estabelecendo como novas maneiras de visualizar e medir a interação bidirecional tumor-hospedeiro que influencia a progressão do câncer. Descrevemos aqui dois protocolos versáteis para recriar co-culturas 2D e 3D altamente controláveis em microdispositivos, mimetizando a complexidade do microambiente tumoral (TME), sob imunovigilância natural e induzida por terapia. Na seção 1, um cenário experimental é fornecido para monitorar o crosstalk entre células tumorais aderentes e populações imunes flutuantes, por microscopia de lapso de tempo de campo brilhante. Como cenário aplicativo, analisamos os efeitos de tratamentos antineoplásicos, como os chamados indutores imunogênicos de morte de células cancerígenas, sobre o recrutamento e ativação de células imunes. Na seção 2, microambientes 3D imunes a tumores são montados em um layout competitivo. A infiltração imune diferencial é monitorada por instantâneos de fluorescência até 72 h, para avaliar estratégias terapêuticas combinadas. Em ambos os cenários, as etapas de processamento de imagem são ilustradas para extrair uma infinidade de parâmetros de células imunes (por exemplo, migração e interação de células imunes, resposta a agentes terapêuticos). Esses métodos simples e poderosos podem ser adaptados para simular a complexidade da EMT, abrangendo a heterogeneidade e plasticidade dos subtipos de câncer, estroma e células imunes, bem como suas interações recíprocas como impulsionadores da evolução do câncer. A conformidade dessas tecnologias em rápida evolução com imagens de alto conteúdo de células vivas pode levar à geração de grandes conjuntos de dados informativos, trazendo novos desafios. De fato, o triângulo "co-culturas/microscopia/análise avançada de dados" estabelece o caminho para uma parametrização precisa do problema que pode auxiliar protocolos terapêuticos feitos sob medida. Esperamos que a integração futura do on-a-chip imune ao câncer com a inteligência artificial para processamento de alto rendimento sinergia um grande passo à frente na alavancagem dos recursos como ferramentas preditivas e pré-clínicas para oncologia de precisão e personalizada.

Introduction

A evolução de diferentes ramos da medicina como disciplinas experimentais tem dependido da capacidade de manipular a população celular e as funções dos órgãos sob condições controladas1. Tal habilidade tem suas raízes na disponibilidade de modelos mensuráveis capazes de recapitular processos que acontecem em nosso corpo.

Na era da imunoterapia e do perfil genômico de célula única2, a biologia do câncer precisa aproveitar modelos emergentes in vitro e computacionais para investigar a interface tumor-imune em um contexto espaço-temporal adequado2,3.

O microambiente tumoral4 (TME) é um tecido complexo onde as células cancerosas interagem continuamente e co-evoluem dinamicamente com os outros componentes celulares (imunes, estromais e endoteliais) e não celulares (matriz extracelular, MEC). A natureza dinâmica desse cenário complexo dita se as células imunes jogam como amigas ou inimigas das células malignas, afetando fortemente tanto a progressão da doença quanto a resposta à terapia. Atualmente, grandes esforços de onco-imunologistas, bioinformáticos e especialistas em biologia de sistemas estão convergindo para abordar o significado clínico da heterogeneidade docâncer5,6, seja no espaço (isto é, em regiões tumorais distintas) e no tempo (isto é, em estágios distintos de progressão tumoral)5,6, e para caracterizar o fenótipo e a função do câncer e das células imunes em nível unicelular. Como exemplo dessa sinergia, técnicas avançadas de visão computacional são atualmente utilizadas rotineiramente para mapeamento espacial do infiltrado imune em amostras histológicas 7,8.

Na frente dos modelos experimentais, unindo estudos em animais e métodos tradicionais in vitro, os avanços na microfluídica e nas técnicas de co-cultivo dão acesso a diferentes classes de modelos celulares micro-projetados, como organoides, sistemas microfisiológicos 9,10,11 (MPS) e organs-on-chip12,13,14 (OOC). Eles compartilham a característica comum de ampliar a visão "global" dos ecossistemas celulares e expandir o potencial in vitro para controlar fatores microambientais, explorando abordagens de microscopia de alto conteúdo15 e processamento de imagens.

Atualmente, os sistemas MPS e OOC de última geração começaram a incluir aspectos imunológicos, incorporando diferentes subtipos de células imunes em tecidos e coculturas existentes, de modo a explorar e medir uma variedade de processos, como doenças inflamatórias, cicatrização de feridas, imunidade da mucosa e resposta a toxinas ou produtos alimentares diários16. Os modelos TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, também integrados com microvasos perfusíveis 18,19,20,21, foram desenvolvidos para investigar interações célula-tipo-dependente, perturbações físicas e químicas, e a atividade citotóxica de linfócitos infiltrantes22, bem como agentes imunomoduladores clinicamente relevantes23.

Aqui, fornecemos protocolos versáteis, abrangendo desde o carregamento de células em chips até ferramentas de processamento de imagens, para explorar coculturas microfluídicas avançadas imunes a tumores em configurações 2D (seção 1) e 3D (seção 2)16, compatíveis com monitoramento dinâmico e multiparamétrico24 e visualização de funções celulares. Isso é conseguido mantendo a facilidade de uso e flexibilidade tanto no gerenciamento de amostras quanto na análise de dados, aproveitando o software gratuito Fiji e suas caixas de ferramentas25,26.

O dispositivo microfluídico, descrito na seção 1, é projetado para realizar co-culturas 2D de células imunes aderentes e cancerosas flutuantes. Essa plataforma foi validada para a mensuração in vitro do comportamento de células imunes na presença de mutações genéticas27 e/ou imunodeficiências28. Aqui, ilustramos etapas para rastrear células imunes em imagens de campo brilhante de lapso de tempo, explorando um método semiautomático baseado no Trackmate (um plugin implementado no software Fiji). Esse procedimento permite a extração de descritores cinemáticos de migração imune29 e resposta (i.e., tempos de interação) a células-alvo cancerosas, tratadas ou não com indutores de morte celular imunogênica27.

É importante ressaltar que esses parâmetros, extraídos de imagens de séries temporais, podem ser processados com maquinário matemático avançado. Como exemplo da potencialidade dessa abordagem, nossos grupos publicaram recentemente uma análise baseada em métodos matemáticos de processos estocásticos e mecânica estatística para modelar propriedades de redes celulares e fornecer uma descrição parametrizada do comportamento das células imunes (isto é, passeio aleatório tendencioso ou não correlacionado, movimento altamente coordenadoou não coordenado 30,31).

A configuração 3D, fornecida na segunda seção, é baseada em um protocolo de co-cultura para recriar TMEs imunocompetentes mais complexas embutidas em duas regiões de gel com diferentes combinações de tipos celulares e drogas de forma competitiva. Aqui, são descritas etapas do processamento das imagens para medir, em diferentes momentos, a infiltração de células imunes coradas em células humanas de melanoma A375M cultivadas dentro de Matrigel, para avaliar combinações de agentes antitumorais32. A linhagem A375M, uma linhagem celular derivada do A375P caracterizada por um fenótipo altamente metastático, foi escolhida para avaliar sua capacidade metastática na presença de células imunes32.

Os modelos descritos podem ser totalmente compatíveis com diferentes fontes celulares (linhagens celulares primárias ou imortalizadas murinas e humanas, organoides, xenoenxertos, entre outras). Em estudos recentes de nosso laboratório, combinando videomicroscopia de alto conteúdo com análise de imagem, o layout 3D competitivo foi aplicado para investigar: i) uma resposta imune antitumoral (citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos, ADCC) e dissecar o papel dos fibroblastos na resistência à terapia com trastuzumabe em modelos on-chip de câncer de mama HER2+ 33; ii) a ação das células mieloides (macrófagos associados ao câncer) nos mecanismos de evasão tumoral e recrutamento de célulasT34; iii) a eficácia de regimes imunoterápicos, especificamente baseados em células dendríticas condicionadas por interferon α (IFN-DCs), cultivadas com células de câncer de cólon tratadas com drogas em matrizes de colágeno, e para avaliar a mobilidade eficiente e os eventos de fagocitose subsequentes35; iv) migração quimiotática de eosinófilos derivados da medula óssea para células de melanoma tratadas ou não tratadas com IL-3336.

Esses modelos avançados poderiam servir como janelas de observação para a compreensão do papel do contexto imunológico na metástase do câncer e nos mecanismos de resistência, mas esforços são necessários para traduzir os achados para a clínica, fechando a lacuna com a pesquisa básica37.

Como um cenário emergente, aproveitar o poder da microscopia automatizada de alto conteúdo acoplada ao uso de microssistemas fisiologicamente mais relevantes está abrindo novos desafios potenciais para o manuseio, processamento e interpretação de centenas, e até milhares, de Gigabytes de dados multiparamétricos, que podem ser gerados a partir de uma única campanha experimental. Isso implica uma ligação direta de experimentos de OOC com algoritmos baseados em inteligência artificial 38,39,40,41,42 (IA), tanto para análise automatizada avançada, quanto para geração de recursos que podem alimentar, por sua vez, modelos in silico de interação câncer-imune 43, com novas aplicações empolgantes no horizonte, como o desenvolvimento de ensaios preditivos de triagem de drogas 44.

Um fluxo de esforços em constante expansão está focado no design de modelos de doenças em conjunto com a otimização de estratégias para implementar as telas de perturbação em grande escala com leituras multi-ômicas de célula única. Isso sem dúvida ajudará o desenvolvimento e, esperançosamente, a implementação clínica, acompanhada por um grau apropriado de padronização do método, de uma abordagem onco-imunologia-on-a-chip sistemática para obter novos insights sobre distúrbios imunológicos e mecanismos de disseminação do câncer.

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Protocol

1. Projeto de chips para co-culturas 2D de células aderentes e flutuantes

NOTA: O layout da co-cultura 2D (Figura 1A-C) é caracterizado por três câmaras (100 μm de altura) interligadas por dois conjuntos de matrizes de microcanais (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). A câmara intermediária forma dois compartimentos fechados sem saída que bloqueiam o transbordamento de células imunes flutuantes para o local do tumor durante a etapa de carregamento 2.5. Esse tipo de dispositivo é útil para medidas bidimensionais em tempo real da motilidade unicelular (aderente ou flutuante) e das interações célula-célula 16,27,28,30,31. Um estudo típico de migração celular (realizado de várias horas a vários dias) combina microscopia de células vivas com algoritmos de processamento de imagens45, a fim de traduzir as sequências de imagens adquiridas em características numéricas25. Com base nos padrões migratórios, vários indicadores biofísicos podem ser estimados, como o deslocamento e a velocidade das células, bem como a duração das interações entre células imunes e células-alvo24.

  1. Preparação de células cancerígenas e PBMC
    1. Cultura de células cancerosas
      NOTA: MDA-MB-231 triplo-negativo [receptor de estrogênio (ER)-, receptor de progesterona (PR)-, e receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano (HER2)-] células de adenocarcinoma de mama humano são rotineiramente cultivadas em um meio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, 100 UI mL−1 de sal sódico de penicilina G e 100 μg mL−1 de sulfato de estreptomicina (meio de crescimento), em condições de cultura padrão (37 °C e 5% CO2).
      1. Para otimizar o crescimento em cultura celular, foram utilizadas placas MDA-MB-231 em frascos de 75 cm2 a uma densidade de 1 × 106 células mL-1 em12 a 15 mL de meio de cultura.
      2. Quando as células atingirem 75-80% de confluência, descartar o meio de crescimento, lavar as células com solução salina tamponada com fosfato pré-aquecido (PBS) para remover completamente a SFB e, em seguida, desanexá-las com tripsina pré-aquecida (1 a 2 min a 37 °C).
      3. Adicionar meio de crescimento para inativar a atividade enzimática da tripsina e coletar células destacadas. Lave as células duas vezes por 5 min a 1.100 x g à temperatura ambiente (TR).
      4. Contar células em uma lâmina de contagem de células por meio do teste de exclusão do corante Azul de Tripano e, em seguida, resemeá-las para cultura de manutenção (por no máximo 6 passagens do descongelamento) ou para procedimentos experimentais.
      5. Para experimentos microfluídicos, sementes de 1 × 10 6 células em placas de6 poços em 3 mL de meio de cultura e tratar com 25 μM de doxorrubicina (DOXO) ou igual volume de solvente DOXO (PBS) como controle.
      6. Quatro a 6 horas após, lavar as células tratadas com DOXO duas vezes com PBS pré-aquecido por 5 min a 1.100 x g em TR.
      7. Conte as células de controlo tratadas com DOXO e PBS como acima (ver passo 1.1.1.5) e defina a co-cultura com células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) em dispositivos microfluídicos.
    2. Isolamento PBMC
      1. Coletar sangue total venoso (10 mL aproximadamente) de voluntários saudáveis em frascos heparinizados e misturar suavemente invertendo o tubo de 2 a 4 vezes47.
      2. Diluir o sangue 1:1 com PBS e camada sobre 10 mL de gradiente de densidade médio Lymphoprep em um tubo de 50 mL.
        NOTA: Certifique-se de fazer as camadas muito suave e lentamente para deixar o sangue e o Lymphoprep formarem duas camadas distintas.
      3. Tubos de centrífuga durante 30 minutos a 400 x g a 4 °C numa caçamba oscilante sem travões. Quatro camadas distintas se formarão: (i) plasma no topo, (ii) uma camada branca e turva contendo PBMCs, (iii) Lymphoprep, e (iv) uma pelota de eritrócitos e granulócitos.
      4. Aspirar suavemente as CMSP com uma pipeta de 2 ml e ressuspender imediatamente em meio de crescimento quente (o mesmo utilizado no passo 1.1.1) e lavar duas vezes durante 5 minutos a 1.100 x g em TR.
      5. Conte os PBMCs peletizados como acima (ver etapa 1.1.1.5) e use para procedimentos experimentais ou congele para armazenamento de longo prazo.
  2. Plaing as células em chips 2D
    Observação : PBMCs não estão manchados neste protocolo. Para caracterizar fenótipos específicos no chip, subpopulações de células imunes podem ser isoladas por seleção de esferas imunomagnéticas, coradas com rastreadores de células fluorescentes, remisturadas com a fração remanescente não marcada e, assim, confrontadas com células-alvo cancerosas, como relatado nos experimentos on-chip, descritos em Vacchelli et al.27 e Racioppi et al.34.
    1. Antes de iniciar experimentos de co-cultura e para facilitar a adição de reagentes, ative os chips armazenados por um tratamento com plasma de oxigênio por alguns segundos. Encher imediatamente os reservatórios com água deionizada ou PBS para manter as superfícies de PDMS (polidimetilsiloxano) hidrofílicas até as etapas de plaqueamento.
      NOTA: O PDMS é intrinsecamente hidrofóbico, o que pode resultar em dificuldades na operação e no aprisionamento de bolhas de ar em microcanais. Consulte a etapa 7 no arquivo suplementar que fornece detalhes sobre a ativação do plasma de oxigênio.
    2. Esterilizar sob um armário UV por 20 min, lavar 2-3 vezes com PBS fresco e, em seguida, incubar com meios de cultura por 1 h. Mantenha os cavacos na incubadora até realizar as etapas de chapeamento.
    3. Retirar o excesso de meios de todos os seis reservatórios. Tome cuidado para não sugar mídia das principais câmaras de cultura.
    4. Aplicar lentamente 1 × 105 células cancerosas ressuspensas em 10-20 μL de meio de crescimento no reservatório superior esquerdo e, em seguida, no poço inferior (Figura 1A, reservatórios 1 e 2). Aguarde 5 minutos para deixar as células aderirem à câmara tumoral. Algumas células se acomodam e se fixam nos reservatórios.
      NOTA: Insira a suspensão celular ao lado das aberturas do canal. Este procedimento é aplicado a células cancerosas MDA-MB-231, outras linhas exigirão otimização da densidade celular. Para melhorar a fixação de células cancerosas, uma funcionalização de revestimento de superfícies (por exemplo, poli-L-lisina, fibronectina) pode ser realizada. Por favor, consulte os protocolos publicados anteriormente para as etapasde revestimento 16, 48,49,50.
    5. No lado direito, pipetar suavemente 1 × 106 PBMCs ressuspendidos em 50 μL de meio de crescimento nos poços 3 e 4 (ver Figura 1A, reservatórios 3 e 4).
      NOTA: Após o fluxo, o PBMC distribuirá para a câmara intermediária criando uma "frente", que representa o ponto de partida do experimento.
    6. Encher todos os seis reservatórios com até 100-150 μL de meio de crescimento. Ao microscópio, verifique se as células se distribuíram corretamente nos compartimentos de cultura, conforme ilustrado na Figura 1D-E. Os volumes finais podem variar de acordo com o tamanho dos reservatórios. Ajuste os volumes para serem iguais em todos os poços.
    7. Coloque os chips de volta na incubadora por aproximadamente 1 h para estabilizar o sistema antes da gravação em time-lapse. Adicionar meio fresco a cada 3 dias, pois pode estar sujeito a perdas por evaporação.
      NOTA: O sistema é compatível com a análise de células vivas/mortas e com o perfil dinâmico de secreção de citocinas multiplex a partir de meios condicionados. Para análises de quimiocinas, alíquotas de até 200-250 μL de sobrenadantes podem ser acessíveis coletando meios dos dois reservatórios de cada compartimento. Os ensaios clássicos de perfil de citocinas ELISA e Luminex requerem cerca de 50 μL de sobrenadantes. Veja 51,52 exemplos de estudos de outros laboratórios realizando perfis de citocinas em modelos OOC.
  3. Aquisição por lapso de tempo de células cancerosas e imunes não marcadas
    NOTA: Normalmente, 3 chips são dispostos em uma única lâmina de microscópio (veja a Figura 1A para chip 2D e a Figura 4B para chip 3D). Usando suportes de estágio alocando 4 lâminas, as co-culturas podem ser adequadas para serem monitoradas por microscopia automatizada de alto conteúdo para analisar grandes lotes de condições experimentais. Os cavacos podem ser facilmente montados em lâminas com espessura igual a 1 mm ou 170 mícrons (lamínulas de plástico ou vidro, multipoços de fundo óptico de 6 poços) para imagens confocais de alta resolução.
    1. Grave séries de imagens de campo brilhante de células não marcadas por meio de uma configuração de microscopia de vídeo equipada com um sistema de incubação.
      NOTA: Aqui conjuntos de dados de séries temporais (janela de tempo: 48 h, taxa de quadros: 2 min) foram adquiridos com um microscópio de fluorescência, equipado com uma objetiva de 4x e pixels CMOS 1.3M, otimizado para caber em uma incubadora de cultura de células padrão.
    2. Aquecer o microscópio durante pelo menos 2 h para equilibrar a 37 °C e 5% CO2 antes de iniciar a aquisição.
    3. Selecione a janela de observação centralizando o arranjo de microcanais entre o tumor e o compartimento central. Isso permite visualizar a dinâmica da infiltração imunológica e as interações dentro da região em que as células cancerosas são semeadas.
    4. Ajuste a intensidade de iluminação e o foco das células cancerígenas e imunológicas.
    5. Para iniciar a aquisição de lapso de tempo, otimize a taxa de quadros e a duração do tempo de acordo com o experimento e o tipo de célula em estudo.
      NOTA: As condições de imagem devem ser otimizadas para evitar a exposição excessiva à foto, mantendo uma boa relação sinal-ruído (SNR). Como as células imunes são muito móveis, a taxa de quadros de aquisição precisa ser suficientemente alta para acompanhar o processo dinâmico de interesse e permitir fácil rastreamento53. Um compromisso deve ser alcançado entre o algoritmo de rastreamento, a compatibilidade com o tamanho do conjunto de dados resultante e a viabilidade, densidade e motilidade das células observadas.
    6. No final do lapso de tempo, use a função Importar sequência de imagens e Salvar como do software ImageJ para converter o conjunto de dados de quadros em um arquivo de vídeo descompactado de 25 fps.
      Observação : o arquivo de vídeo gerado agora está pronto para análise de rastreamento de célula. Aqui, foram coletadas imagens RGB (1280x1024 pixels) com resolução espacial de 1,33 μm/pixel. Um filme de 24 horas de duração (pilha de 3,5 GB) de um único campo de visão (FOV) consiste em 720 quadros para cada condição.
  4. Análise de dados: Extração semiautomática de faixas imunes não rotuladas por Trackmate
    NOTA: Aqui, a análise de motilidade imune em imagens de lapso de tempo não rotuladas 2D é realizada usando o TrackMate54, uma caixa de ferramentas de código aberto disponível no pacote de software Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Vários algoritmos são fornecidos para realizar o rastreamento automatizado de partículas únicas55(SPT) de estruturas pontuais. Eles foram aplicados eficientemente a imagens fluorescentes, onde os objetos são brilhantes sobre um fundo escuro com alta SNR (ou seja, pontos fluorescentes de sub-resolução, vesículas de tráfego marcadas, núcleos)1,25,56,57,58. O TCP baseia-se principalmente em duas etapas sequenciais. Primeiro, os objetos são localizados com posições identificadas em vários quadros (segmentação), conforme esquematizado emFigura 2. No segundo estágio (ligação de partículas), os pontos detectados são ligados ao longo de quadros consecutivos para estimar o movimento e reconstruir suas trajetórias, na forma de uma trilha (Figura 3). As características numéricas podem ser calculadas a partir de cada matriz de coordenadas X, Y, Z extraída ao longo do tempo. A documentação estendida é relatada em54bem como online (http://imagej.net/TrackMate), seguindo o tutorial Introdução ao TrackMate. A precisão do processo pode ser inspecionada imediatamente, manipulando uma interface gráfica intuitiva (GUI semelhante a um assistente) que permite aos usuários, a cada passo, reajustar as configurações. A parte a seguir descreve brevemente como usar o Trackmate para etapas de processamento e quantificação de imagens, aplicadas a imagens de luz visível:
    1. Arraste e solte a pilha de vídeo/imagem em tempo integral na barra de ferramentas de Fiji.
    2. Configuração da pilha de calibração (Figura 2A).
      1. Verifique a dimensionalidade e atribua as propriedades da imagem selecionando Imagem> Propriedades. Unidade de preenchimento das caixas de comprimento, dimensões de pixel e intervalo de quadros.
        NOTA: Para realizar a calibração, use o comprimento conhecido dos microcanais (500 μm, Figura 1C) e divida pelo comprimento medido correspondente em pixels. Para séries temporais 2D, certifique-se de trocar o campo Z/T inserindo 1 como z-slice e o número correto de quadros de filme. Se não for realizado, as saídas quantitativas e os parâmetros do Trackmate serão relatados em unidades de pixel e períodos de tempo.
    3. Pré-processamento de imagens.
      1. Para melhorar a discriminação correta de células imunes de um fundo barulhento, pré-processe imagens de campo brilhante para compensar artefatos. Certifique-se de que os conjuntos de dados consistam em imagens TIFF de 8 bits (faixa de brilho: 0-255).
        NOTA: Iluminação irregular, baixo SNR e contaminação por pequenas partículas de detritos em imagens de luz visível podem comprometer o sucesso de um processo de rastreamento celular. Aqui, os conjuntos de dados de séries temporais são pré-processados por meio de subtração de fundo, função de ajuste de brilho/contraste e por subtração de imagem local de um desfoque gaussiano de imagens originais. Existem outros diferentes kits de ferramentas de análise disponíveis no ImageJ para processamento e segmentação de imagens de contraste de fase ou de campo claro, incluindo o Limiar de Gradiente Empírico (EGT)59.
    4. Primeiro painel de calibração (Figura 2A)
      1. Com a pilha de imagens selecionada, inicie o Trackmate (Plugins>Tracking).  Revise/confirme a dimensionalidade e a janela temporal dos dados (ou seja, largura de pixels e intervalo de quadros).
        NOTA: O TrackMate lê automaticamente na caixa de propriedades da imagem para fornecer os resultados finais de rastreamento em unidades físicas calibradas (ou seja, μm e minutos).
      2. Defina uma região de interesse para calcular a extração de trilhas imunes, inserindo manualmente valores ou desenhando uma área fechada sobre a imagem ativa e pressionando o botão Atualizar origem. Para extrair as vias de migração imune global, selecione regiões retangulares, respectivamente, no lado direito dos microcanais (câmara central, Figura 1E) e no lado esquerdo (câmara tumoral, Figura 1D). Para analisar as interações entre câncer e pontos críticos imunológicos, desenhe sub-regiões circulares usando ferramentas de ROI (vá para Editar → Seleção → Especificar).
        Observação : ao executar pela primeira vez esta caixa de ferramentas em um novo aplicativo biológico, gaste o tempo necessário para otimizar as configurações para reconstruir as faixas.
        NOTA: Execute o rastreamento manual das trajetórias celulares (cerca de 50-100 células) para encontrar empiricamente a configuração correta e ao lado para validar como benchmark a confiabilidade da extração automática de movimentos. Além disso, trabalhe inicialmente em uma área menor para verificar facilmente a precisão dos parâmetros escolhidos.
    5. Etapa de detecção de pontos imunes (Figura 2B)
      1. Selecione o detector Laplaciano de Gaussiano (LoG) padrão. O detector LoG trabalha para encontrar objetos brilhantes, semelhantes a bolhas, arredondados e aplicar um filtro laplaciano de Gaussiano na imagem ajustada para tamanhos de ponto intermediários (5 a 20 pixels de diâmetro).
      2. Em Diâmetro estimado da blob (aqui, 10-13 μm) insira um valor ligeiramente maior do que o tamanho esperado do ponto. Aumente o valor de Limiar (aqui 1-3 μm) até que pontos de fundo espúrios extras sejam reduzidos, possivelmente sem remover os recursos do objeto. As detecções abaixo do valor limite (com base em uma métrica de qualidade) serão descartadas da análise subsequente. Marque a caixa para o filtro mediano e a localização de subpixels para melhorar a qualidade da detecção de pontos.
      3. Use o botão Visualizar para visualizar e inspecionar rapidamente as células imunológicas identificadas sobrepostas nas imagens por círculos coloridos de magenta.
        NOTA: Erros durante a detecção terão um impacto considerável no processo de vinculação. Outras detecções indesejadas podem ser corrigidas nos menus subsequentes por filtros definidos pelo usuário (ou seja, por intensidade, tamanho ou posição do ponto).
    6. Quando estiver satisfeito com as seleções, clique em Avançar.
      NOTA: Essas configurações podem variar dependendo da configuração experimental e das modalidades de aquisição de imagens (por exemplo, FOV, magnificação objetiva, imagens fluorescentes ou de campo claro), tipo de célula (células aderentes ou flutuantes), de motilidade lenta ou rápida, tipo de comportamento celular (interagindo ou não) e baixa/média/alta densidade na área de observação.
    7. Prossiga e ignore o menu Limite inicial. Selecione a janela Hyperstack Displayer.
    8. Definir filtros no painel de pontos (Figura 2C).
      1. Selecione: Cor uniforme. Filtros, como mostrado na Figura 2C, podem ser adicionados para reter pontos rotulados com valores de recurso, exibidos em um histograma, acima ou abaixo de um limite reversível.
    9. Etapa de seleção do rastreador (Figura 3A). Escolha o rastreador de LAP simples, como algoritmo de ligação de partículas, solicitando três campos para preencher (neste caso, "Distância máxima de ligação": 30-50 μm, "Distância máxima de fechamento de gap": 25-50 μm, "Gap - fechamento de intervalo máximo de quadro": 4-6). Este detector gerencia eventos de fechamento de lacunas, com cálculo de vinculação de custos exclusivamente com base em suas respectivas distâncias.
      NOTA: A distância máxima de ligação permitida limita o intervalo de busca espacial para pontos de correspondência candidatos, correspondendo ao deslocamento máximo permitido percorrido entre dois quadros subsequentes (Figura 3D).
      1. Fornecer maiores valores de deslocamento máximo quando a fragmentação de trilhas de partículas altamente móveis é notada.
        Observação : dois links não serão conectados se o movimento quadro-a-quadro for maior do que o valor de distância máxima fornecido. Se os segmentos unirem mal duas células diferentes, diminua o valor do deslocamento máximo.
      2. Tente reconectar os pontos perdidos, variando os valores de "distância máxima para fechamento de gap" e "gap máximo de frame".
        Observação : esses parâmetros lidam com eventos de fechamento de lacunas em quadros não adjacentes. O desaparecimento pontual pode ocorrer para alguns quadros (ou seja, partículas fora de foco, células saindo de fora e no FOV, falhas de segmentação em uma imagem ruidosa).
        NOTA: Para lidar com eventos de divisão ou mesclagem, opte pelo vinculador LAP como detector, que introduz penalidades de matriz de custo de vinculação.
    10. Clique em Avançar para executar o cálculo de rastreamento. Pressione Avançar.
    11. Painel Filtrando trilhas (Figura 3B). Altere a cor dos caminhos imunes selecionando, no menu suspenso, "Track ID" ou outros recursos de faixa. Neste ponto, opte por definir filtros interativos funcionais, para melhorar a qualidade do resultado e revisitar o procedimento.
      NOTA: Manchas espúrias surgem de ruído na imagem e perda de qualidade do recurso. Isso gerará segmentos curtos, enquanto as células de interesse podem ser rastreadas em muitos quadros.
      1. Para remover caminhos curtos, tente filtrar, com base no número de pontos que eles contêm. Além disso, classifique as faixas usando uma combinação de opções, como Deslocamento da faixa, Duração da trilha ou Velocidade mínima/média/máxima para excluir trilhas falsas ou indesejadas (com menos quadros em relação à duração total do lapso de tempo ou envolvendo partículas sujas ou não em movimento) do pós-processamento posterior.
        NOTA: A escolha dos filtros pode variar dependendo da aplicação específica e do sistema biológico.
    12. Examine todas as faixas na interface Opções de Exibição, percorra o tempo e verifique se as trilhas precisas correspondem aos caminhos de migração de células. O menu suspenso fornece códigos de cores para pontos e caminhos para fácil visualização e filtragem por várias modalidades (por exemplo, parâmetros cinéticos, intensidade, posição temporal ou espacial).
      NOTA: Para rastrear culturas de alta densidade ou células de alta mobilidade, aumente a taxa de quadros de aquisição minimizando o deslocamento da célula percorrida em intervalos de tempo consecutivos.
    13. Correção manual de erros de segmentação e vinculação (Figura 3E).
      1. Para melhorar ainda mais a qualidade dos resultados, edite manualmente manchas (partículas de detritos, células estacionárias) e remova rastros errôneos derivados de limites tumorais detectados ao analisar ROIs de interação tumor-imune.
      2. Primeiro, selecione a ferramenta TrackMate na barra de ferramentas do ImageJ. Para eliminar um ponto existente em toda a pilha, pressione shift e crie com o cursor do mouse uma máscara de ROI sobre o ponto de destino (editado em um círculo verde) e pressione a tecla DEL.
      3. Para adicionar um novo ponto (em caso de falta de rastros devido ao desaparecimento de manchas), pressione a tecla A, colocando o mouse no local apontado. Repita o processo de computação de vinculação de trilhas após esta etapa.
    14. Quando satisfeito, selecione Análise no painel Opções de exibição para gerar três arquivos de texto (Figura 3C e 3F). A tabela em "Spots in tracks statistics" fornece as coordenadas espaço-temporais dos pontos imunes (posições X-Y-Z das células marcadas com o quadro associado e o número da faixa). "Links em estatísticas de faixas" e "Estatísticas de faixas" contêm informações relativas às faixas: durações de faixas, número de lacunas ou pontos detectados, inicial e stop-frame de trilha, etc. Salve e exporte para cada conjunto de dados.
      NOTA: Ao clicar em uma linha dentro das janelas de resultado, o respectivo ponto, link ou trilha é ativado dentro do vídeo de lapso de tempo para inspeção visual. Repita as etapas de filtragem para selecionar/remover faixas. Todos os dados exportados futuros serão atualizados. DICA: Os valores de duração da trilha inicial e stop-frame e da trilha podem ser explorados para calcular os tempos de contato entre o câncer e as células imunes ao processar ROIs de interação.
    15. Pressione o botão Salvar para gerar um arquivo XML resultante contendo todos os valores de parâmetro, o caminho para imagens e posições pontuais no tempo. O comando ''Load TrackMate file'' (Plugins> Tracking) restaura toda a sessão do processo para cada arquivo de filme individualmente.
    16. Mover para o último painel da GUI chamado Selecionar uma ação. Na lista, use a função Capturarsobreposição > Executar para produzir um vídeo com faixas sobrepostas. DICA: A opção "Plot N-spots vs time" pode ser usada para calcular a densidade espacial das células imunes em uma ROI (Figura 6B, painel direito).
    17. Análise pós-processamento e estatísticas de migração
      1. Analise os dados posicionais brutos diretamente no Trackmate ou exporte dados para calcular parâmetros cinéticos abrangentes29 (ou seja, comprimento total da trajetória, distância euclidiana, razão de confinamento, deslocamento quadrático médio56, velocidade média ou instantânea da pista, coeficiente de parada, distribuição dos ângulos de migração, índice de migração para frente, velocidade média em linha reta) para classificar o comportamento de migração de células imunes (por exemplo, movimento direcionado ou difusivo30, 31) e resposta às células-alvo do câncer (por exemplo, tratado versus controle).
        NOTA: Plugins úteis adicionais, como a The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/), fornecem vários gráficos (por exemplo, gráficos de rosa ou setor, como ilustrado na Figura 6) e testes estatísticos para análise avançada e visualização de migração experimental e dados de quimiotaxia. A combinação de algoritmos de rastreamento e segmentação celular24,25,45 pode permitir medidas de métricas morfológicas em nível de célula única (isto é, área de superfície celular, comprimento do eixo maior e menor e proporção celular).

2. Modelo 3D imuno-competente de câncer on-chip em um ensaio competitivo

NOTA: O design do chip 3D, representado naFigura 4, consiste em  5 compartimentos principais: um central para a ingestão de células imunes flutuantes, duas regiões laterais para incorporar células tumorais em matrizes de hidrogel (150-250 μm de altura) e câmaras de perfusão média. As câmaras imune e tumoral estão conectadas por dois conjuntos estreitos de microcanais (200×12×10 μm3, L×W×H, Figura 4E). Regularmente micropilares isósceles trapezoidais espaçados de 100 μm (cerca de 25-30 interfaces para cada região lateral do gel, Figura 4C) funcionam como barreiras para confinar a solução de gel durante a injeção, explorando o equilíbrio entre tensão superficial e forças capilares60,61 e conectam regiões tumorais às duas câmaras médias adicionais laterais para estabelecer uma interface gel-líquido (Figura 5). As características detalhadas do ensaio competitivo 3D são mostradas na Figura 4. A migração preferencial de células imunes em direção aos dois compartimentos de hidrogel que hospedam células tumorais submetidas a diferentes tratamentos pode ser monitorada e quantificada. O layout competitivo particular pode ser aplicado para investigar uma infinidade de diferentes fenótipos da biologia do câncer (por exemplo, resistentes a medicamentos vs agressivos, primários ou metastáticos, respondedores versus não respondedores). Além disso, as regiões emblocadas em gel podem ser facilmente integradas com diferentes populações celulares para recriar EMTs mais heterogêneas, incluindo componentes estromais (fibroblastos, células endoteliais)23 ou para simular um meio imunossupressorespecífico34 (por exemplo, macrófagos) para mecanismos dissecantes de resistência a drogas e evasão tumoral.
NOTA: A coloração nuclear e ativa de caspases, usando kits comerciais para ensaios vivos/mortos (por exemplo, Thermo Fisher Scientific, reagentes Incucyte), pode ser implementada para avaliar eventos de morte mitótica ou apoptótica, como relatado em Nguyen et al.33.

  1. Preparação da solução matricial com células e Carregamento no dispositivo
    NOTA: No seguinte cenário experimental, as duas regiões de gel contêm misturas de linhagens celulares de melanoma A375M humanas, cultivadas em solução de matriz (por exemplo, Matrigel), expostas a agentes terapêuticos usados como monoterapia ou em combinação. Esse cenário permitiu avaliar competitivamente a eficácia da combinação de dois fármacos em relação aos isolados e quantificar sua capacidade de atrair CMSP.
    1. Descongelar um estoque de solução matricial (por exemplo, Matrigel) colocando gelo em um refrigerador de 4 °C um dia antes do experimento.
      NOTA: Não exponha o produto a vários ciclos de congelamento-descongelamento, pois ele se torna "aglomerado". Outros protocolos de hidrogéis sintéticos ou naturais podem ser adequados para serem usados neste contexto. Consulte 33,34,35 para a preparação de células cancerosas em matrizes de colágeno.
    2. Ressuspender células de melanoma humano A375, coradas com PKH67 Green Fluorescent Cell Linker compatível com vida em solução matricial (2 mg mL-1). Quando indicado, adicionar 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC; 2,5 μM), referida como DAC, e/ou IFN-α2b, referida como IFN, nas doses adequadas32.
      NOTA: Corresponda ao lote # na folha de especificações do frasco matricial. Com base na concentração, calcule o volume de meio necessário para fazer até 2 mg mL-1 Por favor, ajuste a concentração ideal de proteína e a concentração de suspensão de células cancerígenas de acordo com sua aplicação de interesse.
    3. Pipetar para cima e para baixo com cuidado para evitar a geração de bolhas. Mantenha o tubo da microcentrífuga no gelo durante a mistura para evitar qualquer polimerização indesejada.
    4. Após a esterilização, colocar os dispositivos sobre gelo (usando um balde de gelo e tampa) para evitar a solidificação da solução da matriz durante todo o procedimento de carregamento celular.
    5. Injetar lentamente as duas misturas de IFN e DAC/IFN Matrigel/células tumorais (2-4 μL) no portal esquerdo e direito do gel, respectivamente, com micropipeta de 10 μL usando pontas frias (Figura 5A). Aplique uma pressão suave para empurrar a solução matricial de um lado até atingir o outro.
      NOTA: O volume da solução matricial foi escolhido para evitar transbordamento para canais adjacentes. Não exerça pressão excessiva de pipetagem para evitar que a solução vaze para a mídia e canais centrais. Se durante o carregamento o caminho do gel estiver bloqueado ao longo do canal, tente inserir a solução da outra entrada até que as frentes do gel se encontrem. Ao remover a micropipeta das entradas, segure o êmbolo, caso contrário, a pressão negativa aspirará a solução da matriz.
    6. Colocar o dispositivo em uma incubadora na posição vertical a 37 °C e 5% CO2 por 30 minutos para permitir a gelificação da solução da matriz (Figura 5B). Manuseie com chips de cuidado com gel não polimerizado embutido para evitar vazamento para fora do canal de gel.
    7. Enquanto isso, ressuspenda as PBMCs marcadas com PKH67 (1x106 células) em 10 μL de DMEM completo (meio de Eagle modificado por Dulbecco).
    8. Após a gelificação da matriz, preencher os canais do meio com (50-100 μL) a mesma alíquota do meio de cultura em todos os seis reservatórios para evitar a secagem do gel nos chips. Manter em incubadora até a semeadura da suspensão das células imunes.
      OBS: Verificar ao microscópio a correta e homogênea distribuição das células tumorais no gel e a integridade das barreiras do gel polimerizado. Regiões gelificadas parcialmente ou não uniformes ou bolhas na mistura levam ao fluxo prematuro de PBMCs em canais de meio de gel no ponto de partida do experimento devido a flutuações iniciais de pressão.
    9. Aspirar o meio dos seis poços e posicionar a ponta perto da entrada de um canal de meio para injetar suavemente com suspensão de células PBMC de pressão moderada. A sequência temporal de carregamento está representada na Figura 5C:
      1. PBMCs em meio de 10 μL no poço central superior.
      2. Meio de 50-100 μL em cada um dos quatro poços de canais laterais.
      3. 40-90 μL médio no poço central superior.
      4. 50-100 μL médio no poço central inferior.
    10. Certifique-se ao microscópio de que a distribuição dos PBMCs permaneça confinada na câmara central após a etapa de carregamento. (Figura 7A).
      NOTA: Se não for o ideal, ajuste a concentração se necessário e repita as etapas de semeadura, usando chips imaculados. Ao calcular os volumes para as condições experimentais previstas, consulte um número excessivo de cavacos (15-20%) para ter em conta potenciais erros e ajustamentos. Volumes e concentrações devem ser otimizados de acordo com a aplicação específica.
    11. Colocar os dispositivos montados numa superfície nivelada na incubadora a 37 °C e 5% CO2 para posterior aquisição de imagens de fluorescência. Manuseie com chips de cuidado depois de carregar as células imunológicas que estão flutuando.
      NOTA: Compensar as perdas evaporativas de volumes em reservatórios substituindo os meios a cada 2-3 dias. Para o perfil de quimiocinas, até 100 μL de cada um dos dois poços de compartimentos de cultura podem ser aspirados, consulte a etapa 2.7, na etapa 1.
  2. Contagem automatizada de PBMCs recrutados em imagens fluorescentes de canal único no ImageJ
    NOTA: Métodos clássicos de imunofluorescência para imagens confocais de alta resolução podem ser aplicados a operações on-chip como medições de endpoint. O procedimento básico de coloração envolve fixação celular on-chip, permeabilização, bloqueio, ligação de anticorpos, coloração de núcleos com etapas de lavagem entre elas. Células imunes não marcadas infiltradas em regiões de géis 3D com microambientes de câncer embutidos podem ser fixadas em momentos desejados e coradas para marcadores de expressão de ativação/exaustão/maturação (por exemplo, para células CD8, monitoramento de marcadores CD69, CD95, PD1, TIM3). Em Parlato et al.35, a fagocitose das células apoptóticas SW620 foi avaliada por microscopia confocal, utilizando-se dispositivos montados em lamínulas de 170 μm de espessura. IFN-DCs foram corados adicionando-se alíquotas de HLA-DR-FITC Ab anti-humano on-chip.
    Para calcular a extensão de células imunes vivas infiltradas e coradas fluorescentemente desafiadas com sinais competitivos, um fluxo de trabalho comum de análise de imagem é definido da seguinte forma (Figura 7D-G):
    1. Adquirir, em desfechos de tempo específicos, contraste de fase e microfotografias de fluorescência de canais vermelho/verde das regiões do gel esquerdo e direito contendo células tumorais, respectivamente, expostas a regimes farmacológicos únicos ou combinados.
      NOTA: As imagens foram capturadas em microscópio de fluorescência EVOS-FL após o carregamento celular (0 h), após 48 h e após 72 h de incubação (Figura 7A-B). Um aumento de 4x-10x foi usado para adquirir a câmara central, as matrizes de microcanais e os dois canais laterais justapostos contendo A375 mais IFN e A375 mais DAC/IFN.
      1. Ao realizar operações de aquisição, considere os parâmetros a serem medidos e evite a saturação das características a serem contadas. Os resultados ótimos de segmentação dependem da natureza das imagens adquiridas, devido à variabilidade nas próprias amostras biológicas, à qualidade da coloração e às técnicas de microscopia utilizadas para aplicações orientadas ao usuário.
    2. Carregue dados de canal único de fluorescência (neste caso, vermelho = PBMCs), em Fiji, arrastando-os para a janela principal (Figura 7D). Duplique a imagem para evitar substituir os dados brutos durante a seleção dos filtros de pré-processamento até a segmentação final.
      1. Se a imagem for uma imagem colorida (RGB), pressione Imagem > Tipo 8 ou 16 bits para converter em escala de cinza. Verifique se Editar opções > > Conversãos está definido para dimensionar ao converter.
    3. Pré-processamento de dados brutos através da limpeza de ruídos e artefatos.
      1. Vá para o menu Processar > Subtrair plano de fundo aplicando o algoritmo de bola rolante para corrigir o ruído irregular de fundo com grandes variações espaciais de intensidades. Defina o raio para pelo menos o tamanho da maior partícula de primeiro plano. Escolha a caixa Visualizar para o procedimento de tentativa e erro para obter os melhores resultados. Valores muito pequenos podem remover incorretamente estruturas de interesse.
      2. No comando Brilho&Contraste, arraste os controles deslizantes Mínimo/Máximo para alterar o intervalo de intensidades no histograma. Desloque o controle deslizante Máximo para a esquerda para aumentar o brilho, sem recursos de desbotamento. Mova o slide Mínimo para a direita para aumentar o contraste da imagem, evitando o desaparecimento de recursos menos visíveis no plano de fundo. Clique em Aplicar para corrigir alterações.
    4. Aprimoramento de imagem.
      1. Vá para Process > Filters e experimente os filtros medianos gaussianos nas imagens (Figura 7E).
        NOTA: O raio de pré-filtragem deve ser adaptado aos pixels de ruído da imagem. O filtro Mediana não linear substitui o valor de pixel pelo valor mediano dos vizinhos, para reduzir o ruído de sal e pimenta. "Gaussian Blur" é usado para suavizar uma imagem digital, substituindo pixels por uma média ponderada de pixels circundantes. Os pesos vêm da distribuição de probabilidade gaussiana, de modo que os pixels mais próximos são mais influentes.
      2. Vá opcionalmente para Processar > Matemática > Gama com a caixa de visualização marcada para aumentar o contraste.
        NOTA: As intensidades definidas no painel C são dimensionadas entre os limites mínimo e máximo de dois. Valores < 1,0 acentuam diferenças entre intensidades baixas, enquanto valores > 1,0 acentuam diferenças entre intensidades altas. A correção gama é funcional para encontrar um intervalo de exibição, mostrando os objetos mais fracos sem saturar os mais brilhantes.
    5. Criação de uma máscara de imagem binária.
      1. Vá para Imagem > Ajustar > limite. O método mais simplesmente empregado para determinar os limiares baseia-se na análise de histogramas dos níveis de intensidade, como mostra a Figura 7F. No menu suspenso, jogue com diferentes métodos de limiar global (no nosso caso, Otsu é aplicado).
      2. Role manualmente ou digite um intervalo conhecido de intensidades de pixel nos painéis de histograma, observe a mudança do padrão vermelho sobrepondo a imagem que mais se assemelha à área real da célula. O botão Redefinir remove a sobreposição. Quando estiver satisfeito, clique em Aplicar para gerar uma versão binária da imagem. Marque Opções de > Binário > de Processo para controlar como as imagens limitadas são exibidas e como os objetos são identificados pelo Analisador de Partículas.
    6. Use o comando de menu Process/Binary/Watershed Particles para dividir, parcialmente sobrepostas ou mescladas durante o limite. A bacia hidrográfica muitas vezes pode cortá-los com precisão adicionando uma linha de 1 pixel de espessura. Execute operações morfológicas, como operações de dilatação ou erosão, para aumentar ou remover pixels de pixels saturados abaixo ou em excesso.
      Observação : para obter mais informações, consulte a seção Comandos de menu ou consulte MorphoLibJ, uma biblioteca integrada baseada em morfologia matemática para processar dados binários.
    7. Descrição quantitativa do recurso de imagem.
      1. Uma vez obtido o reconhecimento satisfatório do objeto, abra o Analisador de Partículas de Analisar > Analisar Partículas. As partículas podem ser excluídas por seu tamanho e circularidade, expressos em pixels ou em uma unidade de medida calibrada (verifique a escala correta em relação às configurações do microscópio em Propriedades do > de Imagem). Para incluir tudo, mantenha o padrão de 0-infinito e circularidade intervalo padrão em 0,00 - 1,00 (0 = linha reta, 1 = círculo perfeito).
      2. Para filtrar pequenos pixels de "ruído" ou recursos de não interesse, defina o intervalo mínimo e máximo. Marque as opções Incluir buracos, Mostrar, Estrutura de tópicos e Exibir resultados no campo da janela. Excluir em Bordas descartará partículas detectadas nas bordas da imagem. Adicionar ao Manager adiciona a seleção obtida ao gerente de ROI para análise adicional mantendo as informações de posição da partícula.
        NOTA: No "ROI Manager", é possível corrigir a segmentação automática de saída gravada (mesclar células divididas, dividir células mescladas). Selecione, usando ferramentas de seleção na barra de ferramentas de Fiji, ROIs dentro de ambas as regiões de gel onde as células cancerosas são incorporadas para estimar a infiltração imunológica.
    8. Exporte os valores obtidos para uma planilha para realizar a análise estatística como mostra a Figura 7G. "Resultados" lista uma tabela de dados relativa às propriedades de partículas delineadas numeradas identificadas. "Resumir" abre uma janela com o nome da imagem, contagens totais e outras informações para a imagem inteira.
      1. Vá para Analisar > Definir Medidas para incluir uma ampla gama de parâmetros.
    9. Registre opcionalmente uma macro (selecionando Plug-ins > Macros > Registro) para automatizar o fluxo de trabalho de processamento e economizar tempo de análise em grandes conjuntos de dados.
      1. Utilizar a mesma rotina de processamento para analisar canais verdes de fluorescência nas mesmas regiões para analisar alterações morfológicas de células tumorais em regiões 3D16

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Representative Results

A infiltração imune tumoral é um parâmetro da resposta antitumoral do hospedeiro. Os tumores são heterogêneos na composição, densidade, localização e estado funcional dos leucócitos infiltrantes, cujas interações com células cancerosas podem fundamentar informações clinicamente relevantes para prever o curso da doença e a resposta à terapia. Nesse sentido, tecnologias microfluídicas poderiam ser utilizadas como ferramentas complementares e privilegiadas in vitro para explorar o contexto imunológico de tumores, bem como monitorar a resposta a terapias antineoplásicas. O acoplamento do ensaio microfluídico, imagem de células vivas e software de rastreamento pode estabelecer métodos de quantificação confiáveis para quantificar como as células imunes ajustam seu padrão de migração em diferentes contextos. Neste capítulo, relatamos etapas para a criação de co-culturas versáteis 2D ou 3D de células cancerígenas imunes e alvo em dispositivos microfluídicos ad hoc realizados por procedimentos litográficos suaves padrão. Na Seção 1, dispositivos microfluídicos foram empregados para permitir contatos químicos e físicos entre populações aderentes (células cancerosas MDA-MB-231) e não aderentes (PBMCs). Alguns agentes quimioterápicos (por exemplo, antraciclinas, entre outros) podem induzir apoptose "imunogênica" de células malignas, aumentando assim sua visibilidade em hospedeiros imunocompetentes. A morte celular imunogênica (DCI) do câncer é caracterizada pela liberação de sinais solúveis e ligados à membrana emitidos por células moribundas funcionando como alarmins para células imunes. Para fornecer uma validação quantitativa da resposta do CDI, empregamos dados coletados na plataforma microfluídica onde os leucócitos podem se mover através de pontes microcanais adequadamente construídas em direção às células-alvo. Registros em time-lapse foram realizados após co-carregamento de PBMCs, de doadoras saudáveis (WT, tipo selvagem), com células humanas de câncer de mama MDA-MB-231 pré-tratadas ou não com a antraciclina DOXO. Microfotografias foram geradas a cada 2 min, por dois intervalos de tempo sucessivos de 24 e 48 h. (Exemplar Filme S1 de 0-24 h de intervalo). A análise de rastreamento de PBMCs individuais desafiados com células cancerosas moribundas (tratadas com DOXO) ou vivas (tratadas com PBS) foi feita usando o plug-in Trackmate, como visto em Figura 6A (painel esquerdo). Os valores relevantes de quimiotaxia e gráficos de migração foram gerados automaticamente usando a Ferramenta de Quimiotaxia e Migração, conforme detalhado em62. As trajetórias celulares foram todas extrapoladas para (x, y) = 0 no tempo 24 h. Os resultados indicaram um perfil migratório diferente das células imunes quando co-carregadas com células de câncer de mama expostas a DOXO ou PBS. Quando os PBMCs foram confrontados com células cancerosas apoptóticas, eles cruzaram microcanais em direção a células mortas (mas não para células vivas não tratadas). Migração X/Y aranha e rosa plots, apresentados no painel esquerdo Figura 6B-C, foram mapeados e comparados para destacar o impacto dos agentes indutores imunogênicos nas diferenças na dinâmica imunológica. Os gráficos de Rose demonstram que as PBMCs migraram principalmente em quase todas as direções no experimento controle, apenas uma fração insignificante é guiada até o gradiente gerado pela proliferação de células cancerosas. Por outro lado, os caminhos das células individuais destacam um forte movimento de viés ao longo da direção das células apoptóticas do câncer de mama (direção x negativa). Para avaliar a migração de células imunes direcionadas para células cancerosas tratadas com DOXO ou PBS, vários parâmetros de quimiotaxia são calculados, incluindo: a) o centro de massa (ponto médio espacial de todos os desfechos); b) a direcionalidade; c) o índice de migração para frente (isto é, o deslocamento celular médio em uma direção de interesse que significa em direção ao local alvo do tumor, em nosso caso). Estes últimos valores representam uma medida da eficiência de uma célula em migrar na direção de estímulos quimiotáticos dados. Após atingir a câmara esquerda, uma fração de leucócitos com densidade crescente ao longo de 24-48 h exibiu contatos de longo prazo (>60 min) com MDA-MB-231 tratado com DOXO. Os PBMCs não conseguem migrar massivamente e se envolver em tais interações persistentes e de longo prazo com células cancerosas vivas (como mostrado por microfotografias representativas de PBMCs se aproximando em Figura 6A, certo). Para quantificar as diferenças na interação tumor-imune, a região tumoral foi delineada com um círculo fixo de diâmetro variando de 20 a 80 mícrons, denominado "hotspot". A quantificação e análise a partir de FOVs representativos são mostradas em Figura 6 (Painel direito, B-C).

Na Seção 2, um novo modelo de tumor imunocompetente 3D foi descrito para quantificar o recrutamento de células imunes em resposta a combinações anticâncer de drogas epigenéticas32 (DAC/IFN vs IFN isoladamente), permitindo a comparação de duas condições diferentes de tratamento de células de melanoma A375 simultaneamente. Assim, células de melanoma A375M, marcadas com corante verde fluorescente PKH67, foram incluídas em matrizes Matrigel na presença de DAC e/ou IFN em cada câmara gel, enquanto PBMCs marcadas com PKH26 marcadas em vermelho foram distribuídas homogeneamente na câmara fluídica central no ponto inicial (Figura 7A). Comparamos simultaneamente as duas massas tumorais em matrizes 3D quanto à sua capacidade de atrair CMSP. Às 48 e 72 h, as CMSP são guiadas maciçamente para os microcanais do lado direito, como observado na Figura 7B.

Um homing preferencial de PBMCs em direção à matriz de gel contendo DAC/IFN-treated, em vez de IFN-theim, local de melanoma foi claramente observado, enquanto a baixa taxa de migração foi visível em direção às células A375 expostas a tratamento único (lado esquerdo do chip). O cenário competitivo é aplicável para investigar uma infinidade de diferentes fenótipos da biologia do câncer (por exemplo, resistentes a medicamentos versus agressivos, primários ou metastáticos (por exemplo, células de melanoma A375P vs A375M) e respondedores versus não respondedores). As câmaras de gel podem ser compostas por coculturas complexas de células malignas e múltiplas células não cancerosas associadas a tumores, como células endoteliais, células imunes e fibroblastos33 para caracterizar as respostas a drogas em nível de TME. Eventos de mitose e morte apoptótica de células cancerosas podem ser monitorados pela coloração com corantes vivos33. Procedimentos de imunomarcação em dispositivos microfluídicos 3D podem ser adaptados para avaliar estados de ativação de células imunes infiltradas em sítios tumorais por microscopia confocal35. Nesse sentido, esses sistemas microfluídicos 3D podem mimetizar estruturas tumorais complexas e interações multicelulares e, portanto, são plataformas valiosas para testes pré-clínicos mais confiáveis de drogas.

Figure 1
Gráfico 1. Planimetria do dispositivo microfluídico para montagem de co-culturas tumor-imune 2D. (A) Microfotografia real de 3 chips montados em uma única lâmina de microscópio. Os reservatórios são numerados dependendo da sequência de carregamento e são codificados por cores como as câmaras de cultura correspondentes listadas na legenda. Scalebar, 6 mm. (B) CAD 3D de chip composto por três áreas principais de cultura celular conectadas por microsulcos. C) Detalhes da ponte estreita de microsulcos, mostrando as dimensões adaptadas às células cancerosas e ao tamanho das PBMCs. D-E) A microfotografia de luz visível foi adquirida antes do início do time-lapse, mostrando a distribuição de células cancerosas e CMSP respectivamente na câmara esquerda e intermediária. Barra de escala, 500 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Gráfico 2. Pipeline de análise de trackmate para localização de pontos imunes em imagens de séries temporais. A) Painel superior: Captura de tela do menu de calibração de imagem do Trackmate. Painel inferior: Fiji "Menu de propriedades da imagem" para definir unidades de tempo e espaciais. B) Painel superior: Captura de tela do menu "Detecção de pontos" do Trackmate. Painel inferior: Imagem de saída com valores diferentes aplicados de "Threshold". C) Painel superior: Captura de tela do menu "Spot filtering" do Trackmate ilustrando alguns filtros. Painel inferior: Imagem exemplar de time-lapse, representando pontos imunológicos filtrados por posição ao longo de X na câmara intermediária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Gráfico 3. Pipeline de análise de trackmate para reconstruir trilhas imunes em sequências de imagens de séries temporais. A-C) Capturas de tela dos menus do Trackmate para construção de faixas, filtragem de trilhas e exportação de dados finais. D) Exemplos de trilhas geradas em imagens de lapso de tempo pré-processadas variando as configurações do detector de ligação. E) Exemplo de falsos rastros e ligações ruins derivadas da detecção de bordas de células tumorais. F) As faixas são destacadas em verde selecionando linhas no arquivo .txt dos resultados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Gráfico 4. Visão geral esquemática para chips 3D imunocompetentes em tumores. A) Exemplo de um mestre de silício microestruturado. Os carimbos para PDMS foram padronizados em resiste negativo SU-8 em uma instalação de sala limpa equipada com e-beam e litografia óptica. B) As réplicas do PDMS foram fabricadas por métodos de litografia suave padrão. A unidade central tem as câmaras coloridas como as desenhadas na renderização 3D do chip, retratadas no painel D. C) Microscopia eletrônica de varredura (MEV) visão ampliada da matriz de micropilares adequados para aprisionamento de solução de hidrogel. D) CAD 3D mostrando as câmaras, conectadas por microsulcos e os poços de carregamento. As caixas tracejadas são encaminhadas para fotografias SEM de detalhes (painel C e E). E) Fotografia MEV de microsulcos de conexão de 10 μm de altura. F) Layout CAD 2D descrevendo as dimensões das microestruturas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Gráfico 5. Workflow esquemático das principais etapas do protocolo de carregamento para montagem de co-culturas 3D. A) Painel superior: Esquema da etapa de injeção da solução de Matrigel em cada região lateral do gel. Painel inferior: Fotografia real do chip mostrando o avanço frontal do gel ao longo do canal durante a etapa de carregamento. B) Esquema da etapa de polimerização do Matrigel. Painel inferior: Visão microscópica de contraste de fase da interface gel-ar formada após a etapa de gelificação. Barra de escala, 100 μm. C) Painel superior: Desenho, representando o carregamento de células e meios com volumes exemplares utilizados no protocolo. Painel inferior: Uma imagem de contraste de fase 4X da co-cultura montada em 0h é mostrada. Barra de escala, 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Gráfico 6. Análise do perfil migratório e comportamento de interação das CMSP frente à câmara tumoral morirosa/viva na janela de tempo de 24-48 h. Painel esquerdo. A) Capturas de tela de imagens pré-processadas em time-lapse sobrepostas com faixas coloridas imunes, extraídas pelo Trackmate. As vias imunes são obtidas por um único FOV nas condições experimentais indicadas no intervalo de 24 a 48 h na câmara intermediária. B-C) Trilhas de migração representativas e parcelas de rosas de PBMCs cultivadas nas duas condições diferentes (n = 1550 PBMCs versus células cancerosas tratadas com DOXO, DOXO + ou n =1434 PBMCs versus células cancerosas controle, DOXO-). Cada linha dentro dos gráficos x-y representa uma única trajetória PBMC e cada círculo representa a posição final de uma única célula em relação à posição inicial. Os pontos de partida são definidos como (0,0) usando uma transformação de coordenadas. As coordenadas e o deslocamento do centro de massa de migração celular são apresentados nas condições experimentais indicadas. O centro de coordenadas de massa e o deslocamento (calculados como a distância euclidiana média para os componentes X e Y) fornecem indicação da direção média em que o grupo de células viajou primariamente e a magnitude do movimento celular geral em grupos de condições. As linhas azul e verde, respectivamente, marcam faixas individuais pelo valor da distância euclidiana maior/menor que um valor limite (100 μm). D) Esquema de dados numéricos extraídos por uma trilha celular. E-F) Box & Whiskers plot descrevendo respectivamente direcionalidade (p<0,0001 Unpaired t test with Welch's correction) e FMI (p<0,0001 Unpaired t test with Welch's correction). A linha horizontal nas caixas representa valores medianos. Os valores de FMI são a média para todas as faixas de célula em cada grupo de condições. Painel direito. A) Capturas de tela de ROIs extraídas do Trackmate mostrando interações diferenciais entre PBMCs e células cancerosas tratadas com DOXO ou PBS. B) Densidade de tempo de CMSP em torno de células cancerosas tratadas com DOXO ou controle MDA-MB-231. Número de PBMCs presentes em ROI selecionado em torno de células cancerosas para cada condição. Os valores relatados são a média acima de 9 ROI selecionados de um único FOV de lapso de tempo. Os hotspots de câncer são definidos em uma ROI (80 μm de diâmetro). O mapa de calor de densidade correspondente é exibido. Os pontos representam o número médio de células calculado ao longo de 9 focos de câncer em pontos de tempo indicados. C) Distribuição dos tempos (min) de contatos para cada grupo experimental. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Gráfico 7. Recrutamento preferencial de CMSP em resposta a combinações de fármacos DAC mais IFN em um melanoma imunocompetente 3D competitivo em modelo chip. A) Distribuição dos PBMCs inicialmente carregados na câmara central dos dispositivos microfluídicos. As microfotografias são adquiridas por microscópio de fluorescência EVOS-FL durante intervalo de 0-72 h. A fluorescência vermelha (células marcadas com PKH67) representa CMSP de doadores saudáveis. Células de melanoma humano marcadas com PKH67 (verdes) embutidas em Matrigel contendo tratamentos de combinações simples ou duplas foram plaqueadas em câmaras laterais. B) A375 células mais IFN à esquerda versus A375 mais DAC/IFN à direita. Imagens de fluorescência foram mostradas em 72 h de co-cultivo. A caixa amarela descontinuada mostra um recrutamento visivelmente maciço no lado A375 mais DAC/IFN. C) Contagem de PBMC em quatro ROIs diferentes de câmaras IFN vs câmaras DAC+IFN. Os histogramas representam a contagem de células +/- S.D.; heatmap enumerou valores de cada ROI. Scalebars, 200 μm. D-G) Esquemas das etapas de segmentação e quantificação de CMSP infiltradas em matrizes de gel aplicadas a imagens de fluorescência de canal único. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo Suplementar. Protocolo de microfabricação Clique aqui para baixar este arquivo.

Filme Suplementar 1. Sequências de lapsos de tempo em uma co-cultura on-chip imune a tumores 2D. As microfotografias foram adquiridas a cada 2 min, em um intervalo de tempo de 0-24 h, por meio de um microscópio compacto colocado em uma incubadora de cultura de células padrão. Painel esquerdo. Filme de CMSP de doadoras saudáveis (WT, tipo selvagem), plaqueadas com MDA-MB-231 controle de células de câncer de mama. Painel direito. Filme de uma migração maciça de PBMCs WT em direção à câmara de chip onde as células cancerosas tratadas com MDA-MB-231 DOXO, são carregadas. O layout do chip 2D é descrito em detalhes na seção 1 do Protocolo e mostrado na Figura 1. Por favor, clique aqui para baixar este filme.

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Discussion

Os métodos descritos tentam desenhar uma abordagem geral para recapitular, com grau de complexidade modulável, dois aspectos significativos no campo da oncoimunologia, que podem se beneficiar da adoção de modelos in vitro mais relevantes. O primeiro envolve o lado da população de células tumorais, onde o tratamento de características de células únicas pode levar a uma melhor descrição da heterogeneidade e significado biológico e clínico correlacionado, incluindo resistência à terapia, propensão à metástase, células-tronco e grau de diferenciação. O outro lado da história é representado pela EMT, incluindo componentes não cancerosos (células imunes e estromais, vasos sanguíneos) e paisagem química/física (constituintes da MEC, quimiocinas e outros fatores solúveis liberados) que podem moldar profundamente tanto as características da doença quanto a resposta do indivíduo à terapia63, particularmente à imunoterapia. Vale ressaltar que exportar a abordagem descrita para outros campos de pesquisa requer uma compreensão profunda das limitações e desafios trazidos pelo desenvolvimento e adoção de novos modelos.

Citando uma máxima aplicada em modelagem de engenharia ("modelar o problema e não o sistema"), ela deve ser otimizada que é o número mínimo de componentes (celulares, físicos e químicos) e as condições necessárias para fazer o próprio modelo on-chip biologicamente relevante e estável ao longo de todo o experimento. Cada combinação de tipos celulares/microambiente/ambiente experimental deve, portanto, ser escolhida com precisão, avaliada e monitorada continuamente ao longo de experimentos únicos e de sessão em sessão. Essas verificações incluem, como mencionado nas seções do protocolo, o controle rigoroso de parâmetros como volumes nos dispositivos microfluídicos que podem ser modificados por condições de umidade ou aquecimento de fontes de iluminação, possíveis movimentos e não planaridade dos estágios que causam derivas líquidas descontroladas, mas também alguma verificação final do estado celular, viabilidade e caracterização fenotípica. Um passo crítico diz respeito à decisão de usar sistemas de perfusão para criar estruturas vascularizadas (like), ou para liberação de fármacos on-chip33, uma vez que isso pode afetar os experimentos em termos de complexidade crescente, duração da cultura celular e modulação dos fatores químicos na presença de células flutuantes como as imunes.

A seguir, resumimos as principais questões críticas e relevantes encontradas nos cenários experimentais e na literatura mais recente.

ECM e definição de paisagem química
A TME é profundamente afetada também pelas propriedades mecânicas 64,65 do entorno63, 66. Por essa razão, a escolha da matriz de cultivo é fundamental, especialmente quando se trata de células imunes que, em determinadas condições, poderiam responder a sinais liberados pela própria matriz. Avanços relevantes são esperados no futuro próximo também a partir do projeto e desenvolvimento de novos materiais e hidrogéis (caracterizados por diferentes rigidez, porosidade, presença de fatores solúveis, entre outros parâmetros) que estão possibilitando uma MEC cada vez mais refinada e controlável, mimetizando especificidades de diferentes tecidos hoje, diferentes pacientes amanhã. Por outro lado, também é fundamental monitorar as mudanças induzidas pelas diferentes populações celulares na MEC e definir estratégias para incluir essas informações em análises dinâmicas e fenotípicas.

Gerenciamento de dados
O caminho para a implantação de técnicas on-chip de tumor em um fluxo de trabalho clínico vai se beneficiar de um enorme trabalho experimental que está ocorrendo em várias direções. Os modelos organ-on-chip, como muitas técnicas in vitro, são funcionais, pelo menos potencialmente, para realizar medições de alto rendimento/alto conteúdo. A paralelização das condições experimentais, incluindo controles positivo e negativo, e replicações técnicas/biológicas é possível pela integração de vários cavacos na mesma placa. O aumento na taxa de transferência quantitativa desempenha um papel crucial na tradução e validação desses sistemas em pipeline rápido de triagem de drogas ou genes para imunoterapias. De fato, várias empresas já desenvolveram plataformas em formato multipoço, e diferentes abordagens de imagem estão sendo testadas para permitir o monitoramento de um grande número de dispositivos simultaneamente14. Nos protocolos descritos acima, utilizamos lâminas de microscópio alocando até 3 chips, com a possibilidade de visualizar até 12 condições experimentais em paralelo, utilizando uma bandeja multilâmina de microscópio padrão. Esta configuração é compatível com pipetagem manual e adequada para ajustes orientados personalizados realizados em nossas instalações de microfabricação. Pelo contrário, quando uma forte paralelização é necessária (múltiplos testes de triagem e controles), otimizações de configuração para definir um nível mais alto de automação (ou seja, uso de robôs de pipetagem, multipoços plásticos) são necessárias.

Ao projetar experimentos, um trade-off entre resolução espacial e temporal deve ser levado em consideração.

A enorme quantidade de dados, produzida pela microscopia de alto conteúdo, constitui um fator limitante em termos de armazenamento, transferência e análise. Essas questões estão sendo abordadas com abordagens computacionais implementando ferramentas de aprendizado de máquina e recursos de hardware/software, o que pode promover a possibilidade futura de vincular experimentos on-chip/in-silico67,68 na escolha de estratégias terapêuticas, e isso representa uma oportunidade ambiciosa, mas não transferível.

Além da imagem por fluorescência
A marcação por fluorescência, por corantes ou genes repórteres, devido à sua alta especificidade, representa, sem dúvida, o método padrão-ouro para identificar diferentes populações celulares em condições de co-cultivo e resolver propriedades moleculares com alta SNR. Em modelos OOC esta abordagem é comumente usada como referência e particularmente em microambientes heterogêneos tumor-on-chip, pode ser valiosa para caracterizar o fenótipo de células imunes infiltradas e interagindo.

No entanto, há evidências crescentes de que os efeitos induzidos por fluoróforos, procedimentos trabalhosos de coloração e rotinas de iluminação devem ser monitorados e minimizados69, pois podem afetar profundamente o comportamento e o estado celular70,71. Esse risco parece particularmente verdadeiro para sistemas frágeis, como as células imunes72,73. Reações fototóxicas podem introduzir limitações na definição da janela temporal de aquisição de células vivas quando monitoradas em alta resolução espacial e temporal. Além disso, a riqueza na variedade de subpopulações imunes torna inviável discriminá-las apenas pela coloração fluorescente, considerando o número limitado de filtros comumente disponíveis em microscópios.

Para resolver essa questão, do ponto de vista instrumental, novas técnicas de microscopia livre de rótulos74, como a microscopia holográfica56 ou a microscopia hiperespectral57, estão agora aparecendo no palco. Eles prometem estratégias avançadas de classificação de processos celulares além da fluorescência e podem ser particularmente valiosos para o estudo de amostras sensíveis. Do ponto de vista da análise de dados, abordagens computacionais avançadas, baseadas em algoritmos de aprendizagem profunda75 (treinados por conjuntos de dados de imagens de fluorescência), são abridores de portas para realizar a chamada "marcação in silico"76,77. Eles foram aplicados com sucesso para prever marcadores fluorescentes a partir de imagens de campo claro78, gerando imagens marcadas, sem colorir células, aumentando assim o poder informativo da microscopia de campo brilhante. Essa estratégia também pode ser útil para economizar tempo e canais de fluorescência para outros marcadores. Acreditamos que a comunidade OOC se beneficiará dessas novas técnicas, permitindo um estudo menos invasivo da interação de populações celulares.

Análise de dados
Mecanismos de interações entre células cancerosas imunes e alvo podem ser investigados através do rastreamento dos movimentos celulares28,79. Experimentos de rastreamento de lapso de tempo em coculturas complexas e heterogêneas são extremamente valiosos para extrair padrões de migração celular, mudanças morfológicas e de estado e informações abrangentes sobre linhagens. A realização de análises manuais praticamente só é viável para sequências curtas com poucas células, mas não para experimentos sistemáticos de alto rendimento. Consequentemente, o desenvolvimento de ferramentas computacionais para rastreamento celular, total ou parcialmente automatizadas, é um campo vital de pesquisa em análise de imagens24. Normalmente, o rastreamento celular convencional requer uma frequência relativamente alta de amostragem e resolução espacial para executar corretamente tarefas de segmentação, o que pode ser desafiador em muitas condições experimentais. Para localizar células, existem ferramentas de segmentação e rastreamento de acesso aberto disponíveis (por exemplo, software ImageJ22) conforme apresentado neste protocolo ou software proprietário dedicado. Em estudos em larga escala, aplicamos um software proprietário chamado Cell Hunter16,31, desenvolvido pela Universidade de Tor Vergata, em Roma, para distinguir de forma totalmente automática células cancerígenas e imunes em contexto multipopulacional. Soluções sob medida baseadas em aprendizado de máquina e abordagens de redes neurais 80,81,82 estão começando a ser implementadas hoje em pacotes de software de microscopia 83, desde a melhoria do SNR até o gerenciamento de parâmetros críticos de aquisição ou etapas de segmentação. O aprendizado de máquina pode ser explorado para reconhecer padrões celulares comuns (por exemplo, estilos de movimento) a fim de caracterizar a resposta biológica com relação a fatores microambientais.

Em Comes et al.41, uma arquitetura de Rede Neural Convolucional de Aprendizagem Profunda pré-treinada foi aplicada para classificar se as células cancerosas são ou não expostas a um tratamento medicamentoso usando como "marcador" a motilidade das células imunes, rastreadas a partir de dados de lapso de tempo de co-culturas de células de câncer de mama e PBMCs em matrizes de colágeno em microdispositivos, conforme descrito em33.

Desenvolvimento de métodos e ontologias ômicas unicelulares
Apontamos a necessidade de uma aliança estratégica entre tecnologias ômicas unicelulares84 (e.g., proteômica, metabolômica, genômica) e métodos on-chip: a caracterização molecular detalhada, conjugada a informações dinâmicas funcionais, poderia melhorar a compreensão de mecanismos básicos e a descrição clínica. Neste caso, novos instrumentos para ligar os dois mundos estão em seu início85. O primeiro desafio é implementar abordagens ômicas de célula única diretamente nos chips de oncoimunologia22. Além disso, organ-on-chips poderia ser explorado como plataformas para testar potenciais alvos identificados por análises genômicas e proteômicas86,87. Uma segunda ferramenta de ligação, que ainda está em grande parte ausente, é uma maneira estruturada e padronizada de anotar e armazenar os resultados medidos do sistema88,89. Mas é exatamente disso que precisamos no futuro para construir bancos de dados sistemáticos de resultados quantitativos celulares e características medidas, para minerar, inferir e correlacioná-los com a informação biológica inerente. Em uma palavra, a necessidade de padronização e análise sistemática de conjuntos de dados experimentais heterogêneos exige uma estrutura de ontologia.

Personalização de modelos
A tecnologia organs-on-chip é adequada para personalização12, uma vez que células e tecidos de pacientes isolados (ou classes de pacientes) podem ser usados nos dispositivos sob condições controladas, levando a leituras clinicamente relevantes, úteis para informar estratégias terapêuticas ou de prevenção. Alguns exemplos começam a aparecer na literatura90. É claro que, para modelos tumor-on-chip, esse desafio coloca várias questões técnicas e científicas a serem resolvidas36 (como o controle de características da TME, como concentração de oxigênio, gradientes de citocinas, etc). É importante ressaltar que a perspectiva de tornar as terapias oncológicas e onco-imunológicas mais eficazes, reduzindo os efeitos nocivos para cada paciente, é atraente, tanto do ponto de vista da qualidade de vida quanto da otimização dos recursos de saúde.

Em conclusão, é evidente que este campo é autenticamente interdisciplinar e, como tal, requer um grande esforço no estabelecimento de uma linguagem comum e objetivos compartilhados entre pesquisadores, clínicos, indústria, mas também de diferentes disciplinas (engenharia, biologia, ciência de dados, medicina, química) encontrando um bom equilíbrio e novas soluções91.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar. A AS é apoiada pela Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) e pelo Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS e FM são apoiados pela Associação Italiana para Pesquisa do Câncer (AIRC) no. 21366 para G.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials 
50 mL tubes Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS430828 centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC Millipore-Sigma; St. Louis, MO A3656 DNA-hypomethylating agent
6-well plates Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS3506 culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask Corning, New York, NY 430641U culture flasks
A365M American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		 human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride Millipore-Sigma; St. Louis, MO D1515 anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0728L Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium EuroClone Spa, Milan, Italy ECB4004L saline buffer solution
Fetal Bovine Serum EuroClone Spa, Milan, Italy ECS0180L ancillary for cell culture
Ficoll GE-Heathcare 17-1440-02 separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometer Neubauer Cell counter
Heparinized vials Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b Millipore-Sigma; St. Louis, MO SRP4595 recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3000D ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media Cedarlane Labs, Burlington, Canada Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel Corning, New York, NY 354230 growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231  American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA  HTB-26 human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X   EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3001D ancillary for cell culture
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201 Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH26GL red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH67GL green fluorescent cell dye
RPMI-1640 EuroClone Spa, Milan, Italy ECM2001L Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 15250061 cell stain to assess cell viability
Trypsin EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0920D dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator  Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C) FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Steril VBH 72 MP Laminar flow hood
Optical microscope Zeiss
Refrigerable centrifuge Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) Sigma Aldrich A3648 silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ  MB W&A,  Germany optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm) Ibidi, Germany 10812
Hydrogen Peroxide solution 30% Carlo Erba Reagents 412081 reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone Carlo Erba Reagents 461945 PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm  Sail Brand 7101 substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm Tedpella dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa Allresist,Germany AR-P. 679.04 Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips Ibidi, Germany 10813 substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped Gambetti Xenologia Srl, Italy 30255
Propan-2-ol Carlo Erba Reagents 415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Sigma Aldrich 484431-4L SU-8 resists developer
SU-8 3005 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0001 Negative Photoresists
SU-8 3050 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0005 Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm Tedpella 15111-40, 15111-60, 15111-80 dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96% Carlo Erba Reagents 410381 reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dowsil, Dow Corning 11-3184-01 Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS) Sigma Aldrich 92360-100ML silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

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De Ninno, A., Bertani, F. R., Gerardino, A., Schiavoni, G., Musella, M., Galassi, C., Mattei, F., Sistigu, A., Businaro, L. Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments. J. Vis. Exp. (170), e61895, doi:10.3791/61895 (2021).

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