Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה

Published: April 30, 2021 doi: 10.3791/61895
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 3, 2, 3,4, 1
1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

Summary

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

Abstract

מודלים מורכבים של מחלות דורשים כלים חדשניים המסוגלים לספק תובנות פיזיולוגיות ופתולוגיות רלוונטיות וניתנות לפעולה, ולחשוף תהליכים בלתי נראים אחרת. מבחני תאים מתקדמים המחקים באופן הדוק את נוף in vivo מבססים את עצמם כדרכים חדשות לדמיין ולמדוד את יחסי הגומלין הדו-כיווניים בין הגידול למארח המשפיעים על התקדמות הסרטן. כאן אנו מתארים שני פרוטוקולים רב-תכליתיים ליצירת תרביות דו-ממדיות ותלת-ממדיות הניתנות לשליטה גבוהה במיקרו-מכשירים, המחקים את המורכבות של מיקרו-סביבה גידולית (TME), תחת מעקב חיסוני טבעי ומונע טיפול. בחלק 1, ניתנת הגדרה ניסיונית לניטור crosstalk בין תאי גידול דבקים לבין אוכלוסיות חיסוניות צפות, על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר בהילוך מהיר. כתרחיש אפליקטיבי, אנו מנתחים את ההשפעות של טיפולים אנטי-סרטניים, כגון מה שמכונה גורמים אימונוגניים למוות של תאי סרטן על גיוס והפעלה של תאים חיסוניים. בסעיף 2, מיקרו-סביבות תלת-ממדיות של גידולים חיסוניים מורכבים בפריסה תחרותית. חדירה חיסונית דיפרנציאלית מנוטרת על ידי תמונות פלואורסצנטיות עד 72 שעות, כדי להעריך אסטרטגיות טיפוליות משולבות. בשתי ההגדרות, שלבי עיבוד תמונה מתוארים כדי לחלץ שפע של פרמטרים של תאי מערכת החיסון (למשל, נדידת תאי מערכת החיסון ואינטראקציה, תגובה לחומרים טיפוליים). שיטות פשוטות וחזקות אלה יכולות להיות מותאמות עוד יותר כדי לדמות את המורכבות של TME המקיפה את ההטרוגניות והפלסטיות של תת-סוגים של תאי סרטן, סטרומה ותאי חיסון, כמו גם את יחסי הגומלין שלהם כמניעים של אבולוציה של סרטן. התאימות של טכנולוגיות אלה המתפתחות במהירות עם הדמיה של תאים חיים עם תוכן גבוה יכולה להוביל ליצירת מערכי נתונים אינפורמטיביים גדולים, ולהביא אתגרים חדשים. ואכן, המשולש "תרביות משותפות/מיקרוסקופיה/ניתוח נתונים מתקדם" סולל את הדרך לפרמטריזציה מדויקת של הבעיה שעשויה לסייע לפרוטוקולים טיפוליים מותאמים אישית. אנו צופים כי שילוב עתידי של חיסון לסרטן על שבב עם בינה מלאכותית לעיבוד בתפוקה גבוהה יהווה סינרגיה גדולה קדימה במינוף היכולות ככלי חיזוי ופרה-קליניים לאונקולוגיה מדויקת ומותאמת אישית.

Introduction

האבולוציה של ענפי רפואה שונים כדיסציפלינות ניסיוניות הייתה תלויה ביכולת לתמרן את אוכלוסיית התאים ואת תפקודי האיברים בתנאים מבוקרים1. שורשיה של יכולת זו נעוצים בזמינותם של מודלים מדידים המסוגלים לשחזר תהליכים המתרחשים בגופנו.

בעידן האימונותרפיה ופרופיל גנומי חד-תאי 2, הביולוגיה של הסרטן צריכה לנצל את המודלים המתפתחים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני תקין 2,3.

מיקרו-סביבהגידולית 4 (TME) היא רקמה מורכבת שבה תאים סרטניים מתקשרים ברציפות ומתפתחים באופן דינמי עם תאים אחרים (תאי מערכת החיסון, סטרומה ואנדותל) ושאינם תאיים (המטריצה החוץ תאית, ECM). האופי הדינמי של הנוף המורכב הזה מכתיב אם תאי מערכת החיסון משחקים כחברים או אויבים של תאים ממאירים, ובכך משפיע מאוד הן על התקדמות המחלה והן על התגובה לטיפול. כיום, מאמצים גדולים של אונקו-אימונולוגים, ביואינפורמטיקאים ומומחים לביולוגיה מערכתית מתכנסים כדי להתמודד עם המשמעות הקלינית של הטרוגניות סרטן 5,6, הן במרחב (כלומר, באזורים גידוליים נפרדים) והן בזמן (כלומר, בשלבי התקדמות גידול מובהקים)5,6, ולאפיין פנוטיפ סרטן ותאי חיסון ולתפקד ברמה של תא יחיד. כדוגמה לסינרגיה זו, טכניקות מתקדמות של ראייה ממוחשבת משמשות כיום באופן שגרתי למיפוי מרחבי של חדירת מערכת החיסון בדגימות היסטולוגיות 7,8.

בחזית המודלים הניסיוניים, המגשרים בין מחקרים בבעלי חיים לבין שיטות מסורתיות במבחנה, ההתקדמות במיקרופלואידיקה ובטכניקות של תרבית משותפת מעניקה גישה לסוגים שונים של מודלים תאיים מהונדסים מיקרו כגון אורגנואידים, מערכות מיקרו-פיזיולוגיות 9,10,11 (MPS) ואיברים על שבב12,13,14 (OOC). הם חולקים את התכונה המשותפת להתמקד במבט "התמונה הגדולה" של המערכות האקולוגיות הסלולריות ולהרחיב את הפוטנציאל במבחנה לשלוט בגורמים מיקרו-סביבתיים תוך ניצול מיקרוסקופ15 בעל תוכן גבוה וגישות עיבוד תמונה.

כיום, מערכות MPS ו- OOC חדישות החלו לכלול היבטים אימונולוגיים , המשלבים תת-סוגים שונים של תאים חיסוניים ברקמות קיימות ובתרביות משותפות, כדי לחקור ולמדוד מגוון תהליכים כמו מחלות דלקתיות, ריפוי פצעים, חסינות רירית ותגובה לרעלים או מוצרי מזון יומיומיים16. דגמי TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, המשולבים גם עם מיקרו-כלים מתבלבלים 18,19,20,21, פותחו כדי לחקור אינטראקציות תלויות סוג תא, הפרעות פיזיקליות וכימיות והפעילות ציטוטוקסית של חדירת לימפוציטים22, כמו גם חומרים אימונומודולטוריים רלוונטיים מבחינה קלינית23.

כאן, אנו מספקים פרוטוקולים רב-תכליתיים, החל מטעינת תאים בשבבים ועד לכלי עיבוד תמונה, לניצול תרביות מיקרופלואידיות מתקדמות של גידולים וגידולים בדו-ממד (סעיף 1) ובתלת-ממד (סעיף 2)הגדרות 16, התואמות לניטור והדמיה דינמיים ורב-פרמטריים של24 פונקציות תאיות. זה מושג תוך שמירה על קלות השימוש והגמישות הן בניהול דגימות והן בניתוח נתונים, תוך ניצול תוכנת התוכנה החופשית של פיג'י וארגזי הכלים שלה25,26.

המכשיר המיקרופלואידי, המתואר בסעיף 1, נועד לבצע תרביות דו-ממדיות של סרטן דבק ותאים חיסוניים צפים. פלטפורמה זו אומתה למדידה חוץ גופית של התנהגות תאי מערכת החיסון בנוכחות מוטציות גנטיות27 ו/או ליקויים חיסוניים28. כאן, אנו מדגימים שלבים למעקב אחר תאי מערכת החיסון בתמונות שדה בהיר בהילוך מהיר, על ידי ניצול שיטה חצי-אוטומטית המבוססת על Trackmate (תוסף המיושם בתוכנת פיג'י). הליך זה מאפשר חילוץ של תיאורים קינמטיים של נדידת מערכת החיסון 29 ותגובה (כלומר, זמני אינטראקציה) כדי להתמקד בתאים סרטניים, מטופלים או לא עם גורמים למוות של תאים אימונוגניים27.

חשוב לציין כי פרמטרים אלה, המופקים מתמונות מסדרות זמן, ניתנים לעיבוד באמצעות מכונות מתמטיות מתקדמות. כדוגמה לפוטנציאל של גישה זו, הקבוצות שלנו פרסמו לאחרונה ניתוח המבוסס על שיטות מתמטיות מתהליכים סטוכסטיים ומכניקה סטטיסטית כדי למדל תכונות רשת תאית ולספק תיאור פרמטרי של התנהגות תאי מערכת החיסון (כלומר, הליכה אקראית מוטה או לא מתואמת, תנועה מתואמת מאוד או לא מתואמת30,31).

ההגדרה התלת-ממדית, המסופקת בחלק השני, מבוססת על פרוטוקול תרבית משותפת כדי ליצור מחדש TMEs מורכבים יותר של מערכת החיסון המשובצים בשני אזורי ג'ל עם שילובים שונים של סוגי תאים ותרופות באופן תחרותי. כאן, מתוארים שלבי עיבוד תמונה כדי למדוד, בנקודות זמן שונות, את החדירה של תאי חיסון מוכתמים בתאי מלנומה A375M אנושיים המעובדים בתוך מטריג'ל, כדי להעריך שילובים של חומרים אנטי-סרטניים32. קו A375M, קו תאים נגזר A375P המאופיין בפנוטיפ גרורתי מאוד נבחר כדי להעריך את יכולתם הגרורתית בנוכחות תאי חיסון32.

המודלים המתוארים יכולים להיות תואמים באופן מלא עם מקורות תאים שונים (מורין ובני אדם אימורטליזציה או קווי תאים ראשוניים, אורגנואידים, xenografts, בין היתר). במחקרים האחרונים של המעבדה שלנו, על ידי שילוב של מיקרוסקופ וידאו בתוכן גבוה עם ניתוח תמונה, הפריסה התלת-ממדית התחרותית יושמה כדי לחקור: i) תגובה חיסונית אנטי-גידולית (ציטוטוקסיות בתיווך תאים תלוית נוגדנים, ADCC) ולנתח את התפקיד של פיברובלסטים בעמידות לטיפול בטרסטוזומאב במודלים של סרטן שד HER2+ על שבב33; 2) פעולתם של תאים מיאלואידים (כלומר, מקרופאגים הקשורים לסרטן) במנגנוני התחמקות הגידול וגיוס תאי T34; iii) יעילותם של משטרים אימונותרפיים, המבוססים במיוחד על תאים דנדריטיים מותנים אינטרפרון-α (IFN-DCs), המעובדים עם תאי סרטן המעי הגס שטופלו בתרופות במטריצות קולגן, ולהעריך תנועה יעילה ואת אירועי הפאגוציטוזה הבאים35; iv) נדידה כימוטקטית של אאוזינופילים שמקורם במח עצם לעבר תאי מלנומה IL-33 שטופלו או לא טופלו36.

מודלים מתקדמים אלה יכולים לשמש חלונות תצפית להבנת תפקיד מרקם החיסון בגרורות סרטניות ובמנגנוני עמידות, אך נדרשים מאמצים לתרגם את הממצאים למרפאות, ובכך לסגור את הפער במחקר בסיסי37.

כתרחיש מתפתח, רתימת כוחה של מיקרוסקופיה אוטומטית בעלת תוכן גבוה בשילוב עם שימוש במיקרו-מערכות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית פותחת אתגרים פוטנציאליים חדשים לטיפול, עיבוד ופרשנות של מאות, ואפילו אלפי, ג'יגה-בייט של נתונים רב-פרמטריים, שניתן להפיק מקמפיין ניסיוני יחיד. משמעות הדבר היא קשר ישיר של ניסויי OOC עם אלגוריתמים מבוססי בינה מלאכותית 38,39,40,41,42 (AI) הן לניתוח אוטומטי מתקדם, והן ליצירת תכונות שיכולות להזין בתורן מודלים סיליקו של יחסי גומלין בין סרטן למערכת החיסון 43, עם יישומים חדשים ומלהיבים באופק, כגון פיתוח מבחני סינון תרופות מנבאים 44.

זרם הולך ומתרחב של מאמצים מתמקד בעיצוב מודלים של מחלות במשותף עם אופטימיזציה של אסטרטגיות ליישום מסכי הפרעה בקנה מידה גדול עם קריאות multi-omics תא יחיד. זה ללא ספק יעזור לפיתוח, ובתקווה, ליישום הקליני, המלווה במידה מתאימה של סטנדרטיזציה של שיטה, של גישה אונקו-אימונולוגיה-על-שבב שיטתית כדי לקבל תובנות חדשות על הפרעות חיסוניות ומנגנוני הפצת סרטן.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. תכנון שבבים לתאים דבקים וצפים בתרביות דו-ממדיות

הערה: פריסת התרבית המשותפת הדו-ממדית (איור 1A-C) מאופיינת בשלושה תאים (בגובה 100 מיקרומטר) המחוברים ביניהם באמצעות שתי קבוצות של מערכים מיקרו-ערוציים (500 x 12 x 10 מיקרומטר3, L×W×H). תא הביניים יוצר שני תאים סגורים ללא מוצא אשר חוסמים תאים חיסוניים צפים העולים על גדותיהם לאתר הגידול במהלך שלב ההעמסה 2.5. סוג התקן זה שימושי למדידות דו-ממדיות בזמן אמת של תנועתיות חד-תאית (דבקה או צפה), ושל אינטראקציות תא-תא 16,27,28,30,31. מחקר נדידת תאים טיפוסי (שנערך בין מספר שעות למספר ימים) משלב מיקרוסקופ תאים חיים עם אלגוריתמים לעיבוד תמונה45, על מנת לתרגם את רצפי התמונות הנרכשים לתכונות מספריות25. בהתבסס על דפוסי הנדידה, ניתן להעריך מספר אינדיקטורים ביופיזיים, כגון תזוזה ומהירות של תאים, כמו גם משך האינטראקציות בין תאי החיסון לתאי המטרה24.

  1. הכנת תאי סרטן ותאי PBMC
    1. תרבית תאים סרטניים
      הערה: MDA-MB-231 טריפל נגטיב [קולטן אסטרוגן (ER)-, קולטן פרוגסטרון (PR)-, וקולטן גורם גדילה אפידרמלי אנושי 2 (HER2)-] תאי אדנוקרצינומה אנושיים של השד גדלים באופן שגרתי במדיום 1640 של מכון הזיכרון רוזוול פארק (RPMI) בתוספת 10% (v/v) נסיוב בקר עוברי (FBS), 2 mM L-גלוטמין, 100 IU mL−1 פניצילין G נתרן מלח ו 100 מיקרוגרם mL−1 סטרפטומיצין סולפט (מדיום צמיחה), בתנאי תרבית סטנדרטיים (37°C ו-5% CO2).
      1. כדי לייעל את גדילת תרבית התאים, לוחית MDA-MB-231 תאים ב 75 ס"מ2 צלוחיות בצפיפות של 1 × 106 תאים mL-1 ב 12 עד 15 מ"ל של מדיום גידול.
      2. כאשר התאים מגיעים ל-75-80% מהמפגש, יש להשליך את מדיום הגידול, לשטוף תאים במי מלח חוצצי פוספט שחומם מראש (PBS) כדי להסיר לחלוטין FBS, ולאחר מכן לנתק אותם עם טריפסין שחומם מראש (1 עד 2 דקות ב-37°C).
      3. הוסף מדיום גידול כדי להשבית את הפעילות האנזימטית של טריפסין ולאסוף תאים מנותקים. שטפו תאים פעמיים במשך 5 דקות במהירות של 1,100 x גרם בטמפרטורת החדר (RT).
      4. ספירת תאים בשקופית ספירת תאים באמצעות בדיקת אי הכללת צבע כחול טריפאן ולאחר מכן זרעתם מחדש או לתרבית תחזוקה (לא יותר מ -6 מעברים מהפשרה) או להליכים ניסיוניים.
      5. עבור ניסויים מיקרופלואידים, זרע 1 × 10 6 תאים בצלחות6 בארות ב 3 מ"ל של מדיום גידול או לטפל עם 25 מיקרומטר doxorubicin (DOXO) או נפח שווה של ממס DOXO (PBS) כמו בקרה.
      6. ארבע עד 6 שעות לאחר מכן, שטפו תאים שטופלו ב-DOXO פעמיים עם PBS שחומם מראש במשך 5 דקות ב-1,100 x גרם ב-RT.
      7. ספור תאי בקרה שטופלו ב- DOXO ו- PBS כמפורט לעיל (ראה שלב 1.1.1.5) והגדר את התרבית המשותפת עם תאי דם מונוגרעיניים היקפיים (PBMCs) בהתקנים מיקרופלואידים.
    2. בידוד PBMC
      1. לאסוף דם ורידי שלם (10 מ"ל בערך) ממתנדבים בריאים בבקבוקונים heparinized ולערבב בעדינות על ידי היפוך הצינור 2 עד 4 פעמים47.
      2. לדלל דם 1: 1 עם PBS ושכבה מעל 10 מ"ל של צפיפות שיפוע בינוני Lymphoprep בצינור 50 מ"ל.
        הערה: הקפד לבצע את השכבות בעדינות רבה ובאיטיות רבה כדי לתת לדם ולימפופר ליצור שתי שכבות נפרדות.
      3. צינורות צנטריפוגות למשך 30 דקות ב 400 x גרם ב 4 ° C בדלי מתנדנד החוצה ללא בלמים. ארבע שכבות נפרדות ייווצרו: (i) פלזמה בחלק העליון, (ii) שכבה לבנה ועכורה המכילה PBMCs, (iii) לימפופר, ו-(iv) גלולה של אריתרוציטים וגרנולוציטים.
      4. יש לשאוף בעדינות PBMCs עם פיפטה של 2 מ"ל ומיד להשהות מחדש במדיום צמיחה חם (אותו הדבר משמש בשלב 1.1.1) ולשטוף פעמיים במשך 5 דקות ב 1,100 x גרם ב RT.
      5. יש לספור PBMCs כדוריים לעיל (ראה שלב 1.1.1.5) ולהשתמש בהם להליכים ניסיוניים או להקפיא לאחסון לטווח ארוך.
  2. ציפוי התאים בשבבים דו-ממדיים
    הערה: PBMCs אינם מוכתמים בפרוטוקול זה. כדי לאפיין פנוטיפים ספציפיים על שבב, ניתן לבודד תת-אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון על ידי בחירת חרוזים אימונומגנטית, להיות מוכתמות בעוקבי תאים פלואורסצנטיים, לערבב מחדש עם החלק הנותר ללא תווית, וכך להתמודד עם תאי סרטן מטרה, כפי שדווח בניסויים על שבב, המתוארים ב- Vacchelli et al.27, וב- Racioppi et al.34.
    1. לפני תחילת ניסויים בתרבית משותפת וכדי להקל על הוספת ריאגנטים, הפעל שבבים מאוחסנים על ידי טיפול פלזמה חמצן למשך מספר שניות. מלאו מיד מאגרים במים נטולי יונים, או PBS, כדי לשמור על משטחי PDMS (polydimethylsiloxane) הידרופיליים עד לשלבי הציפוי.
      הערה: PDMS הוא הידרופובי במהותו, מה שעלול לגרום לקשיים בתפעול וללכידה של בועות אוויר במיקרו-ערוצים. ראה שלב 7 בקובץ המשלים המספק פרטים על הפעלת פלזמה חמצן.
    2. יש לעקר מתחת לארון UV למשך 20 דקות, לשטוף 2-3 פעמים עם PBS טרי, ולאחר מכן לדגור עם מדיה תרבותית במשך 1 שעה. יש לשמור את השבבים באינקובטור עד לביצוע שלבי הציפוי.
    3. למשוך מדיה עודפת מכל ששת המאגרים. היזהרו שלא לשאוב את התקשורת מחדרי התרבות המרכזיים.
    4. מרחו באיטיות 1 × 105 תאים סרטניים המרחפים מחדש ב-10-20 מיקרוליטר של מדיום גידול במאגר השמאלי העליון, ולאחר מכן בבאר התחתונה (איור 1A, מאגרים 1 ו-2). המתן 5 דקות כדי לאפשר לתאים להיצמד לתא הגידול. חלק מהתאים ישקעו ויתחברו למאגרים.
      הערה: הכנס את המתלה הסלולרי לצד פתחי הערוצים. הליך זה מוחל על תאי סרטן MDA-MB-231, קווים אחרים ידרשו אופטימיזציה של צפיפות התא. כדי לשפר את ההתקשרות של תאים סרטניים, ניתן לבצע פונקציונליות ציפוי של משטחים (למשל, פולי-L-ליזין, פיברונקטין ). אנא עיין בפרוטוקולים שפורסמו בעבר עבור ציפוי שלבים16, 48,49,50.
    5. בצד ימין מזרימים בעדינות צינורות 1 × 106 PBMCs התלויים מחדש ב-50 מיקרוליטר של מצע גידול לתוך בארות 3 ו-4 (ראו איור 1A, מאגרים 3 ו-4).
      הערה: לאחר הזרימה, PBMC יתחלק לתוך תא הביניים וייצור "חזית", המייצגת את נקודת ההתחלה של הניסוי.
    6. מלאו את כל ששת המאגרים בעד 100-150 מיקרוליטר של מדיום גידול. תחת מיקרוסקופ בדקו שהתאים התפזרו כראוי בתאי התרבית כפי שמתואר באיור 1D-E. הכרכים הסופיים יכולים להשתנות בהתאם לגודל המאגרים. התאימו את הנפחים כך שיהיו שווים בכל הבארות.
    7. החזירו את השבבים לאינקובטור למשך כשעה כדי לייצב את המערכת לפני ההקלטה בהילוך מהיר. הוסף מדיום טרי כל 3 ימים, כפי שהוא עלול להיות נתון הפסדי אידוי.
      הערה: המערכת תואמת הן לאנליזה של תאים חיים/מתים והן לפרופיל דינמי של הפרשת ציטוקינים ממולטיפלקס ממדיה מותנית. עבור אנליזות כימוקינים, עד 200-250 μL aliquots של supernatants עשוי להיות נגיש על ידי איסוף מדיה משני המאגרים של כל תא. בדיקות פרופיל ציטוקינים קלאסיות של ELISA ו- Luminex דורשות כ- 50 μL של supernatants. ראה 51,52 דוגמאות למחקרים של מעבדות אחרות המבצעות פרופיל ציטוקינים במודלים של OOC.
  3. רכישה בהילוך מהיר של תאים סרטניים וחיסוניים לא מסומנים
    הערה: בדרך כלל, 3 שבבים מסודרים בשקופית מיקרוסקופ אחת (ראו איור 1A עבור שבב דו-ממדי ואיור 4B עבור שבב תלת-ממד). באמצעות מחזיקי במה המקצים 4 שקופיות, תרביות משותפות יכולות להיות מתאימות לניטור על ידי מיקרוסקופ אוטומטי בעל תוכן גבוה כדי לנתח קבוצות גדולות של תנאי ניסוי. ניתן להתקין שבבים בקלות על שקופיות בעובי השווה ל -1 מ"מ או 170 מיקרון (כיסויי פלסטיק או זכוכית, בארות מרובות תחתונות אופטיות 6 בארות) להדמיה קונפוקלית ברזולוציה גבוהה.
    1. הקלט סדרות תמונות בשדה בהיר של תאים ללא תווית באמצעות מערך מיקרוסקופ וידאו המצויד במערכת דגירה.
      הערה: כאן נרכשו מערכי נתונים של סדרות זמן (חלון זמן: 48 שעות, קצב פריימים: 2 דקות) במיקרוסקופ פלואורסצנטי, המצויד בפיקסלים 4x objective ו-CMOS 1.3M, המותאמים להתאמה לחממה סטנדרטית של תרביות תאים.
    2. חממו את המיקרוסקופ במשך שעתיים לפחות כדי לאזן ל-37°C ו-5%CO2 לפני תחילת הרכישה.
    3. בחר את חלון התצפית על ידי מרכוז מערך המיקרו-ערוצים בין הגידול לתא המרכזי. זה מאפשר לדמיין את הדינמיקה של חדירה חיסונית ואת האינטראקציות בתוך האזור שבו תאים סרטניים נזרעים.
    4. התאימו את עוצמת התאורה והמיקוד של תאי סרטן ומערכת החיסון.
    5. להשקת רכישת קיטועי זמן, מטב את קצב הפריימים ואת משך הזמן בהתאם לניסוי ולסוג התא הנחקר.
      הערה: יש למטב את תנאי ההדמיה כדי למנוע חשיפה מוגזמת לתמונות תוך שמירה על יחס אות לרעש (SNR) טוב. מכיוון שתאי מערכת החיסון תנועתיים מאוד, קצב הפריימים של הרכישה צריך להיות גבוה מספיק כדי לעקוב אחר התהליך הדינמי המעניין ולאפשר מעקב קל53. יש להגיע לפשרה בין אלגוריתם המעקב, התאימות לגודל מערך הנתונים המתקבל, והכדאיות, הצפיפות והתנועתיות של התאים הנצפים.
    6. בסוף קיטועי הזמן, השתמש בפונקציה Import Image Sequence ו- Save as של תוכנת ImageJ כדי להמיר את ערכת הנתונים של המסגרת בקובץ וידאו לא דחוס של 25 fps.
      הערה: קובץ הווידאו שנוצר מוכן כעת לניתוח מעקב אחר תאים. כאן, תמונות RGB (1280x1024 פיקסלים) נאספו ברזולוציה מרחבית של 1.33 מיקרומטר לפיקסל. סרט באורך 24 שעות (ערימה של 3.5 GB) של שדה ראייה יחיד (FOV) כולל 720 מסגרות לכל תנאי.
  4. ניתוח נתונים: חילוץ חצי אוטומטי של מסלולים חיסוניים לא מסומנים על ידי Trackmate
    הערה: כאן, ניתוח תנועתיות החיסון בתמונות דו-ממדיות ללא תווית בהילוך מהיר מתבצע באמצעות TrackMate54ארגז כלים בקוד פתוח הזמין בחבילת התוכנה פיג'י/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)., מספר אלגוריתמים מסופקים לביצוע מעקב אוטומטי אחר חלקיק יחיד55(SPT) של מבנים דמויי נקודה. הם יושמו ביעילות על תמונות פלואורסצנטיות, שבהן אובייקטים בהירים על רקע כהה עם SNR גבוה (כלומר, כתמים פלואורסצנטיים מתחת לרזולוציה, שלפוחיות תנועה מסומנות, גרעינים)1,25,56,57,58. SPT מבוסס בעיקר על שני שלבים עוקבים. ראשית, אובייקטים עוברים לוקליזציה עם מיקומים מזוהים במסגרות מרובות (סגמנטציה), כפי שסכמטי ב-תרשים 2. בשלב השני (קישור חלקיקים), כתמים שזוהו מקושרים על פני מסגרות עוקבות כדי להעריך תנועה ולשחזר את מסלולם, בצורת מסילה (תרשים 3). ניתן לחשב תכונות מספריות מכל מערך קואורדינטות X, Y, Z שחולץ לאורך זמן. תיעוד מורחב מדווח ב54וכן באופן מקוון (http://imagej.net/TrackMate), בעקבות ערכת הלימוד תחילת העבודה עם TrackMate. ניתן לבדוק את דיוק התהליך באופן מיידי, תוך שימוש בממשק משתמש גרפי אינטואיטיבי (GUI דמוי אשף) המאפשר למשתמשים, בכל שלב, להתאים מחדש את ההגדרות. החלק הבא מתאר בקצרה כיצד להשתמש ב- Trackmate לשלבי עיבוד וכימות תמונה, המוחלים על תמונות אור נראה:
    1. גרור ושחרר את ערימת הווידאו/תמונות המלאה בסרגל הכלים של פיג'י.
    2. הגדרת מחסנית כיול (איור 2A).
      1. בדוק את המימדיות והקצה את מאפייני התמונה על-ידי בחירה באפשרות Image> Properties. תיבות המילוי 'יחידת אורך', 'מידות פיקסלים' ו'מרווח זמן של מסגרת'.
        הערה: כדי לבצע את הכיול, השתמש באורך הידוע של המיקרו-ערוצים (500 מיקרומטר, איור 1C) וחלק באורך הנמדד המתאים בפיקסלים. לסדרות זמן דו-ממדיות, הקפד להחליף את שדה Z/T המזין 1 כ- z פרוסה ואת המספר הנכון של מסגרות סרט. אם הדבר לא יושג, התפוקות והפרמטרים הכמותיים של Trackmate ידווחו ביחידות פיקסלים ובמסגרות זמן.
    3. עיבוד מראש של תמונות.
      1. כדי לשפר את ההבחנה הנכונה של תאי מערכת החיסון מרקע רועש, יש לעבד מראש תמונות של שדה בהיר כדי לפצות על תוצרים. ודא שערכות הנתונים מורכבות מתמונות TIFF של 8 סיביות (טווח בהירות: 0-255).
        הערה: תאורה לא אחידה, SNR נמוך וזיהום על ידי חלקיקי פסולת קטנים בתמונות אור נראה עלולים לסכן את ההצלחה של תהליך מעקב אחר תאים. כאן, ערכות נתונים של סדרות זמן מעובדות מראש באמצעות חיסור רקע, פונקציית התאמת בהירות/ניגודיות, ועל ידי חיסור תמונה מקומי של טשטוש גאוס מתמונות מקוריות. קיימות ערכות כלי ניתוח שונות אחרות הזמינות ב- ImageJ לעיבוד ופילוח של תמונות עם ניגודיות פאזה או שדה בהיר, כולל סף הדרגתי אמפירי (EGT)59.
    4. לוח הכיול הראשון (איור 2A)
      1. לאחר בחירת אוסף תמונות, הפעל את Trackmate (תוספים>מעקב).  לשנות/לאשר את המימדיות ואת חלון הזמן של הנתונים (כלומר, רוחב פיקסלים ומרווח פריימים).
        הערה: TrackMate קורא באופן אוטומטי בתיבת מאפייני התמונה כדי לספק את תוצאות המעקב הסופיות ביחידות פיזיות מכוילות (כלומר, מיקרומטר ודקות).
      2. הגדר אזור עניין לחישוב חילוץ רצועות החיסון, על-ידי הוספה ידנית של ערכים או על-ידי ציור אזור סגור מעל התמונה הפעילה ולאחר מכן לחיצה על לחצן רענן מקור. כדי לחלץ נתיבי נדידת חיסון גלובלית, בחרו אזורים מלבניים בהתאמה בצד ימין של מיקרו-ערוצים (החדר המרכזי, איור 1E) ובצד שמאל (תא הגידול, איור 1D). כדי לנתח אינטראקציות בין סרטן ונקודות חמות של מערכת החיסון, ציירו אזורי משנה מעגליים באמצעות כלי החזר השקעה (עבור אל ערוך → בחירה → ציין).
        הערה: בעת הפעלת ארגז כלים זה בפעם הראשונה ביישום ביולוגי חדש, הקדש את הזמן הדרוש כדי למטב את ההגדרות לשחזור המסילות.
        הערה: בצע מעקב ידני אחר מסלולי התאים (כ- 50-100 תאים) כדי למצוא אמפירית את התצורה הנכונה ולאחר מכן לאמת כאמת מידה את המהימנות של חילוץ אוטומטי של תנועות. בנוסף, לעבוד בתחילה על שטח קטן יותר כדי לבדוק בקלות את הדיוק של הפרמטרים שנבחרו.
    5. שלב זיהוי כתמים חיסוניים (איור 2B)
      1. בחר את ברירת המחדל Laplacian של גלאי Gaussian (LoG). גלאי LoG עובד כדי למצוא עצמים בהירים, דמויי כתמים ועגולים ולהחיל מסנן Laplacian של גאוס על התמונה המכוונת לגדלי ספוט בינוניים (5 עד 20 פיקסלים קוטר).
      2. בקוטר Blob משוער (כאן, 10-13 מיקרומטר) הזן ערך מעט גדול יותר מגודל הספוט הצפוי. הגדל את ערך הסף (כאן 1-3 מיקרומטר) עד להפחתת כתמי רקע מזויפים נוספים, אולי מבלי להסיר את תכונות האובייקט. זיהויים מתחת לערך סף (בהתבסס על מדדי איכות) יימחקו מהניתוח הבא. סמן את התיבה עבור המסנן החציוני ולוקליזציה של תת-פיקסלים כדי לשפר את איכות זיהוי הספוטים.
      3. השתמש בלחצן תצוגה מקדימה כדי להציג ולבדוק במהירות תאים חיסוניים מזוהים המונחים על התמונות על ידי עיגולים בצבע מגנטה.
        הערה: לטעויות במהלך הזיהוי תהיה השפעה ניכרת על תהליך הקישור. זיהויים לא רצויים אחרים ניתנים לתיקון בתפריטים הבאים באמצעות מסננים המוגדרים על-ידי המשתמש (כלומר, לפי עוצמת ספוט, גודל או מיקום).
    6. לאחר שתסתפק בבחירות, לחץ על הבא.
      הערה: הגדרות אלה עשויות להשתנות בהתאם לאופני ההדמייה של ההקמה והרכישה של הניסוי (לדוגמה, FOV, הגדלה אובייקטיבית, תמונות שדה בהיר או פלואורסצנטי), סוג התא (תאים נצמדים או צפים), החל מתנועתיות איטית או מהירה, סוג ההתנהגות התאית (אינטראקציה או לא) וצפיפות נמוכה/בינונית/גבוהה באזור התצפית.
    7. המשך ודלג על תפריט סף ראשוני. בחר בחלון Hyperstack Displayer.
    8. קבעו מסננים בחלונית 'ספוט' (איור 2C).
      1. בחר: צבע אחיד. ניתן להוסיף מסננים, כפי שמוצג באיור 2C, כדי לשמור על נקודות מסומנות עם ערכי תכונות, המוצגות בהיסטוגרמה, מעל או מתחת לסף הפיך.
    9. שלב בחירת כלי המעקב (איור 3A). בחר את מעקב LAP פשוט, כאלגוריתם קישור חלקיקים המבקש שלושה שדות למלא (במקרה זה, "קישור מרחק מקסימלי": 30-50 מיקרומטר, "מרחק מקסימלי סגירת פער": 25-50 מיקרומטר, "פער סגירת פער מסגרת מקסימלי": 4-6). גלאי זה מנהל אירועי סגירת פערים, עם חישוב קישור עלויות אך ורק על בסיס המרחק שלהם.
      הערה: מרחק הקישור המרבי המותר מגביל את טווח החיפוש המרחבי אחר נקודות תואמות מועמדים, בהתאם לתזוזה המרבית המותרת בין שתי מסגרות עוקבות (איור 3D).
      1. ספק ערכים גדולים יותר של תזוזה מקסימלית כאשר מבחינים בפיצול רצועות של חלקיקים תנועתיים מאוד.
        הערה: שני קישורים לא יחוברו אם תנועת מסגרת למסגרת גדולה מערך המרחק המרבי הנתון. אם מקטעים מגשרים בצורה גרועה בין שני תאים שונים, הפחיתו את ערך התזוזה המרבית.
      2. נסו לחבר מחדש נקודות חסרות, תוך שינוי הערכים של "המרחק המרבי לסגירת הפער" ו"פער המסגרת המקסימלי".
        הערה: פרמטרים אלה עוסקים באירועי סגירת פערים במסגרות שאינן סמוכות. היעלמות נקודתית עלולה להתרחש בחלק מהפריימים (כלומר, חלקיקים מחוץ למיקוד, תאים שנותרו בחוץ וב-FOV, כשלים בסגמנטציה בתמונה רועשת).
        הערה: כדי לטפל בפיצול או מיזוג אירועים, בחר במקשר LAP כגלאי המציג קנסות מטריצת עלות קישור.
    10. לחץ על הבא כדי להפעיל את חישוב המעקב. לחץ על הבא.
    11. החלונית 'רצועות סינון' (איור 3B). שנה את הצבע של בחירת נתיבי החיסון, מהתפריט הנפתח, "מזהה מסלול" או תכונות מסלול אחרות. בשלב זה, בחר באופן אופציונלי להגדיר מסננים אינטראקטיביים פונקציונליים, כדי לשפר את איכות התוצאה ולבקר שוב את ההליך.
      הערה: כתמים מזויפים נובעים מרעש בתמונה ומאובדן איכות התכונה. זה ייצור מקטעים קצרים בעוד תאים מעניינים ניתן לעקוב על פני מסגרות רבות.
      1. להסרת נתיבים קצרים, נסו לסנן, בהתאם למספר הכתמים שהם מכילים. בנוסף, מיין רצועות באמצעות שילוב של אפשרויות כגון הזחת מסלול, משך מעקב או מהירות מינימלית/ממוצעת/מקסימלית כדי לא לכלול רצועות שגויות או לא רצויות (עם פחות מסגרות ביחס למשך הכולל של קיטועי זמן או הכוללים חלקיקים מלוכלכים או לא נעים) מהמשך העיבוד.
        הערה: בחירת המסננים עשויה להשתנות בהתאם ליישום הספציפי ולמערכת הביולוגית.
    12. בדוק את כל הרצועות בממשק אפשרויות תצוגה, גלול בזמן וודא עד כמה רצועות מדויקות תואמות נתיבי נדידת תאים. התפריט הנפתח מספק קודי צבע עבור כתמים ונתיבים להדמיה וסינון קלים לפי מספר אופנים (למשל, פרמטרים קינטיים, עוצמה, מיקום זמני או מרחבי).
      הערה: למעקב אחר תרביות בצפיפות גבוהה, או תאים בעלי תנועה גבוהה, הגדל את קצב מסגרות הרכישה תוך מזעור תזוזת התאים במרווחי זמן עוקבים.
    13. תיקון ידני של טעויות סגמנטציה וקישור (איור 3E).
      1. כדי לשפר עוד יותר את איכות התוצאות, ערוך באופן ידני כתמים (חלקיקי פסולת, תאים נייחים) והסר עקבות שגויות הנובעות מגבולות הגידול שזוהו בעת ניתוח החזר השקעה על אינטראקציה בין הגידול למערכת החיסון.
      2. תחילה, בחר בכלי TrackMate בסרגל הכלים ImageJ. לביטול נקודה קיימת לאורך כל הערימה, הקש Shift וצור באמצעות סמן העכבר מסיכת ROI מעל נקודת היעד (ערוכה בעיגול ירוק), ולאחר מכן לחץ על מקש DEL.
      3. להוספת נקודה חדשה (במקרה של רצועות חסרות עקב היעלמות כתמים) הקש על מקש A והנח את העכבר במיקום המחודד. חזור על תהליך החישוב של קישור רצועות לאחר שלב זה.
    14. כשתרצו בכך, בחרו 'ניתוח' בחלונית 'אפשרויות תצוגה' ליצירת שלושה קובצי מלל (איור 3C ו - 3F). הטבלה ב"כתמים בסטטיסטיקה של מסלולים" מספקת את הקואורדינטות המרחביות-זמניות של נקודות החיסון (מיקומי X-Y-Z של התאים המסומנים במסגרת ובמספר הרצועה המשויכים). "קישורים בסטטיסטיקת מסלולים" ו"סטטיסטיקת מסלול" מכילים מידע ביחס למסלולים: משכי מסלול, מספר פערים או נקודות שזוהו, מסלול ראשוני ומסגרת עצירה וכו'. שמור וייצא עבור כל ערכת נתונים.
      הערה: בעת לחיצה על שורה בתוך חלונות התוצאות, הספוט, הקישור או הרצועה המתאימים מופעלים בתוך סרטון קיטועי הזמן לצורך בדיקה חזותית. חזור על שלבי הסינון כדי לבחור/להסיר רצועות. כל הנתונים המיוצאים בעתיד יעודכנו. עצה: ניתן לנצל את ערכי משך הזמן הראשוניים והעצירה-פריים והמסלול כדי לחשב זמני מגע בין תאים סרטניים וחיסוניים בעת עיבוד החזר השקעה על אינטראקציה.
    15. לחצו על הלחצן 'שמור' ליצירת קובץ XML שיתקבל הכולל את כל ערכי הפרמטרים, הנתיב לתמונות ומיקומי הספוט בזמן. הפקודה "טען קובץ TrackMate" (תוספים> מעקב) משחזרת את כל הפעלת התהליך עבור כל קובץ סרט בנפרד.
    16. מעבר לחלונית האחרונה של ממשק המשתמש הגרפי בשם Select an action. ברשימה, השתמש בפונקציה Captureoverlay > Execute כדי להפיק סרטון עם רצועות בשכבת-על. טיפ: ניתן להשתמש באפשרות "Plot N-spots vs time" כדי לחשב את הצפיפות המרחבית של תאי מערכת החיסון בהחזר השקעה (איור 6B, פאנל ימני).
    17. ניתוח לאחר עיבוד וסטטיסטיקות הגירה
      1. נתח את נתוני המיקום הגולמיים ישירות ב- Trackmate או יצא נתונים כדי לחשב פרמטרים קינטיים מקיפים29 (כלומר, אורך מסלול כולל, מרחק אוקלידי, יחס כליאה, תזוזה בריבועממוצע 56, מהירות מסלול ממוצעת או מיידית, מקדם מעצר, התפלגות זוויות נדידה, מדד הגירה קדימה, מהירות קו ישר ממוצעת) כדי לסווג התנהגות נדידת תאי חיסון (למשל, תנועה מכוונת או דיפוזית30, 31) ותגובה לתאי מטרה סרטניים (למשל, טיפול לעומת ביקורת).
        הערה: תוספים שימושיים נוספים כגון כלי הכימוטקסיס וההגירה (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) מספקים גרפים שונים (למשל, רוז או חלקות סקטור, כמו שמתואר באיור 6) ומבחנים סטטיסטיים לניתוח מתקדם והדמיה של נתוני הגירה ניסיונית וכימוטקסיס. שילוב של אלגוריתמים24,25,45 למעקב אחר תאים ופילוח תאים עשוי לאפשר מדידות של מדדים מורפולוגיים ברמת התא הבודד (כלומר, שטח פני התא, אורך הציר הראשי והמינורי ויחס הגובה-רוחב של התא).

2. מודל תלת ממדי של סרטן על שבב בבדיקה תחרותית

הערה: תכנון השבב התלת-ממדי, המתוארבאיור 4, מורכב מ-5 תאים עיקריים: אחד מרכזי לצריכת תאי מערכת החיסון הצפים, שני אזורים צדדיים להטמעת תאי גידול במטריצות  הידרוג'ל (בגובה 150-250 מיקרומטר) ותאי זילוח מדיה. תאי החיסון ותאי הגידול מחוברים באמצעות שתי קבוצות של מערכים צרים של מיקרו-ערוצים (200×12×10 מיקרומטר3, L×W×H, איור 4E). באופן קבוע, מיקרו-עמודים של איזוצלות טרפזיות במרווחים של 100 מיקרומטר (כ-25-30 ממשקים עבור כל אזור ג'ל צדדי, איור 4C) פועלים כמחסומים לתמיסת ג'ל מוגבלת במהלך ההזרקה, תוך ניצול האיזון בין מתח פני השטח לכוחות נימים60,61 ומחברים אזורי גידול לשני תאי המדיה הצדדיים הנוספים כדי ליצור ממשק ג'ל-נוזל (איור 5). המאפיינים המפורטים של המבחן התחרותי התלת-ממדי מוצגים באיור 4. נדידה מועדפת של תאי מערכת החיסון לעבר שני תאי ההידרוג'ל המארחים תאי גידול שעברו טיפולים שונים ניתנת לניטור ולכימות. ניתן ליישם את הפריסה התחרותית המסוימת כדי לחקור שפע של פנוטיפים שונים של ביולוגיה של סרטן (למשל, עמידים לתרופות לעומת אגרסיביים, ראשוניים או גרורתיים, מגיבים לעומת לא מגיבים). בנוסף, ניתן לשלב בקלות את האזורים המשובצים בג'ל עם אוכלוסיות תאים שונות כדי ליצור מחדש TME הטרוגניים יותר, כולל רכיבי סטרומה (פיברובלסטים, תאי אנדותל)23 או כדי לדמות סביבה חיסונית34 ספציפית (למשל, מקרופאגים) לניתוח מנגנונים של עמידות לתרופות והתחמקות מגידולים.
הערה: צביעת קספז גרעינית ופעילה, באמצעות ערכות מסחריות לבדיקות חיות/מתות (למשל, Thermo Fisher Scientific, ריאגנטים אינקוציטים), ניתנת ליישום כדי להעריך אירועי מוות מיטוטי או אפופטוטי, כפי שדווח ב- Nguyen et al.33.

  1. הכנת פתרון מטריצה עם תאים וטעינה במכשיר
    הערה: במסגרת הניסוי הבאה, שני אזורי הג'ל מכילים תערובות של קווי תאי מלנומה אנושיים A375M, הגדלים בתמיסת מטריצה (למשל, מטריג'ל), החשופים לחומרים טיפוליים המשמשים כמונותרפיה או בשילוב. הגדרה זו אפשרה לנו להעריך את היעילות של שילוב של שתי תרופות ביחס לתרופות בודדות באופן תחרותי ולכמת את יכולתן למשוך PBMCs.
    1. הפשיר מלאי של תמיסת מטריצה (למשל, מטריג'ל) על ידי הנחת קרח במקרר 4 מעלות צלזיוס יום אחד לפני הניסוי.
      הערה: אין לחשוף את המוצר למחזורי הקפאה-הפשרה מרובים מכיוון שהוא הופך ל"גושי". פרוטוקולי הידרוג'ל סינתטיים או טבעיים אחרים יכולים להתאים לשימוש בסביבה זו. אנא עיין 33,34,35 להכנת תאים סרטניים במטריצות קולגן.
    2. השהה מחדש תאי מלנומה אנושיים A375, מוכתמים במקשר תאים פלואורסצנטיים ירוק PKH67 תואם חי בתמיסת מטריצה (2 מ"ג מ"ל-1). היכן שצוין, הוסף 5-aza-2'-deoxycytidine (DAC; 2.5 μM), המכונה DAC, ו / או IFN-α2b, המכונה IFN, במינונים המתאימים32.
      הערה: התאם את ה- Lot # בגיליון המפרט של בקבוק המטריצה. בהתבסס על הריכוז, חשב את נפח התווך הדרוש לייצור עד 2 מ"ג מ"ל-1 אנא התאם את ריכוז החלבון האופטימלי ואת ריכוז תרחיף התאים הסרטניים בהתאם ליישום העניין שלך.
    3. פיפטה למעלה ולמטה בזהירות כדי למנוע את הדור של בועות. שמור את צינור המיקרוצנטריפוגה על קרח בזמן הערבוב כדי למנוע פילמור לא רצוי.
    4. לאחר העיקור, הניחו את המכשירים על קרח (באמצעות דלי קרח ומכסה) כדי למנוע התמצקות תמיסת מטריצה במהלך כל הליך טעינת התא.
    5. הזריקו באיטיות את שתי תערובות תאי הגידול IFN ו-DAC/IFN (2-4 μL) לתוך יציאת הג'ל השמאלית והימנית, בהתאמה, עם מיקרופיפטה של 10 מיקרוליטר באמצעות קצוות קרים (איור 5A). הפעל לחץ עדין כדי לדחוף את תמיסת המטריצה מצד אחד עד שתגיע לצד הנגדי.
      הערה: נפח פתרון המטריצה נבחר כדי למנוע גלישה לערוצים סמוכים. אל תפעילו לחץ פיפטינג מוגזם כדי למנוע זליגת הפתרון לתקשורת ולערוצים מרכזיים. אם במהלך ההעמסה נתיב הג'ל חסום לאורך הערוץ, נסו להכניס את התמיסה מהכניסה השנייה עד שחזיתות הג'ל נפגשות. בעת הסרת micropipette מן המפרצים, להחזיק את הבוכנה, אחרת הלחץ השלילי יהיה לשאוף פתרון מטריצה.
    6. הניחו את המכשיר באינקובטור במצב זקוף בטמפרטורה של 37°C ו-5%CO2 למשך 30 דקות כדי לאפשר ג'לציה של תמיסת המטריצה להתרחש (איור 5B). טפל עם שבבי טיפול עם ג'ל לא פולימרי מוטבע כדי למנוע דליפה מתוך תעלת הג'ל.
    7. בינתיים, השהה מחדש PBMCs המסומנים ב- PKH67 (1x106 תאים) ב- 10 μL של DMEM מלא (תווך הנשר השונה של Dulbecco).
    8. לאחר הג'לציה של המטריצה, ממלאים את תעלות המדיה (50-100 μL) באותו אליקוט של מדיום תרבית בכל ששת המאגרים כדי למנוע התייבשות ג'ל בשבבים. יש לשמור באינקובטור עד להשעיית תאי מערכת החיסון.
      הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ את הפיזור הנכון וההומוגני של תאי הגידול בג'ל ואת שלמות מחסומי הג'ל הפולימרי. אזורים או בועות ג'ל אחידים חלקית או לא אחידים בתערובת מובילים לזרימה מוקדמת מדי של PBMCs בערוצי מדיה ג'ל בנקודת ההתחלה של הניסוי עקב תנודות התחלתיות של לחץ.
    9. יש לשאוף מדיה משש הבארות ולמקם את הקצה ליד פתח ערוץ מדיה כדי להזריק בעדינות עם מתלה תאי PBMC בלחץ בינוני. רצף זמני הטעינה מתואר באיור 5C:
      1. PBMCs ב 10 μL בינוני לתוך הבאר המרכזית העליונה.
      2. 50-100 מיקרוליטר בינוני לכל אחת מארבע בארות של תעלות רוחביות.
      3. 40-90 μL בינוני לתוך הבאר המרכזית העליונה.
      4. 50-100 μL בינוני לתוך הבאר המרכזית התחתונה.
    10. ודא תחת מיקרוסקופ כי התפלגות PBMCs נשארת כלואה בתא המרכזי לאחר שלב ההעמסה. (איור 7A).
      הערה: אם זה לא אופטימלי, להתאים את הריכוז במידת הצורך ולחזור על שלבי הזריעה, באמצעות שבבים טהורים. בעת חישוב נפחים עבור תנאי הניסוי המתוכננים, להתייחס למספר עודף של שבבים (15-20%) לקחת בחשבון שגיאות והתאמות פוטנציאליות. נפחים וריכוזים צריכים להיות אופטימליים בהתאם ליישום הספציפי.
    11. מקם התקנים מורכבים על משטח ישר באינקובטור ב 37 ° C ו 5% CO2 לרכישת הדמיה פלואורסצנטית לאחר מכן. טפל עם שבבי טיפול לאחר העמסת תאי החיסון הצפים.
      הערה: לפצות על הפסדי אידוי של נפחים במאגרים על ידי החלפת מדיה כל 2-3 ימים. עבור פרופיל כימוקין, ניתן לשאוף עד 100 μL מכל אחת משתי בארות של תאי תרבית, עיין בשלב 2.7, בשלב 1.
  2. ספירה אוטומטית של מרכזיות מגויסות בתמונות ניאון חד-ערוציות ב-ImageJ
    הערה: שיטות קלאסיות של immunofluorescence עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה קונפוקלית ניתן ליישם על פעולות על שבב כמו מדידות נקודת קצה. הליך הצביעה הבסיסי כולל קיבוע תא על שבב, חלחול, חסימה, קשירת נוגדנים, צביעת גרעינים עם שלבי שטיפה ביניהם. תאים חיסוניים לא מסומנים שהוחדרו לאזורי ג'ל תלת-ממדיים עם מיקרו-סביבות סרטניות משובצות יכולים להיות קבועים בנקודות הזמן הרצויות ומוכתמים עבור סמני ביטוי של הפעלה/תשישות/התבגרות (למשל, עבור תאי CD8, ניטור של CD69, CD95, PD1, TIM3 סמנים). ב Parlato et al.35פגוציטוזה של תאים אפופטוטיים SW620 הוערכה במיקרוסקופ קונפוקלי, באמצעות התקנים שהורכבו על כיסויים בעובי 170 מיקרומטר., IFN-DCs הוכתמו והוסיפו על שבב אנטי אנושי HLA-DR-FITC Ab aliquots.
    כדי לחשב את המידה של תאי חיסון חיים מוכתמים פלואורסצנטית המאותגרים באותות תחרותיים, תהליך עבודה נפוץ של ניתוח תמונה מוגדר באופן הבא (איור 7D-ג):
    1. לרכוש, בנקודות קצה זמן ספציפיות, ניגודיות פאזה ותעלות אדומות/ירוקות מיקרופוטוגרפיות פלואורסצנטיות של אזורי הג'ל השמאלי והימני המכילים תאי גידול שנחשפו בהתאמה למשטר יחיד או שילובים של משטרים פרמקולוגיים.
      הערה: כאן התמונות צולמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOS-FL לאחר העמסת תאים (0 שעות), לאחר 48 שעות ולאחר 72 שעות דגירה (איור 7A-B). נעשה שימוש בהגדלה של 4x-10x כדי לרכוש את התא המרכזי, את מערכי המיקרו-ערוצים ואת שתי התעלות הצדדיות הסמוכות המכילות A375 בתוספת IFN ו-A375 בתוספת DAC/IFN.
      1. בעת ביצוע פעולות רכישה, שקול את הפרמטרים למדידה ולהימנע מרוויה של תכונות שיש לספור. תוצאות פילוח אופטימליות תלויות באופי התמונות הנרכשות, בשל השונות בדגימות הביולוגיות עצמן, באיכות הצביעה ובטכניקות המיקרוסקופ המשמשות ליישומים מוכווני משתמש.
    2. טען נתונים חד-ערוציים פלואורסצנטיים (במקרה זה אדום = PBMCs), בפיג'י על-ידי גרירתם לחלון הראשי (איור 7D). שכפלו את התמונה כדי להימנע מדריסת הנתונים הגולמיים במהלך בחירת מסנני קדם-עיבוד עד לסגמנטציה הסופית.
      1. אם התמונה היא תמונה צבעונית (RGB), לחצו על Image > Type 8 או 16-bit כדי להמיר לגווני אפור. ודא שהאפשרות ערוך אפשרויות > > 'המרותs' מוגדרת לשינוי גודל בעת ההמרה.
    3. עיבוד מראש של נתונים גולמיים באמצעות ניקוי רעש וחפצים.
      1. עבור אל תפריט Process > Subtract Background על-ידי החלת אלגוריתם הכדור המתגלגל כדי לתקן רקע רעש לא אחיד עם וריאציות מרחביות גדולות של עוצמות. הגדר את הרדיוס לפחות לגודל של החלקיק הקדמי הגדול ביותר. בחר בתיבה תצוגה מקדימה עבור הליך ניסוי וטעייה כדי להניב תוצאות מיטביות. ערכים קטנים מדי עלולים להסיר באופן שגוי מבנים בעלי עניין.
      2. בפקודה 'בהירות וניגודיות', גררו מחוונים 'מינימום/מקסימום' כדי לשנות את טווח העוצמות בהיסטוגרמה. הזז את המחוון 'מרבי' שמאלה כדי להגביר את הבהירות, ללא תכונות שטיפה. הזז את השקופית המינימלית ימינה כדי להגדיל את ניגודיות התמונה ולמנוע היעלמות של תכונות פחות גלויות ברקע. לחץ על החל כדי לתקן שינויים.
    4. שיפור תמונה.
      1. עברו אל 'עבד מסנני >' והתנסו במסננים החציוניים, גאוסיאניים בתמונות (איור 7E).
        הערה: יש להתאים את רדיוס הסינון מראש לפיקסלים של רעשי התמונה. המסנן החציוני הלא ליניארי מחליף את ערך הפיקסלים בערך החציוני של השכנים, כדי להפחית את רעש המלח והפלפל. "טשטוש גאוסיאני" משמש להחלקת תמונה דיגיטלית, על-ידי החלפת פיקסלים בממוצע משוקלל של הפיקסלים שמסביב. המשקולות מגיעות מהתפלגות ההסתברות של גאוס, ולכן הפיקסלים הקרובים ביותר משפיעים יותר.
      2. עבור באופן אופציונלי אל עבד > מתמטיקה > גמא עם תיבת תצוגה מקדימה מסומנת כדי להגדיל את הניגודיות.
        הערה: העוצמות המוגדרות בלוח B&C משתנות בין שתי מגבלות המינימום והמקסימום. ערכים < 1.0 מדגישים הבדלים בין עוצמות נמוכות בעוד ערכים > 1.0 מדגישים הבדלים בין עוצמות גבוהות. תיקון גמא הוא פונקציונלי כדי למצוא טווח תצוגה, המציג את האובייקטים המעומעמים ביותר מבלי להרוות את הבהירים ביותר.
    5. יצירת מסיכת תמונה בינארית.
      1. עבור אל תמונה > התאם סף >. השיטה הפשוטה ביותר לקביעת ערכי סף מסתמכת על ניתוח היסטוגרמה של רמות עוצמה, כפי שניתן לראות באיור 7F. בתפריט הנפתח, לשחק עם שיטות סף גלובליות שונות (במקרה שלנו, Otsu מוחל).
      2. גללו או הקלידו ידנית טווח ידוע של עוצמות פיקסלים בחלוניות ההיסטוגרמה, שימו לב לשינוי דוגמת המילוי האדומה המכסה את התמונה, הדומה בעיקר לאזור התא בפועל. הלחצן 'איפוס' מסיר את השכבת-על. לאחר שביעות רצון, לחץ על החל כדי ליצור גרסה בינארית של התמונה. סמן את האפשרות תהליך > אפשרויות > בינארי כדי לשלוט באופן ההצגה של תמונות סף ובאופן שבו אובייקטים מזוהים על-ידי מנתח החלקיקים.
    6. השתמש בפקודה בתפריט Process/Binary/Watershed Particles כדי לחלק חפיפה חלקית או ממוזגת במהלך הסף. קו פרשת המים יכול לעתים קרובות לחתוך אותם במדויק על ידי הוספת קו בעובי של פיקסל אחד. בצע פעולות מורפולוגיות כגון פעולות הרחבה או שחיקה כדי להגדיל או להסיר פיקסלים מתחת או מפיקסלים רוויים מדי.
      הערה: לקבלת מידע נוסף, עיין בסעיף פקודות תפריט או עיין ב- MorphoLibJ, ספריה משולבת המבוססת על מורפולוגיה מתמטית לעיבוד נתונים בינאריים.
    7. תיאור תכונת תמונה כמותית.
      1. לאחר קבלת זיהוי אובייקט משביע רצון, פתח את מנתח החלקיקים מניתוח > ניתוח חלקיקים. ניתן להוציא חלקיקים על ידי גודלם ומעגליותם, המבוטאים בפיקסלים או ביחידת מידה מכויילת (בדוק את קנה המידה הנכון ביחס להגדרות המיקרוסקופ תחת מאפייני > תמונה). כדי לכלול הכל, השאר את ברירת המחדל של 0-Infinity ואת טווח ברירת המחדל המעגלי על 0.00 - 1.00 (0 = קו ישר, 1 = מעגל מושלם).
      2. כדי לסנן פיקסלים קטנים "רעש" או תכונות שאינן מעניינות, הגדר את הטווח המינימלי והמקסימלי. סמן את האפשרויות כלול חורים, הצג, מיתאר והצג תוצאות בשדה החלון. האפשרות 'אל תכלול בקצוות' תמחק חלקיקים שזוהו בגבולות התמונה. הוסף למנהל מוסיף את הבחירה המתקבלת למנהל החזר ההשקעה לניתוח נוסף תוך שמירה על מידע המיקום של החלקיק.
        הערה: ב "ROI Manager", ניתן לתקן פלט רשום פילוח אוטומטי (מיזוג תאים מפוצלים, פיצול תאים ממוזגים). בחר, באמצעות כלי בחירה בסרגל הכלים של פיג'י, החזר השקעה בתוך שני אזורי הג'ל שבהם מוטבעים תאים סרטניים כדי להעריך חדירה חיסונית.
    8. יצא את הערכים שהתקבלו לגיליון אלקטרוני כדי לבצע ניתוח סטטיסטי כפי שמוצג באיור 7G. "תוצאות" מפרטת טבלת נתונים ביחס למאפייני חלקיקים מחולקים לרמות שזוהו. "סיכום" פותח חלון עם שם התמונה, ספירות כוללות ומידע נוסף עבור התמונה כולה.
      1. עבור אל נתח > הגדר מדידות כדי לכלול מגוון רחב של פרמטרים.
    9. הקלט מאקרו אופציונלי (על-ידי בחירה באפשרות תוספים > פקודות מאקרו >- Record) כדי להפוך את זרימת העבודה של העיבוד לאוטומטית ולחסוך ניתוח זמן בערכות נתונים גדולות.
      1. השתמש באותה שגרת עיבוד כדי לנתח ערוץ פלואורסצנטי ירוק באותם אזורים לניתוח שינויים מורפולוגיים של תאי גידול באזורים תלת-ממדיים16

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

חדירה חיסונית של הגידול היא פרמטר של התגובה האנטי-סרטנית של המארח. גידולים הם הטרוגניים בהרכב, צפיפות, מיקום ומצב תפקודי של לויקוציטים חודרים, אשר אינטראקציות עם תאים סרטניים יכולות לעמוד בבסיס מידע רלוונטי מבחינה קלינית לחיזוי מהלך המחלה והתגובה לטיפול. במובן זה, טכנולוגיות מיקרופלואידיות יכולות לשמש ככלים משלימים ומיוחסים במבחנה כדי לחקור את המרקם החיסוני של גידולים, כמו גם כדי לפקח על התגובה לטיפולים אנטי סרטניים. הצימוד של הבדיקה המיקרופלואידית, דימות תאים חיים ותוכנת מעקב עשוי לבסס שיטות כימות אמינות לכימות האופן שבו תאי מערכת החיסון מתאימים את דפוס הנדידה שלהם בהקשרים שונים. בפרק זה, דיווחנו על צעדים להקמת תרביות משותפות דו-ממדיות או תלת-ממדיות רב-תכליתיות של תאי חיסון ותאי סרטן מטרה בהתקנים מיקרופלואידים אד-הוק הממומשים על ידי הליכים ליתוגרפיים רכים סטנדרטיים. בסעיף 1 נעשה שימוש בהתקנים מיקרופלואידים כדי לאפשר מגעים כימיים ופיזיקליים בין אוכלוסיות חסידים (MDA-MB-231 תאים סרטניים) ואוכלוסיות לא דבקות (PBMCs). חומרים כימותרפיים מסוימים (למשל, אנתרציקלינים בין היתר) יכולים לגרום לאפופטוזיס "אימונוגני" של תאים ממאירים, ובכך לשפר את הנראות שלהם אצל מארחים חיסוניים. מוות של תאים אימונוגניים סרטניים (ICD) מאופיין בשחרור אותות קשורים לקרום ומסיסים המועברים על ידי תאים גוססים המתפקדים כאזעקות לתאי מערכת החיסון. כדי לספק אימות כמותי של תגובת ICD, אנו משתמשים בנתונים שנאספו בפלטפורמה המיקרופלואידית שבה לויקוציטים יכולים לנוע דרך גשרים מיקרו-ערוציים שנבנו כראוי לעבר תאי המטרה שלהם. הקלטות בהילוך מהיר בוצעו לאחר טעינה משותפת של PBMCs, מתורמים בריאים (WT, סוג פראי), עם תאי סרטן שד אנושיים MDA-MB-231 שטופלו מראש או לא טופלו באנתרציקלין DOXO. מיקרו-תצלומים נוצרו כל 2 דקות, במשך שני מרווחי זמן רצופים של 24 ו-48 שעות. סרט S1 של מרווח של 0-24 שעות). ניתוח מעקב אחר תאי PBMC בודדים המאותגרים עם תאי סרטן גוססים (מטופלים ב-DOXO) או חיים (מטופלים ב-PBS) נעשה באמצעות תוסף Trackmate, כפי שניתן לראות ב איור 6A (פאנל שמאלי). ערכי כימוטקסיס רלוונטיים וחלקות הגירה נוצרו באופן אוטומטי באמצעות כלי הכימוטקסיס וההגירה, כמפורט ב62. כל מסלולי התא היו אקסטרפולציה ל (x, y) = 0 בזמן 24 שעות. התוצאות הצביעו על פרופיל נדידה שונה של תאי מערכת החיסון כאשר הם עמוסים יחד עם תאי סרטן השד שנחשפו ל-DOXO או PBS. כאשר PBMCs התעמתו עם תאים סרטניים אפופטוטיים, הם חצו מיקרו-ערוצים לעבר תאים גוססים/מתים (אך לא כדי לחיות תאים לא מטופלים). נדידת עכביש X/Y עכבישים וחלקות ורדים, מוצגים בלוח השמאלי איור 6B-Cמופו והושוו כדי להדגיש את ההשפעה של חומרים משרים אימונוגניים על הבדלים בדינמיקה החיסונית., עלילות רוז מראות כי PBMCs נדדו בעיקר כמעט לכל הכיוונים בניסוי הבקרה, רק חלק זניח מונחה במעלה השיפוע שנוצר על ידי תאים סרטניים מתרבים. לעומת זאת, נתיבים של תאים בודדים מדגישים תנועת הטיה חזקה לאורך כיוון תאי סרטן השד אפופטוטיים (כיוון X שלילי). כדי להעריך נדידת תאי חיסון מכוונת לעבר תאים סרטניים שטופלו ב-DOXO או PBS, מחושבים מספר פרמטרים של כימוטקסיס, כולל: א) מרכז המסה (נקודת ממוצע מרחבית של כל נקודות הקצה); ב) הכיווניות; ג) מדד הנדידה קדימה (כלומר, תזוזת התא הממוצעת בכיוון עניין שמשמעותו לכיוון אתר הגידול המטרה, במקרה שלנו). הערכים האחרונים מייצגים מדידה של יעילות התא לנדוד בכיוון נתון גירויים כימוטקטיים. לאחר שהגיעו לחדר השמאלי, חלק קטן של לויקוציטים עם צפיפות גוברת מעל 24-48 שעות הציגו מגעים ארוכי טווח (>60 דקות) עם MDA-MB-231 שטופל ב- DOXO. PBMCs אינם מצליחים לנדוד באופן מאסיבי ולעסוק באינטראקציות ארוכות טווח ומתמשכות כאלה עם תאים סרטניים חיים (כפי שניתן לראות על ידי מיקרו-תצלומים מייצגים של PBMCs מתקרבים ב איור 6Aמימין)., לצורך כימות ההבדלים ביחסי הגומלין בין הגידול למערכת החיסון, אזור הגידול סומן במעגל קבוע בקוטר של 20-80 מיקרון, שנקרא "נקודה חמה". הכימות והניתוח של FOV מייצגים מוצגים ב תרשים 6 (פאנל ימני, ב-ג).

בסעיף 2 תואר מודל גידול חדשני תלת-ממדי של כשירות חיסונית לכימות גיוס תאי חיסון בתגובה לשילובים אנטי-סרטניים של תרופות אפיגנטיות32 (DAC/IFN לעומת IFN בלבד), המאפשר השוואה של שני מצבי טיפול שונים בתאי מלנומה A375 בו זמנית. לפיכך, תאי מלנומה A375M, המסומנים בצבע פלואורסצנטי ירוק PKH67, הוטמעו במטריצות מטריג'ל בנוכחות DAC ו/או IFN בכל תא ג'ל, בעוד שתאי PBMC מסומנים באדום PKH26 פוזרו באופן הומוגני לתוך תא הנוזל המרכזי בנקודת ההתחלה (איור 7A). השווינו בו זמנית את שתי מסות הגידול במטריצות תלת-ממדיות עבור יכולתן למשוך PBMCs. ב-48 וב-72 שעות, PBMCs מונחים באופן מאסיבי לתוך מיקרו-ערוצים בצד ימין, כפי שנצפה באיור 7B.

נצפה בבירור ביות מועדף של PBMCs לכיוון מטריצת הג'ל המכילה אתר מלנומה שטופל ב-DAC/IFN ולא ב-IFN, בעוד שקצב נדידה נמוך נראה לכיוון תאי A375 שנחשפו לטיפול יחיד (צד שמאל). ההגדרה התחרותית ישימה לחקור שפע של פנוטיפים שונים של ביולוגיה של סרטן (למשל, עמידים לתרופות לעומת אגרסיביים, ראשוניים או גרורתיים (למשל, A375P לעומת תאי מלנומה A375M), ומגיבים לעומת לא מגיבים). תאי ג'ל יכולים להיות מורכבים מתרביות מורכבות של תאים ממאירים ומספר תאים שאינם סרטניים הקשורים לגידול, כגון תאי אנדותל, תאי חיסון ופיברובלסטים33 כדי לאפיין תגובות תרופתיות ברמת TME. אירועים של מיטוזה ומוות אפופטוטי של תאים סרטניים ניתן לפקח על ידי צביעה עם צבעים חיים33. ניתן להתאים הליכי אימונוסטיין בהתקנים מיקרופלואידים תלת-ממדיים להערכת מצבי הפעלה של תאי חיסון שחדרו לאתרי הגידול על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי35. במובן זה, מערכות מיקרופלואידיות תלת-ממדיות אלה עשויות לחקות מבני גידול מורכבים ואינטראקציות רב-תאיות ולכן הן פלטפורמות יקרות ערך לבדיקות תרופות פרה-קליניות אמינות יותר.

Figure 1
איור 1. פלנימטריה של המכשיר המיקרופלואידי להרכבת תרביות דו-ממדיות של גידול-חיסון. (A) מיקרופוטו אמיתי של 3 שבבים שהורכבו לשקופית מיקרוסקופ אחת. המאגרים ממוספרים בהתאם לרצף הטעינה ומקודדים בצבע כתאי התרבות המתאימים המפורטים במקרא. סרגל קשקשים, 6 מ"מ. (B) 3D CAD של שבב המורכב משלושה אזורי תרבית תאים עיקריים המחוברים באמצעות מיקרו-חריצים. ג) פרטים על גשר המיקרו-חריצים הצר, המראים את הממדים המותאמים לתאים סרטניים ולגודל PBMC. D-E) מיקרופוטו אור נראה נרכש לפני תחילת חלוף הזמן, המראה את התפלגות התאים הסרטניים וה- PBMCs בהתאמה בחדר השמאלי ובחדר הביניים. סרגל מאזניים, 500 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2. צינור ניתוח Trackmate ללוקליזציה של כתמים חיסוניים בתמונות מסדרות זמן. A) לוח עליון: צילום מסך של תפריט כיול התמונה Trackmate. לוח תחתון: פיג'י "תפריט מאפייני תמונה" להגדרת זמן ויחידות מרחביות. ב) לוח עליון: צילום מסך של תפריט "זיהוי כתמים" של Trackmate. לוח תחתון: פלט תמונה עם החלת ערכים שונים של "סף". C) פאנל עליון: צילום מסך של תפריט "סינון ספוט" של Trackmate הממחיש כמה פילטרים. פאנל תחתון: תמונה מופתית בהילוך מהיר, המתארת נקודות חיסון המסוננות לפי מיקום לאורך X בתא הביניים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3. צינור ניתוח Trackmate לשחזור מסלולים חיסוניים ברצפי תמונות מסדרות זמן. A-C) צילומי מסך של תפריטי Trackmate לבניית מסלולים, סינון רצועות וייצוא נתונים סופיים. ד) דוגמאות לרצועות שנוצרו בתמונות קיטועי זמן שעובדו מראש, המשנות את הגדרות גלאי הקישור. E) דוגמה למסלולים שגויים וקישורים שגויים הנגזרים מזיהוי גבולות תאי גידול. F) רצועות מסומנות בירוק על-ידי בחירת שורות בקובץ .txt התוצאות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4. סקירה סכמטית עבור שבבי גידול חיסוני תלת ממדי. א) דוגמה למאסטר סיליקון מיקרו-מובנה. חותמות PDMS עוצבו בתבנית התנגדות שלילית SU-8 במתקן חדר נקי המצויד באלומה אלקטרונית וליתוגרפיה אופטית. ב) העתקי PDMS יוצרו בשיטות ליתוגרפיה רכה סטנדרטיות. ביחידה המרכזית יש את התאים צבועים כמו אלה שצוירו בעיבוד תלת ממדי של השבב, המתואר בלוח D. C) סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) תצוגה מוגדלת של מערך המיקרו-עמודים המתאימים ללכידת תמיסת הידרוג'ל. D)3D CAD המציג את החדרים, מחוברים על ידי microgrooves ואת בארות הטעינה. תיבות מקווקוות מופנות לתצלומי SEM של פרטים (לוח C ו-E). E) תצלום SEM של מיקרו-חריצים מחברים בגובה 10 מיקרומטר. F) פריסת CAD דו-ממדית המתארת את ממדי המיקרו-מבנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 5
איור 5. זרימת עבודה סכמטית של שלבי פרוטוקול טעינה עיקריים להרכבת תרביות משותפות תלת-ממדיות. א) פנל עליון: סכמות שלב ההזרקה של תמיסת מטריג'ל בכל אזור בצד הג'ל. פאנל תחתון: צילום אמיתי של השבב המראה התקדמות חזית ג'ל לאורך התעלה במהלך שלב הטעינה. ב) סכמות של שלב פילמור מטריגל. לוח תחתון: תצוגה מיקרוסקופית של ניגודיות פאזה של ממשק הג'ל-אוויר שנוצר לאחר שלב הג'לציה. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. C)לוח עליון: ציור, המתאר טעינה של תאים ומדיה עם נפחים לדוגמה המשמשים בפרוטוקול. לוח תחתון: מוצגת תמונת ניגודיות פאזה 4X של התרבות המשותפת שהורכבה בשעה 0h. סרגל מאזניים, 200 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6. ניתוח פרופילים נודדים והתנהגות אינטראקציה של PBMC כלפי תא גידול גוסס/חי בחלון זמן של 24-48 שעות. פאנל שמאלי. א) צילומי מסך של תמונות מעובדות מראש בהילוך מהיר עם רצועות צבעוניות חיסוניות, שחולצו על-ידי Trackmate. נתיבי החיסון מתקבלים על ידי FOV יחיד בתנאי הניסוי המצוינים במרווח של 24 עד 48 שעות בחדר הביניים. B-C) מסלולי נדידה מייצגים וחלקות ורדים של PBMCs שטופחו בשני התנאים השונים (n = 1550 PBMCs לעומת תאי סרטן שטופלו ב- DOXO, DOXO+ או n = 1434 PBMCs לעומת תאי סרטן ביקורת, DOXO-). כל קו בתוך תרשימי x-y מתאר מסלול PBMC יחיד וכל מעגל מייצג את המיקום הסופי של תא בודד ביחס למיקום הראשוני. נקודות ההתחלה מוגדרות ל- (0,0) באמצעות המרת קואורדינטות. הקואורדינטות והתזוזה של מרכז המסה של נדידת התאים מוצגים בתנאי הניסוי שצוינו. מרכז קואורדינטות המסה והתזוזה (המחושב כמרחק אוקלידי ממוצע עבור רכיבי X ו- Y) מספקים אינדיקציה לכיוון הממוצע שבו נעה קבוצת התאים העיקרית ולגודל תנועת התאים הכוללת בקבוצות תנאים. קווים כחולים וירוקים מסמנים בהתאמה רצועות בודדות לפי ערך מרחק אוקלידי גדול/קטן מערך סף (100 מיקרומטר). D) סכימה של נתונים מספריים שחולצו על ידי מסלול תא. E-F) עלילת Box & Whiskers המתארת בהתאמה כיווניות (p<0,0001 מבחן t לא מזווג עם התיקון של וולש) ו-FMI (p<0,0001 מבחן t לא מזווג עם התיקון של וולש). הקו האופקי בתיבות מייצג ערכי חציון. ערכי FMI הם הממוצע עבור כל מסלולי התאים בכל קבוצת תנאים. פאנל ימני. A) צילומי מסך של ROIs שחולצו על ידי Trackmate המראים אינטראקציות דיפרנציאליות בין PBMCs לבין תאי סרטן שטופלו ב- DOXO או PBS. ב) צפיפות זמן של PBMCs סביב תאי סרטן שטופלו ב-DOXO או בלטו ב-MDA-MB-231. מספר PBMCs נוכחים ROI נבחר סביב תאים סרטניים עבור כל מצב. הערכים המדווחים הם הממוצע מעל 9 ROI שנבחר מ- FOV יחיד בהילוך מהיר. נקודות חמות של סרטן מוגדרות בהחזר השקעה (קוטר 80 מיקרומטר). מוצגת מפת חום תואמת של צפיפות. נקודות מייצגות מספר ממוצע של תאים המחושבים על פני 9 נקודות חמות של סרטן בנקודות זמן שצוינו. ג) התפלגות הזמנים (מינימום) של המגעים עבור כל קבוצת ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 7
איור 7. גיוס מועדף של PBMCs בתגובה לשילובי תרופות DAC בתוספת IFN במודל תחרותי של מלנומה חיסונית על שבב תלת-ממדית. א) פיזור של PBMCs טעונים בתחילה בחדר המרכזי של התקנים מיקרופלואידים. מיקרופוטוגרפים נרכשים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי EVOS-FL במרווח של 0-72 שעות. פלואורסצנטיות אדומה (תאים המסומנים ב-PKH67) מייצגת PBMCs מתורמים בריאים. תאי מלנומה אנושיים בעלי תווית PKH67 (ירוקה) המשובצים במטריג'ל המכילים שילובים בודדים או כפולים, הטיפולים צופו בחדרים רוחביים. B) תאי A375 בתוספת IFN משמאל לעומת A375 בתוספת DAC/IFN מימין. תמונות פלואורסצנטיות הוצגו ב-72 שעות של תרבות משותפת. הקופסה הצהובה שהופסק מתארת גיוס מסיבי בעליל ב-A375 בתוספת צד DAC/IFN. C) PBMC נספר בארבעה ROI שונים מתאי IFN לעומת תאי DAC+IFN. היסטוגרמות מייצגות ספירת תאים +/- S.D.; ערכי מפת חום ממוספרים מכל החזר השקעה. Scalebars, 200 μm. D-G) סכמות של שלבי סגמנטציה וכימות של PBMCs שהסתננו במטריצות ג'ל המיושמות על תמונות פלואורסצנטיות חד-ערוציות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

קובץ משלים. פרוטוקול Microfabrication אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

סרט משלים 1. רצפי קיטועי זמן בתרבית דו-ממדית של גידול-חיסון על שבב. מיקרופוטוגרפים נרכשו כל 2 דקות, במרווח זמן של 0-24 שעות באמצעות מיקרוסקופ קומפקטי שהוכנס לאינקובטור תרבית תאים סטנדרטי. פאנל שמאלי. סרט של PBMCs מתורמים בריאים (WT, סוג פראי), מצופה בתאי סרטן השד MDA-MB-231. פאנל ימני. סרט של נדידה מסיבית של PBMCs WT לעבר תא השבב שבו נטענים תאי סרטן שטופלו ב-MDA-MB-231 DOXO. פריסת שבב דו-ממדי מתוארת בפירוט בסעיף 1 של פרוטוקול ומוצגת באיור 1. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הסרט הזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השיטות המתוארות מנסות לעצב גישה כללית כדי לשחזר, עם מידת מורכבות ניתנת לשינוי, שני היבטים משמעותיים בתחום האונקו-אימונולוגיה, אשר יכולים להפיק תועלת מאימוץ מודלים רלוונטיים יותר במבחנה. הראשון נוגע לצד אוכלוסיית תאי הגידול, שם התמודדות עם מאפייני תא בודד עשויה להוביל לתיאור טוב יותר של הטרוגניות ומשמעות ביולוגית וקלינית מתואמת, כולל עמידות לטיפול, השעיה לגרורות, תאי גזע ודרגת התמיינות. הצד השני של הסיפור מיוצג על ידי TME, כולל מרכיבים לא סרטניים (תאי חיסון וסטרומה, כלי דם) ונוף כימי/פיזי (מרכיבי ECM, כימוקינים וגורמים מסיסים אחרים ששוחררו) שיכולים לעצב באופן עמוק הן את מאפייני המחלה והן את תגובת הפרט לטיפול63, במיוחד לאימונותרפיה. ראוי לציין כי ייצוא הגישה המתוארת לתחומי מחקר אחרים דורש הבנה עמוקה של מגבלות ואתגרים הנובעים מפיתוח ואימוץ מודלים חדשים.

אם לצטט מימרה המיושמת במידול הנדסי ("מודל הבעיה ולא המערכת"), יש לבצע אופטימיזציה שהוא המספר המינימלי של רכיבים ותנאים (תאיים, פיזיקליים וכימיים) הדרושים כדי להפוך את המודל על שבב משלו לרלוונטי ביולוגית ויציב לאורך כל הניסוי. לכן, כל שילוב של סוגי תאים/מיקרו-סביבתיים/ניסויים חייב, אם כן, להיבחר, להיות מוערך ומנוטר באופן רציף לאורך ניסויים בודדים וממפגש למפגש. בדיקות אלה כוללות, כפי שהוזכר בסעיפי הפרוטוקול, בקרה קפדנית על פרמטרים כמו נפחים בהתקנים המיקרופלואידים שניתן לשנות על ידי תנאי לחות או חימום ממקורות תאורה, תנועות אפשריות ואי מישוריות של שלבים הגורמים להיסחפות נוזלים בלתי מבוקרת, אך גם אימות מסוים של מצב התא, כדאיות ואפיון פנוטיפי. צעד קריטי אחד נוגע להחלטה להשתמש במערכות זילוח ליצירת מבנים וסקולריים (דומים), או להעברת תרופות על שבב33, שכן הדבר עשוי להשפיע על הניסויים במונחים של הגדלת המורכבות, משך תרבית התאים ומודולציה של הגורמים הכימיים בנוכחות תאים צפים כמו אלה החיסוניים.

להלן נסכם את הסוגיות הקריטיות והרלוונטיות העיקריות שנמצאו במסגרות הניסוי ובספרות העדכנית ביותר.

ECM והגדרת נוף כימי
TME מושפע עמוקות גם על ידי מכני 64,65 תכונות של הסביבה63, 66. מסיבה זו, הבחירה במטריצת התרבית היא בסיסית, במיוחד כאשר מדובר בתאי מערכת החיסון שבתנאים מסוימים יכולים להגיב לאותות המשתחררים על ידי המטריצה עצמה. התקדמות רלוונטית צפויה בעתיד הבא גם מתכנון ופיתוח של חומרים חדשים והידרוג'לים (המתאפיינים בנוקשות שונה, נקבוביות, נוכחות של גורמים מסיסים, בין שאר הפרמטרים) המאפשרים ECM מעודן ונשלט יותר ויותר, המחקה ספציפיות של רקמות שונות היום, חולים שונים מחר. בצד השני קריטי גם לעקוב אחר השינויים הנגרמים על ידי אוכלוסיות התאים השונות ב- ECM ולהגדיר אסטרטגיות לכלול מידע זה בניתוחים דינמיים ופנוטיפיים.

ניהול נתונים
הדרך לפריסה של טכניקות גידול על שבב בתהליך עבודה קליני הולכת להפיק תועלת מעבודה ניסיונית ענקית המתרחשת בכמה כיוונים. מודלים של איבר על שבב, כמו טכניקות רבות במבחנה, הם פונקציונליים, לפחות פוטנציאלית, לביצוע מדידות בעלות תפוקה גבוהה/תוכן גבוה. הקבלה של תנאי ניסוי, כולל בקרות חיוביות ושליליות, ושכפולים טכניים/ביולוגיים מתאפשרת על ידי שילוב מספר שבבים על אותה צלחת. הגידול בתפוקה הכמותית ממלא תפקיד מכריע בתרגום ותיקוף מערכות אלה בצנרת מהירה של תרופות או בדיקות גנטיות לאימונותרפיה. ואכן, מספר חברות כבר פיתחו פלטפורמות בפורמט רב בארות, וגישות הדמיה שונות נבדקות כדי לאפשר ניטור מספר גבוה של מכשירים בו זמנית14. בפרוטוקולים המתוארים לעיל, השתמשנו בשקופיות מיקרוסקופ המקצות עד 3 שבבים, עם אפשרות לדמיין עד 12 תנאי ניסוי במקביל, באמצעות מגש מיקרוסקופ מרובה שקופיות סטנדרטי. מערך זה תואם לצנרת ידנית ומתאים להתאמות מותאמות אישית המבוצעות במתקן המיקרו-פבריקציה שלנו. להיפך, כאשר יש צורך בהקבלה חזקה (בדיקות סינון מרובות ובקרות), נדרשות אופטימיזציות התקנה כדי לקבוע רמה גבוהה יותר של אוטומציה (כלומר, שימוש ברובוטים של צנרת, בארות פלסטיק מרובות).

בעת תכנון ניסויים, יש לקחת בחשבון פשרה בין רזולוציה מרחבית לרזולוציה זמנית.

כמות הנתונים העצומה, המופקת על ידי מיקרוסקופ תוכן גבוה, מהווה גורם מגביל במונחים של אחסון, העברה וניתוח. נושאים אלה מטופלים באמצעות גישות חישוביות המיישמות כלי למידת מכונה ומשאבי חומרה/תוכנה, אשר עשויים לטפח את האפשרות העתידית לקשר ניסויים על שבב / בסיליקו67,68 בבחירת אסטרטגיות טיפוליות, וזה מייצג הזדמנות שאפתנית אך בלתי ניתנת לדחייה.

מעבר להדמיית פלואורסצנטיות
תיוג פלואורסצנטי, על ידי צבעים או גנים עיתונאיים, בשל הספציפיות הגבוהה שלו, מייצג ללא ספק את שיטת תקן הזהב לזיהוי אוכלוסיות תאים שונות בתנאי תרבית משותפת ולפתרון תכונות מולקולריות עם SNR גבוה. במודלים של OOC גישה זו משמשת בדרך כלל כנקודת ייחוס ובמיוחד במיקרו-סביבות הטרוגניות של גידול-על-שבב, זה יכול להיות בעל ערך כדי לאפיין את הפנוטיפ של תאי חיסון שהסתננו ואינטראקציה.

עם זאת, ישנן ראיות הולכות וגדלות לכך שיש לנטר ולמזער השפעות המושרות על ידי פלואורופורים, הליכי צביעה מייגעים ושגרות הארה69 מכיוון שיכולות להשפיע עמוקות על התנהגות התא ומצב70,71. סיכון זה נראה נכון במיוחד עבור מערכות שבירות, כגון תאי חיסון72,73. תגובות פוטוטוקסיות עשויות להציג מגבלות בהגדרת רכישת החלון הרקתי של תאים חיים כאשר הן מנוטרות ברזולוציה מרחבית וטמפורלית גבוהה. יתר על כן, העושר במגוון תת-האוכלוסיות החיסוניות אינו מאפשר להפלות ביניהן רק על ידי כתמים פלואורסצנטיים, בהתחשב במספר המצומצם של מסננים הזמינים בדרך כלל במיקרוסקופים.

כדי להתמודד עם בעיה זו, מנקודת מבט אינסטרומנטלית, טכניקות חדשניות ללא תוויות74 מיקרוסקופיה כגון הולוגרפיה56 או מיקרוסקופיה היפרספקטרלית57 מופיעות כעת על הבמה. הם מבטיחים אסטרטגיות מתקדמות לסיווג תהליכים תאיים מעבר לפלואורסצנטיות ויכולים להיות בעלי ערך רב במיוחד לחקר דגימות רגישות. מנקודת מבט של ניתוח נתונים, גישות חישוביות מתקדמות, המבוססות על אלגוריתמי למידה עמוקה75 (שאומנו על ידי מערכי נתונים של תמונות פלואורסצנטיות), הן פותחות דלתות לביצוע מה שמכונה "תיוג סיליקו"76,77. הם יושמו בהצלחה לחיזוי סמנים פלואורסצנטיים מתמונות שדה בהיר78, ויצרו תמונות מסומנות, ללא תאים מכתימים, ובכך הגדילו את עוצמת המידע של מיקרוסקופ שדה בהיר. אסטרטגיה זו יכולה להיות שימושית גם כדי לחסוך זמן ותעלות פלואורסצנטיות עבור סמנים אחרים. אנו מאמינים כי קהילת OOC תפיק תועלת מטכניקות חדשות אלה המאפשרות מחקר פחות פולשני של אינטראקציה בין אוכלוסיות תאים.

ניתוח נתונים
מנגנוני אינטראקציה בין תאי סרטן חיסוניים ותאי מטרה יכולים להיחקר באמצעות מעקב אחר תנועות תאים28,79. ניסויי מעקב בהילוך מהיר בתרביות משותפות מורכבות והטרוגניות הם בעלי ערך רב לחילוץ דפוסי נדידת תאים, שינויים מורפולוגיים ומצבים ומידע מקיף על שושלת. ביצוע ניתוח ידני אפשרי למעשה רק עבור רצפים קצרים עם מעט תאים, אך לא עבור ניסויים שיטתיים בעלי תפוקה גבוהה. כתוצאה מכך, פיתוח כלים חישוביים למעקב אחר תאים, אוטומטיים באופן מלא או חלקי, הוא תחום מחקר חיוני בניתוח תמונה24. בדרך כלל, מעקב תאים קונבנציונלי דורש תדירות גבוהה יחסית של דגימה ורזולוציה מרחבית כדי לבצע כראוי משימות סגמנטציה, אשר יכול להיות מאתגר בתנאי ניסוי רבים. כדי להתאים תאים לשפות אחרות, ישנם כלי סגמנטציה ומעקב זמינים בגישה פתוחה (לדוגמה, תוכנת ImageJ22) כפי שמוצג בפרוטוקול זה או בתוכנה קניינית ייעודית. במחקרים בקנה מידה גדול, יישמנו תוכנה קניינית בשם Cell Hunter16,31, שפותחה על ידי אוניברסיטת טור ורגטה ברומא, כדי להבחין באופן אוטומטי לחלוטין בין סרטן לבין תאים חיסוניים בהקשר של אוכלוסיות מרובות. פתרונות מותאמים אישית המבוססים על למידת מכונה וגישות רשת עצבית 80,81,82 מתחילים להיות מיושמים כיום בחבילות תוכנת מיקרוסקופיה 83, החל משיפור SNR ועד לניהול פרמטרים קריטיים לרכישה או שלבי סגמנטציה. ניתן לנצל למידת מכונה כדי לזהות דפוסים תאיים נפוצים (למשל, סגנונות תנועה) כדי לאפיין את התגובה הביולוגית ביחס לגורמים מיקרו-סביבתיים.

ב- Comes et al.41, ארכיטקטורת רשת עצבית קונבולוציונית של למידה עמוקה שאומנה מראש יושמה כדי לסווג אם תאים סרטניים נחשפים או לא נחשפים לטיפול תרופתי על ידי שימוש כ"סמן" בתנועתיות תאי החיסון, במעקב מנתוני קיטוע זמן של תרביות משותפות של תאי סרטן השד ו- PBMCs במטריצות קולגן במיקרו-מכשירים, כמתוארב-33.

שיטות אומיקס חד-תאיות ופיתוח אונטולוגיות
אנו מצביעים על הצורך בברית אסטרטגית בין טכנולוגיות אומיקס חד-תאיות84 (כגון פרוטאומיקה, מטבולומיקה, גנומיקה) לבין שיטות על-שבביות: האפיון המולקולרי המפורט, המצומד למידע דינמי פונקציונלי יכול לשפר את הבנת המנגנונים הבסיסיים והתיאור הקליני. במקרה זה, כלים חדשים לקישור בין שני העולמות נמצאים בתחילתם85. האתגר הראשון הוא ליישם גישות אומיקה חד-תאיות ישירות על שבבי האונקו-אימונולוגיה22. יתר על כן, איברים על שבבים יכולים להיות מנוצלים כפלטפורמות לבדיקת מטרות פוטנציאליות שזוהו על ידי גנומיקה וניתוח פרוטאומיקה86,87. כלי קישור שני, שעדיין חסר במידה רבה, הוא דרך מובנית וסטנדרטית לביאור ואחסון תוצאות מערכת נמדדות88,89. אבל זה בדיוק מה שאנחנו צריכים בעתיד כדי לבנות מאגרי מידע שיטתיים של תוצאות כמותיות סלולריות ומאפיינים נמדדים, לכרות, להסיק ולקשר אותם עם המידע הביולוגי הגלום בו. במילה אחת, הצורך בסטנדרטיזציה ובניתוח שיטתי של מערכי נתונים ניסיוניים הטרוגניים מחייב מסגרת אונטולוגית.

התאמה אישית של מודלים
טכנולוגיית איברים על שבב מתאימה להתאמה אישית12, שכן תאים ורקמות מחולים בודדים (או סוגים של חולים) ניתן להשתמש במכשירים בתנאים מבוקרים, מה שמוביל לקריאות רלוונטיות מבחינה קלינית, שימושי כדי ליידע אסטרטגיות טיפוליות או מניעה. כמה דוגמאות מתחילות להופיע בספרות90. כמובן, עבור מודלים של גידול-על-שבב, אתגר זה מציב מספר שאלות טכניות ומדעיות שיש לפתור36 (כמו בקרת מאפייני TME כגון ריכוז חמצן, שיפועי ציטוקינים וכו'). חשוב לציין, האפשרות להפוך את הטיפולים האונקולוגיים והאונקו-אימונולוגיים ליעילים יותר תוך הפחתת ההשפעות המזיקות עבור כל מטופל היא אטרקטיבית, מנקודת מבט של איכות חיים כמו אופטימיזציה של משאבי הבריאות.

לסיכום, ניכר כי תחום זה הוא תחום אינטרדיסציפלינרי אותנטי וככזה נדרש מאמץ רב ביצירת שפה משותפת ומטרות משותפות בין חוקרים, קלינאים, תעשייה, אך גם מדיסציפלינות שונות (הנדסה, ביולוגיה, מדעי הנתונים, רפואה, כימיה) במציאת איזון טוב ופתרונות חדשים91.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף. AS נתמך על ידי Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) ו- Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS ו- FM נתמכים על ידי האגודה האיטלקית לחקר הסרטן (AIRC) מס '21366 ל- G.S.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell culture materials 
50 mL tubes Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS430828 centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC Millipore-Sigma; St. Louis, MO A3656 DNA-hypomethylating agent
6-well plates Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO CLS3506 culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask Corning, New York, NY 430641U culture flasks
A365M American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA
CVCL_B222		 human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride Millipore-Sigma; St. Louis, MO D1515 anthracycline antibiotic 
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0728L Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium EuroClone Spa, Milan, Italy ECB4004L saline buffer solution
Fetal Bovine Serum EuroClone Spa, Milan, Italy ECS0180L ancillary for cell culture
Ficoll GE-Heathcare 17-1440-02 separation of mononuclear cells from human blood. 
hemocytometer Neubauer Cell counter
Heparinized vials Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b Millipore-Sigma; St. Louis, MO SRP4595 recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3000D ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media Cedarlane Labs, Burlington, Canada Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel Corning, New York, NY 354230 growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231  American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA  HTB-26 human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X   EuroClone Spa, Milan, Italy ECB3001D ancillary for cell culture
Pipet aid Drummond Scientific Co., Broomall, PA 4-000-201 Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH26GL red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker Millipore-Sigma; St. Louis, MO PKH67GL green fluorescent cell dye
RPMI-1640 EuroClone Spa, Milan, Italy ECM2001L Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL) Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490 Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL) EuroClone Spa, Milan, Italy ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005 tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 15250061 cell stain to assess cell viability
Trypsin EuroClone Spa, Milan, Italy ECM0920D dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator  Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA 311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230 Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C) FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II) Steril VBH 72 MP Laminar flow hood
Optical microscope Zeiss
Refrigerable centrifuge Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials 
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes) Sigma Aldrich A3648 silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ  MB W&A,  Germany optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm) Ibidi, Germany 10812
Hydrogen Peroxide solution 30% Carlo Erba Reagents 412081 reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone Carlo Erba Reagents 461945 PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm  Sail Brand 7101 substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm Tedpella dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa Allresist,Germany AR-P. 679.04 Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips Ibidi, Germany 10813 substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped Gambetti Xenologia Srl, Italy 30255
Propan-2-ol Carlo Erba Reagents 415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA) Sigma Aldrich 484431-4L SU-8 resists developer
SU-8 3005 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0001 Negative Photoresists
SU-8 3050 Micro resist technology,Germany C1.02.003-0005 Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm Tedpella 15111-40, 15111-60, 15111-80 dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96% Carlo Erba Reagents 410381 reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit Dowsil, Dow Corning 11-3184-01 Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS) Sigma Aldrich 92360-100ML silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Abbas, A. K., L, A. H., P, S. Cellular and Molecular Immunology, Ninth Edition. , (2018).
  2. Eisenstein, M. Cellular censuses to guide cancer care. Nature. , (2019).
  3. Cancer Cell. Models for Immuno-oncology Research. Cancer Cell. , (2020).
  4. Zhang, Z., et al. Morphology-based prediction of cancer cell migration using an artificial neural network and a random decision forest. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 10 (12), 758-767 (2018).
  5. Dagogo-Jack, I., Shaw, A. T. Tumour heterogeneity and resistance to cancer therapies. Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (2), 81-94 (2018).
  6. Milo, I., et al. The immune system profoundly restricts intratumor genetic heterogeneity. Science Immunology. 3 (29), (2018).
  7. Mlecnik, B., et al. The tumor microenvironment and Immunoscore are critical determinants of dissemination to distant metastasis. Science Translational Medicine. , (2016).
  8. Sbarrato, T., et al. 34th Annual Meeting & Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2019): part 1. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7, Suppl 1 282 (2019).
  9. Miller, C. P., Shin, W., Ahn, E. H., Kim, H. J., Kim, D. -H. Engineering Microphysiological Immune System Responses on Chips. Trends in Biotechnology. 38 (8), 857-872 (2020).
  10. Ma, C., Harris, J., Morales, R. -T. T., Chen, W. Microfluidics for Immuno-oncology. Nanotechnology and Microfluidics. , 149-176 (2020).
  11. Mengus, C., et al. In vitro Modeling of Tumor-Immune System Interaction. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (2), 314-323 (2018).
  12. Van Den Berg, A., Mummery, C. L., Passier, R., Van der Meer, A. D. Personalised organs-on-chips: functional testing for precision medicine. Lab on a Chip. , (2019).
  13. Ingber, D. E. Reverse Engineering Human Pathophysiology with Organs-on-Chips. Cell. , (2016).
  14. Huh, D., et al. Microfabrication of human organs-on-chips. Nature Protocols. , (2013).
  15. Mazzarda, F., et al. Organ-on-chip model shows that ATP release through connexin hemichannels drives spontaneous Ca2+ signaling in non-sensory cells of the greater epithelial ridge in the developing cochlea. Lab Chip. , (2020).
  16. Mencattini, A., et al. High-throughput analysis of cell-cell crosstalk in ad hoc designed microfluidic chips for oncoimmunology applications. Methods in Enzymology. 632, 479-502 (2020).
  17. Maharjan, S., Cecen, B., Zhang, Y. S. 3D Immunocompetent Organ-on-a-Chip Models. Small Methods. , 2000235 (2020).
  18. Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab on a Chip. , (2017).
  19. Jeon, J. S., Zervantonakis, I. K., Chung, S., Kamm, R. D., Charest, J. L. In vitro Model of Tumor Cell Extravasation. PLoS ONE. , (2013).
  20. Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2015).
  21. Chen, M. B., Whisler, J. A., Fröse, J., Yu, C., Shin, Y., Kamm, R. D. On-chip human microvasculature assay for visualization and quantification of tumor cell extravasation dynamics. Nature Protocols. , (2017).
  22. Sade-Feldman, M., et al. Defining T Cell States Associated with Response to Checkpoint Immunotherapy in Melanoma. Cell. , (2018).
  23. Di Modugno, F., Colosi, C., Trono, P., Antonacci, G., Ruocco, G., Nisticò, P. 3D models in the new era of immune oncology: Focus on T cells, CAF and ECM. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. , (2019).
  24. Svensson, C. -M., Medyukhina, A., Belyaev, I., Al-Zaben, N., Figge, M. T. Untangling cell tracks: Quantifying cell migration by time lapse image data analysis. Cytometry. Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 93 (3), 357-370 (2018).
  25. Arena, E. T., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Wang, S., Yuan, M., Eliceiri, K. W. Quantitating the cell: turning images into numbers with ImageJ. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology. 6 (2), (2017).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. , (2012).
  27. Vacchelli, E., et al. Chemotherapy-induced antitumor immunity requires formyl peptide receptor 1. Science. 350 (6263), 972-978 (2015).
  28. Businaro, L., et al. Cross talk between cancer and immune cells: exploring complex dynamics in a microfluidic environment. Lab on a Chip. 13 (2), 229-239 (2013).
  29. Beltman, J. B., Marée, A. F. M., de Boer, R. J. Analysing immune cell migration. Nature Reviews Immunology. 9 (11), 789-798 (2009).
  30. Agliari, E., et al. Cancer-driven dynamics of immune cells in a microfluidic environment. Scientific Reports. 4 (1), 6639 (2014).
  31. Biselli, E., et al. Organs on chip approach: a tool to evaluate cancer -immune cells interactions. Scientific Reports. 7 (1), 12737 (2017).
  32. Lucarini, V., et al. Combining Type I Interferons and 5-Aza-2'-Deoxycitidine to Improve Anti-Tumor Response against Melanoma. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 159-169 (2017).
  33. Nguyen, M., et al. Dissecting Effects of Anti-cancer Drugs and Cancer-Associated Fibroblasts by On-Chip Reconstitution of Immunocompetent Tumor Microenvironments. Cell Reports. 25 (13), 3884-3893 (2018).
  34. Racioppi, L., et al. CaMKK2 in myeloid cells is a key regulator of the immune-suppressive microenvironment in breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 2450 (2019).
  35. Parlato, S., et al. 3D Microfluidic model for evaluating immunotherapy efficacy by tracking dendritic cell behaviour toward tumor cells. Scientific Reports. 7 (1), 1093 (2017).
  36. Andreone, S., et al. IL-33 Promotes CD11b/CD18-Mediated Adhesion of Eosinophils to Cancer Cells and Synapse-Polarized Degranulation Leading to Tumor Cell Killing. Cancers. 11 (11), 1664 (2019).
  37. Bray, L. J., Hutmacher, D. W., Bock, N. Addressing Patient Specificity in the Engineering of Tumor Models. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 217 (2019).
  38. Fetah, K. L., et al. Cancer Modeling-on-a-Chip with Future Artificial Intelligence Integration. Small. 15 (50), 1901985 (2019).
  39. Jabbari, P., Rezaei, N. Artificial intelligence and immunotherapy. Expert Review of Clinical Immunology. 15 (7), 689-691 (2019).
  40. Mak, K. -K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. 24 (3), 773-780 (2019).
  41. Mencattini, A., et al. Discovering the hidden messages within cell trajectories using a deep learning approach for in vitro evaluation of cancer drug treatments. Scientific Reports. , (2020).
  42. Isozaki, A., et al. AI on a chip. Lab Chip. , (2020).
  43. Makaryan, S. Z., Cess, C. G., Finley, S. D. Modeling immune cell behavior across scales in cancer. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. , (2020).
  44. Mak, K. K., Pichika, M. R. Artificial intelligence in drug development: present status and future prospects. Drug Discovery Today. , (2019).
  45. Masuzzo, P., Van Troys, M., Ampe, C., Martens, L. Taking Aim at Moving Targets in Computational Cell Migration. Trends in Cell Biology. 26 (2), 88-110 (2016).
  46. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Chapter nine - Methods for Cell and Particle Tracking. Imaging and Spectroscopic Analysis of Living Cells. 504, 183-200 (2012).
  47. Riedhammer, C., Halbritter, D., Weissert, R. Peripheral blood mononuclear cells: Isolation, freezing, thawing, and culture. Methods in Molecular Biology. , (2015).
  48. Harris, J., et al. Fabrication of a microfluidic device for the compartmentalization of neuron soma and axons. Journal of Visualized Experiments. , (2007).
  49. Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nature Protocols. , (2012).
  50. Park, J. W., Vahidi, B., Taylor, A. M., Rhee, S. W., Jeon, N. L. Microfluidic culture platform for neuroscience research. Nature Protocols. , (2006).
  51. Gjorevski, N., et al. Neutrophilic infiltration in organ-on-a-chip model of tissue inflammation. Lab on a Chip. , (2020).
  52. Jenkins, R. W., et al. Ex vivo profiling of PD-1 blockade using organotypic tumor spheroids. Cancer Discovery. , (2018).
  53. Comes, M. C., et al. The influence of spatial and temporal resolutions on the analysis of cell-cell interaction: a systematic study for time-lapse microscopy applications. Scientific Reports. 9 (1), 6789 (2019).
  54. Tinevez, J. -Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  55. Ulman, V., et al. An objective comparison of cell-tracking algorithms. Nature Methods. , (2017).
  56. Tinevez, J. -Y., Herbert, S. The NEMO Dots Assembly: Single-Particle Tracking and Analysis BT - Bioimage Data Analysis Workflows. , 67-96 (2020).
  57. Jacquemet, G., Hamidi, H., Ivaska, J. Filopodia quantification using filoquant. Methods in Molecular Biology. , (2019).
  58. Caldas, P., Radler, P., Sommer, C., Loose, M. Computational analysis of filament polymerization dynamics in cytoskeletal networks. Methods in Cell Biology. , (2020).
  59. Chalfoun, J., Majurski, M., Peskin, A., Breen, C., Bajcsy, P., Brady, M. Empirical gradient threshold technique for automated segmentation across image modalities and cell lines. Journal of Microscopy. 260 (1), 86-99 (2015).
  60. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on a Chip. , (2009).
  61. Farahat, W. A., et al. Ensemble analysis of angiogenic growth in three-dimensional microfluidic cell cultures. PLoS ONE. , (2012).
  62. Zengel, P., Nguyen-Hoang, A., Schildhammer, C., Zantl, R., Kahl, V., Horn, E. μ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. , (2011).
  63. Henke, E., Nandigama, R., Ergün, S. Extracellular Matrix in the Tumor Microenvironment and Its Impact on Cancer Therapy. Frontiers in Molecular Biosciences. , (2020).
  64. Wirtz, D., Konstantopoulos, K., Searson, P. C. The physics of cancer: The role of physical interactions and mechanical forces in metastasis. Nature Reviews. , (2011).
  65. Northcott, J. M., Dean, I. S., Mouw, J. K., Weaver, V. M. Feeling stress: The mechanics of cancer progression and aggression. Frontiers in Cell and Developmental Biology. , (2018).
  66. Wan, L., Neumann, C. A., LeDuc, P. R. Tumor-on-a-chip for integrating a 3D tumor microenvironment: chemical and mechanical factors. Lab Chip. 20 (5), 873-888 (2020).
  67. Braun, E., Bretti, G., Natalini, R. Mass-preserving approximation of a chemotaxis multi-domain transmission model for microfluidic chips. ArXiv. , (2020).
  68. Mahlbacher, G. E., Reihmer, K. C., Frieboes, H. B. Mathematical modeling of tumor-immune cell interactions. Journal of Theoretical Biology. , (2019).
  69. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods in Cell Biology. , (2013).
  70. Jensen, E. C. Use of Fluorescent Probes: Their Effect on Cell Biology and Limitations. Anatomical Record. , (2012).
  71. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. , (2016).
  72. Abbitt, K. B., Rainger, G. E., Nash, G. B. Effects of fluorescent dyes on selectin and integrin-mediated stages of adhesion and migration of flowing leukocytes. Journal of Immunological Methods. , (2000).
  73. Smith, E., et al. Phototoxicity and fluorotoxicity combine to alter the behavior of neutrophils in fluorescence microscopy based flow adhesion assays. Microscopy Research and Technique. , (2006).
  74. Suman, R., et al. Label-free imaging to study phenotypic behavioural traits of cells in complex co-cultures. Scientific Reports. , (2016).
  75. Brent, R., Boucheron, L. Deep learning to predict microscope images. Nature Methods. , (2018).
  76. Christiansen, E. M., et al. In Silico Labeling: Predicting Fluorescent Labels in Unlabeled Images. Cell. , (2018).
  77. Waibel, D. J. E., Tiemann, U., Lupperger, V., Semb, H., Marr, C. In-silico staining from bright-field and fluorescent images using deep learning. Lecture Notes in Computer Science (including subseries Lecture Notes in Artificial Intelligence and Lecture Notes in Bioinformatics). , (2019).
  78. Ounkomol, C., Seshamani, S., Maleckar, M. M., Collman, F., Johnson, G. R. Label-free prediction of three-dimensional fluorescence images from transmitted-light microscopy. Nature Methods. , (2018).
  79. Diehl, M. I., Wolf, S. P., Bindokas, V. P., Schreiber, H. Automated cell cluster analysis provides insight into multi-cell-type interactions between immune cells and their targets. Experimental Cell Research. 393 (2), 112014 (2020).
  80. Chen, H., Engkvist, O., Wang, Y., Olivecrona, M., Blaschke, T. The rise of deep learning in drug discovery. Drug Discovery Today. , (2018).
  81. Angermueller, C., Pärnamaa, T., Parts, L., Stegle, O. Deep learning for computational biology. Molecular Systems Biology. , (2016).
  82. Moen, E., Bannon, D., Kudo, T., Graf, W., Covert, M., Van Valen, D. Deep learning for cellular image analysis. Nature Methods. , (2019).
  83. Nikon. , Available from: http://www.microscope.healthcare.nikon.com/produc (2020).
  84. Bock, C., Farlik, M., Sheffield, N. C. Multi-Omics of Single Cells: Strategies and Applications. Trends in Biotechnology. , (2016).
  85. Lin, A., et al. 3D cell culture models and organ-on-a-chip: Meet separation science and mass spectrometry. Electrophoresis. , (2020).
  86. Ingber, D. E. Developmentally inspired human 'organs on chips.'. Development. , Cambridge. (2018).
  87. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews Drug Discovery. , (2020).
  88. Mangul, S., et al. Systematic benchmarking of omics computational tools. Nature Communications. , (2019).
  89. Burek, P., Scherf, N., Herre, H. Ontology patterns for the representation of quality changes of cells in time. Journal of Biomedical Semantics. 10 (1), 16 (2019).
  90. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. , (2016).
  91. Horning, S. J. A new cancer ecosystem. Science. , (2017).

Tags

החודש ב- JoVE גיליון 170 איברים על שבב אימונולוגיה של גידולים דיבור בין סרטן למערכת החיסון מיקרו-סביבה של גידולים מרקם חיסוני דינמיקה תאית ואינטראקציות גידול על שבב מיקרופלואידי אימונו-אונקולוגיה מעקב אחר תאים
מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Ninno, A., Bertani, F. R.,… More

De Ninno, A., Bertani, F. R., Gerardino, A., Schiavoni, G., Musella, M., Galassi, C., Mattei, F., Sistigu, A., Businaro, L. Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments. J. Vis. Exp. (170), e61895, doi:10.3791/61895 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter