Микрофлюидные модели совместной культуры для анализа иммунного ответа в микроокружениях опухолей in vitro

Summary

В эпоху иммунотерапии и одноклеточного геномного профилирования биология рака требует новых in vitro и вычислительных инструментов для исследования опухолево-иммунного интерфейса в надлежащем пространственно-временном контексте. Мы описываем протоколы для использования опухолево-иммунных микрофлюидных кокультур в 2D и 3D условиях, совместимых с динамическим многопараметрическим мониторингом клеточных функций.

Abstract

Сложные модели заболеваний требуют передовых инструментов, способных предоставить физиологически и патологически значимые, действенные идеи и раскрыть невидимые в противном случае процессы. Продвинутые клеточные анализы, близко имитирующие декорации in vivo, зарекомендовали себя как новые способы визуализации и измерения двунаправленного взаимодействия опухоли и хозяина, влияющего на прогрессирование рака. Здесь мы описываем два универсальных протокола для воссоздания высококонтролируемых 2D и 3D кокультур в микроустройствах, имитирующих сложность микроокружения опухоли (TME), при естественном и индуцированном терапией иммунонаблюдении. В разделе 1 представлена экспериментальная установка для мониторинга перекрестных помех между адгезивными опухолевыми клетками и плавающими иммунными популяциями с помощью покадровой микроскопии светлого поля. В качестве практического сценария мы анализируем влияние противораковых препаратов, таких как так называемые иммуногенные индукторы гибели раковых клеток, на рекрутирование и активацию иммунных клеток. В разделе 2 3D-иммунные к опухоли микросреды собраны в конкурентной компоновке. Дифференциальная иммунная инфильтрация контролируется с помощью флуоресцентных снимков продолжительностью до 72 часов для оценки комбинированных терапевтических стратегий. В обоих случаях проиллюстрированы этапы обработки изображений для извлечения множества параметров иммунных клеток (например, миграция и взаимодействие иммунных клеток, реакция на терапевтические агенты). Эти простые и мощные методы могут быть дополнительно адаптированы для моделирования сложности TME, охватывающей гетерогенность и пластичность подтипов раковых, стромальных и иммунных клеток, а также их взаимные взаимодействия как движущие силы эволюции рака. Соответствие этих быстро развивающихся технологий изображениям с высоким содержанием живых клеток может привести к созданию больших информативных наборов данных, что порождает новые проблемы. Действительно, треугольник «кокультуры/микроскопия/расширенный анализ данных» прокладывает путь к точной параметризации проблемы, которая может помочь в разработке индивидуальных терапевтических протоколов. Мы ожидаем, что будущая интеграция противораковых технологий на чипе с искусственным интеллектом для высокопроизводительной обработки станет большим шагом вперед в использовании возможностей в качестве прогностических и доклинических инструментов для точной и персонализированной онкологии.

Introduction

Эволюция различных отраслей медицины как экспериментальных дисциплин зависела от способности манипулировать клеточной популяцией и функциями органов в контролируемых условиях¹. Такая способность уходит своими корнями в наличие измеримых моделей, способных повторять процессы, происходящие в нашем организме.

В эпоху иммунотерапии и одноклеточного геномного профилирования 2 биология рака должна использовать преимущества новых in vitro и вычислительных моделей для исследования интерфейса опухоль-иммунитет в надлежащем пространственно-временном контексте ^2,3.

Микроокружение^{опухоли 4} (TME) представляет собой сложную ткань, в которой раковые клетки непрерывно взаимодействуют и динамически развиваются вместе с другими клеточными (иммунные, стромальные и эндотелиальные клетки) и неклеточными (внеклеточный матрикс, ECM) компонентами. Динамическая природа этого сложного ландшафта определяет, играют ли иммунные клетки роль друзей или врагов злокачественных клеток, тем самым сильно влияя как на прогрессирование заболевания, так и на реакцию на терапию. В настоящее время онкоиммунологи, биоинформатики и эксперты в области системной биологии прилагают большие усилия для изучения клинической значимости гетерогенности рака 5,6 либо в пространстве (т.е. в отдельных опухолевых областях), либо во времени (т.е. на разных стадиях прогрессирования опухоли)^5,6, а также для характеристики фенотипа и функции рака и иммунных клеток на уровне отдельных клеток. В качестве примера этой синергии в настоящее время регулярно используются передовые методы компьютерного зрения для пространственного картирования иммунного инфильтрата в гистологических образцах ^7,8.

Что касается экспериментальных моделей, то исследования на животных и традиционные методы in vitro, достижения в области микрофлюидики и методов совместного культивирования дают доступ к различным классам микроинженерных клеточных моделей, таких как органоиды, микрофизиологические системы 9,10,11 (MPS) и органы на чипе^12,13,14 (ООК). У них есть общая черта, заключающаяся в том, чтобы увеличивать «общую картину» клеточных экосистем и расширять потенциал in vitro для контроля факторов микросреды, используя при этом микроскопию с высоким содержанием¹⁵ и подходы к обработке изображений.

В настоящее время современные системы МПС и ООК начали включать иммунологические аспекты, включая различные подтипы иммунных клеток в существующие ткани и кокультуры, чтобы исследовать и измерять различные процессы, такие как воспалительные заболевания, заживление ран, иммунитет слизистой оболочки и реакция на токсины или повседневные пищевые продукты¹⁶. Модели TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, также интегрированные с перфузируемыми микрососудами 18,19,20,21, были разработаны для исследования клеточно-тип-зависимых взаимодействий, физических и химических возмущений и цитотоксической активности инфильтрирующие лимфоциты²², а также клинически значимые иммуномодулирующие средства²³.

Здесь мы предлагаем универсальные протоколы, начиная от загрузочных клеток в чипах и заканчивая инструментами обработки изображений, для использования передовых иммуноферментных микрофлюидных кокультур в 2D (раздел 1) и 3D (раздел 2)¹⁶, совместимых с динамическим, многопараметрическим²⁴ мониторингом и визуализацией клеточных функций. Это достигается за счет сохранения простоты использования и гибкости как в управлении выборками, так и в анализе данных, используя преимущества бесплатного программного обеспечения Фиджи и его наборов инструментов^25,26.

Микрофлюидное устройство, описанное в разделе 1, предназначено для проведения 2D-кокультур адгезивных раковых и плавающих иммунных клеток. Эта платформа была валидирована для измерения in vitro поведения иммунных клеток при наличии генетических мутаций²⁷ и/или иммунодефицитов²⁸. Здесь мы проиллюстрируем шаги по отслеживанию иммунных клеток в покадровых изображениях яркого поля, используя полуавтоматический метод, основанный на Trackmate (плагин, реализованный в программном обеспечении Фиджи). Эта процедура позволяет извлекать кинематические дескрипторы иммунной миграции ²⁹ и ответа (т.е. времени взаимодействия) на раковые клетки-мишени, обработанные или не обработанные иммуногенными индукторами²⁷ гибели клеток.

Важно отметить, что эти параметры, извлеченные из изображений временных рядов, могут быть обработаны с помощью передового математического оборудования. В качестве примера потенциальности этого подхода наши группы недавно опубликовали анализ, основанный на математических методах стохастических процессов и статистической механики, для моделирования свойств клеточной сети и предоставления параметризованного описания поведения иммунных клеток (т.е. смещенного или некоррелированного случайного блуждания, высоко или нескоординированного движения^30,31).

Настройка 3D, представленная во втором разделе, основана на протоколе совместного культивирования для воссоздания более сложных иммунокомпетентных TME, встроенных в две области геля с различными комбинациями типов клеток и лекарств в конкурентной манере. Здесь описаны этапы обработки изображений для измерения в различные моменты времени инфильтрации окрашенных иммунных клеток в клетки меланомы человека A375M, культивируемые в Matrigel, для оценки комбинаций противоопухолевых агентов³². Линия A375M, клеточная линия, полученная из A375P, характеризующаяся высокометастатическим фенотипом, была выбрана для оценки их метастатической способности в присутствии иммунных клеток³².

Описанные модели могут быть полностью совместимы с различными клеточными источниками (мышиные и человеческие иммортализированные или первичные клеточные линии, органоиды, ксенотрансплантаты и другие). В недавних исследованиях нашей лаборатории, сочетая видеомикроскопию с высоким содержанием с анализом изображений, конкурентный 3D-макет был применен для изучения: i) противоопухолевого (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности, ADCC) иммунного ответа и анализа роли фибробластов в резистентности к терапии трастузумабом в моделях рака молочной железы HER2⁺ на чипе³³; ii) действие миелоидных клеток (т.е. рак-ассоциированных макрофагов) в механизмах уклонения от опухоли и рекрутирования Т-клеток³⁴; iii) эффективность иммунотерапевтических режимов, в частности, основанных на дендритных клетках, кондиционированных интерфероном α (ИФН-ДК), культивируемых с помощью обработанных лекарственными препаратами клеток рака толстой кишки в коллагеновых матрицах, а также для оценки эффективного движения и последующих событий фагоцитоза³⁵; iv) хемотаксическая миграция эозинофилов, полученных из костного мозга, к клеткам меланомы, обработанным или необработанным^{IL-33 36}.

Эти передовые модели могут служить окнами наблюдения для понимания роли иммунной структуры в метастазировании рака и механизмах резистентности, но требуются усилия для перевода результатов в клиники, закрывая пробел с фундаментальными исследованиями³⁷.

В качестве нового сценария использование возможностей автоматизированной микроскопии с высоким содержанием в сочетании с использованием более физиологически значимых микросистем открывает новые потенциальные проблемы для обработки, обработки и интерпретации сотен и даже тысяч гигабайт многопараметрических данных, которые могут быть получены в результате одной экспериментальной кампании. Это подразумевает прямую связь экспериментов OOC с алгоритмами на основе искусственного интеллекта 38,39,40,41,42 (ИИ) как для расширенного автоматизированного анализа, так и для генерации функций, которые, в свою очередь, могут питать in silico модели взаимодействия рака и иммунитета⁴³, с захватывающими новыми приложениями^на горизонте^, такими как разработка прогностических скрининговых анализов^{лекарств 44}.

Постоянно расширяющийся поток усилий сосредоточен на разработке моделей заболеваний вместе с оптимизацией стратегий реализации крупномасштабных экранов возмущений с одноклеточными мультиомиксными показаниями. Это, несомненно, поможет разработке и, надеюсь, клиническому внедрению, сопровождаемому соответствующей степенью стандартизации метода, систематического подхода онкоиммунологии на чипе, чтобы получить новое представление об иммунных нарушениях и механизмах распространения рака.

Protocol

1. Дизайн чипа для адгезивных и плавающих клеток 2D-кокультур

ПРИМЕЧАНИЕ: Схема 2D-культуры (рис. 1A-C) характеризуется тремя камерами (высотой 100 мкм), соединенными между собой двумя наборами микроканальных массивов (500 x 12 x 10^{мкм 3}, Д×Ш×В). Промежуточная камера образует два закрытых тупиковых компартмента, которые блокируют плавающие иммунные клетки, переполняющие место опухоли на этапе загрузки 2.5. Этот тип устройства полезен для двумерных измерений подвижности отдельных клеток (как адгезивных, так и плавающих) в режиме реального времени, а также межклеточных взаимодействий 16,27,28,30,31. Типичное исследование миграции клеток (проводимое от нескольких часов до нескольких дней) сочетает в себе микроскопию живых клеток с алгоритмами^{обработки изображений 45}, чтобы перевести полученные последовательности изображений в числовые признаки²⁵. На основе миграционных паттернов можно оценить несколько биофизических показателей, таких как смещение и скорость клеток, а также продолжительность взаимодействия иммунных клеток и клеток-мишеней²⁴.

1. Подготовка раковых клеток и клеток PBMC
   1. Культура раковых клеток
      ПРИМЕЧАНИЕ: MDA-MB-231 тройной отрицательный [рецептор эстрогена (ER)-, рецептор прогестерона (PR)- и рецептор эпидермального фактора роста человека 2 (HER2)-] клетки аденокарциномы молочной железы человека обычно выращиваются в среде Мемориального института Розуэлл-Парк (RPMI) 1640 с добавлением 10% (v/v) эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ L-глютамина, 100 МЕ натриевой соли пенициллина G 100 мл 1 и 100 мкг ^мл-1 стрептомицина сульфата (питательная среда), в стандартных условиях культивирования (37 °C и 5% CO₂).
      1. Для оптимизации роста клеточных культур планшетируют клетки MDA-MB-231 в^колбах размером 75 см 2 при плотности 1 × 10^{6 клеток мл-1 в 12-15} мл питательной среды.
      2. Когда клетки достигнут 75-80% слияния, выбросьте питательную среду, промойте клетки предварительно подогретым фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), чтобы полностью удалить FBS, а затем отделите их предварительно подогретым трипсином (1-2 минуты при 37 ° C).
      3. Добавьте питательную среду, чтобы инактивировать ферментативную активность трипсина и собрать отделившиеся клетки. Мойте клетки дважды в течение 5 минут при 1 100 x g при комнатной температуре (RT).
      4. Подсчитайте клетки на предметном стекле для подсчета клеток с помощью теста на исключение красителя Trypan Blue, а затем повторно засейте их либо для поддерживающей культуры (не более 6 пассажей от оттаивания), либо для экспериментальных процедур.
      5. Для микрофлюидных экспериментов засейте 1 × 10 6 клеток в 6-луночных планшетах в 3 мл питательной среды и обработайте либо 25 мкМ доксорубицином (DOXO), либо равным объемом растворителя DOXO (PBS) в качестве контроля.
      6. Через четыре-6 часов после этого дважды промойте клетки, обработанные DOXO, предварительно подогретым PBS в течение 5 минут при дозе 1,100 x g при RT.
      7. Подсчитайте контрольные клетки, обработанные DOXO и PBS, как указано выше (см. шаг 1.1.1.5), и установите кокультуру с мононуклеарными клетками периферической крови (PBMC) в микрофлюидных устройствах.
   2. Изоляция PBMC
      1. Соберите венозную цельную кровь (примерно 10 мл) от здоровых добровольцев в гепаринизированные флаконы и аккуратно перемешайте, перевернув пробирку 2-4 раза⁴⁷.
      2. Разбавьте кровь 1:1 PBS и нанесите более 10 мл градиентной среды плотности Lymphoprep в пробирку объемом 50 мл.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы делаете наслоение очень осторожно и медленно, чтобы кровь и лимфопреп образовали два отдельных слоя.
      3. Центрифужные пробирки в течение 30 минут при 400 x g при 4 °C в откидном ведре без тормозов. Образуются четыре отдельных слоя: (i) плазма наверху, (ii) белый и мутный слой, содержащий PBMC, (iii) лимфопреп и (iv) гранула эритроцитов и гранулоцитов.
      4. Осторожно аспирируйте PBMC с помощью пипетки объемом 2 мл и немедленно ресуспендируйте в теплой питательной среде (то же, что используется на этапе 1.1.1) и промывайте дважды в течение 5 минут при дозе 1,100 x g при RT.
      5. Подсчитайте гранулированные PBMC, как указано выше (см. этап 1.1.1.5), и либо используйте для экспериментальных процедур, либо заморозьте для длительного хранения.
2. Покрытие ячеек в 2D-чипах
   ПРИМЕЧАНИЕ: PBMC не окрашиваются в этом протоколе. Чтобы охарактеризовать специфические фенотипы на чипе, субпопуляции иммунных клеток могут быть выделены путем иммуномагнитного отбора шариков, окрашены флуоресцентными клеточными трекерами, повторно смешаны с немеченой оставшейся фракцией и, таким образом, противопоставлены раковым клеткам-мишеням, как сообщается в экспериментах на чипе, описанных в Vacchelli et ^al.27 и в Racioppi et ^al.34.
   1. Перед началом экспериментов по совместному культивированию и для облегчения добавления реагентов активируйте хранящиеся чипы кислородно-плазменной обработкой в течение нескольких секунд. Немедленно заполните резервуары деионизированной водой или PBS, чтобы поверхности PDMS (полидиметилсилоксан) оставались гидрофильными до этапов нанесения покрытия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PDMS по своей природе гидрофобна, что может привести к трудностям в работе и улавливанию пузырьков воздуха в микроканалах. См. шаг 7 в дополнительном файле, содержащем подробную информацию об активации кислородной плазмы.
   2. Стерилизовать под УФ-шкафом в течение 20 мин, промыть 2-3 раза свежим PBS, а затем инкубировать с питательными средами в течение 1 ч. Храните чипсы в инкубаторе до выполнения этапов гальванического покрытия.
   3. Изымайте лишние среды из всех шести резервуаров. Следите за тем, чтобы среда не всасывалась из основных камер культуры.
   4. Медленно применяют 1 × 10⁵ раковых клеток, ресуспендированных в 10-20 мкл питательной среды в верхнем левом резервуаре, а затем в нижней лунке (рис. 1А, резервуары 1 и 2). Подождите 5 минут, чтобы клетки прилипли к опухолевой камере. Некоторые клетки осядут и прикрепятся в водоемах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вставьте клеточную суспензию рядом с отверстиями каналов. Эта процедура применяется к раковым клеткам MDA-MB-231, другие линии потребуют оптимизации плотности клеток. Для улучшения прикрепления раковых клеток может быть выполнена функционализация покрытий поверхностей (например, поли-L-лизин, фибронектин). Пожалуйста, ознакомьтесь с ранее опубликованными протоколами для этапов нанесения покрытия¹⁶, ⁴⁸, ^{49, 50}.
   5. С правой стороны осторожно пипетите 1 × 10⁶ PBMC ресуспендируют в 50 мкл питательной среды в лунки 3 и 4 (см. рис. 1А, коллекторы 3 и 4).
      ПРИМЕЧАНИЕ: После протекания PBMC будет распределяться в промежуточную камеру, создавая «фронт», который представляет собой отправную точку эксперимента.
   6. Заполните все шесть резервуаров до 100-150 мкл питательной среды. Под микроскопом проверьте, правильно ли распределены клетки в культуральных отсеках, как показано на рисунке 1D-E. Конечные объемы могут варьироваться в зависимости от размера резервуаров. Отрегулируйте объемы так, чтобы они были одинаковыми во всех скважинах.
   7. Поместите чипы обратно в инкубатор примерно на 1 час, чтобы стабилизировать систему перед покадровой записью. Добавляйте свежую среду каждые 3 дня, так как она может быть подвержена потерям при испарении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Система совместима как с анализом живых/мертвых клеток, так и с динамическим мультиплексным профилированием секреции цитокинов из кондиционированных сред. Для хемокинового анализа до 200-250 мкл аликвот надосадочных веществ могут быть доступны путем сбора сред из двух резервуаров каждого отсека. Классические анализы ИФА и цитокинов Luminex требуют около 50 мкл надосадочных веществ. Пожалуйста, ознакомьтесь с ^51,52 примерами исследований других лабораторий, выполняющих профилирование цитокинов на моделях OOC.
3. Покадровое получение немеченых раковых и иммунных клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, 3 чипа расположены на одном предметном стекле микроскопа (см. Рисунок 1A для 2D-чипа и Рисунок 4B для 3D-чипа). Используя держатели ступеней, выделяющие 4 предметных стекла, кокультуры могут быть пригодны для мониторинга с помощью автоматизированной микроскопии с высоким содержанием для анализа больших партий экспериментальных условий. Чипы могут быть легко установлены на предметных стеклах толщиной 1 мм или 170 микрон (пластиковые или стеклянные покровные стекла, 6-луночные оптические донные мультилунки) для конфокальной визуализации высокого разрешения.
   1. Запись серии изображений немеченых клеток в ярком поле с помощью установки видеомикроскопии, оснащенной инкубационной системой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь наборы данных временных рядов (временное окно: 48 ч, частота кадров: 2 мин) были получены с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного 4-кратным объективом и пикселями CMOS 1,3M, оптимизированными для размещения в стандартном инкубаторе клеточных культур.
   2. Перед началом сбора микроскопа прогрейте микроскоп не менее 2 ч до уравновешивания до 37 °C и 5%_CO2.
   3. Выберите окно наблюдения, центрируя массив микроканалов между опухолью и центральным компартиментом. Это позволяет визуализировать динамику иммунной инфильтрации и взаимодействия внутри области, в которой высеваются раковые клетки.
   4. Отрегулируйте интенсивность освещения и фокусировку раковых и иммунных клеток.
   5. Для запуска покадровой съемки оптимизируйте частоту кадров и продолжительность времени в соответствии с экспериментом и типом исследуемой ячейки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Условия съемки должны быть оптимизированы, чтобы избежать чрезмерной фотоэкспозиции, сохраняя при этом хорошее отношение сигнал/шум (SNR). Поскольку иммунные клетки очень подвижны, частота кадров сбора данных должна быть достаточно высокой, чтобы следить за интересующим динамическим процессом и обеспечивать легкое отслеживание⁵³. Должен быть достигнут компромисс между алгоритмом отслеживания, совместимостью с размером результирующего набора данных и жизнеспособностью, плотностью и подвижностью наблюдаемых клеток.
   6. В конце интервальной съемки используйте функцию «Импортировать последовательность изображений» и «Сохранить как» программного обеспечения ImageJ, чтобы преобразовать набор данных кадра в несжатый видеофайл со скоростью 25 кадров в секунду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сгенерированный видеофайл теперь готов к анализу отслеживания ячеек. Здесь были собраны изображения RGB (1280x1024 пикселей) с пространственным разрешением 1,33 мкм/пиксель. Фильм продолжительностью 24 часа (стек 3,5 ГБ) с одним полем зрения (FOV) состоит из 720 кадров для каждого условия.
4. Анализ данных: полуавтоматическое извлечение немеченых иммунных треков с помощью Trackmate
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь анализ подвижности иммунной системы в 2D-немаркированных покадровых изображениях проводится с помощью TrackMate⁵⁴, набор инструментов с открытым исходным кодом, доступный в пакете программного обеспечения Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Предусмотрено несколько алгоритмов для автоматического отслеживания отдельных частиц⁵⁵(СПТ) точечных структур. Они были эффективно применены к флуоресцентным изображениям, где объекты яркие на темном фоне с высоким отношением сигнал/шум (т.е. флуоресцентные пятна с низким разрешением, меченые дорожные везикулы, ядра)^{1,25,56,57,58}. SPT в основном основан на двух последовательных шагах. Во-первых, объекты локализованы с идентифицированными позициями в нескольких кадрах (сегментация), как показано в схемеРисунок 2. На втором этапе (связывание частиц) обнаруженные пятна связываются в последовательных кадрах для оценки движения и реконструкции их траекторий в форме трека (Рисунок 3). Числовые признаки могут быть вычислены из каждого извлеченного массива координат X, Y, Z с течением времени. Расширенная документация представлена в⁵⁴а также онлайн (http://imagej.net/TrackMate), следуя руководству по началу работы с TrackMate. Точность процесса может быть проверена немедленно, обрабатывая интуитивно понятный графический интерфейс пользователя (графический интерфейс, похожий на мастер), который позволяет пользователям на каждом этапе изменять настройки. В следующей части кратко показано, как использовать Trackmate для обработки изображений и этапов количественной оценки, применяемых к изображениям в видимом свете:
   1. Перетащите стек видео/изображений, работающий полный рабочий день, на панель инструментов Фиджи.
   2. Настройка калибровочного стека (рис. 2A).
      1. Проверьте размерность и назначьте свойства изображения, выбрав «Изображение> Свойства». Поля «Единица заполнения длины», «Размеры в пикселях» и «Интервал между кадрами».
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для выполнения калибровки используйте известную длину микроканалов (500 мкм, рис. 1C) и разделите на соответствующую измеренную длину в пикселях. Для временных рядов 2D убедитесь, что поле Z/T поменяно местами, введя 1 в качестве z-среза и правильное количество кадров фильма. Если этого не сделать, количественные результаты и параметры Trackmate будут отображаться в пиксельных единицах и таймфреймах.
   3. Предварительная обработка изображений.
      1. Чтобы улучшить правильное различение иммунных клеток на шумном фоне, предварительно обработайте изображения яркого поля для компенсации артефактов. Убедитесь, что наборы данных состоят из 8-битных изображений TIFF (диапазон яркости: 0–255).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Неравномерное освещение, низкое отношение сигнал/шум и загрязнение мелкими частицами мусора на изображениях в видимом свете могут поставить под угрозу успех процесса отслеживания клеток. Здесь наборы данных временных рядов предварительно обрабатываются с помощью вычитания фона, функции регулировки яркости/контрастности и локального вычитания размытия изображения по Гауссу из исходных изображений. В ImageJ доступны и другие наборы инструментов для анализа для обработки и сегментации фазово-контрастных изображений или изображений яркого поля, включая эмпирический порог градиента (EGT)⁵⁹.
   4. Первая калибровочная панель (рис. 2A)
      1. Выбрав стек изображений, запустите Trackmate (Плагины>Отслеживание).  Пересмотреть/подтвердить размерность и временное окно данных (т. е. ширину пикселя и интервал кадра).
         ПРИМЕЧАНИЕ: TrackMate автоматически считывает данные в поле свойств изображения, чтобы дать окончательные результаты отслеживания в откалиброванных физических единицах (т.е. мкм и минутах).
      2. Определите интересующую область для вычисления извлечения иммунных треков, вручную вставив значения или нарисовав замкнутую область поверх активного изображения, а затем нажав кнопку «Обновить источник». Чтобы выделить глобальные пути иммунной миграции, выберите прямоугольные области соответственно с правой стороны микроканалов (центральная камера, рис. 1E) и слева (опухолевая камера, рис. 1D). Чтобы проанализировать взаимодействие между раком и иммунными горячими точками, нарисуйте круговые субрегионы с помощью инструментов ROI (перейдите в раздел «Редактирование» → «Выделение» → «Указать»).
         ПРИМЕЧАНИЕ: При первом запуске этого набора инструментов на новом биологическом приложении потратьте необходимое время на оптимизацию настроек для реконструкции дорожек.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните ручное отслеживание траекторий ячеек (около 50-100 ячеек), чтобы эмпирически найти правильную конфигурацию и затем проверить в качестве эталона надежность автоматического извлечения движений. Кроме того, первоначально работайте на меньшей площади, чтобы легко проверить точность выбранных параметров.
   5. Этап обнаружения иммунных пятен (рис. 2B)
      1. Выберите детектор Лапласиана Гаусса (LoG) по умолчанию. Детектор LoG работает для поиска ярких, похожих на капли, округлых объектов и применения лапласианского фильтра Гаусса к изображению, настроенному на промежуточные размеры пятен (от 5 до 20 пикселей в диаметре).
      2. В поле «Расчетный диаметр большого двоичного объекта» (здесь 10–13 мкм) введите значение, немного превышающее ожидаемый размер пятна. Увеличивайте пороговое значение (здесь 1-3 мкм) до тех пор, пока не уменьшатся дополнительные паразитные фоновые пятна, возможно, без удаления элементов объекта. Обнаружения ниже порогового значения (на основе показателей качества) будут исключены из последующего анализа. Установите флажок для медианного фильтра и субпиксельной локализации, чтобы улучшить качество обнаружения пятен.
      3. Используйте кнопку «Предварительный просмотр» для просмотра и быстрого осмотра идентифицированных иммунных клеток, наложенных на изображения пурпурными кругами.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Ошибки при обнаружении окажут значительное влияние на процесс связывания. Другие нежелательные обнаружения могут быть исправлены в последующих меню с помощью пользовательских фильтров (например, по интенсивности, размеру или положению пятна).
   6. Когда вы будете удовлетворены выбором, нажмите «Далее».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки могут варьироваться в зависимости от экспериментальной установки и методов получения изображений (например, поле зрения, увеличение объектива, яркопольные или флуоресцентные изображения), типа клеток (адгезивные или плавающие клетки), от медленной или быстрой подвижности, типа клеточного поведения (взаимодействующие или нет) и низкой/средней/высокой плотности в области наблюдения.
   7. Продолжите и пропустите меню Initial Thresholding. Выберите окно Hyperstack Displayer.
   8. Установите фильтры на панели спотов (рис. 2C).
      1. Выберите: Однородный цвет. Фильтры, как показано на рисунке 2C, могут быть добавлены для сохранения помеченных пятен со значениями признаков, отображаемых на гистограмме, выше или ниже обратимого порога.
   9. Этап выбора трекера (рис. 3А). Выберите трекер Simple LAP, так как алгоритм связывания частиц запрашивает три поля для заполнения (в данном случае «Максимальное расстояние связывания»: 30-50 мкм, «Максимальное расстояние закрытия зазора»: 25-50 мкм, «Максимальное закрытие зазора кадра»: 4-6). Этот детектор управляет событиями закрытия пробелов, при этом расчет привязки затрат производится исключительно на основе их соответствующего расстояния.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимально допустимое расстояние связи ограничивает диапазон пространственного поиска потенциальных совпадающих точек, соответствующий максимально допустимому смещению, пройденному между двумя последующими кадрами (рис. 3D).
      1. Обеспечивают большие значения максимального смещения при обнаружении фрагментации треков высокоподвижных частиц.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Два звена не будут соединены, если перемещение от кадра к кадру больше, чем заданное максимальное значение расстояния. Если сегменты плохо соединяют две разные ячейки, уменьшите значение максимального смещения.
      2. Попробуйте заново соединить недостающие места, варьируя значения «максимального расстояния для закрытия зазора» и «максимального зазора кадра».
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры имеют дело с событиями закрытия разрыва в несмежных кадрах. Для некоторых кадров может произойти точечное исчезновение (например, частицы не в фокусе, ячейки, оставленные и находящиеся в поле зрения, сбои сегментации в зашумленном изображении).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Для обработки событий разделения или слияния выберите компоновщик LAP в качестве детектора, который вводит штрафы за матрицу затрат на связывание.
   10. Нажмите кнопку Далее, чтобы запустить расчет отслеживания. Нажмите Далее.
   11. Панель фильтрации треков (рис. 3B). Измените цвет иммунных путей, выбрав в раскрывающемся меню «Идентификатор трека» или другие функции трека. На этом этапе выберите, по желанию, чтобы установить интерактивные фильтры функциональными, чтобы улучшить качество результата и вернуться к процедуре.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Паразитные пятна возникают из-за шума на изображении и потери качества изображения. Это приведет к созданию коротких сегментов, в то время как интересующие ячейки можно будет отслеживать во многих кадрах.
       1. Чтобы удалить короткие контуры, попробуйте отфильтровать их, исходя из количества пятен, которые они содержат. Кроме того, можно сортировать дорожки, используя комбинацию таких параметров, как «Смещение дорожки», «Длительность дорожки» или «Минимальная/средняя/максимальнаяскорость», чтобы исключить ложные или нежелательные дорожки (с меньшим количеством кадров по отношению к общей продолжительности интервальной съемки или с грязными или недвижущимися частицами) из дальнейшей постобработки.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор фильтров может варьироваться в зависимости от конкретного применения и биологической системы.
   12. Изучите все дорожки в интерфейсе параметров отображения, прокрутите время и проверьте, насколько точно треки соответствуют путям миграции ячеек. Выпадающее меню содержит цветовые коды для пятен и траекторий для удобной визуализации и фильтрации по нескольким модальностям (например, кинетические параметры, интенсивность, временное или пространственное положение).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Для отслеживания культур высокой плотности или высокоподвижных клеток увеличьте частоту кадров сбора данных, минимизируя смещение клеток, перемещаемое через последовательные промежутки времени.
   13. Ручное исправление ошибок сегментации и связывания (рис. 3E).
       1. Чтобы еще больше повысить качество результатов, редактируйте пятна (частицы мусора, неподвижные клетки) вручную и удаляйте ошибочные следы, полученные из обнаруженных границ опухоли при анализе ROI опухолево-иммунного взаимодействия.
       2. Сначала выберите инструмент TrackMate на панели инструментов ImageJ. Чтобы удалить существующее пятно по всему стеку, нажмите клавишу Shift и создайте курсором мыши маску ROI над целевым пятном (отредактированным в зеленом круге), а затем нажмите клавишу DEL.
       3. Для добавления нового пятна (в случае отсутствия треков из-за исчезновения пятен) нажмите клавишу A, наведя мышь на указанное место. Повторите процесс вычисления связывания дорожек после этого шага.
   14. Когда все будет готово, выберите «Анализ» на панели «Параметры отображения», чтобы создать три текстовых файла (рис. 3C и 3F). В таблице «Пятна в статистике треков» приведены пространственно-временные координаты иммунных пятен (X-Y-Z положения клеток, помеченных соответствующим фреймом и номером трека). «Ссылки в статистике треков» и «Статистика треков» содержат информацию относительно треков: длительность трека, количество обнаруженных пробелов или пятен, начальный и стоп-кадр трека и т.д. Сохранение и экспорт для каждого набора данных.
       ПРИМЕЧАНИЕ: При нажатии на строку в окнах результатов в покадровой видеосъемке активируется соответствующая точка, ссылка или трек для визуального осмотра. Повторите шаги фильтрации, чтобы выбрать/удалить треки. Все будущие экспортируемые данные будут обновлены. СОВЕТ: Значения начального и стоп-кадра и длительности отслеживания можно использовать для расчета времени контакта между раком и иммунными клетками при обработке рентабельности инвестиций.
   15. Нажмите кнопку «Сохранить», чтобы создать результирующий XML-файл, содержащий все значения параметров, путь к изображениям и позиции пятен во времени. Команда ''Load TrackMate file'' (Плагины> Tracking) восстанавливает весь сеанс процесса для каждого файла фильма в отдельности.
   16. Перейдите к последней панели графического интерфейса под названием «Выбрать действие». В списке используйте наложение захвата > функцию «Выполнить», чтобы создать видео с наложенными дорожками. СОВЕТ: Опция «График N-точек в зависимости от времени» может быть использована для вычисления пространственной плотности иммунных клеток в ROI (рис. 6B, правая панель).
   17. Постпроцессинговый анализ и миграционная статистика
       1. Анализируйте необработанные данные о местоположении непосредственно в Trackmate или экспортируйте данные для расчета комплексных кинетических параметров²⁹ (т. е. общей длины траектории, евклидова расстояния, коэффициента удержания, смещения в среднем квадрате⁵⁶, средней или мгновенной скорости пути, коэффициента остановки, распределения углов миграции, индекса прямой миграции, средней скорости по прямой) для классификации поведения миграции иммунных клеток (например, направленного или диффузионного движения^{30, 31}) и реакция на раковые клетки-мишени (например, лечение по сравнению с контролем).
          ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные полезные плагины, такие как The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/), предоставляют различные графики (например, графики розы или сектора, как показано на рисунке 6) и статистические тесты для расширенного анализа и визуализации экспериментальных данных миграции и хемотаксиса. Сочетание алгоритмов^24,25,45 отслеживания клеток и сегментации клеток может позволить измерять морфологические показатели на уровне одной клетки (т.е. площадь поверхности клетки^, длину большой и малой осей и соотношение сторон клетки).

2. 3D-иммунокомпетентная модель рака на чипе в конкурентном анализе

ПРИМЕЧАНИЕ: Конструкция 3D-чипа, изображенная на рисунке 4, состоит из 5 основных отсеков: центрального для приема плавающих иммунных клеток, двух боковых областей для встраивания опухолевых клеток в гидрогелевые матрицы (высотой 150-250 мкм) и камер перфузии среды. Иммунная и опухолевая камеры соединены двумя наборами узких массивов микроканалов (200×12×10^{мкм 3}, L×W×H, рис. 4E). Обычно трапециевидные равнобедренные микростолбы с интервалом 100 мкм (около 25-30 границ раздела для каждой боковой области геля, рис. 4C) работают как барьеры для удержания раствора геля во время инъекции, используя баланс между поверхностным натяжением и капиллярными силами^60,61 и соединяя опухолевые области с двумя боковыми дополнительными медиакамерами^, чтобы установить границу раздела гель-жидкость (рис. 5). Подробные характеристики конкурентного 3D-анализа показаны на рисунке 4. Предпочтительная миграция иммунных клеток к двум гидрогелевым компартментам, содержащим опухолевые клетки, которые подверглись различным методам лечения, может контролироваться и количественно оцениваться. Конкретная конкурентная схема может быть применена для исследования множества различных фенотипов биологии рака (например, лекарственно-устойчивые против агрессивных, первичные или метастатические, респондеры против нереспондеров). Кроме того, области, встроенные в гель, могут быть легко интегрированы с различными клеточными популяциями для воссоздания более гетерогенных TME, включая стромальные компоненты (фибробласты, эндотелиальные клетки)²³ или для моделирования специфических иммуносупрессивных сред³⁴ (например, макрофагов) для рассечения механизмов лекарственной устойчивости и уклонения от опухоли.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ядерное и активное окрашивание каспазы с использованием коммерческих наборов для анализов живых/мертвых (например, реагентов Thermo Fisher Scientific, Incucyte) может быть реализовано для оценки событий митотической или апоптотической смерти, как сообщается в Nguyen et ^al.33.

1. Приготовление матричного раствора с ячейками и загрузка в прибор
   ПРИМЕЧАНИЕ: В следующих экспериментальных условиях две области геля содержат смеси клеточных линий меланомы человека A375M, выращенных в матричном растворе (например, Matrigel), подвергнутых воздействию терапевтических агентов, используемых в качестве монотерапии или в комбинации. Эта настройка позволила нам оценить эффективность комбинации двух препаратов по отношению к одному в конкурентной манере и количественно оценить их способность привлекать PBMC.
   1. Разморозьте бульон матричного раствора (например, Matrigel), поместив его на лед в холодильник с температурой 4 ° C за день до эксперимента.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не подвергайте продукт многократным циклам замораживания-оттаивания, так как он становится «комковатым». Другие протоколы синтетических или натуральных гидрогелей могут быть подходящими для использования в этих условиях. Пожалуйста^, обратитесь к ^33,34,35 для подготовки раковых клеток в коллагеновых матрицах.
   2. Ресуспендировать клетки меланомы человека A375, окрашенные совместимым с живыми флуоресцентным клеточным линкером PKH67 Green в матричном растворе (2 мг ^мл-1). Там, где это указано, добавляют 5-аза-2'-дезоксицитидин (DAC; 2,5 мкМ), называемый DAC, и/или ИФН-α2b, называемый ИФН, в соответствующих дозах³².
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сопоставьте лот # в спецификации матричной бутылки. На основе концентрации рассчитайте объем среды, необходимый для получения до 2 мг ^мл-1 Пожалуйста, отрегулируйте оптимальную концентрацию белка и концентрацию суспензии раковых клеток в соответствии с интересующим вас приложением.
   3. Осторожно пипеткой вверх и вниз, чтобы избежать образования пузырьков. Держите микроцентрифужную пробирку на льду во время смешивания, чтобы предотвратить нежелательную полимеризацию.
   4. После стерилизации поместите устройства на лед (используя ведро со льдом и крышку), чтобы избежать затвердевания матричного раствора в течение всей процедуры загрузки клеток.
   5. Медленно вводите две смеси ИФН и ЦАК/ИФН матригеля / опухолевых клеток (2-4 мкл) в левый и правый порт геля соответственно с помощью микропипетки объемом 10 мкл с помощью холодных наконечников (рис. 5A). Слегка надавите, чтобы протолкнуть матричный раствор с одной стороны, пока не достигнет противоположной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем матричного раствора был выбран таким образом, чтобы избежать перелива в соседние каналы. Не оказывайте чрезмерного давления пипетки, чтобы предотвратить утечку раствора в среду и центральные каналы. Если во время загрузки путь геля заблокирован вдоль канала, попробуйте ввести раствор с другого входного отверстия до тех пор, пока фронты геля не встретятся. При извлечении микропипетки из входных отверстий придерживайте поршень, иначе отрицательное давление будет асспирировать матричный раствор.
   6. Поместите устройство в инкубатор в вертикальное положение при 37 °C и 5% CO₂ на 30 минут, чтобы обеспечить гелеобразование матричного раствора (рис. 5B). Осторожно обрабатывайте стружку встроенным неполимеризованным гелем, чтобы предотвратить утечку из гелевого канала.
   7. Тем временем ресуспендируют меченные PKH67 PBMC (1x10⁶ клеток) в 10 мкл полного DMEM (модифицированная среда Дульбекко Орла).
   8. После матричного гелеобразования заполните каналы среды (50-100 мкл) одной и той же аликвотой питательной среды во всех шести резервуарах, чтобы предотвратить высыхание геля в стружке. Держать в инкубаторе до высева суспензии иммунных клеток.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте под микроскопом правильное и однородное распределение опухолевых клеток в геле и целостность полимеризованных гелевых барьеров. Частично или неоднородные гелеобразные области или пузырьки в смеси приводят к преждевременному течению PBMC в каналах гелевых сред в начальной точке эксперимента из-за начальных колебаний давления.
   9. Аспирируйте среду из шести лунок и расположите наконечник рядом с входом в канал среды, чтобы осторожно впрыскивать суспензию ячейки PBMC умеренного давления. Временная последовательность загрузки показана на рисунке 5C:
      1. PBMC в среде 10 мкл в верхнюю центральную лунку.
      2. 50-100 мкл среды в каждую из четырех лунок боковых каналов.
      3. 40-90 мкл среды в верхнюю центральную лунку.
      4. 50-100 мкл среды в нижнюю центральную лунку.
   10. Под микроскопом убедитесь, что распределение PBMC остается ограниченным в центральной камере после этапа загрузки. (Рисунок 7А).
       ПРИМЕЧАНИЕ: Если это не оптимально, при необходимости отрегулируйте концентрацию и повторите этапы посева, используя нетронутую стружку. При расчете объемов для планируемых условий эксперимента ориентируйтесь на избыточное количество микросхем (15-20%), чтобы учесть возможные погрешности и корректировки. Объемы и концентрации должны быть оптимизированы в соответствии с конкретным применением.
   11. Поместите собранные устройства на ровную поверхность в инкубаторе при температуре 37 °C и 5% CO₂ для последующего получения флуоресцентной визуализации. Бережно обращайтесь с чипсами после загрузки иммунных клеток, которые плавают.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Компенсируйте потери объемов испарения в резервуарах путем замены сред каждые 2-3 дня. Для профилирования хемокинов можно отсасывать до 100 мкл из каждой из двух лунок культуральных отсеков, см. шаг 2.7 на этапе 1.
2. Автоматизированный подсчет рекрутированных PBMC на одноканальных флуоресцентных изображениях в ImageJ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Классические методы иммунофлуоресценции для конфокальной визуализации с высоким разрешением могут быть применены к операциям на кристалле в качестве конечных измерений. Основная процедура окрашивания включает фиксацию клеток на чипе, пермеабилизацию, блокировку, связывание антител, окрашивание ядер с промывкой между ними. Немеченые иммунные клетки, инфильтрированные в области 3D-гелей со встроенным микроокружением рака, могут быть зафиксированы в желаемые моменты времени и окрашены для экспрессии маркеров активации/истощения/созревания (например, для клеток CD8, мониторинг маркеров CD69, CD95, PD1, TIM3). В Parlato et al.³⁵фагоцитоз апоптотических клеток SW620 оценивали методом конфокальной микроскопии с использованием устройств, установленных на покровных стеклах толщиной 170 мкм. ИФН-ДК окрашивали с добавлением античеловеческих аликвот HLA-DR-FITC Ab.
   Чтобы рассчитать степень инфильтрации флуоресцентно окрашенных живых иммунных клеток, подвергающихся воздействию конкурентных сигналов, общий рабочий процесс анализа изображений устанавливается следующим образом (Рисунок 7D-Г):
   1. Получение, в определенных конечных точках времени, фазового контраста и красных/зеленых каналов флуоресцентных микрофотографий левой и правой областей геля, содержащих опухолевые клетки, соответственно подвергшихся воздействию одного или комбинаций фармакологических режимов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь изображения были получены флуоресцентным микроскопом EVOS-FL после загрузки клеток (0 ч), через 48 ч и через 72 ч инкубации (рис. 7A-B). 4-10-кратное увеличение было использовано для получения центральной камеры, микроканальных матриц и двух сопоставленных боковых каналов, содержащих A375 плюс ИФН и A375 плюс ЦАП/ИФН.
      1. При выполнении операций сбора данных учитывайте параметры для измерения и избегайте насыщения подсчитываемых объектов. Оптимальные результаты сегментации зависят от характера полученных изображений из-за изменчивости самих биологических образцов, качества окрашивания и методов микроскопии, используемых для приложений, ориентированных на пользователя.
   2. Загрузите флуоресцентные одноканальные данные (в данном случае красный = PBMC) на Фиджи, перетащив их в главное окно (рис. 7D). Дублируйте изображение, чтобы избежать перезаписи необработанных данных во время выбора фильтров предварительной обработки до окончательной сегментации.
      1. Если изображение является цветным изображением (RGB), нажмите «Изображение > тип 8 или 16 бит», чтобы преобразовать его в оттенки серого. Убедитесь, что для параметра «Параметры редактирования >» > «Преобразованиеs» установлено масштабирование при преобразовании.
   3. Предварительная обработка необработанных данных путем очистки от шума и артефактов.
      1. Перейдите в меню «Обработать» > «Вычесть фон», применив алгоритм катящегося шара для коррекции неравномерного шумового фона с большими пространственными вариациями интенсивности. Установите радиус не менее чем на размер самой большой частицы переднего плана. Установите флажок «Предварительный просмотр» для процедуры проб и ошибок, чтобы получить оптимальные результаты. Слишком малые значения могут привести к неправильному удалению интересующих структур.
      2. В команде «Яркость и контрастность» перетащите ползунки «Минимум/Максимум», чтобы изменить диапазон интенсивности на гистограмме. Сдвиньте ползунок «Максимум» влево, чтобы увеличить яркость без функций размытия. Переместите слайд «Минимум» вправо, чтобы увеличить контрастность изображения, избегая исчезновения менее заметных элементов на заднем плане. Нажмите кнопку Применить, чтобы исправить изменения.
   4. Улучшение изображения.
      1. Перейдите в раздел Process > Filters и поэкспериментируйте с медианными, гауссовскими фильтрами на изображениях (рис. 7E).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Радиус предварительной фильтрации должен быть адаптирован к пикселям шума изображения. Нелинейный медианный фильтр заменяет значение пикселя медианным значением соседей, чтобы уменьшить шум соли и перца. «Размытие по Гауссу» используется для сглаживания цифрового изображения путем замены пикселей средневзвешенным значением окружающих пикселей. Веса взяты из гауссовского распределения вероятностей, поэтому ближайшие пиксели более влиятельны.
      2. При желании перейдите в раздел «Обработать» > «Математика» > «Гамма» с отмеченным флажком «Предварительный просмотр», чтобы увеличить контрастность.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Интенсивность, установленная на панели B&C, масштабируется между двумя минимальными и максимальными пределами. Значения < 1,0 подчеркивают различия между низкой интенсивностью, в то время как значения > 1,0 подчеркивают различия между высокими интенсивностями. Гамма-коррекция функциональна для определения диапазона отображения, показывая самые тусклые объекты, не насыщая самые яркие.
   5. Создание двоичной маски изображения.
      1. Перейдите в раздел «Изображение» > «Настроить порог >». Наиболее простой метод определения пороговых значений основан на гистограммном анализе уровней интенсивности, как показано на рисунке 7F. В выпадающем меню поиграйте с различными методами глобального порога (в нашем случае применяется Otsu).
      2. Вручную прокрутите или введите известный диапазон интенсивности пикселей на панелях гистограммы, наблюдайте за изменением красного узора, накладывающегося на изображение, которое в основном напоминает фактическую область ячейки. Кнопка «Сброс» удаляет наложение. Когда все будет удовлетворено, нажмите «Применить», чтобы создать двоичную версию изображения. Установите флажок Process > Binary > Options, чтобы управлять отображением изображений с пороговыми значениями и идентификацией объектов анализатором частиц.
   6. Используйте команду меню Process/Binary/Watershed Articles, чтобы разделить частично перекрывающиеся или объединенные частицы во время порогового значения. Водораздел часто может точно разрезать их на части, добавив линию толщиной 1 пиксель. Выполняйте морфологические операции, такие как операции расширения или эрозии, для увеличения или удаления пикселей из-под или перенасыщенных пикселей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения дополнительной информации см. раздел Команды меню или обратитесь к MorphoLibJ, интегрированной библиотеке, основанной на математической морфологии для обработки двоичных данных.
   7. Описание функции количественного изображения.
      1. Получив удовлетворительное распознавание объектов, откройте анализатор частиц в разделе «Анализ» > «Анализ частиц». Частицы могут быть исключены по их размеру и цикличности, выраженным в пикселях или в калиброванной единице измерения (проверьте правильность шкалы относительно настроек микроскопа в разделе «Свойства изображения>»). Чтобы включить все, оставьте диапазон по умолчанию 0-бесконечность и цикличность по умолчанию на 0,00–1,00 (0 = прямая линия, 1 = идеальный круг).
      2. Чтобы отфильтровать мелкие «шумовые» пиксели или неинтересные объекты, установите минимальный и максимальный диапазон. Установите флажок «Включить отверстия», «Показать», «Контур» и «Отобразить результаты» в поле окна. Исключить по краям отбрасывает частицы, обнаруженные на границах изображения. Добавить в Manager добавляет полученный выбор в менеджер ROI для дальнейшего анализа, сохраняя информацию о положении частицы.
         ПРИМЕЧАНИЕ: В «Менеджере ROI» можно исправить автоматическую сегментацию записанных выходных данных (слияние разделенных ячеек, разделение объединенных ячеек). С помощью инструментов выделения на панели инструментов Фиджи выберите ROI внутри обеих областей геля, в которые встроены раковые клетки, чтобы оценить иммунную инфильтрацию.
   8. Экспортируйте полученные значения в электронную таблицу для выполнения статистического анализа, как показано на рисунке 7G. В разделе «Результаты» приводится таблица данных, относящаяся к идентифицированным пронумерованным очерченным свойствам частиц. «Резюмировать» открывает окно с названием изображения, общим количеством и другой информацией для всего изображения.
      1. Перейдите в раздел «Анализ» > «Установить измерения», чтобы включить широкий спектр параметров.
   9. При необходимости запишите макрос (выбрав Подключаемые модули > Макросы > Запись), чтобы автоматизировать рабочий процесс обработки и сэкономить время на анализ больших наборов данных.
      1. Используйте ту же процедуру обработки для анализа зеленого флуоресцентного канала в тех же областях для анализа морфологических изменений опухолевых клеток в 3D-областях¹⁶

Representative Results

Иммунная инфильтрация опухоли является параметром противоопухолевого ответа хозяина. Опухоли неоднородны по составу, плотности, расположению и функциональному состоянию инфильтрирующих лейкоцитов, взаимодействие которых с раковыми клетками может лежать в основе клинически значимой информации для прогнозирования течения заболевания и ответа на терапию. В этом смысле микрофлюидные технологии могут быть использованы в качестве дополнительных и привилегированных инструментов in vitro для изучения иммунной структуры опухолей, а также для мониторинга ответа на противоопухолевую терапию. Сочетание микрофлюидного анализа, визуализации живых клеток и программного обеспечения для отслеживания может создать надежные методы количественной оценки для количественной оценки того, как иммунные клетки корректируют свою миграционную модель в различных контекстах. В этой главе мы сообщили о шагах по созданию универсальных 2D или 3D кокультур иммунных и целевых раковых клеток в специальных микрофлюидных устройствах, реализованных с помощью стандартных процедур мягкой литографии. В Секции 1 использовались микрофлюидные устройства, обеспечивающие химические и физические контакты между адгезивными (раковые клетки MDA-MB-231) и неадгезивными (PBMC) популяциями. Некоторые химиотерапевтические агенты (например, антрациклины и другие) могут индуцировать «иммуногенный» апоптоз злокачественных клеток, тем самым повышая их видимость у иммунокомпетентных хозяев. Иммуногенная гибель раковых клеток (ИКД) характеризуется высвобождением связанных с мембраной и растворимых сигналов, доставляемых умирающими клетками, функционирующими как сигнализаторы для иммунных клеток. Чтобы обеспечить количественную проверку ответа МКБ, мы используем данные, собранные на микрофлюидной платформе, где лейкоциты могут перемещаться через соответствующим образом построенные микроканальные мостики к своим клеткам-мишеням. Покадровая запись была выполнена после совместной загрузки PBMC от здоровых доноров (WT, дикого типа) с клетками рака молочной железы MDA-MB-231 человека, предварительно обработанными или без антрациклина DOXO. Микрофотографии создавались каждые 2 минуты в течение двух последовательных интервалов времени по 24 и 48 ч. Фильм S1 интервала 0-24 ч). Анализ отслеживания отдельных PBMC с умирающими (обработанными DOXO) или живыми (обработанными PBS) раковыми клетками проводился с использованием подключаемого модуля Trackmate, как показано на Рисунок 6А (левая панель). Соответствующие значения хемотаксиса и графики миграции были автоматически сгенерированы с помощью инструмента хемотаксиса и миграции, как описано в разделе⁶². Все траектории клеток были экстраполированы на (x, y) = 0 в момент времени 24 ч. Результаты показали другой миграционный профиль иммунных клеток при совместной загрузке с клетками рака молочной железы, подвергшимися воздействию DOXO или PBS. Когда PBMC сталкивались с апоптотическими раковыми клетками, они пересекали микроканалы к умирающим/мертвым клеткам (но не к живым необработанным клеткам). Миграционные графики X/Y паука и розы, представленные на левой панели Рисунок 6B-C, были картированы и сравнены, чтобы подчеркнуть влияние иммуногенных индукторов на различия в иммунной динамике. Графики Роуз показывают, что PBMC мигрировали в основном почти во всех направлениях в контрольном эксперименте, только незначительная часть направляется вверх по градиенту, генерируемому пролиферирующими раковыми клетками. И наоборот, пути отдельных клеток подчеркивают сильное смещение вдоль направления клеток апоптотического рака молочной железы (отрицательное x-направление). Для оценки направленной миграции иммунных клеток к раковым клеткам, обработанным DOXO или PBS, вычисляются несколько параметров хемотаксиса, в том числе: а) центр масс (пространственная усредненная точка всех конечных точек); б) направленность; в) индекс прямой миграции (т.е. среднее смещение клеток в интересующем направлении, то есть к целевому месту опухоли, в нашем случае). Последние значения представляют собой измерение эффективности клетки для миграции в направлении заданных хемотаксических стимулов. После попадания в левую камеру фракция лейкоцитов с возрастающей плотностью в течение 24-48 ч выявляла длительные (>60 мин) контакты с DOXO-обработанным MDA-MB-231. PBMC не могут массово мигрировать и участвовать в таких длительных и стойких взаимодействиях с живыми раковыми клетками (как показано репрезентативными микрофотографиями приближающихся PBMC в Рисунок 6А, справа). Для количественной оценки различий во взаимодействии опухоли и иммунитета область опухоли была очерчена фиксированным кругом диаметром от 20 до 80 микрон, названным «горячей точкой». Количественная оценка и анализ репрезентативных полов зрения показаны в Рисунок 6 (Правая панель, B-C).

В разделе 2 была описана новая 3D-иммунокомпетентная модель опухоли для количественной оценки рекрутирования иммунных клеток в ответ на противораковые комбинации эпигенетических препаратов³² (DAC / IFN против только IFN), что позволяет сравнивать два разных состояния лечения клеток меланомы A375 одновременно. Таким образом, клетки меланомы A375M, меченные зеленым флуоресцентным красителем PKH67, были встроены в матрицы Матригеля в присутствии DAC и/или ИФН в каждую гелевую камеру, тогда как PBMC PKH26 с красной меткой были равномерно распределены в центральную жидкостную камеру в начальной точке (рис. 7A). Мы сравнили одновременно две опухолевые массы в 3D-матрицах на предмет их способности привлекать PBMC. Через 48 и 72 ч PBMC массово направляются в правые микроканалы, как показано на рисунке 7B.

Было четко отмечено преимущественное направление PBMC к гелевой матрице, содержащей участок меланомы, обработанный DAC / IFN, а не обработанный IFN, в то время как плохая скорость миграции была видна в направлении клеток A375, подвергшихся однократной обработке (левая сторона чипа). Соревновательная обстановка применима для исследования множества различных фенотипов биологии рака (например, лекарственно-устойчивых против агрессивных, первичных или метастатических (например, A375P против клеток меланомы A375M), а также респондеров и нереспондеров). Гелевые камеры могут состоять из сложных кокультур злокачественных клеток и множественных нераковых клеток, связанных с опухолью, таких как эндотелиальные клетки, иммунные клетки и фибробласты³³, для характеристики ответов на лекарственные средства на уровне TME. События митоза и апоптотической гибели раковых клеток можно контролировать путем окрашивания живыми красителями³³. Процедуры иммуноокрашивания на 3D-микрофлюидных устройствах могут быть адаптированы для оценки состояний активации инфильтрированных иммунных клеток в опухолевых участках с помощью конфокальной микроскопии³⁵. В этом смысле эти 3D-микрофлюидные системы могут имитировать сложные опухолевые структуры и многоклеточные взаимодействия и, следовательно, являются ценными платформами для более надежного доклинического тестирования лекарств.

Рисунок 1. Планиметрия микрофлюидного устройства для сборки 2D опухолево-иммунных кокультур. (A) Реальная микрофотография 3 чипов, собранных в одно предметное стекло микроскопа. Резервуары пронумерованы в зависимости от последовательности загрузки и имеют цветовую маркировку, как соответствующие культуральные камеры, перечисленные в легенде. Масштабная линейка, 6 мм. (B) 3D CAD чипа, состоящего из трех основных областей клеточных культур, соединенных микроканавками. C) Детали узкого микроканавочного моста, показывающие размеры, адаптированные к раковым клеткам и размеру PBMC. D-E) Микрофотография в видимом свете была получена до начала интервальной съемки, показывающая распределение раковых клеток и PBMC соответственно в левой и промежуточной камере. Масштабная линейка, 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2. Конвейер анализа Trackmate для локализации иммунных пятен на изображениях временных рядов. A) Верхняя панель: скриншот меню калибровки изображения Trackmate. Нижняя панель: Фиджи «Меню свойств изображения» для установки временных и пространственных единиц. Б) Верхняя панель: Скриншот меню Trackmate «Обнаружение пятен». Нижняя панель: Выходное изображение с примененными различными значениями «Порога». C) Верхняя панель: Скриншот меню Trackmate «Точечная фильтрация», иллюстрирующий некоторые фильтры. Нижняя панель: Примерное покадровое изображение, изображающее иммунные пятна, отфильтрованные по положению вдоль X в промежуточной камере. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3. Конвейер Trackmate Analysis для восстановления иммунных треков в последовательностях изображений временных рядов. A-C) Скриншоты меню Trackmate для построения треков, фильтрации треков и экспорта итоговых данных. D) Примеры сгенерированных треков в предварительно обработанных покадровых изображениях, изменяющих настройки детектора связи. E) Пример ложных следов и плохих ссылок, полученных при обнаружении границ опухолевых клеток. F) Треки подсвечиваются зеленым цветом путем выбора строк в файле .txt результатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4. Схематический обзор 3D-иммунокомпетентных опухолевых чипов. А) Пример микроструктурированного кремниевого мастера. Штампы для PDMS были нанесены негативным резистом SU-8 в чистом помещении, оборудованном электронно-лучевой и оптической литографией. Б) Реплики PDMS были изготовлены стандартными методами мягкой литографии. Центральный блок имеет камеры, окрашенные в цвет, как те, которые нарисованы в 3D-рендеринге чипа, изображенные на панели D. C) Сканирующая электронная микроскопия (SEM) увеличенный вид массива микростолбов, подходящих для улавливания раствора гидрогеля. D)3D CAD, показывающий камеры, соединенные микроканавками, и загрузочные колодцы. Пунктирные рамки относятся к фотографиям деталей SEM (панель C и E). E) СЭМ-фотография соединительных микроканавок высотой 10 мкм. F) 2D-макет САПР с изображением размеров микроструктур. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5. Схематический рабочий процесс основных шагов протокола загрузки для сборки 3D-кокультур. A) Верхняя панель: Схемы этапа впрыска раствора Матригеля в каждую боковую область геля. Нижняя панель: Реальная фотография чипа, показывающая продвижение геля вперед вдоль канала на этапе загрузки. Б) Схемы этапа полимеризации Матригеля. Нижняя панель: фазово-контрастный микроскопический вид границы раздела гель-воздух, образованный после стадии гелеобразования. Масштабная линейка, 100 мкм. C)Верхняя панель: Рисунок, изображающий загрузку ячеек и носителей с примерными объемами, используемыми в протоколе. Нижняя панель: показано 4-кратное фазово-контрастное изображение собранной совместной культуры в 0h. Масштабная линейка, 200 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6. Анализ миграционных профилей и поведения взаимодействия PBMC по отношению к умирающей/живой опухолевой камере во временном окне 24-48 ч. Левая панель. A) Скриншоты предварительно обработанных изображений с интервальной съемкой, наложенных на иммунные цветные дорожки, извлеченные Trackmate. Иммунные пути получены с помощью одного поля зрения в указанных экспериментальных условиях в интервале от 24 до 48 ч в промежуточной камере. B-C) Репрезентативные пути миграции и участки роз PBMC, культивируемых в двух разных условиях (n = 1550 PBMC по сравнению с раковыми клетками, обработанными DOXO, DOXO + или n = 1434 PBMC по сравнению с контрольными раковыми клетками, DOXO-). Каждая линия внутри графиков x-y изображает одну траекторию PBMC, а каждый круг представляет собой конечное положение одной ячейки по отношению к начальному положению. Начальные точки устанавливаются равными (0,0) с помощью преобразования координат. Координаты и смещение центра масс миграции клеток отображены в указанных экспериментальных условиях. Координаты центра масс и смещение (вычисляемые как среднее евклидово расстояние для компонентов X и Y) дают представление о среднем направлении, в котором группа клеток в основном перемещалась, и величине общего движения клеток в группах состояний. Синяя и зеленая линии соответственно обозначают отдельные треки евклидовым значением расстояния больше/меньше порогового значения (100 мкм). Г) Схема числовых данных, извлеченных треком ячейки. E-F) График Бокса и Усов, изображающий соответственно направленность (p<0,0001 Непарный t-критерий с поправкой Уэлча) и FMI (p<0,0001 Непарный t-критерий с поправкой Уэлча). Горизонтальная линия в прямоугольниках представляет медианные значения. Значения FMI являются средними для всех треков клеток в каждой группе состояний. Правая панель. A) Скриншоты извлеченных Trackmate ROI, показывающих дифференциальное взаимодействие между PBMC и раковыми клетками, обработанными DOXO или PBS. B) Временная плотность PBMC вокруг обработанных DOXO или контрольных раковых клеток MDA-MB-231. Количество PBMC, присутствующих в выбранном ROI вокруг раковых клеток для каждого состояния. Сообщаемые значения представляют собой среднее значение за 9 выбранных ROI из одного покадрового поля зрения. Горячие точки рака определяются в ROI (диаметр 80 мкм). Отображается соответствующая тепловая карта плотности. Точки представляют среднее количество клеток, рассчитанное по 9 горячим точкам рака в указанные моменты времени. В) Распределение времени (мин) контактов для каждой экспериментальной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7. Предпочтительный набор PBMC в ответ на комбинации препаратов DAC плюс ИФН в конкурентной 3D-иммунокомпетентной меланоме на чипе. А) Распределение первоначально загруженных ПБМК в центральной камере микрофлюидных устройств. Микрофотографии получены флуоресцентным микроскопом EVOS-FL с интервалом от 0 до 72 часов. Красная флуоресценция (клетки, меченные PKH67) представляет собой PBMC от здоровых доноров. Меченные PKH67 (зеленые) клетки меланомы человека, встроенные в Matrigel, содержащие одинарные или двойные комбинации, были покрыты боковыми камерами. B) Ячейки A375 плюс ИФН слева по сравнению с A375 плюс DAC/IFN справа. Флуоресцентные изображения были показаны через 72 ч совместной культуры. Снятая с производства желтая рамка изображает явно массовый набор в A375 плюс сторону DAC/IFN. C) PBMC учитывается в четырех различных показателях рентабельности инвестиций из камер IFN по сравнению с камерами DAC + IFN. Гистограммы представляют количество ячеек +/- S.D.; Тепловая карта перечисляет значения для каждого ROI. Масштабные линейки, 200 мкм. D-G) Схемы этапов сегментации и количественного определения инфильтрированных PBMC в гелевых матрицах, нанесенных на одноканальные флуоресцентные изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительный файл. Протокол микрофабрикации Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительный фильм 1. Покадровые последовательности в 2D-иммуноопухолевой кокультуре на чипе. Микрофотографии получали каждые 2 мин, с интервалом времени 0-24 ч с помощью компактного микроскопа, помещенного в стандартный инкубатор клеточных культур. Левая панель. Видео PBMC от здоровых доноров (WT, дикого типа), покрытых контрольными клетками рака молочной железы MDA-MB-231. Правая панель. Видеоролик о массовой миграции PBMC WT к чип-камере, где загружаются раковые клетки, обработанные MDA-MB-231 DOXO. Компоновка 2D-чипа подробно описана в разделе 1 Протокола и показана на рисунке 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот фильм.

Discussion

Описанные методы пытаются разработать общий подход к повторению, с модулируемой степенью сложности, двух важных аспектов в области онкоиммунологии, которые могут выиграть от принятия более актуальных моделей in vitro. Первый включает в себя сторону популяции опухолевых клеток, где устранение характеристик отдельных клеток может привести к лучшему описанию гетерогенности и коррелированной биологической и клинической значимости, включая резистентность к терапии, устойчивость к метастазированию, стволовые клетки и степень дифференцировки. Другая сторона истории представлена TME, включая доброкачественные компоненты (иммунные и стромальные клетки, кровеносные сосуды) и химический/физический ландшафт (компоненты ECM, высвобождаемые хемокины и другие растворимые факторы), которые могут глубоко формировать как характеристики заболевания, так и реакцию человека на терапию⁶³, особенно на иммунотерапию. Стоит отметить, что экспорт описанного подхода в другие области исследований требует глубокого понимания ограничений и проблем, связанных с разработкой и внедрением новых моделей.

Цитируя максиму, применяемую в инженерном моделировании («моделировать проблему, а не систему»), она должна быть оптимизирована, то есть минимальное количество (клеточных, физических и химических) компонентов и условий, необходимых для того, чтобы сделать собственную модель на кристалле биологически значимой и стабильной на протяжении всего эксперимента. Таким образом, каждая комбинация типов клеток / микросреды / экспериментальных условий должна быть точно выбрана, оценена и постоянно контролироваться в ходе отдельных экспериментов и от сеанса к сеансу. Эти проверки включают в себя, как упоминалось в разделах протокола, строгий контроль параметров, таких как объемы в микрофлюидных устройствах, которые могут быть изменены условиями влажности или нагревом от источников освещения, возможные движения и неплоскостность ступеней, вызывающих неконтролируемые дрейфы жидкости, а также некоторая конечная проверка состояния клеток, жизнеспособности и фенотипической характеристики. Один из важнейших шагов касается решения об использовании перфузионных систем для создания васкуляризированных (подобных) структур или для доставки лекарств на чипе³³, поскольку это может повлиять на эксперименты с точки зрения увеличения сложности, продолжительности культивирования клеток и модуляции химических факторов в присутствии плавающих клеток, таких как иммунные.

Далее мы суммируем основные критические и актуальные проблемы, обнаруженные в экспериментальных условиях и в самой последней литературе.

ECM и определение химического ландшафта
На TME также оказывают глубокое влияние механические 64,65 свойства окружающей среды^{63, 66}. По этой причине выбор культивирующей матрицы имеет основополагающее значение, особенно при работе с иммунными клетками, которые в определенных условиях могут реагировать на сигналы, испускаемые самой матрицей. В ближайшем будущем ожидается также соответствующий прогресс в области проектирования и разработки новых материалов и гидрогелей (отличающихся различной жесткостью, пористостью, наличием растворимых факторов и другими параметрами), которые позволяют создавать все более совершенный и контролируемый ECM, имитирующий специфику различных тканей сегодня, разных пациентов завтра. С другой стороны, также важно отслеживать изменения, вызванные различными клеточными популяциями в ECM, и определять стратегии для включения этой информации в динамический и фенотипический анализ.

Управление данными
Путь к развертыванию методов лечения опухолей на чипе в клиническом рабочем процессе выиграет от огромной экспериментальной работы, которая проводится по нескольким направлениям. Модели «орган-на-чипе», как и многие методы in vitro, функционируют, по крайней мере, потенциально, для выполнения измерений с высокой пропускной способностью и высоким содержанием. Распараллеливание экспериментальных условий, включая положительный и отрицательный контроль, а также технические/биологические реплики, стало возможным благодаря интеграции нескольких микросхем на одной пластине. Увеличение количественной пропускной способности играет решающую роль в переводе и валидации этих систем в быстром конвейере скрининга лекарств или генов для иммунотерапии. Действительно, несколько компаний уже разработали платформы в многолуночном формате, и в настоящее время тестируются различные подходы к визуализации, позволяющие одновременно контролировать большое количество устройств¹⁴. В приведенных выше протоколах мы использовали предметные стекла микроскопа, выделяющие до 3 чипов, с возможностью параллельной визуализации до 12 экспериментальных условий, используя стандартный многослайдовый лоток микроскопа. Эта установка совместима с ручным пипетированием и подходит для индивидуальной регулировки, выполняемой на нашем микропроизводственном предприятии. Напротив, когда требуется сильное распараллеливание (многократные скрининговые испытания и контроль), требуется оптимизация настройки для установки более высокого уровня автоматизации (например, использование роботов-пипетировщиков, пластиковых многолунок).

При планировании экспериментов необходимо учитывать компромисс между пространственным и временным разрешением.

Огромное количество данных, полученных с помощью микроскопии с высоким содержанием, представляет собой ограничивающий фактор с точки зрения хранения, передачи и анализа. Эти проблемы решаются с помощью вычислительных подходов, реализующих инструменты машинного обучения и аппаратно-программные ресурсы, которые могут способствовать будущей возможности связывать эксперименты на кристалле / in silico^67,68 при выборе терапевтических стратегий, и это представляет собой амбициозную^, но не откладываемую возможность.

Помимо флуоресцентной визуализации
Флуоресцентная маркировка красителями или репортерными генами, благодаря своей высокой специфичности, несомненно, представляет собой метод золотого стандарта для идентификации различных клеточных популяций в условиях совместного культивирования и разрешения молекулярных свойств с высоким SNR. В моделях OOC этот подход обычно используется в качестве эталона, и, в частности, в гетерогенных микроокружениях опухоли на чипе, он может быть полезен для характеристики фенотипа иммунных клеток, инфильтрированных и взаимодействующих.

Тем не менее, появляется все больше доказательств того, что эффекты, вызванные флуорофорами, трудоемкими процедурами окрашивания и процедурами освещения, должны контролироваться и сводиться к минимуму⁶⁹, поскольку могут глубоко влиять на поведение и состояние клеток^70,71. Этот риск, по-видимому, особенно актуален для хрупких систем, таких как иммунные клетки^72,73. Фототоксические реакции могут накладывать ограничения на определение временного окна приобретения живых клеток при мониторинге с высоким пространственным и временным разрешением. Более того, богатство разнообразия иммунных субпопуляций делает невозможным различение их только флуоресцентным окрашиванием, учитывая ограниченное количество фильтров, обычно доступных на микроскопах.

Чтобы решить эту проблему, с инструментальной точки зрения, в настоящее время на сцене появляются новые методы микроскопии без меток⁷⁴, такие как голографическая⁵⁶ или гиперспектральная микроскопия⁵⁷. Они обещают передовые стратегии классификации клеточных процессов, выходящие за рамки флуоресценции, и могут быть особенно ценными для изучения чувствительных образцов. С точки зрения анализа данных, передовые вычислительные подходы, основанные на алгоритмах глубокого обучения⁷⁵ (обученных наборами данных флуоресцентных изображений), открывают двери для выполнения так называемой «маркировки in silico»^76,77. Они были успешно применены для предсказания флуоресцентных маркеров по изображениям^{яркого поля 78}, генерируя меченые изображения, без окрашивания клеток, тем самым увеличивая информативность светлопольной микроскопии. Эта стратегия также может быть полезна для экономии времени и каналов флуоресценции для других маркеров. Мы считаем, что сообщество OOC выиграет от этих новых методов, позволяющих менее инвазивно изучать взаимодействие клеточных популяций.

Анализ данных
Механизмы взаимодействия между иммунными и раковыми клетками-мишенями могут быть исследованы путем отслеживания движений клеток^28,79. Эксперименты по покадровому отслеживанию в сложных и гетерогенных кокультурах чрезвычайно ценны для извлечения моделей миграции клеток, морфологических изменений и изменений состояния, а также исчерпывающей информации о происхождении. Выполнение ручного анализа практически возможно только для коротких последовательностей с небольшим количеством клеток, но не для высокопроизводительных систематических экспериментов. Следовательно, разработка вычислительных инструментов для отслеживания клеток, полностью или частично автоматизированных, является жизненно важной областью исследований в области анализа изображений²⁴. Как правило, обычное отслеживание клеток требует относительно высокой частоты выборки и пространственного разрешения для правильного выполнения задач сегментации, что может быть сложной задачей во многих экспериментальных условиях. Для локализации ячеек доступны инструменты сегментации и отслеживания с открытым доступом (например, программное обеспечение ImageJ²²), представленные в этом протоколе, или специальное проприетарное программное обеспечение. В крупномасштабных исследованиях мы применили проприетарное программное обеспечение под названием Cell Hunter^16,31, разработанное Университетом Тор Вергата в Риме^, чтобы полностью автоматически различать раковые и иммунные клетки в контексте нескольких популяций. Индивидуальные решения, основанные на машинном обучении и нейросетевых подходах 80,81,82, сегодня начинают внедряться в программные пакеты ⁸³ микроскопии^, от улучшения SNR до управления критическими параметрами сбора данных или этапами сегментации. Машинное обучение может быть использовано для распознавания общих клеточных паттернов (например, стилей движения), чтобы охарактеризовать биологическую реакцию по отношению к факторам микросреды.

В Comes et ^al.41 была применена предварительно обученная архитектура сверточной нейронной сети глубокого обучения для классификации того, подвергаются ли раковые клетки медикаментозному лечению или нет, используя в качестве «маркера» подвижность иммунных клеток, отслеживаемую по покадровым данным кокультур клеток рака молочной железы и PBMC в коллагеновых матрицах в микроустройствах. как описано в^{пункте 33}.

Разработка методов и онтологий одноклеточной омиксы
Мы указываем на необходимость стратегического альянса между одноклеточными омиксными технологиями⁸⁴ (например, протеомикой, метаболомикой, геномикой) и методами на кристалле: молекулярная детальная характеристика, сопряженная с функциональной динамической информацией, может улучшить понимание основных механизмов и клинического описания. В этом случае новые инструменты для связи двух миров находятся в начале⁸⁵. Первая задача состоит в том, чтобы внедрить одноклеточные омиксные подходы непосредственно на онкоиммунологических чипах²². Кроме того, органы-на-чипах могут быть использованы в качестве платформ для тестирования потенциальных мишеней, идентифицированных с помощью геномного и протеомного анализа^86,87. Второй инструмент связывания, который до сих пор в значительной степени отсутствует, представляет собой структурированный, стандартизированный способ аннотирования и хранения результатов измерений^88,89. Но это именно то, что нам нужно в будущем, чтобы построить систематические базы данных клеточных количественных результатов и измеренных характеристик, добывать, выводить и соотносить их с присущей биологической информацией. Одним словом, необходимость стандартизации и систематического анализа гетерогенных экспериментальных наборов данных требует структуры онтологии.

Персонализация моделей
Технология «органы-на-чипе» подходит для персонализации¹², поскольку клетки и ткани отдельных пациентов (или классов пациентов) могут использоваться в устройствах в контролируемых условиях, что приводит к клинически значимым показаниям, полезным для информирования о терапевтических или профилактических стратегиях. Некоторые примеры начинают появляться в литературе⁹⁰. Конечно, для моделей опухоли на чипе эта задача ставит несколько технических и научных вопросов, которые необходимо решить³⁶ (например, контроль характеристик TME, таких как концентрация кислорода, градиенты цитокинов и т. д.). Важно отметить, что перспектива повышения эффективности онкологической и онкоиммунологической терапии при одновременном снижении вредного воздействия на каждого пациента привлекательна как с точки зрения качества жизни, так и с точки зрения оптимизации ресурсов здравоохранения.

В заключение, очевидно, что эта область является подлинно междисциплинарной и, как таковая, требует больших усилий для установления общего языка и общих целей между исследователями, клиницистами, промышленностью, а также из разных дисциплин (инженерия, биология, наука о данных, медицина, химия), нахождение хорошего баланса и новых решений⁹¹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator