Modelos de cocultivo microfluídico para diseccionar la respuesta inmune en microambientes tumorales in vitro

Summary

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular, la biología del cáncer requiere nuevas herramientas in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado. Describimos protocolos para explotar cocultivos microfluídicos inmunes al tumor en entornos 2D y 3D, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico de las funciones celulares.

Abstract

Los modelos de enfermedades complejas exigen herramientas de vanguardia capaces de ofrecer información fisiológica y patológicamente relevante y procesable, y revelar procesos que de otro modo serían invisibles. Los ensayos celulares avanzados que imitan de cerca el escenario in vivo se están estableciendo como formas novedosas de visualizar y medir la interacción bidireccional tumor-huésped que influye en la progresión del cáncer. Aquí describimos dos protocolos versátiles para recrear cocultivos 2D y 3D altamente controlables en microdispositivos, imitando la complejidad del microambiente tumoral (TME), bajo inmunovigilancia natural e inducida por terapia. En la sección 1, se proporciona un entorno experimental para monitorear la diafonía entre las células tumorales adherentes y las poblaciones inmunes flotantes, mediante microscopía de lapso de tiempo de campo brillante. Como escenario aplicativo, analizamos los efectos de los tratamientos contra el cáncer, como los llamados inductores inmunogénicos de muerte de células cancerosas sobre el reclutamiento y la activación de las células inmunes. En la sección 2, los microambientes inmunes al tumor 3D se ensamblan en un diseño competitivo. La infiltración inmune diferencial se monitoriza mediante instantáneas de fluorescencia hasta 72 h, para evaluar estrategias terapéuticas combinadas. En ambos entornos, se ilustran los pasos de procesamiento de imágenes para extraer una gran cantidad de parámetros de células inmunes (por ejemplo, migración e interacción de células inmunes, respuesta a agentes terapéuticos). Estos métodos simples y poderosos se pueden adaptar aún más para simular la complejidad del TME que abarca la heterogeneidad y plasticidad de los subtipos de células cancerosas, estromales e inmunes, así como sus interacciones recíprocas como impulsores de la evolución del cáncer. El cumplimiento de estas tecnologías en rápida evolución con imágenes de alto contenido de células vivas puede conducir a la generación de grandes conjuntos de datos informativos, lo que plantea nuevos desafíos. De hecho, el triángulo "co-cultivos/microscopía/análisis avanzado de datos" establece el camino hacia una parametrización precisa del problema que puede ayudar a protocolos terapéuticos a medida. Esperamos que la futura integración de inmune al cáncer en un chip con inteligencia artificial para el procesamiento de alto rendimiento sinergice un gran paso adelante en el aprovechamiento de las capacidades como herramientas predictivas y preclínicas para la oncología de precisión y personalizada.

Introduction

La evolución de las diferentes ramas de la medicina como disciplinas experimentales ha dependido de la capacidad de manipular la población celular y las funciones orgánicas en condiciones controladas¹. Tal capacidad tiene sus raíces en la disponibilidad de modelos medibles capaces de recapitular los procesos que ocurren en nuestro cuerpo.

En la era de la inmunoterapia y el perfil genómico unicelular 2, la biología del cáncer necesita aprovechar los modelos emergentes in vitro y computacionales para investigar la interfaz tumor-inmune en un contexto espaciotemporal adecuado ^2,3.

El microambiente tumoral⁴ (TME) es un tejido complejo donde las células cancerosas interactúan continuamente y coevolucionan dinámicamente con los otros componentes celulares (células inmunes, estromales y endoteliales) y no celulares (la matriz extracelular, ECM). La naturaleza dinámica de este complejo paisaje dicta si las células inmunes juegan como amigas o enemigas de las células malignas, lo que afecta fuertemente tanto la progresión de la enfermedad como la respuesta a la terapia. Hoy en día, grandes esfuerzos de oncoinmunólogos, bioinformáticos y expertos en biología de sistemas están convergiendo para abordar la importancia clínica de la heterogeneidad del cáncer 5,6, ya sea en el espacio (es decir, en distintas regiones tumorales) y el tiempo (es decir, en distintas etapas de progresión tumoral)^5,6, y para caracterizar el fenotipo y la función del cáncer y las células inmunes a nivel de una sola célula. Como ejemplo de esta sinergia, las técnicas avanzadas de visión artificial se utilizan ahora de forma rutinaria para el mapeo espacial del infiltrado inmune en muestras histológicas ^7,8.

En el frente de los modelos experimentales, uniendo estudios en animales y métodos tradicionales in vitro, los avances en microfluídica y técnicas de cocultivo dan acceso a diferentes clases de modelos celulares de microingeniería como organoides, sistemas microfisiológicos 9,10,11 (MPS) y órganos en chip^12,13,14 (OOC). Comparten el rasgo común de ampliar la visión general de los ecosistemas celulares y expandir el potencial in vitro para controlar los factores microambientales mientras explotan la microscopía de alto contenido¹⁵ y los enfoques de procesamiento de imágenes.

Hoy en día, los sistemas MPS y OOC de última generación han comenzado a incluir aspectos inmunológicos, incorporando diferentes subtipos de células inmunes en tejidos y cocultivos existentes, para explorar y medir una variedad de procesos como enfermedades inflamatorias, cicatrización de heridas, inmunidad mucosa y respuesta a toxinas o productos alimenticios diarios¹⁶. Los modelos TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, también integrados con microvasos perfusibles 18,19,20,21, se han desarrollado para investigar las interacciones dependientes del tipo celular, las perturbaciones físicas y químicas y la actividad citotóxica de linfocitos infiltrantes²², así como agentes inmunomoduladores clínicamente relevantes²³.

Aquí, proporcionamos protocolos versátiles, que abarcan desde células de carga en chips hasta herramientas de procesamiento de imágenes, para explotar cocultivos microfluídicos avanzados inmunes al tumor en configuraciones 2D (sección 1) y 3D (sección 2)¹⁶, compatibles con el monitoreo dinámico y multiparamétrico²⁴ y la visualización de funciones celulares. Esto se logra manteniendo la facilidad de uso y flexibilidad tanto en la gestión de muestras como en el análisis de datos, aprovechando el software gratuito de Fiji y sus cajas de herramientas^25,26.

El dispositivo microfluídico, descrito en la sección 1, está diseñado para realizar cocultivos 2D de cáncer adherente y células inmunes flotantes. Esta plataforma fue validada para la medición in vitro del comportamiento de las células inmunes en presencia de mutaciones genéticas²⁷ y/o inmunodeficiencias²⁸. Aquí, ilustramos los pasos para rastrear las células inmunes en imágenes de campo claro de lapso de tiempo, explotando un método semiautomático basado en Trackmate (un complemento implementado en el software de Fiji). Este procedimiento permite la extracción de descriptores cinemáticos de migración inmune ²⁹ y respuesta (es decir, tiempos de interacción) a células cancerosas diana, tratadas o no con inductores de muerte celular inmunogénica²⁷.

Es importante destacar que estos parámetros, extraídos de imágenes de series temporales, se pueden procesar con maquinaria matemática avanzada. Como ejemplo de la potencialidad de este enfoque, nuestros grupos publicaron recientemente un análisis basado en métodos matemáticos de procesos estocásticos y mecánica estadística para modelar las propiedades de la red celular y proporcionar una descripción parametrizada del comportamiento de las células inmunes (es decir, caminata aleatoria sesgada o no correlacionada, movimiento altamente o no coordinado^30,31).

La configuración 3D, proporcionada en la segunda sección, se basa en un protocolo de cocultivo para recrear TME inmunocompetentes más complejos incrustados en dos regiones de gel con diferentes combinaciones de tipos de células y medicamentos de manera competitiva. Aquí, se describen los pasos de procesamiento de imágenes para medir, en diferentes puntos temporales, la infiltración de células inmunes teñidas en células de melanoma A375M humano cultivadas dentro de Matrigel, para evaluar combinaciones de agentes antitumorales³². La línea A375M, una línea celular derivada de A375P caracterizada por un fenotipo altamente metastásico, fue elegida para evaluar su capacidad metastásica en presencia de células inmunes³².

Los modelos descritos pueden ser totalmente compatibles con diferentes fuentes celulares (líneas celulares murinas y humanas inmortalizadas o primarias, organoides, xenoinjertos, entre otros). En estudios recientes de nuestro laboratorio, al combinar microscopía de video de alto contenido con análisis de imágenes, se aplicó el diseño 3D competitivo para investigar: i) una respuesta inmune antitumoral (citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y diseccionar el papel de los fibroblastos en la resistencia a la terapia con trastuzumab en modelos en chip de cáncer de mama HER2^{+ 33}; ii) la acción de las células mieloides (es decir, macrófagos asociados al cáncer) en los mecanismos de evasión tumoral y reclutamiento de células T³⁴; iii) la eficacia de los regímenes inmunoterapéuticos, específicamente basados en células dendríticas condicionadas por interferón α (IFN-DC), cultivadas con células de cáncer de colon tratadas con fármacos en matrices de colágeno, y evaluar el movimiento eficiente y los eventos de fagocitosis subsiguientes³⁵; iv) la migración quimiotáctica de eosinófilos derivados de la médula ósea hacia células de melanoma tratadas o no tratadas con IL-33³⁶.

Estos modelos avanzados podrían servir como ventanas de observación para comprender el papel de la textura inmune en la metástasis del cáncer y los mecanismos de resistencia, pero se requieren esfuerzos para traducir los hallazgos a las clínicas, cerrando la brecha con la investigación básica³⁷.

Como escenario emergente, aprovechar el poder de la microscopía automatizada de alto contenido junto con el uso de microsistemas más relevantes fisiológicamente está abriendo nuevos desafíos potenciales para el manejo, procesamiento e interpretación de cientos, e incluso miles, de Gigabytes de datos multiparamétricos, que se pueden generar a partir de una sola campaña experimental. Esto implica un vínculo directo de los experimentos OOC con algoritmos basados en inteligencia artificial 38,39,40,41,42 (AI) tanto para el análisis automatizado avanzado como para la generación de características que pueden alimentar a su vez modelos in silico de interacción cáncer-inmune 43, con nuevas aplicaciones emocionantes en el horizonte^, como el desarrollo de ensayos predictivos de detección de medicamentos ⁴⁴.

Un flujo de esfuerzos cada vez mayor se centra en el diseño de modelos de enfermedades junto con la optimización de estrategias para implementar las pantallas de perturbación a gran escala con lecturas multiómicas de una sola célula. Sin duda, esto ayudará al desarrollo y, con suerte, a la implementación clínica, acompañada de un grado apropiado de estandarización del método, de un enfoque sistemático de oncoinmunología en un chip para obtener nuevos conocimientos sobre los trastornos inmunes y los mecanismos de diseminación del cáncer.

Protocol

1. Diseño de chip para cocultivos 2D de células adherentes y flotantes

NOTA: El diseño de cocultivo 2D (Figura 1A-C) se caracteriza por tres cámaras (100 μm de altura) interconectadas por dos conjuntos de matrices de microcanales (500 x 12 x 10 μm³, L×W×H). La cámara intermedia forma dos compartimentos cerrados sin salida que bloquean las células inmunes flotantes que se desbordan en el sitio del tumor durante el paso de carga 2.5. Este tipo de dispositivo es útil para mediciones bidimensionales en tiempo real de la motilidad unicelular (adherente o flotante) y de las interacciones célula-célula 16,27,28,30,31. Un estudio típico de migración celular (realizado de varias horas a varios días) combina microscopía de células vivas con algoritmos de procesamiento de imágenes⁴⁵, para traducir las secuencias de imágenes adquiridas en características numéricas²⁵. A partir de los patrones migratorios, se pueden estimar varios indicadores biofísicos, como el desplazamiento y la velocidad de las células, así como la duración de las interacciones entre las células inmunes y las células diana²⁴.

1. Preparación de células cancerosas y PBMC
   1. Cultivo de células cancerosas
      NOTA: MDA-MB-231 triple negativo [receptor de estrógeno (ER)-, receptor de progesterona (PR)-, y receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2)-] las células de adenocarcinoma de mama humano se cultivan rutinariamente en un medio Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% (v/v) de suero fetal bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, 100 UI mL−1 de penicilina G sal sódica y 100 μg mL⁻¹ de sulfato de estreptomicina (medio de crecimiento), en condiciones de cultivo estándar (37 °C y 5%_CO2).
      1. Para optimizar el crecimiento del cultivo celular, colocar en placa células MDA-MB-231 en matraces de 75 cm² a una densidad de 1 × 10⁶ células ^mL-1 en 12 a 15 ml de medio de crecimiento.
      2. Cuando las células alcancen el 75-80% de la confluencia, deseche el medio de crecimiento, lave las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) precalentada para eliminar completamente el FBS y luego sepáralas con tripsina precalentada (1 a 2 min a 37 °C).
      3. Agregue medio de crecimiento para inactivar la actividad enzimática de tripsina y recolectar células desprendidas. Lave las celdas dos veces durante 5 minutos a 1.100 x g a temperatura ambiente (RT).
      4. Contar células en un portaobjetos de conteo de células mediante la prueba de exclusión de colorante Trypan Blue y luego volver a sembrarlas para cultivo de mantenimiento (para no más de 6 pasajes desde la descongelación) o para procedimientos experimentales.
      5. Para experimentos microfluídicos, sembrar 1 × 10 6 células en placas de⁶ pocillos en 3 ml de medio de crecimiento y tratar con 25 μM de doxorrubicina (DOXO) o un volumen igual de disolvente DOXO (PBS) como control.
      6. Cuatro a 6 horas después, lave las células tratadas con DOXO dos veces con PBS precalentado durante 5 minutos a 1.100 x g en RT.
      7. Contar las células de control tratadas con DOXO y PBS como se indica anteriormente (véase el paso 1.1.1.5) y establecer el cocultivo con células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en dispositivos microfluídicos.
   2. Aislamiento PBMC
      1. Recoja sangre total venosa (10 ml aproximadamente) de voluntarios sanos en viales heparinizados y mezcle suavemente invirtiendo el tubo de 2 a 4 veces⁴⁷.
      2. Diluir sangre 1:1 con PBS y colocar sobre 10 mL de gradiente de densidad medio Lymphoprep en un tubo de 50 mL.
         NOTA: Asegúrese de hacer las capas muy suave y lentamente para permitir que la sangre y Lymphoprep formen dos capas distintas.
      3. Tubos centrífugos durante 30 minutos a 400 x g a 4 °C en un cucharón abatible sin frenos. Se formarán cuatro capas distintas: (i) plasma en la parte superior, (ii) una capa blanca y turbia que contiene PBMC, (iii) Lymphoprep y (iv) una bolita de eritrocitos y granulocitos.
      4. Aspirar suavemente las PBMC con una pipeta de 2 ml y resuspender inmediatamente en un medio de crecimiento caliente (el mismo utilizado en el paso 1.1.1) y lavar dos veces durante 5 min a 1.100 x g a RT.
      5. Contar las PBMC peletizadas como se indica anteriormente (véase el paso 1.1.1.5) y utilizarlas para procedimientos experimentales o congelarlas para su almacenamiento a largo plazo.
2. Recubrimiento de las células en chips 2D
   NOTA: Las PBMC no están teñidas en este protocolo. Para caracterizar fenotipos específicos en chip, las subpoblaciones de células inmunes pueden aislarse mediante selección de perlas inmunomagnéticas, teñirse con seguidores de células fluorescentes, remezclarse con la fracción restante no marcada y, por lo tanto, confrontarse con células cancerosas objetivo, como se informó en los experimentos en chip, descritos en Vacchelli et ^al.27, y en Racioppi et ^al.34.
   1. Antes de comenzar los experimentos de cocultivo y para facilitar la adición de reactivos, active los chips almacenados mediante un tratamiento de plasma de oxígeno durante unos segundos. Llene inmediatamente los depósitos con agua desionizada o PBS para mantener las superficies PDMS (polidimetilsiloxano) hidrófilas hasta los pasos de recubrimiento.
      NOTA: El PDMS es intrínsecamente hidrófobo, lo que puede dar lugar a dificultades de funcionamiento y al atrapamiento de burbujas de aire en microcanales. Consulte el paso 7 del archivo complementario que proporciona detalles sobre la activación del plasma de oxígeno.
   2. Esterilizar bajo un gabinete UV durante 20 minutos, lavar 2-3 veces con PBS fresco y luego incubar con medios de cultivo durante 1 h. Mantenga las fichas en la incubadora hasta que realice los pasos de enchapado.
   3. Retire el exceso de medios de los seis depósitos. Tenga cuidado de evitar succionar los medios de comunicación de las principales cámaras de cultivo.
   4. Aplicar lentamente 1 × 10⁵ células cancerosas resuspendidas en 10-20 μL de medio de crecimiento en el reservorio superior izquierdo y luego en el pocillo inferior (Figura 1A, reservorios 1 y 2). Espere 5 minutos para permitir que las células se adhieran a la cámara tumoral. Algunas células se asentarán y se adherirán en los reservorios.
      NOTA: Inserte la suspensión celular junto a las aberturas del canal. Este procedimiento se aplica a las células cancerosas MDA-MB-231, otras líneas requerirán optimización de la densidad celular. Para mejorar la unión de las células cancerosas, se puede realizar una funcionalización de recubrimiento de superficies (por ejemplo, poli-L-lisina, fibronectina). Consulte los protocolos publicados anteriormente para los pasos^{de recubrimiento 16}, ^48,49,50.
   5. En el lado derecho, pipetear suavemente 1 × 10⁶ PBMC resuspendidos en 50 μL de medio de crecimiento en pocillos 3 y 4 (véase la figura 1A, depósitos 3 y 4).
      NOTA: Después de fluir, PBMC se distribuirá en la cámara intermedia creando un "frente", que representa el punto de partida del experimento.
   6. Llene los seis reservorios con hasta 100-150 μL de medio de crecimiento. Bajo un microscopio, verifique que las células se hayan distribuido correctamente en los compartimentos de cultivo como se muestra en la Figura 1D-E. Los volúmenes finales pueden variar con el tamaño de los depósitos. Ajuste los volúmenes para que sean iguales en todos los pozos.
   7. Vuelva a colocar los chips en la incubadora durante aproximadamente 1 h para estabilizar el sistema antes de la grabación de lapso de tiempo. Añadir medio fresco cada 3 días, ya que puede estar sujeto a pérdidas por evaporación.
      NOTA: El sistema es compatible tanto con el análisis de células vivas / muertas como con el perfil dinámico de secreción de citoquinas multiplex de medios acondicionados. Para los análisis de quimiocinas, se puede acceder a alícuotas de sobrenadantes de hasta 200-250 μL mediante la recolección de medios de los dos reservorios de cada compartimento. Los ensayos clásicos de perfiles de citoquinas ELISA y Luminex requieren aproximadamente 50 μL de sobrenadantes. Consulte ^51,52 ejemplos de estudios de otros laboratorios que realizan perfiles de citoquinas en modelos OOC.
3. Adquisición en lapso de tiempo de cáncer y células inmunitarias no marcadas
   NOTA: Normalmente, 3 chips están dispuestos en un solo portaobjetos de microscopio (consulte la Figura 1A para el chip 2D y la Figura 4B para el chip 3D). Utilizando soportes de escenario que asignan 4 portaobjetos, los cocultivos pueden ser adecuados para ser monitoreados por microscopía automatizada de alto contenido para analizar grandes lotes de condiciones experimentales. Los chips se pueden montar fácilmente en portaobjetos con un grosor igual a 1 mm o 170 micras (cubreobjetos de plástico o vidrio, multipocillos de fondo óptico de 6 pocillos) para obtener imágenes confocales de alta resolución.
   1. Grabe series de imágenes de campo claro de células no marcadas mediante una configuración de microscopía de vídeo equipada con un sistema de incubación.
      NOTA: Aquí se adquirieron conjuntos de datos de series temporales (ventana de tiempo: 48 h, velocidad de fotogramas: 2 min) con un microscopio de fluorescencia, equipado con un objetivo 4x y píxeles CMOS 1.3M, optimizado para encajar en una incubadora de cultivo celular estándar.
   2. Calentar el microscopio durante al menos 2 h para equilibrar a 37 °C y 5% de_CO2 antes de comenzar la adquisición.
   3. Seleccione la ventana de observación centrando la matriz de microcanales entre el tumor y el compartimiento central. Esto permite visualizar la dinámica de la infiltración inmune y las interacciones dentro de la región en la que se siembran las células cancerosas.
   4. Ajustar la intensidad de la iluminación y el enfoque de las células cancerosas e inmunitarias.
   5. Para lanzar la adquisición de lapso de tiempo, optimice la velocidad de fotogramas y la duración del tiempo de acuerdo con el experimento y el tipo de celda en estudio.
      NOTA: Las condiciones de imagen deben optimizarse para evitar una exposición excesiva a la foto, manteniendo al mismo tiempo una buena relación señal-ruido (SNR). Como las células inmunes son muy móviles, la velocidad de fotogramas de adquisición debe ser lo suficientemente alta como para seguir el proceso dinámico de interés y permitir un fácil seguimiento⁵³. Se debe llegar a un compromiso entre el algoritmo de seguimiento, la compatibilidad con el tamaño del conjunto de datos resultante y la viabilidad, densidad y motilidad de las células observadas.
   6. Al final del lapso de tiempo, utilice la función Importar secuencia de imágenes y Guardar como del software ImageJ para convertir el conjunto de datos de fotogramas en un archivo de vídeo sin comprimir de 25 fps.
      NOTA: El archivo de vídeo generado ya está listo para el análisis de seguimiento de celdas. Aquí, se recopilaron imágenes RGB (1280x1024 píxeles) con una resolución espacial de 1,33 μm / píxel. Una película de 24 horas de duración (pila de 3,5 GB) de un solo campo de visión (FOV) consta de 720 fotogramas para cada condición.
4. Análisis de datos: Extracción semiautomática de pistas inmunes no marcadas por Trackmate
   NOTA: Aquí, el análisis de motilidad inmune en imágenes de lapso de tiempo 2D no etiquetadas se lleva a cabo utilizando TrackMate⁵⁴, una caja de herramientas de código abierto disponible en el paquete de software Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Se proporcionan varios algoritmos para realizar el seguimiento automatizado de partículas individuales⁵⁵(SPT) de estructuras puntuales. Se han aplicado de manera eficiente a imágenes fluorescentes, donde los objetos son brillantes sobre un fondo oscuro con alta SNR (es decir, puntos fluorescentes de subresolución, vesículas de tráfico etiquetadas, núcleos)^{1,25,56,57,58}. SPT se basa principalmente en dos pasos secuenciales. En primer lugar, los objetos se localizan con posiciones identificadas en varios fotogramas (segmentación), como se esquematiza enFigura 2. En la segunda etapa (enlace de partículas), los puntos detectados se vinculan a lo largo de fotogramas consecutivos para estimar el movimiento y reconstruir sus trayectorias, en forma de pista (Figura 3). Las características numéricas se pueden calcular a partir de cada matriz de coordenadas X, Y, Z extraída a lo largo del tiempo. La documentación ampliada se informa en⁵⁴así como en línea (http://imagej.net/TrackMate), siguiendo el tutorial Introducción a TrackMate. La precisión del proceso se puede inspeccionar de inmediato, manejando una interfaz gráfica de usuario intuitiva (GUI similar a un asistente) que permite a los usuarios, en cada paso, reajustar la configuración. La siguiente parte muestra brevemente cómo usar Trackmate para el procesamiento de imágenes y los pasos de cuantificación, aplicados a imágenes con luz visible:
   1. Arrastre y suelte la pila de vídeo/imagen a tiempo completo en la barra de herramientas de Fiji.
   2. Configuración de la pila de calibración (Figura 2A).
      1. Compruebe la dimensionalidad y asigne las propiedades de la imagen seleccionando Propiedades > imagen. Unidad de relleno de longitud, dimensiones de píxeles y cuadros de intervalo de fotogramas.
         NOTA: Para realizar la calibración, utilice la longitud conocida de los microcanales (500 μm, Figura 1C) y divida por la longitud medida correspondiente en píxeles. Para series temporales 2D, asegúrese de cambiar el campo Z/T introduciendo 1 como z-slice y el número correcto de fotogramas de película. Si no se logra, las salidas cuantitativas y los parámetros de Trackmate se informarán en unidades de píxeles y marcos de tiempo.
   3. Pre-procesamiento de imágenes.
      1. Para mejorar la discriminación correcta de las células inmunes de un fondo ruidoso, preprocese imágenes de campo claro para compensar los artefactos. Asegúrese de que los conjuntos de datos constan de imágenes TIFF de 8 bits (rango de brillo: 0-255).
         NOTA: La iluminación desigual, la baja SNR y la contaminación por partículas de escombros pequeños en imágenes de luz visible podrían comprometer el éxito de un proceso de seguimiento celular. Aquí, los conjuntos de datos de series temporales se procesan previamente mediante sustracción de fondo, función de ajuste de brillo/contraste y sustracción de imagen local de un desenfoque gaussiano de las imágenes originales. Existen otros kits de herramientas de análisis diferentes disponibles en ImageJ para el procesamiento y la segmentación de imágenes de contraste de fase o de campo claro, incluido el umbral de gradiente empírico (EGT)⁵⁹.
   4. Primer panel de calibración (Figura 2A)
      1. Con la pila de imágenes seleccionada, inicie Trackmate (Plugins>Tracking).  Revisar/confirmar la dimensionalidad y la ventana temporal de los datos (es decir, el ancho de píxeles y el intervalo de fotogramas).
         NOTA: TrackMate lee automáticamente en el cuadro de propiedades de la imagen para dar los resultados finales de seguimiento en unidades físicas calibradas (es decir, μm y minutos).
      2. Defina una región de interés para calcular la extracción de pistas inmunes, insertando valores manualmente o dibujando un área cerrada sobre la imagen activa y, a continuación, presionando el botón Actualizar fuente. Para extraer las rutas de migración inmune global, seleccione regiones rectangulares respectivamente en el lado derecho de los microcanales (cámara central, Figura 1E) y a la izquierda (cámara tumoral, Figura 1D). Para analizar las interacciones entre el cáncer y los puntos calientes inmunitarios, dibuje subregiones circulares utilizando herramientas de ROI (vaya a Editar → selección → Especificar).
         NOTA: Cuando ejecute por primera vez esta caja de herramientas en una nueva aplicación biológica, dedique el tiempo necesario a optimizar la configuración para reconstruir las pistas.
         NOTA: Realizar un seguimiento manual de las trayectorias celulares (unas 50-100 celdas) para encontrar empíricamente la configuración correcta y a continuación validar como referencia la fiabilidad de la extracción automática de movimientos. Además, trabaje inicialmente en un área más pequeña para verificar fácilmente la precisión de los parámetros elegidos.
   5. Paso de detección de manchas inmunes (Figura 2B)
      1. Seleccione el detector predeterminado Laplaciano de Gaussiano (LoG). El detector LoG funciona para encontrar objetos brillantes, redondeados en forma de mancha y aplicar un filtro laplaciano de gaussiano en la imagen ajustada para tamaños de punto intermedios (5 a 20 píxeles de diámetro).
      2. En Estimated Blob Diameter (Diámetro estimado de la mancha) (aquí, 10-13 μm) introduzca un valor ligeramente mayor que el tamaño de punto esperado. Aumente el valor de umbral (aquí 1-3 μm) hasta que se reduzcan los puntos de fondo espurios adicionales, posiblemente sin eliminar las características del objeto. Las detecciones por debajo del valor umbral (basadas en una métrica de calidad) se descartarán del análisis posterior. Marque la casilla del filtro mediano y la localización de subpíxeles para mejorar la calidad de la detección de manchas.
      3. Utilice el botón Vista previa para ver e inspeccionar rápidamente las células inmunitarias identificadas superpuestas en las imágenes por círculos de color magenta.
         NOTA: Los errores durante la detección tendrán un impacto considerable en el proceso de vinculación. Otras detecciones no deseadas pueden corregirse en los menús siguientes mediante filtros definidos por el usuario (es decir, por intensidad de punto, tamaño o posición).
   6. Una vez que esté satisfecho con las selecciones, presione Siguiente.
      NOTA: Estos ajustes pueden variar dependiendo de la configuración experimental y las modalidades de adquisición de imágenes (por ejemplo, FOV, aumento objetivo, imágenes de campo brillante o fluorescentes), tipo de célula (células adherentes o flotantes), de la motilidad lenta o rápida, tipo de comportamiento celular (interactuando o no) y densidad baja/media/alta en el área de observación.
   7. Continúe y omita el menú Umbral inicial. Seleccione la ventana Hyperstack Displayer.
   8. Defina filtros en el panel de puntos (Figura 2C).
      1. Seleccionar: Color uniforme. Los filtros, como se muestra en la Figura 2C, se pueden agregar para retener puntos etiquetados con valores de entidad, mostrados en un histograma, por encima o por debajo de un umbral reversible.
   9. Etapa de selección del rastreador (Figura 3A). Elija el rastreador LAP simple, como algoritmo de enlace de partículas que solicita tres campos para completar (en este caso, "Distancia máxima de enlace": 30-50 μm, "Distancia máxima de cierre de brecha": 25-50 μm, "Brecha de marco máximo de cierre de brecha": 4-6). Este detector gestiona los eventos de cierre de brechas, con un cálculo de enlace de costos basado únicamente en su distancia respectiva.
      NOTA: La distancia de enlace máxima permitida limita el rango de búsqueda espacial para los puntos de coincidencia candidatos, correspondiente al desplazamiento máximo permitido recorrido entre dos fotogramas posteriores (Figura 3D).
      1. Proporcionar valores mayores de desplazamiento máximo cuando se nota la fragmentación de las huellas de partículas altamente móviles.
         NOTA: No se conectarán dos enlaces si el movimiento fotograma a fotograma es mayor que el valor de distancia máxima dado. Si los segmentos unen mal dos celdas diferentes, disminuya el valor del desplazamiento máximo.
      2. Intente volver a conectar los puntos que faltan, variando los valores de "la distancia máxima para el cierre de la brecha" y "la brecha máxima del cuadro".
         NOTA: Estos parámetros tratan de eventos de cierre de huecos en fotogramas no adyacentes. La desaparición puntual puede ocurrir para algunos fotogramas (es decir, partículas desenfocadas, celdas que salen y están en el FOV, fallas de segmentación en una imagen ruidosa).
         NOTA: Para manejar eventos de división o fusión, opte por el enlazador LAP como detector que introduce penalizaciones de matriz de costos de vinculación.
   10. Haga clic en Siguiente para ejecutar el cálculo de seguimiento. Presione Siguiente.
   11. Panel Filtrado de pistas (Figura 3B). Cambie el color de las rutas inmunes seleccionando, desde el menú desplegable, "ID de seguimiento" u otras funciones de seguimiento. En este punto, elija opcionalmente establecer filtros interactivos funcionales, para mejorar la calidad del resultado y revisar el procedimiento.
       NOTA: Las manchas espurias surgen del ruido en la imagen y la pérdida de calidad de la característica. Esto generará segmentos cortos, mientras que las celdas de interés se pueden rastrear en muchos marcos.
       1. Para eliminar rutas cortas, intente filtrarlas, según el número de puntos que contienen. Además, ordene las pistas utilizando una combinación de opciones como el desplazamiento de la pista, la duración de la pista o la velocidad mínima/media/máxima para excluir pistas falsas o no deseadas (con menos fotogramas con respecto a la duración total del lapso de tiempo o que impliquen partículas sucias o que no se muevan) del posprocesamiento.
          NOTA: La elección de los filtros puede variar según la aplicación específica y el sistema biológico.
   12. Examine todas las pistas en la interfaz Opciones de visualización, desplácese por el tiempo y compruebe la precisión de las pistas que coinciden con las rutas de migración de celdas. El menú desplegable proporciona códigos de color para puntos y trayectorias para facilitar la visualización y el filtrado por varias modalidades (por ejemplo, parámetros cinéticos, intensidad, posición temporal o espacial).
       NOTA: Para el seguimiento de cultivos de alta densidad, o celdas de alta movilidad, aumente la velocidad de fotogramas de adquisición minimizando el desplazamiento de celdas viajado en intervalos de tiempo consecutivos.
   13. Corrección manual de errores de segmentación y vinculación (Figura 3E).
       1. Para mejorar aún más la calidad de los resultados, edite manualmente las manchas (partículas de desechos, células estacionarias) y elimine las pistas erróneas derivadas de los límites tumorales detectados al analizar los ROI de interacción tumoral-inmune.
       2. Primero, seleccione la herramienta TrackMate en la barra de herramientas de ImageJ. Para eliminar un punto existente en toda la pila, presione shift y cree con el cursor del mouse una máscara ROI sobre el punto objetivo (editado en un círculo verde) y luego presione la tecla SUPR.
       3. Para agregar un nuevo punto (en caso de que falten pistas debido a la desaparición de manchas) presione la tecla A, colocando el mouse en la ubicación señalada. Repita el proceso de cálculo de vinculación de pistas después de este paso.
   14. Cuando esté satisfecho, seleccione Análisis en el panel Opciones de visualización para generar tres archivos de texto (Figura 3C y 3F). La tabla en "Spots in tracks statistics" proporciona las coordenadas espaciotemporales de las manchas inmunes (posiciones X-Y-Z de las células marcadas con el marco asociado y el número de pista). "Estadísticas de enlaces en pistas" y "Estadísticas de pistas" contienen información relativa a las pistas: duraciones de pistas, número de huecos o puntos detectados, inicio de pista y fotograma de parada, etc. Guarde y exporte para cada conjunto de datos.
       NOTA: Al hacer clic en una fila dentro de las ventanas de resultados, el punto, enlace o pista respectiva se activa dentro del video de lapso de tiempo para la inspección visual. Repita los pasos de filtrado para seleccionar/eliminar pistas. Todos los datos exportados futuros se actualizarán. SUGERENCIA: Los valores de duración iniciales y de fotograma de parada y seguimiento se pueden explotar para calcular los tiempos de contacto entre el cáncer y las células inmunes al procesar los ROI de la interacción.
   15. Pulse el botón Guardar para generar un archivo XML resultante que contenga todos los valores de los parámetros, la ruta a las imágenes y las posiciones puntuales en el tiempo. El comando ''Load TrackMate file'' (Plugins> Tracking) restaura toda la sesión de proceso para cada archivo de película individualmente.
   16. Vaya al último panel de la GUI llamado Seleccionar una acción. En la lista, utilice la superposición de captura > función Ejecutar para producir un vídeo con pistas superpuestas. CONSEJO: La opción "Trazar N-puntos vs tiempo" se puede utilizar para calcular la densidad espacial de las células inmunes en un ROI (Figura 6B, panel derecho).
   17. Análisis posterior al procesamiento y estadísticas de migración
       1. Analice los datos de posición sin procesar directamente en Trackmate o exporte datos para calcular parámetros cinéticos completos²⁹ (es decir, longitud total de la trayectoria, distancia euclidiana, relación de confinamiento, desplazamiento cuadrático medio⁵⁶, velocidad de pista promedio o instantánea, coeficiente de detención, distribución de ángulos de migración, índice de migración hacia adelante, velocidad media en línea recta) para clasificar el comportamiento de migración de células inmunes (por ejemplo, movimiento dirigido o difusivo^{30, 31}) y la respuesta a las células cancerosas diana (p. ej., tratadas frente a control).
          NOTA: Los complementos útiles adicionales, como The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) proporcionan varios gráficos (por ejemplo, gráficos de rosas o sectores, como se muestra en la Figura 6) y pruebas estadísticas para el análisis avanzado y la visualización de datos experimentales de migración y quimiotaxis. La combinación de algoritmos de seguimiento celular y segmentación celular^24,25,45 puede permitir mediciones de métricas morfológicas a nivel de celda única (es decir, área de superficie celular, la longitud del eje mayor y menor^, y la relación de aspecto celular).

2. Modelo 3D inmunocompetente de cáncer en chip en un ensayo competitivo

NOTA: El diseño del chip 3D, representado en laFigura 4, consta de 5 compartimentos principales: uno central para la ingesta de células inmunes flotantes, dos regiones laterales para incrustar células tumorales en  matrices de hidrogel (150-250 μm de altura) y cámaras de perfusión de medios. Las cámaras inmunes y tumorales están conectadas por dos conjuntos de matrices estrechas de microcanales (200×12×10 μm³, L×W×H, Figura 4E). Regularmente, los micropilares isósceles trapezoidales espaciados en 100 μm (alrededor de 25-30 interfaces para cada región lateral del gel, Figura 4C) funcionan como barreras para confinar la solución de gel durante la inyección, explotando el equilibrio entre la tensión superficial y las fuerzas capilares^60,61 y conectan las regiones tumorales a las dos cámaras de medios laterales adicionales para establecer una interfaz gel-líquido (Figura 5). Las características detalladas del ensayo competitivo 3D se muestran en la Figura 4. Se puede monitorear y cuantificar la migración preferencial de las células inmunes hacia los dos compartimentos de hidrogel que albergan células tumorales que se han sometido a diferentes tratamientos. El diseño competitivo particular se puede aplicar para investigar una gran cantidad de diferentes fenotipos de biología del cáncer (por ejemplo, resistente a los medicamentos frente a agresivo, primario o metastásico, respondedores frente a no respondedores). Además, las regiones incrustadas en gel se pueden integrar fácilmente con diferentes poblaciones celulares para recrear EMT más heterogéneas, incluidos componentes estromales (fibroblastos, células endoteliales)²³ o para simular medios inmunosupresores específicos³⁴ (por ejemplo, macrófagos) para diseccionar mecanismos de resistencia a fármacos y evasión tumoral.
NOTA: La tinción nuclear y activa de caspasas, mediante el uso de kits comerciales para ensayos vivos/muertos (por ejemplo, Thermo Fisher Scientific, reactivos Incucyte), puede implementarse para evaluar eventos de muerte mitótica o apoptótica, como se informa en Nguyen et ^al.33.

1. Preparación de solución matricial con células y carga en el dispositivo
   NOTA: En el siguiente entorno experimental, las dos regiones de gel contienen mezclas de líneas celulares de melanoma A375M humano, cultivadas en solución de matriz (por ejemplo, Matrigel), expuestas a agentes terapéuticos utilizados como monoterapia o en combinación. Este entorno nos permitió evaluar la eficacia de una combinación de dos fármacos con respecto a los únicos de manera competitiva y cuantificar su capacidad para atraer PBMC.
   1. Descongelar un stock de solución matricial (por ejemplo, Matrigel) colocándolo en hielo en una nevera a 4 °C un día antes del experimento.
      NOTA: No exponga el producto a múltiples ciclos de congelación-descongelación a medida que se vuelve "grumoso". Otros protocolos de hidrogeles sintéticos o naturales pueden ser adecuados para ser utilizados en este entorno. Consulte 33,34,35 para la preparación de células cancerosas en matrices de colágeno.
   2. Resuspender las células de melanoma humano A375, teñidas con PKH67 Green Fluorescent Cell Linker en solución de matriz compatible (2 mg ^mL-1). Cuando esté indicado, añadir 5-aza-2'-desoxicitidina (DAC; 2,5 μM), denominada DAC, y/o IFN-α2b, denominada IFN, a las dosis adecuadas³².
      NOTA: Haga coincidir el lote # en la hoja de especificaciones de la botella de matriz. Basado en la concentración, calcule el volumen de medio necesario para hacer hasta 2 mg ^mL-1 Ajuste la concentración óptima de proteína y la concentración de suspensión de células cancerosas de acuerdo con su aplicación de interés.
   3. Pipetear hacia arriba y hacia abajo con cuidado para evitar la generación de burbujas. Mantenga el tubo de microcentrífuga en hielo mientras lo mezcla para evitar cualquier polimerización no deseada.
   4. Después de la esterilización, coloque los dispositivos sobre hielo (usando un cubo de hielo y una tapa) para evitar la solidificación de la solución de matriz durante todo el procedimiento de carga celular.
   5. Inyecte lentamente las dos mezclas de IFN y DAC/IFN Matrigel/células tumorales (2-4 μL) en el puerto de gel izquierdo y derecho, respectivamente, con micropipeta de 10 μL utilizando puntas frías (Figura 5A). Aplique una presión suave para empujar la solución de matriz desde un lado hasta llegar al opuesto.
      NOTA: El volumen de la solución matricial se eligió para evitar el desbordamiento en canales adyacentes. No ejerza una presión de pipeteo excesiva para evitar que la solución se filtre en los medios y canales centrales. Si durante la carga se bloquea la ruta del gel a lo largo del canal, intente insertar la solución desde la otra entrada hasta que los frentes de gel se encuentren. Al retirar la micropipeta de las entradas, sostenga el émbolo, de lo contrario, la presión negativa aspirará la solución de la matriz.
   6. Colocar el dispositivo en una incubadora en posición vertical a 37 °C y 5% de_CO2 durante 30 minutos para permitir la gelificación de la solución de matriz (Figura 5B). Maneje con cuidado los chips con gel no polimerizado incorporado para evitar que se escape del canal de gel.
   7. Mientras tanto, resuspenda las PBMC marcadas con PKH67 (1x10⁶ células) en 10 μL de DMEM completo (medio de Eagle modificado de Dulbecco).
   8. Después de la gelificación de la matriz, llene los canales de los medios con (50-100 μL) la misma alícuota de medio de cultivo en los seis depósitos para evitar el secado del gel en las virutas. Mantener en la incubadora hasta la suspensión de la siembra de células inmunes.
      NOTA: Verifique bajo un microscopio la distribución correcta y homogénea de las células tumorales en el gel y la integridad de las barreras de gel polimerizadas. Las regiones gelificadas parcialmente o no uniformes o burbujas en la mezcla conducen al flujo prematuro de PBMC en los canales de medios de gel en el punto de inicio del experimento debido a las fluctuaciones iniciales de presión.
   9. Aspire los medios de los seis pocillos y coloque la punta cerca de la entrada de un canal de medios para inyectar suavemente con suspensión de células PBMC de presión moderada. La secuencia temporal de carga se representa en la Figura 5C:
      1. PBMC en medio de 10 μL en el pozo central superior.
      2. 50-100 μL de medio en cada uno de los cuatro pocillos de canales laterales.
      3. 40-90 μL de medio en el pozo central superior.
      4. 50-100 μL de medio en el pozo central inferior.
   10. Asegúrese bajo un microscopio de que la distribución de PBMC permanezca confinada en la cámara central después del paso de carga. (Figura 7A).
       NOTA: Si no es óptimo, ajuste la concentración si es necesario y repita los pasos de siembra, utilizando chips prístinos. Al calcular los volúmenes para las condiciones experimentales planificadas, refiérase a un número excesivo de fichas (15-20%) para tener en cuenta los posibles errores y ajustes. Los volúmenes y las concentraciones deben optimizarse de acuerdo con la aplicación específica.
   11. Coloque los dispositivos ensamblados en una superficie nivelada en la incubadora a 37 °C y 5% de_CO2 para la posterior adquisición de imágenes de fluorescencia. Manejar con cuidado los chips después de cargar las células inmunes que están flotando.
       NOTA: Compense las pérdidas por evaporación de volúmenes en los reservorios reemplazando los medios cada 2-3 días. Para el perfil de quimiocinas, se pueden aspirar hasta 100 μL de cada uno de los dos pocillos de compartimentos de cultivo, consulte el paso 2.7, en el paso 1.
2. Conteo automatizado de PBMC reclutados en imágenes fluorescentes de un solo canal en ImageJ
   NOTA: Los métodos clásicos de inmunofluorescencia para imágenes confocales de alta resolución se pueden aplicar a las operaciones en chip como mediciones de punto final. El procedimiento básico de tinción implica la fijación celular en chip, permeabilización, bloqueo, unión de anticuerpos, tinción de núcleos con pasos de lavado intermedios. Las células inmunes no marcadas infiltradas en regiones de geles 3D con microambientes cancerosos incrustados pueden fijarse en los puntos de tiempo deseados y teñirse para marcadores de expresión de activación/agotamiento/maduración (p. ej., para células CD8, monitorización de marcadores CD69, CD95, PD1, TIM3). En Parlato et al.³⁵, la fagocitosis de las células apoptóticas SW620 se evaluó mediante microscopía confocal, utilizando dispositivos montados en cubreobjetos de 170 μm de espesor. Los IFN-DC se tiñeron agregando alícuotas antihumanas HLA-DR-FITC Ab anti-chip.
   Para calcular la extensión de las células inmunes vivas teñidas con fluorescencia infiltradas desafiadas con señales competitivas, se establece un flujo de trabajo de análisis de imágenes común de la siguiente manera (Figura 7D-G):
   1. Adquirir, en puntos finales específicos, contraste de fase y microfotografías de fluorescencia de canales rojo/verde de las regiones de gel izquierda y derecha que contienen células tumorales expuestas respectivamente a regímenes farmacológicos únicos o combinados de ellos.
      NOTA: Aquí las imágenes fueron capturadas por un microscopio de fluorescencia EVOS-FL después de la carga celular (0 h), después de 48 h y después de 72 h de incubación (Figura 7A-B). Se utilizó un aumento de 4x-10x para adquirir la cámara central, las matrices de microcanales y los dos canales laterales yuxtapuestos que contienen A375 más IFN y A375 más DAC / IFN.
      1. Al realizar operaciones de adquisición, tenga en cuenta los parámetros a medir y evitar la saturación de las características a contar. Los resultados óptimos de segmentación dependen de la naturaleza de las imágenes adquiridas, debido a la variabilidad en las propias muestras biológicas, la calidad de la tinción y las técnicas de microscopía utilizadas para aplicaciones orientadas al usuario.
   2. Cargue datos de fluorescencia de un solo canal (en este caso rojo = PBMC), en Fiji arrastrándolos a la ventana principal (Figura 7D). Duplique la imagen para evitar sobrescribir los datos sin procesar durante la selección de filtros de preprocesamiento hasta la segmentación final.
      1. Si la imagen es una imagen en color (RGB), presione Imagen > Tipo 8 o 16 bits para convertir a escala de grises. Compruebe que Editar > opciones >conversión esté configurado para escalar al realizar la conversión.
   3. Preprocesamiento de datos sin procesar a través de la limpieza de ruido y artefactos.
      1. Vaya al menú Procesar > Restar fondo aplicando el algoritmo de bola rodante para corregir el fondo de ruido desigual con grandes variaciones espaciales de intensidades. Establezca el radio en al menos el tamaño de la partícula de primer plano más grande. Elija el cuadro Vista previa para el procedimiento de prueba y error para obtener resultados óptimos. Los valores demasiado pequeños pueden eliminar incorrectamente las estructuras de interés.
      2. En el comando Brillo y contraste, arrastre los controles deslizantes Mínimo/Máximo para cambiar el rango de intensidades en el histograma. Desplace el control deslizante Máximo hacia la izquierda para aumentar el brillo, sin funciones de lavado. Mueva la diapositiva Mínimo hacia la derecha para aumentar el contraste de la imagen evitando la desaparición de entidades menos visibles en el fondo. Haga clic en Aplicar para corregir los cambios.
   4. Mejora de imagen.
      1. Vaya a Procesar filtros > y experimente con los filtros gaussianos medianos en las imágenes (Figura 7E).
         NOTA: El radio de prefiltrado debe adaptarse a los píxeles de ruido de la imagen. El filtro mediano no lineal reemplaza el valor de píxel con el valor mediano de los vecinos, para reducir el ruido de sal y pimienta. El "desenfoque gaussiano" se utiliza para suavizar una imagen digital, reemplazando los píxeles con un promedio ponderado de píxeles circundantes. Los pesos provienen de la distribución de probabilidad gaussiana, por lo que los píxeles más cercanos son más influyentes.
      2. Vaya opcionalmente a Procesar > Math > Gamma con la casilla Vista previa marcada para aumentar el contraste.
         NOTA: Las intensidades establecidas en el panel B&C se escalan entre los límites de dos mínimos y máximos. Los valores < 1.0 acentúan las diferencias entre intensidades bajas, mientras que los valores > 1.0 acentúan las diferencias entre intensidades altas. La corrección gamma es funcional para encontrar un rango de visualización, mostrando los objetos más tenues sin saturar los más brillantes.
   5. Creación de una máscara de imagen binaria.
      1. Vaya a Imagen > ajustar > umbral. El método más sencillo para determinar los umbrales se basa en el análisis histográfico de los niveles de intensidad, como se muestra en la Figura 7F. En el menú desplegable, juega con diferentes métodos de umbrales globales (en nuestro caso, se aplica Otsu).
      2. Desplácese manualmente o escriba un rango conocido de intensidades de píxeles en los paneles del histograma, observe el cambio del patrón rojo que se superpone a la imagen que se asemeja principalmente al área de celda real. El botón Restablecer quita la superposición. Una vez satisfecho, haga clic en Aplicar para generar una versión binaria de la imagen. Marque Proceso > Opciones de > binario para controlar cómo se muestran las imágenes con umbrales y cómo el analizador de partículas identifica los objetos.
   6. Utilice el comando de menú Proceso/Binario/Partículas de cuenca para dividir parcialmente superpuestas o fusionadas durante el umbral. Watershed a menudo puede cortarlos con precisión agregando una línea de espesor de 1 píxel. Realice operaciones morfológicas como operaciones de dilatación o erosión para crecer o eliminar píxeles de píxeles subsaturados o sobresaturados.
      NOTA: Para obtener más información, consulte la sección Comandos de menú o consulte MorphoLibJ, una biblioteca integrada basada en morfología matemática para procesar datos binarios.
   7. Descripción cuantitativa de la característica de imagen.
      1. Una vez obtenido el reconocimiento satisfactorio de objetos, abra el Analizador de partículas desde Analizar > Analizar partículas. Las partículas pueden excluirse por su tamaño y circularidad, expresadas en píxeles o en una unidad de medida calibrada (compruebe la escala correcta en relación con los ajustes del microscopio en Propiedades de la > de imagen). Para incluir todo, mantenga el valor predeterminado de 0-Infinito y el rango predeterminado de circularidad en 0.00 - 1.00 (0 = línea recta, 1 = círculo perfecto).
      2. Para filtrar pequeños píxeles de "ruido" o características que no interesan, establezca el rango mínimo y máximo. Marque las opciones Incluir agujeros, Mostrar, Contorno y Mostrar resultados en el campo de la ventana. Excluir en bordes descartará las partículas detectadas en los bordes de la imagen. Agregar al administrador agrega la selección obtenida al administrador de ROI para un análisis posterior manteniendo la información de posición de la partícula.
         NOTA: En el "ROI Manager", es posible corregir la segmentación automática de la salida registrada (fusionar celdas divididas, dividir celdas combinadas). Seleccione, mediante el uso de herramientas de selección en la barra de herramientas de Fiji, ROI dentro de ambas regiones de gel donde se incrustan las células cancerosas para estimar la infiltración inmune.
   8. Exporte los valores obtenidos a una hoja de cálculo para realizar un análisis estadístico como se muestra en la Figura 7G. "Resultados" enumera una tabla de datos relativa a las propiedades de partículas numeradas identificadas. "Resumir" abre una ventana con el nombre de la imagen, los recuentos totales y otra información para toda la imagen.
      1. Vaya a Analizar > establecer medidas para incluir una amplia gama de parámetros.
   9. Grabe opcionalmente una macro (seleccionando Plugins > Macros > Record) para automatizar el flujo de trabajo de procesamiento y ahorrar tiempo en el análisis de grandes conjuntos de datos.
      1. Usar la misma rutina de procesamiento para analizar el canal de fluorescencia verde en las mismas regiones para analizar los cambios morfológicos de las células tumorales en regiones 3D¹⁶

Representative Results

La infiltración inmune tumoral es un parámetro de la respuesta antitumoral del huésped. Los tumores son heterogéneos en la composición, densidad, ubicación y estado funcional de los leucocitos infiltrantes, cuyas interacciones con las células cancerosas pueden ser la base de información clínicamente relevante para predecir el curso de la enfermedad y la respuesta a la terapia. En este sentido, las tecnologías microfluídicas podrían utilizarse como herramientas in vitro complementarias y privilegiadas para explorar la textura inmune de los tumores, así como para monitorizar la respuesta a las terapias anticancerígenas. El acoplamiento del ensayo microfluídico, las imágenes de células vivas y el software de seguimiento puede establecer métodos de cuantificación confiables para cuantificar cómo las células inmunes ajustan su patrón de migración en diferentes contextos. En este capítulo, hemos informado sobre los pasos para establecer cocultivos versátiles 2D o 3D de células cancerosas inmunes y diana en dispositivos microfluídicos ad hoc realizados mediante procedimientos litográficos blandos estándar. En la Sección 1 se emplearon dispositivos microfluídicos para permitir contactos químicos y físicos entre poblaciones adherentes (células cancerosas MDA-MB-231) y no adherentes (PBMC). Algunos agentes quimioterapéuticos (por ejemplo, antraciclinas, entre otros) pueden inducir la apoptosis "inmunogénica" de las células malignas, mejorando así su visibilidad en huéspedes inmunocompetentes. La muerte celular inmunogénica del cáncer (DCI) se caracteriza por la liberación de señales solubles y unidas a la membrana entregadas por las células moribundas que funcionan como alarminas para las células inmunes. Para proporcionar una validación cuantitativa de la respuesta del DCI, empleamos datos recopilados en la plataforma microfluídica donde los leucocitos pueden moverse a través de puentes de microcanales adecuadamente construidos hacia sus células diana. Los registros de lapso de tiempo se realizaron después de la cocarga de PBMC, de donantes sanos (WT, tipo salvaje), con células de cáncer de mama MDA-MB-231 humano pretratadas o no con la antraciclina DOXO. Se generaron microfotografías cada 2 min, durante dos intervalos de tiempo sucesivos de 24 y 48 h. (Ejemplar Película S1 de intervalo de 0-24 h). El análisis de seguimiento de PBMC individuales desafiados con células cancerosas moribundas (tratadas con DOXO) o vivas (tratadas con PBS) se realizó utilizando el complemento Trackmate, como se ve en Figura 6A (panel izquierdo). Los valores relevantes de quimiotaxis y gráficos de migración se generaron automáticamente mediante la Herramienta de quimiotaxis y migración, como se detalla en⁶². Las trayectorias celulares se extrapolaron a (x, y) = 0 en el momento 24 h. Los resultados indicaron un perfil migratorio diferente de las células inmunes cuando se cargan conjuntamente con células de cáncer de mama expuestas a DOXO o PBS. Cuando las PBMC se enfrentaron a células cancerosas apoptóticas, cruzaron microcanales hacia células moribundas / muertas (pero no hacia células vivas no tratadas). Diagramas de migración X/Y araña y rosa, presentados en el panel izquierdo Figura 6B-C, se mapearon y compararon para resaltar el impacto de los agentes inductores inmunogénicos en las diferencias en la dinámica inmune. Los diagramas de rosa demuestran que los PBMC migraron principalmente en casi todas las direcciones en el experimento de control, solo una fracción insignificante es guiada por el gradiente generado por la proliferación de células cancerosas. Por el contrario, las trayectorias de las células individuales resaltan un fuerte movimiento de sesgo a lo largo de la dirección de las células de cáncer de mama apoptóticas (dirección x negativa). Para evaluar la migración de células inmunitarias dirigidas hacia las células cancerosas tratadas con DOXO o PBS, se calculan varios parámetros de quimiotaxis, que incluyen: a) el centro de masa (punto promedio espacial de todos los puntos finales); b) la direccionalidad; c) el índice de migración hacia adelante (es decir, el desplazamiento celular promedio en una dirección de interés que significa hacia el sitio del tumor objetivo, en nuestro caso). Estos últimos valores representan una medida de la eficiencia de una célula para migrar en la dirección dada los estímulos quimiotácticos. Después de llegar a la cámara izquierda, una fracción de leucocitos con una densidad creciente durante 24-48 h exhibió contactos a largo plazo (>60 min) con MDA-MB-231 tratado con DOXO. Las PBMC no migran masivamente y participan en tales interacciones a largo plazo y persistentes con células cancerosas vivas (como lo muestran las microfotografías representativas de las PBMC que se acercan a las PBMC en Figura 6A, derecha). Para cuantificar las diferencias en la interacción tumor-inmune, la región tumoral se delineó con un círculo fijo de diámetro que oscilaba entre 20 y 80 micras, llamado "punto caliente". La cuantificación y el análisis de los FOV representativos se muestran en Figura 6 (Panel derecho, B-C).

En la Sección 2 se describió un nuevo modelo tumoral inmunocompetente 3D para cuantificar el reclutamiento de células inmunes en respuesta a combinaciones anticancerígenas de fármacos epigenéticos³² (DAC/IFN vs IFN solo), permitiendo la comparación de dos condiciones de tratamiento diferentes de células de melanoma A375 simultáneamente. Así, las células de melanoma A375M, marcadas con colorante verde PKH67 se incrustaron en matrices Matrigel en presencia de DAC y/o IFN en cada cámara de gel, mientras que las PBMC marcadas en rojo PKH26 se distribuyeron homogéneamente en la cámara fluídica central en el punto de partida (Figura 7A). Comparamos simultáneamente las dos masas tumorales en matrices 3D por su capacidad para atraer PBMCs. A las 48 y 72 h, las PBMC son guiadas masivamente hacia los microcanales del lado derecho, como se observa en la Figura 7B.

Se observó claramente una orientación preferencial de PBMC hacia la matriz de gel que contenía el sitio de melanoma tratado con DAC / IFN, en lugar de tratado con IFN, mientras que la tasa de migración deficiente fue visible hacia las células A375 expuestas a un solo tratamiento (lado izquierdo del chip). El entorno competitivo es aplicable para investigar una gran cantidad de diferentes fenotipos de biología del cáncer (p. ej., resistente a los medicamentos frente a agresivo, primario o metastásico (p. ej., células de melanoma A375P frente a A375M) y respondedores frente a no respondedores). Las cámaras de gel pueden estar compuestas por cocultivos complejos de células malignas y múltiples células no cancerosas asociadas a tumores, como células endoteliales, células inmunes y fibroblastos³³ para caracterizar las respuestas farmacológicas a nivel de TME. Los eventos de mitosis y muerte apoptótica de las células cancerosas pueden ser monitoreados por tinción con colorantes vivos³³. Los procedimientos de inmunotinción en dispositivos microfluídicos 3D podrían adaptarse para evaluar los estados de activación de células inmunes infiltradas en sitios tumorales por microscopía confocal³⁵. En este sentido, estos sistemas microfluídicos 3D pueden imitar estructuras tumorales complejas e interacciones multicelulares y, por lo tanto, son plataformas valiosas para pruebas preclínicas de medicamentos más confiables.

Figura 1. Planimetría del dispositivo microfluídico para ensamblar cocultivos 2D inmunes a tumores. (A) Microfotografía real de 3 chips ensamblados en un solo portaobjetos de microscopio. Los depósitos están numerados dependiendo de la secuencia de carga y están codificados por colores como las cámaras de cultivo correspondientes enumeradas en la leyenda. Scalebar, 6 mm. (B) CAD 3D de chip que consta de tres áreas principales de cultivo celular conectadas por microsurcos. C) Detalles del estrecho puente de microsurcos, mostrando las dimensiones adaptadas a las células cancerosas y el tamaño de las PBMC. D-E) La microfotografía de luz visible fue adquirida antes del comienzo del time-lapse, mostrando la distribución de células cancerosas y PBMCs respectivamente en la cámara izquierda e intermedia. Barra de escala, 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Pipeline de análisis de Trackmate para la localización de manchas inmunes en imágenes de series temporales. A) Panel superior: Captura de pantalla del menú de calibración de imágenes de Trackmate. Panel inferior: Fiji "Menú de propiedades de imagen" para establecer unidades de tiempo y espaciales. B) Panel superior: Captura de pantalla del menú "Detección de manchas" de Trackmate. Panel inferior: Imagen de salida con diferentes valores aplicados de "Umbral". C) Panel superior: Captura de pantalla del menú "Filtrado puntual" de Trackmate que ilustra algunos filtros. Panel inferior: Imagen ejemplar de lapso de tiempo, que representa manchas inmunes filtradas por posición a lo largo de X en la cámara intermedia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Canalización de análisis de Trackmate para reconstruir pistas inmunes en secuencias de imágenes de series temporales. A-C) Capturas de pantalla de los menús de Trackmate para la creación de pistas, el filtrado de pistas y la exportación de datos finales. D) Ejemplos de pistas generadas en imágenes de lapso de tiempo preprocesadas que varían la configuración del detector de enlace. E) Ejemplo de pistas falsas y enlaces erróneos derivados de la detección de bordes de células tumorales. F) Las pistas se resaltan en verde seleccionando filas en el archivo .txt de resultados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Descripción esquemática de los chips tumorales inmunocompetentes 3D. A) Ejemplo de un maestro de silicio microestructurado. Los sellos para PDMS se modelaron en resistencia negativa SU-8 en una instalación de sala limpia equipada con viga electrónica y litografía óptica. B) Las réplicas de PDMS fueron fabricadas por métodos estándar de litografía blanda. La unidad central tiene las cámaras coloreadas como las dibujadas en la representación 3D del chip, representadas en el panel D. C) Microscopía electrónica de barrido (SEM) Vista ampliada de la matriz de micropilares adecuados para el atrapamiento de soluciones de hidrogel. D)CAD 3D que muestra las cámaras, conectadas por microsurcos y los pozos de carga. Las cajas discontinuas se refieren a fotografías SEM de detalles (panel C y E). E) Fotografía SEM de microsurcos de conexión de 10 μm de altura. F) Diseño CAD 2D que representa las dimensiones de las microestructuras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5. Flujo de trabajo esquemático de los principales pasos del protocolo de carga para ensamblar coculturas 3D. A) Panel superior: Esquemas de la etapa de inyección de la solución de Matrigel en cada región lateral del gel. Panel inferior: Fotografía real del chip que muestra el avance frontal del gel a lo largo del canal durante el paso de carga. B) Esquemas de la etapa de polimerización de Matrigel. Panel inferior: Vista microscópica de contraste de fase de la interfaz gel-aire formada después de la etapa de gelificación. Barra de escala, 100 μm. C)Panel superior: Dibujo, que representa la carga de celdas y medios con volúmenes ejemplares utilizados en el protocolo. Panel inferior: Se muestra una imagen de contraste de fase 4X del cocultivo ensamblado a 0h. Barra de escala, 200 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6. Análisis de perfiles migratorios y comportamiento de interacción de PBMC hacia la cámara tumoral moribunda/viva en la ventana de tiempo de 24-48 h. Panel izquierdo. A) Capturas de pantalla de imágenes preprocesadas de lapso de tiempo superpuestas con pistas de colores inmunes, extraídas por Trackmate. Las vías inmunes se obtienen por un solo campo de visión en las condiciones experimentales indicadas en el intervalo de 24 a 48 h en la cámara intermedia. B-C) Trayectorias migratorias representativas y parcelas de rosas de PBMC cultivadas en las dos condiciones diferentes (n = 1550 PBMC versus células cancerosas tratadas con DOXO, DOXO+ o n = 1434 PBMC versus células cancerosas control, DOXO-). Cada línea dentro de los gráficos x-y representa una sola trayectoria PBMC y cada círculo representa la posición final de una sola celda con respecto a la posición inicial. Los puntos iniciales se establecen en (0,0) mediante una transformación de coordenadas. Las coordenadas y el desplazamiento del centro de masa de la migración celular se muestran en las condiciones experimentales indicadas. Las coordenadas del centro de masa y el desplazamiento (calculados como distancia euclidiana promedio para los componentes X e Y) proporcionan una indicación de la dirección promedio en la que viajó principalmente el grupo de células y la magnitud del movimiento celular general en los grupos de condición. Las líneas azules y verdes, respectivamente, marcan las pistas individuales por un valor de distancia euclidiano mayor/menor que un valor umbral (100 μm). D) Esquema de datos numéricos extraídos por una pista celular. E-F) Diagrama de caja y bigotes que representa respectivamente la direccionalidad (p<0,0001 Prueba t no pareada con corrección de Welch) y FMI (p<0,0001 Prueba t no pareada con corrección de Welch). La línea horizontal en los cuadros representa los valores medianos. Los valores de FMI son el promedio de todas las pistas celulares en cada grupo de condición. Panel derecho. A) Capturas de pantalla de ROI extraídos de Trackmate que muestran interacciones diferenciales entre PBMC y células cancerosas tratadas con DOXO o PBS. B) Densidad de tiempo de PBMC alrededor de las células cancerosas MDA-MB-231 tratadas o controladas con DOXO. Número de PBMC presentes en el ROI seleccionado alrededor de las células cancerosas para cada afección. Los valores informados son el promedio de más de 9 ROI seleccionados de un solo FOV de lapso de tiempo. Los puntos calientes de cáncer se definen en un ROI (80 μm de diámetro). Se muestra el mapa de calor de densidad correspondiente. Los puntos representan el número medio de células calculado sobre 9 puntos críticos de cáncer en los puntos de tiempo indicados. C) Distribución de tiempos (min) de contactos para cada grupo experimental. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7. Reclutamiento preferencial de PBMC en respuesta a combinaciones de fármacos DAC más IFN en un modelo competitivo de melanoma en chip inmunocompetente en 3D. A) Distribución de PBMCs inicialmente cargados en la cámara central de dispositivos microfluídicos. Las microfotografías se adquieren mediante el microscopio de fluorescencia EVOS-FL durante un intervalo de 0-72 h. La fluorescencia roja (células marcadas con PKH67) representa PBMC de donantes sanos. Las células de melanoma humano marcadas con PKH67 (verde) incrustadas en Matrigel que contenían tratamientos de combinación simple o doble se colocaron en cámaras laterales. B) Celdas A375 más IFN a la izquierda frente a A375 más DAC/IFN a la derecha. Las imágenes de fluorescencia se mostraron a las 72 h de cocultivo. El cuadro amarillo descontinuado muestra un reclutamiento visiblemente masivo en el A375 más el lado DAC / IFN. C) PBMC cuenta en cuatro ROI diferentes de cámaras IFN vs cámaras DAC + IFN. Los histogramas representan recuentos celulares +/- D.E.; Valores enumerados de mapa de calor de cada ROI. Scalebars, 200 μm. D-G) Esquemas de los pasos de segmentación y cuantificación de PBMCs infiltrados en matrices de gel aplicadas a imágenes de fluorescencia de un solo canal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Expediente complementario. Protocolo de microfabricación Haga clic aquí para descargar este archivo.

Película suplementaria 1. Secuencias de lapsos de tiempo en un cocultivo 2D inmune al tumor en chip. Las microfotografías se adquirieron cada 2 min, en un intervalo de tiempo de 0-24 h por medio de un microscopio compacto colocado en una incubadora de cultivo celular estándar. Panel izquierdo. Película de PBMCs de donantes sanos (WT, tipo salvaje), chapados con MDA-MB-231 control de células de cáncer de mama. Panel derecho. Película de una migración masiva de PBMCs WT hacia la cámara de chip donde se cargan las células cancerosas tratadas con MDA-MB-231 DOXO. El diseño del chip 2D se describe en detalle en la sección 1 del Protocolo y se muestra en la Figura 1. Haga clic aquí para descargar esta película.

Discussion

Los métodos descritos tratan de diseñar un enfoque general para recapitular, con grado modulable de complejidad, dos aspectos significativos en el campo de la oncoinmunología, que pueden beneficiarse de la adopción de modelos in vitro más relevantes. El primero involucra el lado de la población de células tumorales, donde abordar las características de una sola célula puede conducir a una mejor descripción de la heterogeneidad y la importancia biológica y clínica correlacionada, incluida la resistencia a la terapia, la propensión a la metástasis, las células madre y el grado de diferenciación. El otro lado de la historia está representado por el TME, incluyendo componentes no cancerosos (células inmunes y estromales, vasos sanguíneos) y el paisaje químico/físico (componentes de la ECM, quimiocinas y otros factores solubles liberados) que pueden moldear profundamente tanto las características de la enfermedad como la respuesta del individuo a la terapia⁶³, particularmente a la inmunoterapia. Vale la pena señalar que exportar el enfoque descrito a otros campos de investigación requiere una comprensión profunda de las limitaciones y desafíos planteados por el desarrollo y la adopción de nuevos modelos.

Citando una máxima aplicada en el modelado de ingeniería ("modelar el problema, no el sistema"), se debe optimizar cuál es el número mínimo de componentes (celulares, físicos y químicos) y las condiciones necesarias para hacer que el propio modelo en chip sea biológicamente relevante y estable a lo largo de todo el experimento. Cada combinación de tipos de células / entorno microambiental / experimental debe, por lo tanto, ser elegida, evaluada y monitoreada continuamente con precisión a lo largo de experimentos individuales y de sesión en sesión. Estas comprobaciones incluyen, como se menciona en las secciones del protocolo, un control estricto de parámetros como volúmenes en los dispositivos microfluídicos que pueden modificarse por condiciones de humedad o calentamiento de fuentes de iluminación, posibles movimientos y no planaridad de etapas que causan derivas de líquido incontroladas, pero también alguna verificación de punto final del estado celular, viabilidad y caracterización fenotípica. Un paso crítico se refiere a la decisión de utilizar sistemas de perfusión para crear estructuras vascularizadas (similares), o para la administración de fármacos en chip³³, ya que esto puede afectar los experimentos en términos de complejidad creciente, duración del cultivo celular y modulación de los factores químicos en presencia de células flotantes como las inmunes.

A continuación, resumimos las principales cuestiones críticas y relevantes encontradas en los entornos experimentales y en la literatura más reciente.

ECM y definición del paisaje químico
TME se ve profundamente afectado también por las propiedades mecánicas 64,65 del entorno^{63, 66}. Por esta razón, la elección de la matriz de cultivo es fundamental, especialmente cuando se trata de células inmunes que, en ciertas condiciones, podrían responder a las señales liberadas por la propia matriz. Se esperan avances relevantes en el futuro próximo también a partir del diseño y desarrollo de nuevos materiales e hidrogeles (caracterizados por diferentes rigidez, porosidad, presencia de factores solubles, entre otros parámetros) que están permitiendo una ECM cada vez más refinada y controlable, imitando las especificidades de diferentes tejidos hoy, diferentes pacientes mañana. Por otro lado, también es crítico monitorizar los cambios inducidos por las diferentes poblaciones celulares en la ECM y definir estrategias para incluir esta información en análisis dinámicos y fenotípicos.

Gestión de datos
El camino hacia el despliegue de técnicas de tumor en chip en un flujo de trabajo clínico se beneficiará de un enorme trabajo experimental que se está llevando a cabo en varias direcciones. Los modelos de órgano en chip, como muchas técnicas in vitro, son funcionales, al menos potencialmente, para realizar mediciones de alto rendimiento / alto contenido. La paralelización de las condiciones experimentales, incluidos los controles positivos y negativos, y las réplicas técnicas/biológicas es posible mediante la integración de varios chips en la misma placa. El aumento en el rendimiento cuantitativo juega un papel crucial en la traducción y validación de estos sistemas en la línea rápida de detección de fármacos o genes para inmunoterapias. De hecho, varias empresas ya han desarrollado plataformas en un formato de múltiples pozos, y se están probando diferentes enfoques de imagen para permitir el monitoreo de un gran número de dispositivos simultáneamente¹⁴. En los protocolos descritos anteriormente, utilizamos portaobjetos de microscopio asignando hasta 3 chips, con la posibilidad de visualizar hasta 12 condiciones experimentales en paralelo, utilizando una bandeja multi-portaobjetos de microscopio estándar. Esta configuración es compatible con el pipeteo manual y adecuada para ajustes orientados a la medida realizados en nuestras instalaciones de microfabricación. Por el contrario, cuando se necesita una fuerte paralelización (múltiples pruebas y controles de cribado), se requieren optimizaciones de configuración para establecer un mayor nivel de automatización (es decir, el uso de robots de pipeteo, multipozos de plástico).

Al diseñar experimentos, se debe tener en cuenta una compensación entre la resolución espacial y temporal.

La enorme cantidad de datos, producidos por microscopía de alto contenido, constituye un factor limitante en términos de almacenamiento, transferencia y análisis. Estos problemas se están abordando con enfoques computacionales que implementan herramientas de aprendizaje automático y recursos de hardware / software, lo que puede fomentar la posibilidad futura de vincular experimentos on-chip / in silico^67,68 en la elección de estrategias terapéuticas^, y eso representa una oportunidad ambiciosa pero no diferible.

Más allá de las imágenes de fluorescencia
El marcaje fluorescente, por colorantes o genes reporteros, debido a su alta especificidad, representa sin duda el método estándar de oro para identificar diferentes poblaciones celulares en condiciones de cocultivo y para resolver propiedades moleculares con alta SNR. En los modelos OOC este enfoque se utiliza comúnmente como referencia y particularmente en microambientes heterogéneos de tumor en chip, puede ser valioso para caracterizar el fenotipo de las células inmunes infiltradas e interactuando.

Sin embargo, cada vez hay más evidencias de que los efectos inducidos por fluoróforos, laboriosos procedimientos de tinción y rutinas de iluminación deben ser monitoreados y minimizados⁶⁹ porque pueden afectar profundamente el comportamiento celular y el estado^70,71. Este riesgo parece particularmente cierto para los sistemas frágiles, como las células inmunes^72,73. Las reacciones fototóxicas pueden introducir limitaciones en la definición de la adquisición de la ventana temporal de células vivas cuando se monitorean a alta resolución espacial y temporal. Además, la riqueza en la variedad de subpoblaciones inmunes hace inviable discriminar entre ellas solo mediante tinción fluorescente, considerando el número limitado de filtros comúnmente disponibles en los microscopios.

Para abordar este problema, desde un punto de vista instrumental, nuevas técnicas de microscopía⁷⁴ sin etiqueta como la holográfica⁵⁶ o la microscopía hiperespectral⁵⁷ están apareciendo ahora en el escenario. Prometen estrategias avanzadas de clasificación de procesos celulares más allá de la fluorescencia y pueden ser particularmente valiosas para estudiar muestras sensibles. Desde el punto de vista del análisis de datos, los enfoques computacionales avanzados, basados en algoritmos de aprendizaje profundo⁷⁵ (entrenados por conjuntos de datos de imágenes de fluorescencia), abren las puertas para realizar el llamado "etiquetado in silico"^76,77. Se han aplicado con éxito para predecir marcadores fluorescentes a partir de imágenes de campo claro⁷⁸, generando imágenes etiquetadas, sin teñir células, aumentando así el poder informativo de la microscopía de campo brillante. Esta estrategia también puede ser útil para ahorrar tiempo y canales de fluorescencia para otros marcadores. Creemos que la comunidad OOC se beneficiará de estas nuevas técnicas que permiten un estudio menos invasivo de la interacción de las poblaciones celulares.

Análisis de datos
Los mecanismos de interacciones entre las células cancerosas inmunes y diana pueden ser investigados a través del seguimiento de los movimientos celulares^28,79. Los experimentos de seguimiento de lapso de tiempo en cocultivos complejos y heterogéneos son extremadamente valiosos para extraer patrones de migración celular, cambios morfológicos y de estado, e información completa del linaje. Realizar análisis manuales prácticamente solo es factible para secuencias cortas con pocas células, pero no para experimentos sistemáticos de alto rendimiento. En consecuencia, el desarrollo de herramientas computacionales para el seguimiento celular, ya sea total o parcialmente automatizado, es un campo vital de investigación en el análisis de imágenes²⁴. Por lo general, el seguimiento celular convencional requiere una frecuencia relativamente alta de muestreo y resolución espacial para realizar correctamente las tareas de segmentación, lo que puede ser un desafío en muchas condiciones experimentales. Para localizar las celdas, hay disponibles herramientas de segmentación y seguimiento de acceso abierto (por ejemplo, el software ImageJ²²) como se presenta en este protocolo o software propietario dedicado. En estudios a gran escala, aplicamos un software propietario llamado Cell Hunter^16,31, desarrollado por la Universidad de Tor Vergata en Roma^, para distinguir de manera totalmente automática el cáncer y las células inmunes en un contexto multipoblacional. Las soluciones a medida basadas en el aprendizaje automático y los enfoques de redes neuronales 80,81,82 están comenzando a implementarse hoy en los paquetes de software de microscopía ^83, desde la mejora de SNR hasta la gestión de parámetros críticos de adquisición o pasos de segmentación. El aprendizaje automático se puede explotar para reconocer patrones celulares comunes (por ejemplo, estilos de movimiento) con el fin de caracterizar la respuesta biológica con respecto a los factores microambientales.

En Comes et ^al.41, se aplicó una arquitectura de red neuronal convolucional de aprendizaje profundo previamente entrenada para clasificar si las células cancerosas están o no expuestas a un tratamiento farmacológico utilizando como "marcador" la motilidad de las células inmunes, rastreadas a partir de datos de lapso de tiempo de cocultivos de células de cáncer de mama y PBMC en matrices de colágeno en microdispositivos, como se describe en³³.

Desarrollo de métodos ómicos unicelulares y ontologías
Señalamos la necesidad de una alianza estratégica entre las tecnologías ómicas unicelulares⁸⁴ (por ejemplo, proteómica, metabolómica, genómica) y los métodos en chip: la caracterización molecular detallada, conjugada con información dinámica funcional, podría mejorar la comprensión de los mecanismos básicos y la descripción clínica. En este caso, los nuevos instrumentos para vincular los dos mundos están en sus inicios⁸⁵. El primer desafío es implementar enfoques ómicos unicelulares directamente en los chips de oncoinmunología²². Además, el organ-on-chips podría ser explotado como plataformas para probar objetivos potenciales identificados por análisis genómicos y proteómicos^86,87. Una segunda herramienta de enlace, que todavía falta en gran medida, es una forma estructurada y estandarizada de anotar y almacenar los resultados medidos del sistema^88,89. Pero esto es exactamente lo que necesitamos en el futuro para construir bases de datos sistemáticas de resultados cuantitativos celulares y características medidas, para extraerlos, inferirlos y correlacionarlos con la información biológica inherente. En una palabra, la necesidad de estandarización y análisis sistemático de conjuntos de datos experimentales heterogéneos requiere un marco de ontología.

Personalización de modelos
La tecnología de órganos en chip es adecuada para la personalización¹², ya que las células y tejidos de pacientes individuales (o clases de pacientes) pueden usarse en los dispositivos bajo condiciones controladas, lo que lleva a lecturas clínicamente relevantes, útiles para informar estrategias terapéuticas o de prevención. Algunos ejemplos están empezando a aparecer en la literatura⁹⁰. Por supuesto, para los modelos de tumor en chip, este desafío plantea varias cuestiones técnicas y científicas a resolver³⁶ (como el control de las características de TME, como la concentración de oxígeno, los gradientes de citoquinas, etc.). Es importante destacar que la perspectiva de hacer que las terapias oncológicas y oncoinmunologías sean más efectivas y reducir los efectos nocivos para cada paciente es atractiva, tanto desde una perspectiva de calidad de vida como para la optimización de los recursos sanitarios.

En conclusión, es evidente que este campo es auténticamente interdisciplinario y, como tal, requiere un gran esfuerzo para establecer un lenguaje común y objetivos compartidos entre investigadores, clínicos, industria, pero también de diferentes disciplinas (ingeniería, biología, ciencia de datos, medicina, química) encontrando un buen equilibrio y nuevas soluciones⁹¹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator