Mikrofluidiske samkulturmodeller for dissekering av immunresponsen i in vitro tumormikromiljøer

Summary

I en alder av immunterapi og encellet genomisk profilering, krever kreftbiologi nye in vitro og beregningsverktøy for å undersøke tumor-immungrensesnittet i en riktig spatiotemporal kontekst. Vi beskriver protokoller for å utnytte tumorimmune mikrofluidiske kokulturer i 2D- og 3D-innstillinger, kompatible med dynamisk, multiparametrisk overvåking av cellulære funksjoner.

Abstract

Komplekse sykdomsmodeller krever banebrytende verktøy som er i stand til å levere fysiologisk og patologisk relevant, handlingsbar innsikt og avdekke ellers usynlige prosesser. Avanserte celleanalyser som nøye etterligner in vivo-landskap, etablerer seg som nye måter å visualisere og måle toveis tumor-vert-samspillet som påvirker utviklingen av kreft. Her beskriver vi to allsidige protokoller for å gjenskape svært kontrollerbare 2D- og 3D-samkulturer i mikroenheter, som etterligner kompleksiteten til tumormikromiljøet (TME), under naturlig og terapiindusert immunovervåking. I seksjon 1 er det gitt en eksperimentell setting for å overvåke crosstalk mellom adherente tumorceller og flytende immunpopulasjoner, ved lysfelt time-lapse-mikroskopi. Som et applikativt scenario analyserer vi effekten av anti-kreftbehandlinger, for eksempel de såkalte immunogene kreftcelledødsinduserne på rekruttering og aktivering av immunceller. I seksjon 2 er 3D-tumorimmune mikromiljøer samlet i en konkurransedyktig layout. Differensiell immuninfiltrasjon overvåkes av øyeblikksbilder av fluorescens opptil 72 timer for å evaluere kombinasjonsterapeutiske strategier. I begge innstillinger er bildebehandlingstrinnene illustrert for å trekke ut en mengde immuncelleparametere (f.eks. Immuncellemigrasjon og interaksjon, respons på terapeutiske midler). Disse enkle og kraftige metodene kan skreddersys ytterligere for å simulere kompleksiteten til TME som omfatter heterogeniteten og plastisiteten til kreft-, stromale og immuncelleundertyper, samt deres gjensidige interaksjoner som drivere for kreftutvikling. Overholdelse av disse raskt utviklende teknologiene med live-celle med høyt innhold kan føre til generering av store informative datasett, noe som gir nye utfordringer. Faktisk setter trekanten '' co-kulturer / mikroskopi / avansert dataanalyse "banen mot et presist problem parametrisering som kan hjelpe skreddersydde terapeutiske protokoller. Vi forventer at fremtidig integrering av kreftimmun on-a-chip med kunstig intelligens for høy gjennomstrømningsbehandling vil synergisere et stort skritt fremover for å utnytte evnene som prediktive og prekliniske verktøy for presisjon og personlig onkologi.

Introduction

Utviklingen av ulike grener av medisinen som eksperimentelle disipliner har vært avhengig av evnen til å manipulere cellepopulasjon og organfunksjoner under kontrollerte forhold¹. Slik evne har sine røtter i tilgjengeligheten av målbare modeller som er i stand til å rekapitulere prosesser som skjer i kroppen vår.

I en alder av immunterapi og encellet genomisk profilering 2, må kreftbiologi dra nytte av nye in vitro og beregningsmodeller for å undersøke tumor-immungrensesnittet i en riktig spatiotemporal kontekst ^2,3.

Tumormikromiljøet⁴ (TME) er et komplekst vev hvor kreftceller kontinuerlig samhandler og dynamisk utvikler seg sammen med de andre cellulære (immun-, stromal- og endotelceller) og ikke-cellulære (den ekstracellulære matrisen, ECM) komponentene. Den dynamiske naturen til dette komplekse landskapet dikterer om immunceller spiller som venner eller fiender av ondartede celler, og påvirker dermed sterkt både sykdomsprogresjon og respons på terapi. I dag konvergerer store anstrengelser fra onkoimmunologer, bioinformatikere og systembiologieksperter for å adressere den kliniske betydningen av kreftheterogenitet 5,6, enten i rommet (dvs. i forskjellige tumorregioner) og tid (dvs. i forskjellige tumorprogresjonsstadier)^5,6, og for å karakterisere kreft og immuncellefenotype og funksjon på enkeltcellenivå. Som et eksempel på denne synergien brukes avanserte datasynsteknikker nå rutinemessig til romlig kartlegging av immuninfiltrat i histologiske prøver ^7,8.

På forsiden av eksperimentelle modeller, som bygger bro mellom dyreforsøk og tradisjonelle in vitro-metoder, gir fremskritt innen mikrofluidikk og samdyrkingsteknikker tilgang til forskjellige klasser av mikrokonstruerte cellulære modeller som organoider, mikrofysiologiske systemer 9,10,11 (MPS) og organer på brikke^12,13,14 (OOC). De deler fellestrekket for å zoome inn i det store bildets syn på de cellulære økosystemene og utvide in vitro-potensialet for å kontrollere mikromiljøfaktorer mens de utnytter mikroskopi¹⁵ med høyt innhold og bildebehandlingsmetoder.

I dag har state-of-the-art- MPS- og OOC-systemer begynt å inkludere immunologiske aspekter , som inneholder forskjellige undertyper av immunceller i eksisterende vevs- og samkulturer, for å utforske og måle en rekke prosesser som inflammatoriske sykdommer, sårheling, slimhinneimmunitet og respons på giftstoffer eller daglige matvarer¹⁶. TME-on-a-chip-modeller 10,11,12,13,14,15,16,17, også integrert med parfymerbare mikrofartøyer 18,19,20,21, er utviklet for å undersøke celletypeavhengige interaksjoner, fysiske og kjemiske forstyrrelser og den cytotoksiske aktiviteten til infiltrerende lymfocytter²², samt klinisk aktuelle immunmodulerende midler²³.

Her tilbyr vi allsidige protokoller, som spenner fra lasting av celler i brikker til bildebehandlingsverktøy, for å utnytte avanserte tumorimmune mikrofluidiske samkulturer i 2D (seksjon 1) og 3D (seksjon 2) innstillinger¹⁶, kompatible med dynamisk, multiparametrisk²⁴ overvåking og visualisering av cellulære funksjoner. Dette oppnås ved å opprettholde brukervennlighet og fleksibilitet både i prøvehåndtering og dataanalyse, og dra nytte av Fiji freeware-programvare og verktøykasser^25,26.

Den mikrofluidiske enheten, beskrevet i avsnitt 1, er designet for å utføre 2D-samkulturer av adherent kreft og flytende immunceller. Denne plattformen ble validert for in vitro-måling av immuncelleadferd i nærvær av genetiske mutasjoner²⁷ og/eller immundefekter²⁸. Her illustrerer vi trinn for sporing av immunceller i time-lapse-lysfeltbilder, ved å utnytte en halvautomatisk metode basert på Trackmate (et plugin implementert i Fiji-programvaren). Denne prosedyren muliggjør ekstraksjon av kinematiske beskrivelser av immunmigrasjon ²⁹ og respons (dvs. interaksjonstider) for å målrette kreftceller, behandlet eller ikke med immunogene celledødsindusere²⁷.

Det er viktig at disse parametrene, hentet fra tidsseriebilder, kan behandles med avansert matematisk maskineri. Som et eksempel på potensialiteten til denne tilnærmingen, publiserte våre grupper nylig en analyse basert på matematiske metoder fra stokastiske prosesser og statistisk mekanikk for å modellere cellulære nettverksegenskaper og gi en parametrisert beskrivelse av immuncelleadferd (dvs. partisk eller ukorrelert tilfeldig gange, høyt eller ikke koordinert bevegelse^30,31).

3D-innstillingen, gitt i den andre delen, er basert på en samkulturprotokoll for å gjenskape mer komplekse immunkompetente TMEer innebygd i to gelregioner med forskjellige kombinasjoner av celletyper og stoffer på en konkurransedyktig måte. Her beskrives bildebehandlingstrinn for å måle, på forskjellige tidspunkter, infiltrasjonen av fargede immunceller i humane A375M melanomceller dyrket i Matrigel, for å evaluere antitumormiddelkombinasjoner³². A375M-linjen, en A375P-avledet cellelinje karakterisert ved en svært metastatisk fenotype, ble valgt for å evaluere deres metastatiske evne i nærvær av immunceller³².

De beskrevne modellene kan være fullt kompatible med forskjellige cellekilder (murine og humane immortaliserte eller primære cellelinjer, organoider, xenotransplantater, blant de andre). I nyere studier av laboratoriet vårt, ved å kombinere videomikroskopi med høyt innhold med bildeanalyse, ble det konkurransedyktige 3D-oppsettet brukt for å undersøke: i) en antitumoral (antistoffavhengig cellemediert cytotoksisitet, ADCC) immunrespons og dissekere rollen til fibroblaster i resistens mot trastuzumabbehandling i HER2 ⁺ brystkreft on-chip-modeller³³; ii) virkningen av myeloide celler (dvs. kreftassosierte makrofager) i mekanismer for tumorunnvikelse og rekruttering av T-celler³⁴; iii) effekten av immunterapeutiske regimer, spesielt basert på interferon-α-kondisjonerte dendrittiske celler (IFN-DC), dyrket med medikamentbehandlede tykktarmskreftceller i kollagenmatriser, og å evaluere effektiv bevegelse og de påfølgende fagocytosehendelsene³⁵; iv) kjemotaktisk migrasjon av benmargsderiverte eosinofiler mot IL-33-behandlede eller ubehandlede melanomceller³⁶.

Disse avanserte modellene kan tjene som observasjonsvinduer for å forstå rollen som immunkonsistens i kreftmetastase og resistensmekanismer, men det kreves innsats for å oversette funn til klinikkene, og lukke gapet med grunnforskning³⁷.

Som et fremvoksende scenario åpner utnyttelsen av kraften til automatisert mikroskopi med høyt innhold koblet til bruk av mer fysiologisk relevante mikrosystemer nye potensielle utfordringer for håndtering, behandling og tolkning av hundrevis, og til og med tusenvis av gigabyte multiparametriske data, som kan genereres fra en enkelt eksperimentell kampanje. Dette innebærer en direkte kobling av OOC-eksperimenter med kunstig intelligens 38,39,40,41,42 (AI)-baserte algoritmer både for avansert automatisert analyse, og generering av funksjoner som igjen kan mate i silikomodeller av kreft-immun samspill 43, med spennende nye applikasjoner i horisonten^, for eksempel utviklingen av prediktive legemiddelscreeningsanalyser ⁴⁴.

En stadig voksende strøm av innsats er fokusert på utforming av sykdomsmodeller i fellesskap med optimalisering av strategier for å implementere de store forstyrrelsesskjermene med enkeltcelle multi-omics-avlesninger. Dette vil utvilsomt hjelpe utviklingen og forhåpentligvis den kliniske implementeringen, ledsaget av en passende grad av metodestandardisering, av en systematisk onkoimmunologi-on-a-chip-tilnærming for å få ny innsikt i immunforstyrrelser og kreftspredningsmekanismer.

Protocol

1. Chipdesign for adherente og flytende celler 2D kokulturer

MERK: 2D-samkulturoppsettet (figur 1A-C) er preget av tre kamre (100 μm høye) sammenkoblet av to sett med mikrokanalarrayer (500 x 12 x 10 μm³, L×W×H). Mellomkammeret danner to lukkede blindrom som blokkerer flytende immunceller som flyter over i svulststedet under belastningstrinn 2.5. Denne enhetstypen er nyttig for sanntids todimensjonale målinger av enkeltcelle (enten adherent eller flytende) motilitet, og av celle-celle-interaksjoner 16,27,28,30,31. En typisk cellemigrasjonsstudie (utført fra flere timer til flere dager) kombinerer levende cellemikroskopi med bildebehandlingsalgoritmer⁴⁵, for å oversette de oppkjøpte bildesekvensene til numeriske egenskaper²⁵. Basert på migrasjonsmønstrene kan flere biofysiske indikatorer estimeres, for eksempel forskyvning og hastighet av celler, samt varigheten av immuncelle- og målcelleinteraksjoner²⁴.

1. Fremstilling av kreft og PBMC-celler
   1. Kreftcellekultur
      MERK: MDA-MB-231 trippel-negativ [østrogenreseptor (ER)-, progesteronreseptor (PR) - og human epidermal vekstfaktorreseptor 2 (HER2)-] humant brystadenokarsinomceller dyrkes rutinemessig i et Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium supplert med 10% (v / v) føtal bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IE ml-1 penicillin G natriumsalt og 100 μg ml ^{- 1} streptomycinsulfat (vekstmedium), under standard dyrkningsbetingelser (37 °C og 5 % CO₂).
      1. For å optimalisere cellekulturveksten, plate MDA-MB-231 celler i 75 cm² kolber med en tetthet på 1 × 10⁶ celler ^mL-1 i 12 til 15 ml vekstmedium.
      2. Når cellene når 75-80% av samløpet, kast vekstmediet, vask celler med forvarmet fosfatbufret saltvann (PBS) for å fjerne FBS helt, og løsne dem deretter med forvarmet trypsin (1 til 2 min ved 37 ° C).
      3. Legg til vekstmedium for å inaktivere trypsinets enzymatiske aktivitet og samle frittliggende celler. Vask cellene to ganger i 5 minutter ved 1,100 x g ved romtemperatur (RT).
      4. Telle celler i et celletellingslysbilde ved hjelp av Trypan Blue fargestoffekskluderingstest og deretter reseed dem enten for vedlikeholdskultur (for ikke mer enn 6 passasjer fra tining) eller for eksperimentelle prosedyrer.
      5. For mikrofluidiske eksperimenter, frø 1 × 10 6 celler i 6-brønnsplater i 3 ml vekstmedium og enten behandle med 25 μM doksorubicin (DOXO) eller et likt volum DOXO løsningsmiddel (PBS) som kontroll.
      6. Fire til 6 timer etter, vask DOXO-behandlede celler to ganger med forvarmet PBS i 5 minutter ved 1,100 x g ved RT.
      7. Telle DOXO-behandlede og PBS-behandlede kontrollceller som ovenfor (se trinn 1.1.1.5) og sette samkulturen med mononukleære celler i perifert blod (PBMC) i mikrofluidiske enheter.
   2. PBMC-isolasjon
      1. Samle venøst fullblod (ca. 10 ml) fra friske frivillige i hepariniserte hetteglass og bland forsiktig ved å snu røret 2 til 4 ganger⁴⁷.
      2. Fortynn blod 1: 1 med PBS og lag over 10 ml tetthetsgradientmedium Lymphoprep i et 50 ml rør.
         MERK: Sørg for å gjøre lagdelingen veldig forsiktig og sakte for å la blod og lymfrep danne to forskjellige lag.
      3. Sentrifugerør i 30 minutter ved 400 x g ved 4 °C i en utsvingbar skuffe uten bremser. Fire forskjellige lag vil dannes: (i) plasma øverst, (ii) et hvitt og uklart lag som inneholder PBMC, (iii) lymfoprep og (iv) en pellet av erytrocytter og granulocytter.
      4. Aspirer forsiktig PBMC med en 2 ml pipette og resuspender umiddelbart i varmt vekstmedium (samme brukt i trinn 1.1.1) og vask to ganger i 5 minutter ved 1 100 x g ved RT.
      5. Telle pelleterte PBMC som ovenfor (se trinn 1.1.1.5) og enten bruke til eksperimentelle prosedyrer eller fryse for langtidslagring.
2. Plettering av cellene i 2D-brikker
   MERK: PBMC-er er ikke farget i denne protokollen. For å karakterisere spesifikke fenotyper på brikken, kan immuncelle-underpopulasjoner isoleres ved immunmagnetisk perlevalg, farget med fluorescerende cellesporere, blandet på nytt med den umerkede gjenværende fraksjonen, og dermed konfrontert med målkreftceller, som rapportert i on-chip-eksperimentene, beskrevet i Vacchelli et ^al.27, og i Racioppi et ^al.34.
   1. Før du starter samkultureksperimenter og for å lette tilsetningen av reagenser, aktiver lagrede sjetonger ved en oksygenplasmabehandling i noen sekunder. Fyll umiddelbart reservoarene med avionisert vann eller PBS for å holde PDMS (polydimetylsiloksan) overflater hydrofile til plating trinn.
      MERK: PDMS er egentlig hydrofob, noe som kan føre til vanskeligheter ved drift og innfesting av luftbobler i mikrokanaler. Se trinn 7 i tilleggsfilen med detaljer om oksygenplasmaaktivering.
   2. Steriliser under et UV-skap i 20 minutter, vask 2-3 ganger med fersk PBS, og inkuber deretter med kulturmedier i 1 time. Hold sjetonger i inkubator til du utfører plating trinn.
   3. Trekk overflødig media fra alle seks reservoarene. Pass på å unngå å suge opp media fra de viktigste kulturkamrene.
   4. Påfør langsomt 1 × 10⁵ kreftceller resuspendert i 10-20 μL vekstmedium i øvre venstre reservoar, og deretter i nedre brønn (figur 1A, reservoar 1 og 2). Vent 5 minutter for å la cellene feste seg i tumorkammeret. Noen celler vil slå seg ned og feste seg i reservoarene.
      MERK: Sett inn mobilfjæring ved siden av kanalåpningene. Denne prosedyren brukes på MDA-MB-231 kreftceller, andre linjer vil kreve optimalisering av celletetthet. For å forbedre kreftcellefeste kan en beleggfunksjonalisering av overflater (f.eks. Poly-L-lysin, fibronektin) utføres. Se tidligere publiserte protokoller for belegg^{trinn 16}, ^48,49,50.
   5. På høyre side piper forsiktig 1 × 10⁶ PBMC resuspendert i 50 μL vekstmedium til brønn 3 og 4 (se figur 1A, reservoar 3 og 4).
      MERK: Etter flyt vil PBMC distribuere seg i mellomkammeret og skape en "front", som representerer utgangspunktet for eksperimentet.
   6. Fyll alle de seks reservoarene med opptil 100-150 μL vekstmedium. Under et mikroskop kontrolleres det at cellene har fordelt seg riktig i dyrkningsrommene som vist i figur 1D-E. Endelige volumer kan variere med størrelsen på reservoarene. Juster volumene slik at de er like i alle brønner.
   7. Plasser sjetongene tilbake i inkubatoren i ca. 1 time for å stabilisere systemet før time-lapse-opptak. Tilsett friskt medium hver 3. dag, da det kan bli utsatt for fordampningstap.
      MERK: Systemet er kompatibelt med både live/dead-cell analyse og dynamisk multiplex cytokin sekresjon profilering fra betingede medier. For kjemokinanalyser kan opptil 200-250 μL alikoter av supernatanter være tilgjengelige ved å samle media fra de to reservoarene i hvert rom. Klassiske ELISA- og Luminex-cytokinprofileringsanalyser krever ca. 50 μL supernatanter. Se ^51,52 eksempler på studier av andre laboratorier som utfører cytokinprofilering på OOC-modeller.
3. Time-lapse-tilegnelse av umerket kreft og immunceller
   MERK: Vanligvis er 3 chips arrangert på et enkelt mikroskopglass (se figur 1A for 2D-chip og figur 4B for 3D-chip). Ved å bruke sceneholdere som tildeler 4 lysbilder, kan kokulturer være egnet til å overvåkes ved automatisert mikroskopi med høyt innhold for å analysere store grupper av eksperimentelle forhold. Chips kan enkelt monteres på lysbilder med tykkelse lik 1 mm eller 170 mikron (plast- eller glassdeksler, 6-brønns optiske bunnbrønner) for høyoppløselig konfokal avbildning.
   1. Ta opp bildeserier med lyse felt av umerkede celler ved hjelp av et videomikroskopioppsett utstyrt med et inkubasjonssystem.
      MERK: Her ble tidsseriedatasett (tidsvindu: 48 timer, bildefrekvens: 2 min) anskaffet med et fluorescensmikroskop, utstyrt med et 4x mål og CMOS 1.3M piksler, optimalisert for å passe inn i en standard cellekulturinkubator.
   2. Varm opp mikroskopet i minst 2 timer for å balansere til 37 °C og 5 % CO₂ før du starter oppkjøpet.
   3. Velg observasjonsvinduet ved å sentrere mikrokanalmatrisen mellom svulsten og det sentrale rommet. Dette gjør det mulig å visualisere dynamikken i immuninfiltrasjon og interaksjonene i regionen der kreftceller blir frøet.
   4. Juster belysningsintensiteten og fokuset på kreft og immunceller.
   5. For å starte time-lapse-oppkjøp, optimaliser bildefrekvens og tidsvarighet i henhold til eksperiment og celletype som studeres.
      MERK: Bildeforholdene må optimaliseres for å unngå overdreven fotoeksponering samtidig som et godt signal-støy-forhold (SNR) opprettholdes. Siden immunceller er svært bevegelige, må bildefrekvensen for oppkjøpet være tilstrekkelig høy til å følge den dynamiske prosessen av interesse og muliggjøre enkel sporing⁵³. Et kompromiss bør oppnås mellom sporingsalgoritmen, kompatibiliteten med størrelsen på det resulterende datasettet, og levedyktigheten, tettheten og motiliteten til observerte celler.
   6. På slutten av time-lapse, bruk funksjonen Importer bildesekvens og Lagre som av ImageJ-programvaren for å konvertere rammedatasettet i en 25 fps ukomprimert videofil.
      MERK: Den genererte videofilen er nå klar for cellesporingsanalyse. Her ble RGB-bilder (1280x1024 piksler) samlet inn med en romlig oppløsning på 1,33 μm / piksel. En film med 24 timers varighet (3,5 GB stabel) av ett enkelt synsfelt (FOV) består av 720 bilder for hver tilstand.
4. Dataanalyse: Halvautomatisk ekstraksjon av umerkede immunspor av Trackmate
   MERK: Her utføres immunmotilitetsanalyse i 2D umerkede time-lapse-bilder ved hjelp av TrackMate⁵⁴, en verktøykasse med åpen kildekode som er tilgjengelig i programvarepakken Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Flere algoritmer er gitt for å utføre automatisert enkeltpartikkelsporing⁵⁵(SPT) av flekklignende strukturer. De har blitt brukt effektivt på fluorescerende bilder, hvor objekter er lyse over en mørk bakgrunn med høy SNR (dvs. fluorescerende flekker med underoppløsning, merkede trafikkvesikler, kjerner)^{1,25,56,57,58}. SPT er hovedsakelig basert på to sekvensielle trinn. Først lokaliseres objekter med identifiserte posisjoner i flere rammer (segmentering), som skjematisert iFigur 2. I det andre trinnet (partikkelkobling) er oppdagede flekker koblet over påfølgende rammer for å estimere bevegelse og rekonstruere banene deres, i form av et spor (Figur 3). Numeriske funksjoner kan beregnes fra hver ekstraherte X-, Y- og Z-koordinatmatrise over tid. Utvidet dokumentasjon er rapportert i⁵⁴så vel som online (http://imagej.net/TrackMate), etter opplæringen Komme i gang med TrackMate. Nøyaktigheten av prosessen kan inspiseres umiddelbart, og håndterer et intuitivt grafisk brukergrensesnitt (veiviserlignende GUI) som gjør det mulig for brukere, på hvert trinn, å justere innstillingene. Følgende del beskriver kort hvordan du bruker Trackmate til bildebehandling og kvantifiseringstrinn, brukt på bilder i synlig lys:
   1. Dra og slipp video-/bildestabelen på heltid på Fiji-verktøylinjen.
   2. Oppsett av kalibreringsstakk (figur 2A).
      1. Kontroller dimensjonaliteten og tilordne bildeegenskapene ved å velge Bilde> Egenskaper. Fyllenhet for lengde, bildepunktdimensjoner og rammeintervallbokser.
         MERK: For å utføre kalibreringen, bruk den kjente lengden på mikrokanalene (500 μm, figur 1C) og divider med den tilsvarende målte lengden i piksler. For 2D-tidsserier må du passe på å bytte Z/T-felt som skriver inn 1 som z-stykke og riktig antall filmbilder. Hvis det ikke oppnås, rapporteres kvantitative utdata og parametere fra Trackmate i pikselenheter og tidsrammer.
   3. Forbehandling av bilder.
      1. For å forbedre riktig diskriminering av immunceller fra en støyende bakgrunn, forhåndsbehandle lysfeltbilder for å kompensere artefakter. Kontroller at datasettene består av 8-biters TIFF-bilder (lysstyrkeområde: 0-255).
         MERK: Ujevn belysning, lav SNR, og forurensning av små ruskpartikler i bilder i synlig lys kan kompromittere suksessen til en cellesporingsprosess. Her er tidsseriedatasett forhåndsbehandlet gjennom bakgrunnssubtraksjon, lysstyrke / kontrastjusteringsfunksjon, og ved lokal bildesubtraksjon av en gaussisk uskarphet fra originale bilder. Det finnes andre forskjellige analyseverktøy tilgjengelig i ImageJ for behandling og segmentering av fasekontrast- eller lysfeltbilder, inkludert Empirical Gradient Threshold (EGT)⁵⁹.
   4. Første kalibreringspanel (figur 2A)
      1. Med bildestakken valgt, start Trackmate (Plugins>Tracking).  Revidere/bekrefte dimensjonaliteten og tidsvinduet til data (dvs. pikselbredde og rammeintervall).
         MERK: TrackMate leser automatisk i bildeegenskapsboksen for å gi de endelige sporingsresultatene i kalibrerte fysiske enheter (dvs. μm og minutter).
      2. Definer et interesseområde for å beregne ekstraksjonen av immunspor, ved å sette inn verdier manuelt eller ved å tegne et lukket område over det aktive bildet, og deretter trykke på Oppdater kilde-knappen. For å trekke ut globale immunmigrasjonsbaner, velg rektangulære regioner henholdsvis på høyre side av mikrokanaler (sentralkammer, figur 1E) og til venstre (tumorkammer, figur 1D). Hvis du vil analysere interaksjoner mellom kreft og immunsoner, tegner du sirkulære underområder ved hjelp av ROI-verktøy (gå til Rediger → markering → Spesifiser).
         MERK: Når du kjører denne verktøykassen for første gang på en ny biologisk applikasjon, bruk den nødvendige tiden til å optimalisere innstillingene for å rekonstruere sporene.
         MERK: Utfør manuell sporing av cellebanene (ca. 50-100 celler) for å finne empirisk riktig konfigurasjon og ved siden av validere som referanse påliteligheten av automatisk ekstraksjon av bevegelser. I tillegg må du først jobbe på et mindre område for enkelt å kontrollere nøyaktigheten til de valgte parametrene.
   5. Oppdagelsestrinn for immunflekker (figur 2B)
      1. Velg standard Laplacian of Gaussian (LoG) detektor. LoG-detektoren arbeider for å finne lyse, blob-lignende, runde objekter og bruke et laplacian av gaussisk filter på bildet innstilt for mellomliggende punktstørrelser (5 til 20 piksler i diameter).
      2. I Estimert blobdiameter (her 10-13 μm) angir du en verdi som er litt større enn den forventede spotstørrelsen. Øk terskelverdien (her 1-3 μm) til ekstra falske bakgrunnspunkter reduseres, muligens uten å fjerne objektfunksjonene. Gjenkjenninger under terskelverdien (basert på kvalitetsberegninger) forkastes fra den påfølgende analysen. Merk av i boksen for medianfilter og underpiksellokalisering for å forbedre kvaliteten på punktdeteksjon.
      3. Bruk Forhåndsvisning-knappen til å vise og raskt inspisere identifiserte immunceller som er lagt på bildene av magentafargede sirkler.
         MERK: Feil under gjenkjenningen vil ha en betydelig innvirkning på koblingsprosessen. Andre uønskede registreringer kan korrigeres i de påfølgende menyene av brukerdefinerte filtre (dvs. etter punktintensitet, størrelse eller posisjon).
   6. Når du er fornøyd med valgene, trykker du på Neste.
      MERK: Disse innstillingene kan variere avhengig av eksperimentell oppsett og oppkjøpsmodaliteter (f.eks. FOV, objektiv forstørrelse, lysfelt eller fluorescerende bilder), celletype (adherente eller flytende celler), fra langsom eller rask motilitet, type cellulær oppførsel (samspill eller ikke) og lav / medium / høy tetthet i observasjonsområdet.
   7. Fortsett og hopp over Initial Thresholding-menyen. Velg vinduet Hyperstack Displayer.
   8. Angi filtre på flekkpanelet (figur 2C).
      1. Velg: Ensartet farge. Filtre, som vist i figur 2C, kan legges til for å beholde merkede flekker med funksjonsverdier, vist i et histogram, over eller under en reversibel terskel.
   9. Trinnet for valg av sporing (figur 3A). Velg Simple LAP tracker, som partikkelkoblingsalgoritme som ber om tre felt å fylle ut (i dette tilfellet "Linking max distance": 30-50 μm, "Gap-closing max distance": 25-50 μm, "Gap-closing max frame gap": 4-6). Denne detektoren håndterer gap-lukkende hendelser, med kostnadskoblingsberegning utelukkende basert på deres respektive avstand.
      MERK: Den maksimalt tillatte koblingsavstanden begrenser det romlige søkeområdet for kandidatmatchende flekker, som tilsvarer den maksimalt tillatte forskyvningen som er reist mellom to påfølgende rammer (figur 3D).
      1. Gi større verdier av maksimal forskyvning når fragmenteringen av spor av svært motile partikler blir lagt merke til.
         MERK: To koblinger kobles ikke sammen hvis ramme-til-ramme-bevegelsen er større enn den angitte maksimale avstandsverdien. Hvis segmenter bygger bro mellom to forskjellige celler, reduserer du verdien av maksimal forskyvning.
      2. Prøv å koble til manglende flekker på nytt, og varier verdiene for "maksimal avstand for gaplukking" og "det maksimale rammegapet".
         MERK: Disse parameterne omhandler åpningshendelser i ikke-tilstøtende rammer. Spotforsvinning kan forekomme for noen rammer (dvs. ufokuserte partikler, celler som utelater og i FOV, segmenteringsfeil i et støyende bilde).
         MERK: For å håndtere splitting eller sammenslåing hendelser, velger LAP linker som detektor som introduserer knytte kostnadsmatrise straffer.
   10. Klikk Neste for å kjøre sporingsberegningen. Trykk på Neste.
   11. Panelet Filtrering av spor (figur 3B). Endre fargen på immunbaner som velger, fra rullegardinmenyen, "Track ID" eller andre sporfunksjoner. På dette tidspunktet velger du eventuelt å sette interaktive filtre funksjonelle, for å forbedre kvaliteten på resultatet og gå tilbake til prosedyren.
       MERK: Falske flekker oppstår fra støy i bildet og tap av funksjonskvalitet. Dette vil generere korte segmenter mens celler av interesse kan spores over mange rammer.
       1. For å fjerne korte baner, prøv å filtrere ut, basert på antall flekker de inneholder. I tillegg kan du sortere spor ved hjelp av en kombinasjon av alternativer som Sporforskyvning, Sporvarighet eller Minimal/Gjennomsnitt/Maksimalhastighet for å utelate falske eller uønskede spor (med færre rammer i forhold til den totale varigheten av intervallet eller som involverer skitne eller ikke bevegelige partikler) fra videre etterbehandling.
          MERK: Valget av filtre kan variere avhengig av den spesifikke applikasjonen og det biologiske systemet.
   12. Undersøk alle sporene i grensesnittet for visningsalternativer, bla gjennom tiden og bekreft hvordan nøyaktige spor samsvarer med celleoverføringsbaner. Rullegardinmenyen inneholder fargekoder for flekker og baner for enkel visualisering og filtrering av flere modaliteter (f.eks. kinetiske parametere, intensitet, tidsmessig eller romlig posisjon).
       MERK: For sporing av kulturer med høy tetthet, eller høybevegelige celler, øker du bildefrekvensen for å minimere celleforskyvning som er reist i påfølgende tidsintervaller.
   13. Manuell korrigering av segmenterings- og koblingsfeil (figur 3E).
       1. For å forbedre kvaliteten på resultatene ytterligere, rediger manuelt flekker (ruskpartikler, stasjonære celler) og fjern feilaktige spor som stammer fra oppdagede tumorgrenser når du analyserer avkastningen på tumor-immuninteraksjon.
       2. Velg først TrackMate-verktøyet på ImageJ-verktøylinjen. For å eliminere et eksisterende sted gjennom hele stabelen, trykk på skift og opprett med musepekeren en ROI-maske over målpunktet (redigert i en grønn sirkel), og trykk deretter på DEL-tasten.
       3. For å legge til et nytt sted (i tilfelle manglende spor på grunn av flekker forsvinner), trykk på A-tasten og legg musen på det spisse stedet. Gjenta beregningsprosessen for sporkobling etter dette trinnet.
   14. Når du er fornøyd, velger du Analyse i Visningsalternativer-panelet for å generere tre tekstfiler (figur 3C og 3F). Tabellen i "Spots in tracks statistics" gir de spatiotemporale koordinatene til immunflekker (X-Y-Z-posisjoner av cellene merket med tilhørende ramme og spornummer). "Lenker i sporstatistikk" og "Sporstatistikk" inneholder informasjon i forhold til sporene: sporvarigheter, antall oppdagede hull eller flekker, spor start- og stoppramme osv. Lagre og eksporter for hvert datasett.
       MERK: Når du klikker på en rad i resultatvinduene, aktiveres det respektive stedet, lenken eller sporet i time-lapse-videoen for visuell inspeksjon. Gjenta filtreringstrinnene for å velge/fjerne spor. Alle fremtidige eksporterte data vil bli oppdatert. TIPS: Spor innledende og stoppramme og spor varighetsverdier kan utnyttes til å beregne tider for kontakt mellom kreft og immunceller når du behandler avkastning på interaksjon.
   15. Trykk på Lagre-knappen for å generere en resulterende XML-fil som inneholder alle parameterverdiene, banen til bilder og spotposisjoner i tide. Kommandoen '' Last inn TrackMate-fil '' (Plugins> Tracking) gjenoppretter hele prosessøkten for hver filmfil individuelt.
   16. Gå til det siste panelet i GUI-en som heter Velg en handling. I listen bruker du Captureoverlay > Execute-funksjonen for å produsere en video med spor overlagt. TIPS: "Plot N-spots vs time" alternativet kan brukes til å beregne den romlige tettheten av immunceller i en avkastning (figur 6B, høyre panel).
   17. Etterbehandling av analyse og flyttestatistikk
       1. Analyser de rå posisjonsdataene direkte i Trackmate eller eksporter data for å beregne omfattende kinetiske parametere²⁹ (dvs. total banelengde, euklidsk avstand, inneslutningsforhold, gjennomsnittlig kvadrert forskyvning⁵⁶, gjennomsnittlig eller øyeblikkelig sporhastighet, arrestkoeffisient, fordeling av migrasjonsvinkler, fremovermigrasjonsindeks, gjennomsnittlig rettlinjehastighet) for å klassifisere immuncellemigrasjonsadferd (f.eks. rettet eller diffusiv bevegelse^{30, 31}) og respons på målkreftceller (f.eks. behandlet vs kontroll).
          MERK: Ytterligere nyttige plugins som The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) gir ulike grafer (f.eks. Rose eller sektorplott, som vist i figur 6) og statistiske tester for avansert analyse og visualisering av eksperimentell migrasjon og kjemotaksisdata. Kombinere cellesporing og cellesegmenteringsalgoritmer^24,25,45 kan muliggjøre målinger av morfologiske beregninger på enkeltcellenivå (dvs. celleoverflate^, hoved- og mindre akselengde og cellestørrelsesforhold).

2. 3D immunkompetent kreft on-chip modell i en konkurransedyktig analyse

MERK: 3D-chipdesignen, avbildet ifigur 4, består av 5 hovedrom: en sentral for det flytende immuncelleinntaket, to sideregioner for innebygging av tumorceller i  hydrogelmatriser (150-250 μm høye) og medieperfusjonskamre. Immun- og tumorkamre er forbundet med to sett med smale arrays av mikrokanaler (200×12×10 μm³, L×W×H, figur 4E). Regelmessig 100 μm-fordelte trapesformede likebente mikropilarer (ca. 25-30 grensesnitt for hver sidegelregion, figur 4C) fungerer som barrierer for å begrense geloppløsning under injeksjon, og utnytter balansen mellom overflatespenning og kapillærkrefter^60,61 og kobler tumorregioner til de to laterale ekstra mediekamrene for å sette et gel-væskegrensesnitt (figur 5). De detaljerte funksjonene i 3D-konkurranseanalysen er vist i figur 4. Foretrukket migrasjon av immunceller mot de to hydrogelrommene som er vert for tumorceller som har gjennomgått forskjellige behandlinger, kan overvåkes og kvantifiseres. Den spesielle konkurransedyktige utformingen kan brukes til å undersøke en mengde forskjellige kreftbiologiske fenotyper (f.eks. stoffresistente vs aggressive, primære eller metastatiske, respondere vs ikke-respondere). I tillegg kan de gelinnebygde regionene enkelt integreres med forskjellige cellepopulasjoner for å gjenskape mer heterogene TME, inkludert stromale komponenter (fibroblaster, endotelceller)²³ eller for å simulere spesifikt immunsuppressivt miljø³⁴ (f.eks. makrofager) for dissekering av mekanismer for legemiddelresistens og tumorunnvikelse.
MERK: Kjernefysisk og aktiv caspasefarging, ved å bruke kommersielle sett for levende / døde analyser (f.eks. Thermo Fisher Scientific, Incucyte reagenser), kan implementeres for å vurdere mitotiske eller apoptotiske dødshendelser, som rapportert i Nguyen et ^al.33.

1. Fremstilling av matriksløsning med celler og Lasting i enheten
   MERK: I følgende eksperimentelle omgivelser inneholder de to gelregionene blandinger av humane A375M melanomcellelinjer, dyrket i matriksoppløsning (f.eks. Matrigel), utsatt for terapeutiske midler brukt som monoterapi eller i kombinasjon. Denne innstillingen tillot oss å evaluere effekten av en kombinasjon av to stoffer med hensyn til enkle på en konkurransedyktig måte og å kvantifisere deres evne til å tiltrekke seg PBMCs.
   1. Tin et lager av matriksoppløsning (f.eks. Matrigel) ved å legge det på is i et 4 °C kjøleskap en dag før forsøket.
      MERK: Ikke utsett produktet for flere fryse-tine-sykluser, da det blir "klumpete". Andre syntetiske eller naturlige hydrogelprotokoller kan være egnet til bruk i denne settingen. Vennligst referer til ^33,34,35 for fremstilling av kreftceller i kollagenmatriser.
   2. Resuspendere A375 humane melanomceller, farget med levendekompatibel PKH67 grønn fluorescerende cellelinker i matriksløsning (2 mg ^ml-1). Der det er indisert, legg til 5-aza-2'-deoksycytidin (DAC; 2,5 μM), referert til som DAC, og/eller IFN-α2b, referert til som IFN, i riktige doser³².
      MERK: Match Lot # på matrix flasken spec sheet. Basert på konsentrasjonen, beregne volumet av medium som trengs for å lage opptil 2 mg ^ml-1 Vennligst juster den optimale proteinkonsentrasjonen og kreftcellesuspensjonskonsentrasjonen i samsvar med din anvendelse av interesse.
   3. Pipett forsiktig opp og ned for å unngå dannelse av bobler. Hold mikrosentrifugerøret på is mens du blander for å forhindre uønsket polymerisering.
   4. Etter sterilisering, legg enhetene på is (ved hjelp av en isbøtte og lokk) for å unngå matriseløsningsstørkning under hele prosedyren for cellebelastning.
   5. Injiser langsomt de to IFN- og DAC/IFN-matrigel/tumorcelleblandingene (2-4 μL) i henholdsvis venstre og høyre gelport med 10 μL mikropipette ved hjelp av kaldtupper (figur 5A). Påfør forsiktig trykk for å skyve matriksoppløsning fra den ene siden til den når motsatt.
      MERK: Volumet av matriseløsning ble valgt for å unngå overløp i tilstøtende kanaler. Ikke utøv for høyt pipetteringstrykk for å forhindre at oppløsningen lekker ut i mediet og sentrale kanaler. Hvis gelbanen under lasting er blokkert langs kanalen, kan du prøve å sette løsningen fra det andre innløpet til gelfrontene møtes. Når mikropipetten fjernes fra innløpene, hold stempelet, ellers vil undertrykket aspirere matriksoppløsningen.
   6. Plasser enheten i en inkubator i oppreist stilling ved 37 ° C og 5% CO₂ i 30 minutter for å tillate gelering av matriksoppløsningen (figur 5B). Håndter med pleiespon med innebygd upolymerisert gel for å forhindre lekkasje ut av gelkanalen.
   7. I mellomtiden kan du resuspendere PKH67-merkede PBMCer (1x10⁶ celler) i 10 μL komplett DMEM (Dulbeccos modifiserte Eagle's medium).
   8. Etter matriksgelering, fyll mediekanaler med (50-100 μL) samme alikot av kulturmedium i alle seks reservoarene for å forhindre geltørking i flisene. Oppbevares i inkubator til immuncellesuspensjon sådde.
      MERK: Kontroller under et mikroskop riktig og homogen fordeling av tumorceller i gelen og integriteten til de polymeriserte gelbarrierer. Delvis eller ikke ensartede gelerte regioner eller bobler i blandingen fører til for tidlig strømning av PBMC i gelmediekanaler ved startpunktet for forsøket på grunn av trykkinnledende svingninger.
   9. Aspirer medier fra de seks brønnene og plasser spissen nær innløpet til en mediekanal for å injisere forsiktig med moderat trykk PBMC-cellesuspensjon. Den tidsmessige lastesekvensen er vist i figur 5C:
      1. PBMC i 10 μL medium inn i den øvre sentrale brønnen.
      2. 50-100 μL medium i hver av fire brønner av sidekanaler.
      3. 40-90 μL medium inn i den øvre sentrale brønnen.
      4. 50-100 μL medium inn i den nedre sentrale brønnen.
   10. Forsikre deg under et mikroskop at PBMC-fordelingen forblir begrenset i sentralkammeret etter lastetrinnet. (figur 7A).
       NOTAT: Hvis det ikke er optimalt, juster konsentrasjonen om nødvendig og gjenta såtrinnene ved hjelp av uberørte sjetonger. Ved beregning av volumer for de planlagte eksperimentelle forholdene, se et overskytende antall sjetonger (15-20%) for å ta hensyn til potensielle feil og justeringer. Volumer og konsentrasjoner bør optimaliseres i henhold til den spesifikke applikasjonen.
   11. Plasser monterte enheter på en jevn overflate i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO₂ for etterfølgende fluorescensavbildning. Håndter med forsiktighetsbrikker etter lasting av immunceller som flyter.
       MERK: Kompenser fordampningstap av volumer i reservoarer ved å erstatte medier hver 2-3 dag. For kjemokinprofilering kan opptil 100 μL fra hver av to brønner i kulturrom aspireres, se trinn 2.7 i trinn 1.
2. Automatisert telling av rekrutterte PBMC-er i enkanals fluorescerende bilder i ImageJ
   MERK: Klassiske metoder for immunfluorescens for konfokal høyoppløselig avbildning kan brukes på on-chip-operasjoner som endepunktsmålinger. Den grunnleggende fargeprosedyren innebærer cellefiksering, permeabilisering, blokkering, antistoffbinding, farging av kjerner med vasketrinn i mellom. Umerkede immunceller infiltrert i 3D-gelregioner med innebygde kreftmikromiljøer kan fikseres på ønskede tidspunkter og farges for ekspresjonsmarkører for aktivering/utmattelse/modning (f.eks. for CD8-celler, overvåking av CD69-, CD95-, PD1-, TIM3-markører). I Parlato mfl.³⁵, ble fagocytose av SW620 apoptotiske celler evaluert ved konfokal mikroskopi, ved bruk av enheter montert på 170 μm tykke deksel. IFN-DCs ble farget og tilsatte anti-menneskelige HLA-DR-FITC Ab-alikoter på brikken.
   For å beregne omfanget av infiltrerte fluorescerende fargede levende immunceller som utfordres med konkurrerende signaler, settes en vanlig arbeidsflyt for bildeanalyse som følger (Figur 7D-G):
   1. Anskaffe, ved spesifikke endepunkter, fasekontrast og røde / grønne kanaler fluorescensmikrofotografier av venstre og høyre gelregioner som inneholder tumorceller henholdsvis utsatt for enkle eller kombinasjoner av farmakologiske regimer.
      MERK: Her ble bildene tatt med et EVOS-FL fluorescensmikroskop etter cellebelastning (0 timer), etter 48 timer og etter 72 timers inkubasjon (figur 7A-B). En 4x-10x forstørrelse ble brukt til å skaffe sentralkammeret, mikrokanalarrayene og de to sidekanalene som inneholdt A375 pluss IFN og A375 pluss DAC / IFN.
      1. Når du utfører anskaffelsesoperasjoner, bør du vurdere parametrene for å måle og unngå metning av funksjoner som skal telles. Optimale segmenteringsresultater avhenger av arten av de oppkjøpte bildene, på grunn av variasjon i selve de biologiske prøvene, kvaliteten på fargingen og mikroskopiteknikkene som brukes til brukerorienterte applikasjoner.
   2. Last inn fluorescensdata i én kanal (i dette tilfellet rød = PBMC), på Fiji ved å dra den inn i hovedvinduet (figur 7D). Dupliser bildet for å unngå å overskrive rådataene under valg av forhåndsbehandlingsfiltre til endelig segmentering.
      1. Hvis bildet er et fargebilde (RGB), trykker du på Bilde > Type 8 eller 16-bit for å konvertere til gråtoner. Kontroller at Rediger > Alternativer > Konverteringerer satt til skalering ved konvertering.
   3. Forbehandling av rådata via opprydding av støy og artefakter.
      1. Gå til Prosess > Trekk fra bakgrunnsmenyen ved å bruke rulleballalgoritmen for å korrigere ujevn støybakgrunn med store romlige intensitetsvariasjoner. Sett radiusen til minst størrelsen på den største forgrunnspartikkelen. Velg Forhåndsvisning-boksen for prøving og feiling for å gi optimale resultater. For små verdier kan feilaktig fjerne strukturer av interesse.
      2. I kommandoen Lysstyrke og kontrast drar du glidebryterne Minimum/maksimum for å endre intensitetsområdet i histogrammet. Skift glidebryteren Maksimum til venstre for å øke lysstyrken, uten utvaskingsfunksjoner. Flytt Minimum-lysbildet til høyre for å øke kontrasten i bildet, slik at mindre synlige funksjoner i bakgrunnen ikke forsvinner. Klikk på Bruk for å rette opp endringene.
   4. Forbedring av bilder.
      1. Gå til Behandle >filtre og eksperimenter med median, gaussiske filtre på bilder (figur 7E).
         MERK: Forhåndsfiltreringsradius bør tilpasses bildestøypikslene. Det ikke-lineære middelverdifilteret erstatter bildepunktverdien med medianverdien til naboer for å redusere salt- og pepperstøy. "Gaussian Blur" brukes til å jevne ut et digitalt bilde ved å erstatte bildepunkter med et vektet gjennomsnitt av omkringliggende bildepunkter. Vektene kommer fra den gaussiske sannsynlighetsfordelingen, så de nærmeste pikslene er mer innflytelsesrike.
      2. Gå eventuelt til Process > Math > Gamma med merket av for Forhåndsvisning for å øke kontrasten.
         MERK: Intensitetene som er angitt i B&C-panelet, skaleres mellom de to min- og maksgrensene. Verdier < 1,0 fremhever forskjeller mellom lave intensiteter, mens verdier > 1,0 fremhever forskjeller mellom høye intensiteter. Gammakorreksjon er funksjonell for å finne et visningsområde, som viser de svakeste objektene uten å mette de lyseste.
   5. Opprettelse av en binær bildemaske.
      1. Gå til bilde > juster terskelen >. Den mest brukte metoden for å bestemme terskler er avhengig av histogramanalyse av intensitetsnivåer, som vist i figur 7F. I rullegardinmenyen, spill med forskjellige globale terskelmetoder (i vårt tilfelle brukes Otsu).
      2. Rull manuelt eller skriv inn et kjent utvalg av pikselintensiteter i histogrampanelene, observer endringen av det røde mønsteret som ligger over bildet som for det meste ligner det faktiske celleområdet. Tilbakestill-knappen fjerner overlegget. Når du er fornøyd, klikker du på Bruk for å generere en binær versjon av bildet. Merk av for Process > Binary > Options for å kontrollere hvordan terskelbilder vises og hvordan objekter identifiseres av Particle Analyzer.
   6. Bruk menykommandoen Prosess/Binær/Vannskillepartikler til å dele delvis overlappende eller sammenslått under terskelen. Vannskille kan ofte kutte dem nøyaktig fra hverandre ved å legge til en 1-piksel tykk linje. Utfør morfologiske operasjoner, for eksempel Utvide eller Erodere, for å utvide eller fjerne bildepunkter fra under- eller overmettede bildepunkter.
      MERK: Hvis du vil ha mer informasjon, kan du se delen Menykommandoer eller se MorphoLibJ, et integrert bibliotek basert på matematisk morfologi for å behandle binære data.
   7. Beskrivelse av kvantitative bildefunksjoner.
      1. Når du har oppnådd tilfredsstillende objektgjenkjenning, åpner du partikkelanalysatoren fra Analyser > analyser partikler. Partikler kan utelukkes ved størrelse og sirkularitet, uttrykt i piksler eller i en kalibrert måleenhet (sjekk riktig skala i forhold til mikroskopinnstillinger under Bilde > egenskaper). For å inkludere alt, hold standardområdet 0-uendelig og sirkularitet på 0,00 - 1,00 (0 = rett linje, 1 = perfekt sirkel).
      2. For å filtrere små "støy" piksler eller funksjoner av ikke interesse, angi minimums- og maksimumsområdet. Merk av for Inkluder hull, Vis, Disposisjon og Vis resultater i vindusfeltet. Ekskluder på kanter vil forkaste partikler som er oppdaget på kantene av bildet. Add to Manager legger til det oppnådde valget til ROI-lederen for videre analyse og beholder posisjonsinformasjonen til partikkelen.
         MERK: I "ROI Manager" er det mulig å korrigere automatisk segmentering registrert utgang (slå sammen delte celler, splittede sammenslåtte celler). Velg, ved hjelp av utvalgsverktøy i Fiji-verktøylinjen, avkastning innenfor begge gelregionene der kreftceller er innebygd for å estimere immuninfiltrasjon.
   8. Eksporter de oppnådde verdiene til et regneark for å utføre statistisk analyse som vist i figur 7G. "Resultater" viser en datatabell i forhold til nummererte skisserte partikkelegenskaper identifisert. "Oppsummer" åpner et vindu med navnet på bildet, totalt antall og annen informasjon for hele bildet.
      1. Gå til Analyser > Angi målinger for å inkludere et bredt spekter av parametere.
   9. Registrer eventuelt en makro (ved å velge Plugins > Macros > Record) for å automatisere behandlingsarbeidsflyten og spare tidsanalyse på store datasett.
      1. Bruk samme behandlingsrutine for å analysere grønn fluorescenskanal i de samme regionene for å analysere morfologiske endringer av tumorceller i 3D-regioner¹⁶

Representative Results

Tumorimmuninfiltrasjon er en parameter for vertens antitumorrespons. Tumorer er heterogene i sammensetning, tetthet, plassering og funksjonell tilstand av infiltrerende leukocytter som interaksjoner med kreftceller kan ligge til grunn for klinisk relevant informasjon for å forutsi sykdomsforløp og respons på terapi. I denne forstand kan mikrofluidiske teknologier brukes som komplementære og privilegerte in vitro-verktøy for å utforske immunkonsistensen av svulster, samt å overvåke responsen på kreftbehandlinger. Koblingen av mikrofluidisk analyse, levende celleavbildning og sporingsprogramvare kan etablere pålitelige kvantifiseringsmetoder for å kvantifisere hvordan immunceller justerer migrasjonsmønsteret i forskjellige sammenhenger. I dette kapittelet har vi rapportert trinn for å sette opp allsidige 2D- eller 3D-samkulturer av immun- og målkreftceller i ad hoc mikrofluidiske enheter realisert ved standard myklitografiske prosedyrer. I seksjon 1 ble mikrofluidiske enheter brukt for å tillate kjemiske og fysiske kontakter mellom adherente (MDA-MB-231 kreftceller) og ikke-adherente (PBMCs) populasjoner. Noen kjemoterapeutiske midler (f.eks. antracykliner blant de andre) kan indusere "immunogen" apoptose av ondartede celler, og dermed øke deres synlighet i immunkompetente verter. Kreft immunogen celledød (ICD) er preget av frigjøring av membranbundne og løselige signaler levert av døende celler som fungerer som alarminer for immunceller. For å gi en kvantitativ validering av ICD-respons, bruker vi data samlet inn i den mikrofluidiske plattformen der leukocytter kan bevege seg gjennom passende bygde mikrokanalbroer mot målcellene. Time-lapse-opptak ble utført etter samtidig lasting av PBMC, fra friske donorer (WT, vill type), med humane MDA-MB-231 brystkreftceller forbehandlet eller ikke med antracyklin DOXO. Mikrofotografier ble generert hvert 2. minutt, i to påfølgende tidsintervaller på 24 og 48 timer. (Forbilledlig Film S1 av 0-24 timers intervall). Sporingsanalyse av individuelle PBMCer utfordret med døende (DOXO-behandlede) eller levende (PBS-behandlede) kreftceller ble gjort ved hjelp av Trackmate plug-in, som vist i Figur 6A (venstre panel). Relevante kjemotaksisverdier og migrasjonsplott ble automatisk generert ved hjelp av kjemotaksis og migrasjonsverktøyet, som beskrevet i⁶². Cellebanene ble alle ekstrapolert til (x, y) = 0 på tidspunktet 24 timer. Resultatene indikerte en annen migrerende profil av immuncellene når de ble lastet sammen med brystkreftceller utsatt for DOXO eller PBS. Når PBMC ble konfrontert med apoptotiske kreftceller, krysset de mikrokanaler mot døende / døde celler (men ikke for å leve ubehandlede celler). Migrasjon X / Y edderkopp og rose diagrammer, presentert i venstre panel Figur 6B-C, ble kartlagt og sammenlignet for å fremheve virkningen av immunogene induktormidler på forskjeller i immundynamikk. Roseplott viser at PBMC migrerte hovedsakelig i nesten alle retninger i kontrolleksperimentet, bare en ubetydelig brøkdel styres opp gradienten generert av prolifererende kreftceller. Omvendt markerer banene til individuelle celler en sterk skjevhetsbevegelse langs retningen av apoptotiske brystkreftceller (negativ x-retning). For å evaluere rettet immuncellemigrasjon mot DOXO-behandlede eller PBS-behandlede kreftceller, beregnes flere kjemotaksisparametere, inkludert: a) massesenteret (romlig gjennomsnittlig punkt for alle endepunkter); b) direksjonaliteten; c) Forward Migration Index (dvs. gjennomsnittlig celleforskyvning i en retning av interesse som betyr mot måltumorstedet, i vårt tilfelle). Sistnevnte verdier representerer en måling av effektiviteten til en celle for å migrere i retningen gitt kjemotaktiske stimuli. Etter å ha nådd venstre kammer, viste en brøkdel av leukocytter med økende tetthet over 24-48 timer langvarig (>60 min) kontakter med DOXO-behandlet MDA-MB-231. PBMC klarer ikke å migrere massivt og engasjere seg i slike langsiktige og vedvarende interaksjoner med levende kreftceller (som vist ved representative mikrofotografier av nærmer seg PBMC i Figur 6A, ikke sant). For å kvantifisere forskjeller i tumor-immun samspill ble tumorområdet avgrenset med en fast sirkel med diameter på 20-80 mikron, kalt "hotspot". Kvantifiseringen og analysen fra representative FOVer er vist i Figur 6 (Høyre panel, B-C).

I seksjon 2 ble en ny 3D immunkompetent tumormodell beskrevet for å kvantifisere rekrutteringen av immunceller som respons på anti-kreftkombinasjoner av epigenetiske legemidler³² (DAC / IFN vs IFN alene), noe som gjør det mulig å sammenligne to forskjellige behandlingsbetingelser for A375 melanomceller samtidig. Dermed ble A375M melanomceller, merket med PKH67 grønt fluorescerende fargestoff, innebygd i Matrigel-matriser i nærvær av DAC og / eller IFN i hvert gelkammer, mens PKH26 rødmerkede PBMC ble fordelt homogent i det sentrale fluidkammeret ved utgangspunktet (figur 7A). Vi sammenlignet samtidig de to tumormassene i 3D-matriser for deres evne til å tiltrekke seg PBMC. Ved 48 og 72 timer ledes PBMC massivt inn i mikrokanalene på høyre side, som observert i figur 7B.

En fortrinnsrett av PBMC mot gelmatrisen som inneholdt DAC / IFN-behandlet, i stedet for IFN-behandlet, melanomsted ble tydelig observert, mens dårlig migrasjonshastighet var synlig mot A375-celler utsatt for enkeltbehandling (venstre chipside). Konkurranseinnstillingen gjelder for å undersøke en mengde forskjellige kreftbiologiske fenotyper (f.eks. Stoffresistent vs aggressiv, primær eller metastatisk (f.eks. A375P vs A375M melanomceller) og respondere vs ikke-respondere). Gelkamre kan bestå av komplekse samkulturer av ondartede celler og flere ikke-kreftformede tumorassosierte celler, som endotelceller, immunceller og fibroblaster³³ for å karakterisere legemiddelresponser på TME-nivå. Hendelser av mitose og apoptotisk død av kreftceller kan overvåkes ved farging med levende fargestoffer³³. Immunfargingsprosedyrer på 3D-mikrofluidiske enheter kan tilpasses for å evaluere aktiveringstilstander av infiltrerte immunceller på tumorsteder ved konfokal mikroskopi³⁵. I denne forstand kan disse 3D-mikrofluidiske systemene etterligne komplekse tumorstrukturer og multicellulære interaksjoner, og er derfor verdifulle plattformer for mer pålitelig preklinisk legemiddeltesting.

Figur 1. Planimetri av den mikrofluidiske enheten for montering av 2D-tumor-immune kokulturer. (A) Ekte mikrofotografi av 3 chips satt sammen til et enkelt mikroskoplysbilde. Reservoarene nummereres avhengig av lastesekvensen og er fargekodet som de tilsvarende kulturkamrene som er oppført i forklaringen. Skalabar, 6 mm. (B) 3D CAD av brikke bestående av tre hovedcellekulturområder forbundet med mikrospor. C) Detaljer om den smale mikrosporbroen, som viser dimensjonene skreddersydd for kreftceller og PBMCs størrelse. D-E) Mikrofotografi i synlig lys ble tatt før tidsforløpet, og viste fordelingen av henholdsvis kreftceller og PBMC i venstre og mellomliggende kammer. Skala, 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2. Trackmate analyse pipeline for lokalisering av immun flekker i tidsseriebilder. A) Øvre panel: Skjermbilde av Trackmate-bildekalibreringsmenyen. Nedre panel: Fiji "Image properties menu" for å angi tid og romlige enheter. B) Øvre panel: Skjermbilde av Trackmate "Spots detection"-menyen. Nedre panel: Utgangsbilde med brukte forskjellige verdier for "Threshold". C) Øvre panel: Skjermbilde av Trackmate "Spot filtering"-menyen som illustrerer noen filtre. Nedre panel: Eksemplarisk intervallbilde, som viser immunflekker filtrert etter posisjon langs X i mellomkammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3. Trackmate Analysis pipeline for rekonstruksjon av immunspor i bildesekvenser av tidsserier. A-C) Skjermbilder av Trackmate-menyer for sporbygging, sporfiltrering og eksport av endelige data. D) Eksempler på genererte spor i forhåndsbehandlede tidsforkortede bilder som varierer innstillingene for koblingsdetektoren. E) Eksempel på falske spor og dårlige koblinger avledet fra påvisning av tumorcellegrenser. F) Spor utheves i grønt ved å velge rader i filen .txt resultater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4. Skjematisk oversikt for 3D immunokompetent tumor-on chips. A) Eksempel på en mikrostrukturert silisiummaster. Frimerker for PDMS ble mønstret i SU-8 negativ motstand i et renromsanlegg utstyrt med e-stråle og optisk litografi. B) PDMS-replikaer ble fremstilt ved standard myklitografimetoder. Den sentrale enheten har kamrene farget som de som er tegnet i 3D-gjengivelse av brikken, avbildet i panelet D. C) Skanning elektronmikroskopi (SEM) forstørret visning av rekke mikropilarer egnet for hydrogelløsningsinnfangning. D)3D CAD som viser kamrene, forbundet med mikrospor og lastebrønnene. Stiplede bokser refereres til SEM-fotografier av detaljer (panel C og E). E) SEM-fotografi av 10 μm høye forbindelsesmikrospor. F) 2D CAD-layout som viser dimensjonene til mikrostrukturer. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5. Skjematisk arbeidsflyt for hovedtrinn i lasteprotokollen for montering av 3D-samkulturer. A) Øvre panel: Skjema over injeksjonstrinnet til Matrigel oppløsning i hver gelsideregion. Nedre panel: Ekte fotografi av brikken som viser gelfrontforskyvning langs kanalen under lastetrinnet. B) Skjema over Matrigel polymerisasjonstrinn. Nedre panel: Fasekontrastmikroskopisk visning av gel-luftgrensesnittet dannet etter geleringstrinn. Skala, 100 μm. C)Øvre panel: Tegning, som viser lasting av celler og medier med eksemplariske volumer som brukes i protokollen. Nedre panel: Et 4X fasekontrastbilde av den sammensatte samkulturen ved 0h vises. Skalabar, 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6. Analyse av migrasjonsprofiler og interaksjonsatferd av PBMC mot døende/levende tumorkammer i tidsvinduet 24-48 timer. Venstre panel. A) Skjermbilder av forhåndsbehandlede tidsforbehandlede bilder overlagt med immunfargede spor, hentet ut av Trackmate. Immunbanene oppnås ved en enkelt FOV i de angitte eksperimentelle forholdene i intervallet 24 til 48 timer i mellomkammeret. B-C) Representative migrasjonsspor og roseplott av PBMC dyrket under de to forskjellige tilstandene (n = 1550 PBMC versus DOXO-behandlede kreftceller, DOXO+ eller n =1434 PBMC versus kontrollkreftceller, DOXO-). Hver linje i x-y-plott viser en enkelt PBMC-bane, og hver sirkel representerer den endelige posisjonen til en enkelt celle i forhold til startposisjonen. Startpunktene settes til (0,0) ved hjelp av en koordinattransformasjon. Koordinatene og forskyvningen av massesenteret for cellemigrasjon vises under de angitte eksperimentelle forholdene. Senteret for massekoordinater og forskyvning (beregnet som gjennomsnittlig euklidsk avstand for X- og Y-komponentene) gir indikasjon på den gjennomsnittlige retningen som gruppen av celler primært reiste i og størrelsen på den totale cellebevegelsen i tilstandsgrupper. Blå og grønne linjer markerer henholdsvis individuelle spor med euklidsk avstandsverdi større/mindre enn en terskelverdi (100 μm). D) Skjema for numeriske data ekstrahert av et cellespor. E-F) Box &; Whiskers plot som viser henholdsvis direksjonalitet (s<0,0001 Unpaired t test med Welchs korreksjon) og FMI (s<0,0001 Unpaired t test med Welchs korreksjon). Den vannrette linjen i bokser representerer medianverdier. FMI-verdiene er gjennomsnittet for alle cellespor i hver tilstandsgruppe. Høyre panel. A) Skjermbilder av Trackmate ekstrahert avkastning som viser differensielle interaksjoner mellom PBMCs og DOXO eller PBS-behandlede kreftceller. B) Tidstetthet av PBMC rundt DOXO-behandlede eller kontroll-MDA-MB-231 kreftceller. Antall PBMCer tilstede i utvalgte avkastning rundt kreftceller for hver tilstand. Rapporterte verdier er gjennomsnittet over 9 utvalgte ROI fra en enkelt time-lapse FOV. Kreft hotspots er definert i en avkastning (80 μm i diameter). Tilsvarende varmekart for tetthet vises. Prikker representerer gjennomsnittlig antall celler beregnet over 9 krefthotspots på angitte tidspunkter. C) Fordeling av tider (min) av kontakter for hver eksperimentell gruppe. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7. Foretrukket rekruttering av PBMC som respons på DAC pluss IFN-legemiddelkombinasjoner i et konkurransedyktig 3D immunkompetent melanom på chipmodell. A) Distribusjon av opprinnelig lastede PBMCer i det sentrale kammeret for mikrofluidiske enheter. Mikrofotografier tas med EVOS-FL fluorescensmikroskop i intervallet 0-72 timer. Rød fluorescens (PKH67-merkede celler) representerer PBMC fra friske givere. PKH67-merkede (grønne) humane melanomceller innebygd i Matrigel inneholdende enkelt- eller dobbeltkombinasjonsbehandlinger ble belagt i laterale kamre. B) A375-celler pluss IFN til venstre mot A375 pluss DAC/IFN til høyre. Fluorescensbilder ble vist ved 72 timers samkultur. Utgått gul boks viser synlig massiv rekruttering i A375 pluss DAC / IFN side. C) PBMC teller i fire forskjellige avkastninger fra IFN-kamre vs DAC + IFN-kamre. Histogrammer representerer celletall +/- S.D.; heatmap oppregnet verdier fra hver avkastning. Skalastenger, 200 μm. D-G) Skjemaer over segmenterings- og kvantifiseringstrinn for infiltrerte PBMCer i gelmatriser anvendt på enkeltkanals fluorescensbilder. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil. Mikrofabrikasjonsprotokoll Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfilm 1. Time-lapses sekvenser i en 2D tumor-immun on-chip co-kultur. Mikrofotografier ble tatt hvert 2. minutt, i et tidsintervall på 0-24 timer ved hjelp av et kompakt mikroskop plassert i en standard cellekulturinkubator. Venstre panel. Film av PBMCs fra friske donorer (WT, vill type), belagt med MDA-MB-231 kontroll brystkreftceller. Høyre panel. Film av en massiv migrasjon av PBMCs WT mot chipkammeret der MDA-MB-231 DOXO-behandlede kreftceller, er lastet. 2D-brikkeoppsett er beskrevet i detalj i avsnitt 1 i protokollen og vist i figur 1. Klikk her for å laste ned denne filmen.

Discussion

De beskrevne metodene forsøker å designe en generell tilnærming for å rekapitulere, med modulerbar grad av kompleksitet, to viktige aspekter innen onkoimmunologi, som kan dra nytte av å ta i bruk mer relevante in vitro-modeller. Den første involverer tumorcellepopulasjonssiden, hvor håndtering av enkeltcelleegenskaper kan føre til en bedre beskrivelse av heterogenitet og korrelert biologisk og klinisk signifikans, inkludert resistens mot terapi, tilbøyelighet til metastase, stamcelle og differensieringsgrad. Den andre siden av historien er representert av TME, inkludert ikke-kreftfremkallende komponenter (immun- og stromale celler, blodkar) og kjemisk / fysisk landskap (ECM-bestanddeler, kjemokiner og andre løselige faktorer som frigjøres) som dypt kan forme både sykdommens egenskaper og individets respons på terapi⁶³, spesielt på immunterapi. Det er verdt å merke seg at eksport av den beskrevne tilnærmingen til andre forskningsfelt krever en dyp forståelse av begrensninger og utfordringer som følge av utvikling og vedtak av nye modeller.

Ved å sitere en leveregel anvendt i teknisk modellering ("modellere problemet ikke systemet"), må den optimaliseres som er det minste antall (cellulære, fysiske og kjemiske) komponenter og forhold som trengs for å lage egen on-chip-modell biologisk relevant og stabil langs hele eksperimentet. Hver kombinasjon av celletyper / mikromiljø / eksperimentell innstilling må dermed velges nøyaktig, evalueres og kontinuerlig overvåkes langs enkelteksperimenter og fra økt til økt. Disse kontrollene inkluderer, som nevnt i protokollseksjonene, streng kontroll av parametere som volumer i de mikrofluidiske enhetene som kan modifiseres av fuktighetsforhold eller oppvarming fra belysningskilder, mulige bevegelser og ikke-planaritet av stadier som forårsaker ukontrollert væskedrift, men også noe endepunktverifisering av celletilstand, levedyktighet og fenotypisk karakterisering. Et kritisk skritt gjelder beslutningen om å bruke perfusjonssystemer for å skape vaskulariserte (lignende) strukturer, eller for levering av legemidler på brikken³³, siden dette kan påvirke forsøkene når det gjelder økende kompleksitet, cellekulturvarighet og modulering av de kjemiske faktorene i nærvær av flytende celler som immunforsvaret.

I det følgende oppsummerer vi de viktigste kritiske og relevante problemstillingene som finnes i eksperimentelle settinger og i den nyeste litteraturen.

ECM og kjemisk landskapsdefinisjon
TME er dypt påvirket også av de mekaniske 64,65 egenskapene til omgivelsene^{63, 66}. Av denne grunn er valget av dyrkingsmatrisen grunnleggende, spesielt når det gjelder immunceller som under visse forhold kan reagere på signaler som frigjøres av selve matrisen. Relevante fremskritt forventes i neste fremtid også fra design og utvikling av nye materialer og hydrogeler (kjennetegnet av forskjellig stivhet, porøsitet, tilstedeværelse av løselige faktorer, blant de andre parametrene) som muliggjør en stadig mer raffinert og kontrollerbar ECM, som etterligner spesifisiteter av forskjellige vev i dag, forskjellige pasienter i morgen. På den andre siden er det også viktig å overvåke endringene indusert av de forskjellige cellepopulasjonene i ECM og definere strategier for å inkludere denne informasjonen i dynamiske og fenotypiske analyser.

Håndtering av data
Veien mot distribusjon av tumor on-chip teknikker i en klinisk arbeidsflyt kommer til å dra nytte av et stort eksperimentelt arbeid som foregår langs flere retninger. Organ-on-chip-modeller, som mange in vitro-teknikker, er funksjonelle, i det minste potensielt, for å utføre målinger med høy gjennomstrømning / høyt innhold. Parallellisering av eksperimentelle forhold, inkludert positive og negative kontroller, og tekniske/biologiske replikater er gjort mulig ved å integrere flere brikker på samme plate. Økningen i den kvantitative gjennomstrømningen spiller en avgjørende rolle i å oversette og validere disse systemene i rask legemiddel- eller genscreeningrørledning for immunterapier. Faktisk har flere selskaper allerede utviklet plattformer i et multibrønnformat, og ulike bildebehandlingsmetoder testes for å tillate overvåking av et høyt antall enheter samtidig¹⁴. I de ovenfor beskrevne protokollene brukte vi mikroskopglass som tildelte opptil 3 chips, med mulighet til å visualisere opptil 12 eksperimentelle forhold parallelt, ved hjelp av et standard mikroskop multi-slide skuff. Dette oppsettet er kompatibelt med håndpipettering og egnet for spesialtilpassede justeringer utført i vårt mikrofabrikasjonsanlegg. Tvert imot, når en sterk parallellisering er nødvendig (flere screeningstester og kontroller), er det nødvendig med oppsettoptimaliseringer for å sette et høyere nivå av automatisering (dvs. bruk av pipetteringsroboter, plastbrønner).

Ved utforming av eksperimenter må det tas hensyn til en avveining mellom romlig og tidsmessig oppløsning.

Den enorme mengden data, produsert ved mikroskopi med høyt innhold, utgjør en begrensende faktor når det gjelder lagring, overføring og analyse. Disse problemene blir adressert med beregningsmessige tilnærminger som implementerer maskinlæringsverktøy og maskinvare / programvareressurser, noe som kan fremme fremtidig mulighet til å koble on-chip / in-silico eksperimenter^67,68 ved valg av terapeutiske strategier, og det representerer en ambisiøs^, men ikke-utsettbar mulighet.

Utover fluorescensavbildning
Fluorescensmerking, av fargestoffer eller reportergener, på grunn av sin høye spesifisitet, representerer utvilsomt gullstandardmetoden for å identifisere forskjellige cellepopulasjoner i kokulturforhold og for å løse molekylære egenskaper med høy SNR. I OOC-modeller brukes denne tilnærmingen ofte som referanse, og spesielt i heterogene tumor-on-chip-mikromiljøer kan det være verdifullt å karakterisere fenotypen av immunceller som infiltreres og samhandler.

Likevel er det økende bevis for at effekter indusert av fluoroforer, arbeidskrevende fargeprosedyrer og belysningsrutiner må overvåkes og minimeres⁶⁹ fordi kan påvirke celleadferd og tilstand^70,71. Denne risikoen synes spesielt å gjelde for skjøre systemer, som immunceller^72,73. Fototoksiske reaksjoner kan introdusere begrensninger i å definere temporalvinduets oppkjøp av levende celler når de overvåkes med høy romlig og tidsmessig oppløsning. Videre gjør rikdommen i mangfoldet av immunpopulasjoner det umulig å diskriminere blant dem bare ved fluorescerende farging, med tanke på det begrensede antallet filtre som vanligvis er tilgjengelige på mikroskoper.

For å løse dette problemet, fra et instrumentelt synspunkt, vises nå nye etikettfrie⁷⁴ mikroskopiteknikker som holografisk⁵⁶ eller hyperspektral mikroskopi⁵⁷ på scenen. De lover avanserte cellulære prosessklassifiseringsstrategier utover fluorescens og kan være spesielt verdifulle for å studere sensitive prøver. Fra et dataanalysesynspunkt er avanserte beregningsmetoder, basert på dype læringsalgoritmer⁷⁵ (trent av fluorescensbildedatasett), døråpnere for å utføre den såkalte "in silico labeling"^76,77. De har blitt brukt til å forutsi fluorescerende markører fra lysfeltbilder⁷⁸, generere merkede bilder uten å farge celler, og dermed øke lysfeltmikroskopiens informative kraft. Denne strategien kan også være nyttig for å spare tid og fluorescenskanaler for andre markører. Vi tror at OOC-samfunnet vil dra nytte av disse nye teknikkene som tillater en mindre invasiv studie av cellepopulasjonsinteraksjon.

Analyse av data
Mekanismer for interaksjoner mellom immun- og målkreftceller kan undersøkes ved sporing av cellebevegelser^28,79. Time-lapse-sporingseksperimenter i komplekse og heterogene samkulturer er ekstremt verdifulle for å trekke ut cellemigrasjonsmønstre, morfologiske og tilstandsendringer og omfattende avstamningsinformasjon. Å utføre manuell analyse er praktisk talt bare mulig for korte sekvenser med få celler, men ikke for systematiske eksperimenter med høy gjennomstrømning. Følgelig er utvikling av beregningsverktøy for cellesporing, enten helt eller delvis automatisert, et viktig forskningsfelt innen bildeanalyse²⁴. Vanligvis krever konvensjonell cellesporing relativt høy frekvens av prøvetaking og romlig oppløsning for å utføre segmenteringsoppgaver på riktig måte, noe som kan være utfordrende under mange eksperimentelle forhold. For å lokalisere celler er det tilgjengelige segmenterings- og sporingsverktøy med åpen tilgang (f.eks. ImageJ-programvare²²) som presentert i denne protokollen eller dedikert proprietær programvare. I store studier brukte vi en proprietær programvare kalt Cell Hunter^16,31, utviklet av Universitetet i Tor Vergata i Roma^, for å skille på en helautomatisk måte kreft og immunceller i multipopulasjonskontekst. Skreddersydde løsninger basert på maskinlæring og nevrale nettverkstilnærminger 80,81,82 begynner å bli implementert i mikroskopiprogramvarepakker ^83, fra å forbedre SNR til å administrere kritiske innsamlingsparametere eller segmenteringstrinn. Maskinlæring kan utnyttes til å gjenkjenne vanlige cellulære mønstre (f.eks. Bevegelsesstiler) for å karakterisere den biologiske responsen med hensyn til mikromiljøfaktorer.

I Comes et ^al.41 ble en forhåndstrent Deep Learning Convolutional Neural Network-arkitektur brukt for å klassifisere om kreftceller er eller ikke utsatt for en medikamentell behandling ved å bruke som en "markør" immuncellens motilitet, sporet fra time-lapse-data av samkulturer av brystkreftceller og PBMCer i kollagenmatriser i mikroenheter, som beskrevet i³³.

Single-cell omics metoder og ontologier utvikling
Vi peker på behovet for en strategisk allianse mellom single-cell omics teknologier⁸⁴ (f.eks. proteomikk, metabolomikk, genomikk) og on-chip-metoder: molekylær detaljert karakterisering, konjugert til funksjonell dynamisk informasjon, kan forbedre forståelsen av grunnleggende mekanismer og klinisk beskrivelse. I dette tilfellet er nye instrumenter for å knytte de to verdenene sammen i begynnelsen⁸⁵. Den første utfordringen er å implementere encellede omics-tilnærminger direkte på onkoimmunologibrikkene²². Videre kan organ-on-chips utnyttes som plattformer for å teste potensielle mål identifisert av genomikk og proteomikkanalyser^86,87. Et annet koblingsverktøy, som fortsatt i stor grad mangler, er en strukturert, standardisert måte å kommentere og lagre målte systemresultater^88,89. Men dette er akkurat det vi trenger i fremtiden for å bygge systematiske databaser med cellulære kvantitative resultater og målte egenskaper, for å mine, utlede og korrelere dem med den iboende biologiske informasjonen. I et ord krever behovet for standardisering og systematisk analyse av heterogene eksperimentelle datasett et ontologisk rammeverk.

Tilpasse modeller
Organs-on-chip-teknologi er egnet for personalisering¹², siden celler og vev fra enkeltpasienter (eller pasientklasser) kan brukes i enhetene under kontrollerte forhold, noe som fører til klinisk relevante avlesninger, nyttige for å informere terapeutiske eller forebyggende strategier. Noen eksempler begynner å dukke opp i litteratur⁹⁰. Selvfølgelig, for tumor-on-chip-modeller, stiller denne utfordringen flere tekniske og vitenskapelige spørsmål som skal løses³⁶ (som TME-egenskaper som oksygenkonsentrasjon, cytokingradienter osv.). Det er viktig at utsiktene til å gjøre onkologi- og onkoimmunologibehandlinger mer effektive samtidig som skadelige effekter reduseres for hver pasient, er attraktive, fra et livskvalitetsperspektiv som for optimalisering av helseressurser.

Avslutningsvis er det tydelig at dette feltet er autentisk tverrfaglig, og som sådan krever det en stor innsats for å etablere et felles språk og felles mål mellom forskere, klinikere, industri, men også fra ulike disipliner (ingeniørfag, biologi, datavitenskap, medisin, kjemi) å finne god balanse og nye løsninger⁹¹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator