Mikrofluidiska samkulturmodeller för dissekering av immunsvaret i in vitro-tumörmikromiljöer

Summary

I en tid av immunterapi och encellsgenomisk profilering kräver cancerbiologi nya in vitro- och beräkningsverktyg för att undersöka tumör-immungränssnittet i ett korrekt spatiotemporalt sammanhang. Vi beskriver protokoll för att utnyttja tumörimmuna mikrofluidiska samkulturer i 2D- och 3D-inställningar, kompatibla med dynamisk, multiparametrisk övervakning av cellulära funktioner.

Abstract

Komplexa sjukdomsmodeller kräver banbrytande verktyg som kan leverera fysiologiskt och patologiskt relevanta, handlingsbara insikter och avslöja annars osynliga processer. Avancerade cellanalyser som nära efterliknar in vivo-landskap etablerar sig som nya sätt att visualisera och mäta det dubbelriktade tumör-värdsamspelet som påverkar utvecklingen av cancer. Här beskriver vi två mångsidiga protokoll för att återskapa mycket kontrollerbara 2D- och 3D-samkulturer i mikroenheter, som efterliknar komplexiteten hos tumörmikromiljön (TME), under naturlig och terapiinducerad immunövervakning. I avsnitt 1 tillhandahålls en experimentell inställning för att övervaka överhörning mellan vidhäftande tumörceller och flytande immunpopulationer, genom tidsfördröjningsmikroskopi i ljusa fält. Som ett applikationsscenario analyserar vi effekterna av anti-cancerbehandlingar, såsom de så kallade immunogena cancercelldödsinducerarna på rekrytering och aktivering av immunceller. I avsnitt 2 monteras 3D-tumörimmuna mikromiljöer i en konkurrenskraftig layout. Differentiell immuninfiltration övervakas med fluorescensbilder upp till 72 timmar för att utvärdera terapeutiska kombinationsstrategier. I båda inställningarna illustreras bildbehandlingssteg för att extrahera en mängd immuncellsparametrar (t.ex. immuncellsmigration och interaktion, svar på terapeutiska medel). Dessa enkla och kraftfulla metoder kan skräddarsys ytterligare för att simulera TME:s komplexitet som omfattar heterogeniteten och plasticiteten hos cancer-, stroma- och immuncellssubtyper, samt deras ömsesidiga interaktioner som drivkrafter för cancerevolution. Överensstämmelsen hos dessa snabbt utvecklande tekniker med levande celler med hög innehållsavbildning kan leda till generering av stora informativa dataset, vilket ger upphov till nya utmaningar. Faktum är att triangeln "samkulturer/mikroskopi/avancerad dataanalys" anger vägen mot en exakt problemparametrisering som kan hjälpa skräddarsydda terapeutiska protokoll. Vi förväntar oss att framtida integration av cancerimmun on-a-chip med artificiell intelligens för bearbetning med hög genomströmning kommer att synergisera ett stort steg framåt för att utnyttja kapaciteten som prediktiva och prekliniska verktyg för precision och personlig onkologi.

Introduction

Utvecklingen av olika grenar av medicin som experimentella discipliner har varit beroende av förmågan att manipulera cellpopulationer och organfunktioner under kontrollerade förhållanden¹. Sådan förmåga har sina rötter i tillgången på mätbara modeller som kan rekapitulera processer som händer i vår kropp.

I en tid av immunterapi och encellsgenomisk profilering 2 måste cancerbiologi dra nytta av framväxande in vitro- och beräkningsmodeller för att undersöka tumör-immungränssnittet i ett korrekt spatiotemporalt sammanhang ^2,3.

Tumörmikromiljö⁴ (TME) är en komplex vävnad där cancerceller kontinuerligt interagerar och dynamiskt samutvecklas med de andra cellulära (immun-, stroma- och endotelcelluella) och icke-cellulära (den extracellulära matrisen, ECM) komponenterna. Den dynamiska naturen i detta komplexa landskap dikterar huruvida immunceller spelar som vänner eller fiender till maligna celler, vilket starkt påverkar både sjukdomsprogression och svar på terapi. Numera konvergerar stora ansträngningar från onco-immunologer, bioinformatiker och systembiologiexperter för att ta itu med den kliniska betydelsen av cancerheterogenitet 5,6, antingen i utrymmet (dvs. i distinkta tumörregioner) och tid (dvs. vid distinkta tumörprogressionsstadier)^5,6, och för att karakterisera cancer och immuncellsfenotyp och funktion på encellsnivå. Som ett exempel på denna synergi används nu avancerade datorseende tekniker rutinmässigt för rumslig kartläggning av immuninfiltrat i histologiska prover ^7,8.

På framsidan av experimentella modeller, överbryggande djurstudier och traditionella in vitro-metoder, ger framsteg inom mikrofluidik och samodlingstekniker tillgång till olika klasser av mikrokonstruerade cellulära modeller såsom organoider, mikrofysiologiska system ^9,10,11 (MPS) och organ-on-chip^12,13,14 (OOC). De delar det gemensamma draget att zooma in den "stora bilden" av de cellulära ekosystemen och utöka in vitro-potentialen för att kontrollera mikromiljöfaktorer samtidigt som de utnyttjar mikroskopi¹⁵ med högt innehåll och bildbehandlingsmetoder.

Numera har state-of-the-art- MPS- och OOC-system börjat inkludera immunologiska aspekter , som innehåller olika subtyper av immunceller i befintliga vävnader och samkulturer, så att utforska och mäta en mängd olika processer som inflammatoriska sjukdomar, sårläkning, slemhinneimmunitet och svar på toxiner eller dagliga livsmedelsprodukter¹⁶. TME-on-a-chip modellerna 10,11,12,13,14,15,16,17, även de integrerade med perfuserbara mikrokärl 18,19,20,21, har utvecklats för att undersöka celltypsberoende interaktioner, fysikaliska och kemiska störningar och cytotoxiska aktiviteten hos Infiltrerande lymfocyter²², såväl som kliniskt relevanta immunmodulerande medel²³.

Här tillhandahåller vi mångsidiga protokoll, som sträcker sig från laddning av celler i chips till bildbehandlingsverktyg, för att utnyttja avancerade tumörimmuna mikrofluidiska samkulturer i 2D (avsnitt 1) och 3D (avsnitt 2) inställningar¹⁶, kompatibla med dynamisk, multiparametrisk²⁴ övervakning och visualisering av cellulära funktioner. Detta uppnås med bibehållen användarvänlighet och flexibilitet både i provhantering och dataanalys, med fördel av Fiji freeware-programvara och dess verktygslådor^25,26.

Den mikrofluidiska anordningen, som beskrivs i avsnitt 1, är utformad för att utföra 2D-samkulturer av vidhäftande cancer och flytande immunceller. Denna plattform validerades för in vitro-mätning av immuncellsbeteende i närvaro av genetiska mutationer²⁷ och/eller immunbrist²⁸. Här illustrerar vi steg för att spåra immunceller i time-lapse ljusfältsbilder genom att utnyttja en halvautomatisk metod baserad på Trackmate (ett plugin implementerat i Fiji-programvaran). Denna procedur möjliggör extraktion av kinematiska deskriptorer av immunmigration ²⁹ och respons (dvs. interaktionstider) för att rikta cancerceller, behandlade eller inte med immunogena celldödsinducerare²⁷.

Viktigt är att dessa parametrar, extraherade från tidsseriebilder, kan bearbetas med avancerade matematiska maskiner. Som ett exempel på potentialen i detta tillvägagångssätt publicerade våra grupper nyligen en analys baserad på matematiska metoder från stokastiska processer och statistisk mekanik för att modellera cellulära nätverksegenskaper och ge en parametrisk beskrivning av immuncellsbeteende (dvs. partisk eller okorrelerad slumpmässig gång, mycket eller inte samordnad rörelse^30,31).

3D-inställningen, som tillhandahålls i det andra avsnittet, är baserad på ett samodlingsprotokoll för att återskapa mer komplexa immunkompetenta TME inbäddade i två gelregioner med olika kombinationer av celltyper och läkemedel på ett konkurrenskraftigt sätt. Här beskrivs bildbehandlingssteg för att vid olika tidpunkter mäta infiltrationen av färgade immunceller i humana A375M-melanomceller odlade inom Matrigel, för att utvärdera kombinationer av antitumörmedel³². A375M-linjen, en A375P-härledd cellinje kännetecknad av en mycket metastatisk fenotyp valdes för att utvärdera deras metastatiska förmåga i närvaro av immunceller³².

De beskrivna modellerna kan vara helt kompatibla med olika cellkällor (murina och humana odödliga eller primära cellinjer, organoider, xenotransplantat, bland andra). I nyligen genomförda studier av vårt laboratorium, genom att kombinera höginnehållsvideomikroskopi med bildanalys, tillämpades den konkurrenskraftiga 3D-layouten för att undersöka: i) ett antitumöralt (antikroppsberoende cellmedierad cytotoxicitet, ADCC) immunsvar och dissekera fibroblasternas roll i resistens mot trastuzumabbehandling i HER2 ⁺ bröstcancer on-chip-modeller³³; ii) verkan av myeloida celler (dvs cancerassocierade makrofager) i mekanismer för tumörflykt och rekrytering av T-celler³⁴; iii) effekten av immunterapeutiska regimer, specifikt baserade på interferon-α-konditionerade dendritiska celler (IFN-DCs), odlade med läkemedelsbehandlade koloncancerceller i kollagenmatriser, och för att utvärdera effektiv rörelse och efterföljande fagocytoshändelser³⁵; iv) den kemotaktiska migrationen av benmärgshärledda eosinofiler mot IL-33-behandlade eller obehandlade melanomceller³⁶.

Dessa avancerade modeller kan fungera som observationsfönster för att förstå immunkontexturens roll i cancermetastaser och resistensmekanismer, men ansträngningar krävs för att översätta fynd till klinikerna och stänga klyftan med grundforskning³⁷.

Som ett framväxande scenario öppnar utnyttjandet av kraften i automatiserad mikroskopi med högt innehåll i kombination med användningen av mer fysiologiskt relevanta mikrosystem nya potentiella utmaningar för hantering, bearbetning och tolkning av hundratals, och till och med tusentals, gigabyte multiparametriska data, som kan genereras från en enda experimentell kampanj. Detta innebär en direkt koppling av OOC-experiment med artificiell intelligens 38,39,40,41,42 (AI)-baserade algoritmer både för avancerad automatiserad analys och generering av funktioner som i sin tur kan matas in silico-modeller av cancer-immun samspel⁴³, med spännande nya tillämpningar vid horisonten^, såsom utveckling av prediktiva läkemedelsscreeninganalyser ⁴⁴.

Ett ständigt växande flöde av insatser är inriktat på design av sjukdomsmodeller tillsammans med optimering av strategier för att implementera storskaliga störningsskärmar med encelliga multi-omics-avläsningar. Detta kommer utan tvekan att bidra till utvecklingen och, förhoppningsvis, det kliniska genomförandet, åtföljt av en lämplig grad av metodstandardisering, av en systematisk onkoimmunologi-on-a-chip-strategi för att få nya insikter om immunsjukdomar och mekanismer för spridning av cancer.

Protocol

1. Chipdesign för vidhäftande och flytande celler 2D-samkulturer

2D-samkulturlayouten (figur 1A-C) kännetecknas av tre kammare (100 μm höga) sammankopplade med två uppsättningar mikrokanalmatriser (500 x 12 x 10 μm³, L×W×H). Mellankammaren bildar två slutna återvändsgränder som blockerar flytande immunceller som flödar över i tumörstället under laddningssteg 2.5. Denna enhetstyp är användbar för tvådimensionella mätningar i realtid av encellsmotilitet (antingen vidhäftande eller flytande) och av cell-cellinteraktioner 16,27,28,30,31. En typisk cellmigrationsstudie (utförd från flera timmar till flera dagar) kombinerar levande cellmikroskopi med bildbehandlingsalgoritmer⁴⁵ för att översätta de förvärvade bildsekvenserna till numeriska funktioner²⁵. Baserat på migrationsmönstren kan flera biofysiska indikatorer uppskattas, såsom cellernas förskjutning och hastighet, samt varaktigheten av immuncells- och målcellsinteraktioner²⁴.

1. Beredning av cancer och PBMC-celler
   1. Odling av cancerceller
      OBS: MDA-MB-231 trippelnegativ [östrogenreceptor (ER)-, progesteronreceptor (PR)- och human epidermal tillväxtfaktorreceptor 2 (HER2)-] humana adenokarcinomceller i bröst odlas rutinmässigt i ett Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium kompletterat med 10% (v / v) fetalt bovint serum (FBS), 2 mM L-glutamin, 100 IE ml-1 penicillin G natriumsalt och 100 μg ^ml-1 streptomycinsulfat (tillväxtmedium), under standardodlingsförhållanden (37 °C och 5 %_CO2).
      1. För att optimera cellodlingstillväxten, platta MDA-MB-231-celler i 75 cm² kolvar med en densitet av 1 × 10⁶ celler ^ml-1 i 12 till 15 ml tillväxtmedium.
      2. När cellerna når 75-80% av sammanflödet, kassera tillväxtmediet, tvätta cellerna med förvärmd fosfatbuffrad saltlösning (PBS) för att helt avlägsna FBS och lossa dem sedan med förvärmt trypsin (1 till 2 min vid 37 ° C).
      3. Lägg till tillväxtmedium för att inaktivera trypsin enzymatisk aktivitet och samla fristående celler. Tvätta cellerna två gånger i 5 minuter vid 1 100 x g vid rumstemperatur (RT).
      4. Räkna celler i ett cellräkningsglas med hjälp av Trypan Blue-färguteslutningstest och sätt sedan tillbaka dem antingen för underhållskultur (för högst 6 passager från upptining) eller för experimentella förfaranden.
      5. För mikrofluidiska experiment, frö 1 × 10⁶ celler i 6-brunnsplattor i 3 ml tillväxtmedium och behandla antingen med 25 μM doxorubicin (DOXO) eller en lika stor volym DOXO-lösningsmedel (PBS) som kontroll.
      6. Fyra till 6 timmar efter, tvätta DOXO-behandlade celler två gånger med förvärmd PBS i 5 minuter vid 1 100 x g vid RT.
      7. Räkna DOXO-behandlade och PBS-behandlade kontrollceller enligt ovan (se steg 1.1.1.5) och ställ in samkulturen med mononukleära celler i perifert blod (PBMC) i mikrofluidiska enheter.
   2. PBMC-isolering
      1. Samla venöst helblod (ca 10 ml) från friska frivilliga i hepariniserade injektionsflaskor och blanda försiktigt genom att invertera röret 2 till 4 gånger⁴⁷.
      2. Späd blod 1:1 med PBS och skikt över 10 ml densitetsgradientmedium Lymphoprep i ett 50 ml rör.
         OBS: Se till att göra skiktningen mycket försiktigt och långsamt för att låta blod och lymfoprep bilda två distinkta lager.
      3. Centrifugera rören i 30 minuter vid 400 x g vid 4 °C i en utsvängbar skopa utan bromsar. Fyra distinkta skikt kommer att bildas: (i) plasma på toppen, (ii) ett vitt och grumligt lager innehållande PBMC, (iii) Lymphoprep, och (iv) en pellet av erytrocyter och granulocyter.
      4. Aspirera försiktigt PBMC med en 2 ml pipett och suspendera omedelbart i varmt tillväxtmedium (samma som används i steg 1.1.1) och tvätta två gånger i 5 minuter vid 1 100 x g vid rumstemperatur.
      5. Räkna pelleterade PBMC enligt ovan (se steg 1.1.1.5) och använd dem antingen för experimentella förfaranden eller frys för långtidsförvaring.
2. Plätering av cellerna i 2D-chips
   PBMC är inte färgade i detta protokoll. För att karakterisera specifika fenotyper på chip kan immuncellssubpopulationer isoleras genom immunomagnetiskt pärlval, färgas med fluorescerande cellspårare, blandas om med den omärkta återstående fraktionen och därmed konfronteras med målcancerceller, vilket rapporterats i on-chip-experimenten, beskrivna i Vacchelli et ^al.27 och i Racioppi et ^al.34.
   1. Innan samodlingsexperiment påbörjas och för att underlätta tillsats av reagens, aktivera lagrade chips genom en syreplasmabehandling i några sekunder. Fyll omedelbart reservoarer med avjoniserat vatten eller PBS för att hålla PDMS (polydimetylsiloxan) ytor hydrofila tills pläteringssteg.
      PDMS är i sig hydrofobt, vilket kan leda till svårigheter att använda och fånga luftbubblor i mikrokanaler. Se steg 7 i den kompletterande filen med information om aktivering av syreplasma.
   2. Sterilisera under ett UV-skåp i 20 minuter, tvätta 2-3 gånger med färsk PBS och inkubera sedan med odlingsmedia i 1 timme. Håll chips i inkubatorn tills du utför pläteringssteg.
   3. Dra ut överflödigt media från alla sex reservoarerna. Var noga med att undvika att suga upp media från de viktigaste kulturkamrarna.
   4. Applicera långsamt 1 × 10⁵ cancerceller resuspenderade i 10-20 μL tillväxtmedium i den övre vänstra behållaren och sedan i den nedre brunnen (figur 1A, reservoar 1 och 2). Vänta 5 minuter för att låta cellerna fästa i tumörkammaren. Vissa celler kommer att bosätta sig och fästa i behållarna.
      OBS: Sätt i mobilupphängning bredvid kanalöppningarna. Denna procedur tillämpas på MDA-MB-231 cancerceller, andra linjer kräver celldensitetsoptimering. För att förbättra cancercellbindningen kan en beläggningsfunktionalisering av ytor (t.ex. poly-L-lysin, fibronektin) utföras. Se tidigare publicerade protokoll för beläggningssteg¹⁶, ^48,49,50.
   5. På höger sida återsuspenderas försiktigt pip 1 × 10⁶ PBMC i 50 μL odlingsmedium i brunnarna 3 och 4 (se figur 1A, reservoarerna 3 och 4).
      OBS: Efter flytning kommer PBMC att distribueras in i mellankammaren och skapa en "front", som representerar utgångspunkten för experimentet.
   6. Fyll alla sex reservoarerna med upp till 100-150 μL odlingsmedium. Kontrollera under ett mikroskop att cellerna har fördelat sig korrekt i odlingsfacken enligt figur 1D-E. Slutliga volymer kan variera med reservoarernas storlek. Justera volymerna så att de är lika i alla brunnar.
   7. Placera chipsen tillbaka i inkubatorn i cirka 1 timme för att stabilisera systemet före timelapse-registrering. Tillsätt färskt medium var tredje dag, eftersom det kan utsättas för avdunstningsförluster.
      OBS: Systemet är kompatibelt med både levande / dödcellsanalys och dynamisk multiplexcytokinsekretionsprofilering från konditionerade medier. För kemokinanalyser kan upp till 200–250 μl alikvoter av supernatanter vara tillgängliga genom att samla in media från de två reservoarerna i varje avdelning. Klassiska ELISA- och Luminex-cytokinprofileringsanalyser kräver cirka 50 μL supernatanter. Se ^51,52 exempel på studier av andra laboratorier som utför cytokinprofilering på OOC-modeller.
3. Time-lapse förvärv av omärkta cancer- och immunceller
   OBS: Vanligtvis är 3 chips anordnade på ett enda mikroskopglas (se figur 1A för 2D-chip och figur 4B för 3D-chip). Med hjälp av scenhållare som fördelar 4 bilder kan samkulturer vara lämpliga att övervakas med automatiserad mikroskopi med högt innehåll för att analysera stora satser av experimentella förhållanden. Chips kan enkelt monteras på objektglas med tjocklek lika med 1 mm eller 170 mikron (plast- eller glastäckglas, 6-brunns optiska bottenbrunnar) för högupplöst konfokal avbildning.
   1. Spela in ljusfältsbildserier av omärkta celler med hjälp av en videomikroskopiuppsättning utrustad med ett inkubationssystem.
      OBS: Här förvärvades tidsseriedataset (tidsfönster: 48 timmar, bildhastighet: 2 min) med ett fluorescensmikroskop, utrustat med ett 4x mål och CMOS 1,3 M pixlar, optimerade för att passa in i en standard cellodlingsinkubator.
   2. Värm upp mikroskopet i minst 2 timmar för att uppnå jämvikt till 37 °C och 5%_CO2 innan förvärvet påbörjas.
   3. Välj observationsfönstret genom att centrera mikrokanalmatrisen mellan tumören och det centrala facket. Detta gör det möjligt att visualisera dynamiken i immuninfiltration och interaktionerna inom regionen där cancerceller såddas.
   4. Justera belysningsintensiteten och fokusen hos cancer och immunceller.
   5. För att starta time-lapse-förvärv, optimera bildhastighet och tidslängd enligt experiment och celltyp som studeras.
      Bildförhållandena måste optimeras för att undvika överdriven fotoexponering samtidigt som ett bra signal-brusförhållande (SNR) bibehålls. Eftersom immunceller är mycket rörliga måste förvärvsbildfrekvensen vara tillräckligt hög för att följa den dynamiska processen av intresse och möjliggöra enkel spårning⁵³. En kompromiss bör nås mellan spårningsalgoritmen, kompatibiliteten med storleken på den resulterande datauppsättningen och livskraften, densiteten och rörligheten hos observerade celler.
   6. I slutet av tidsfördröjningen, använd funktionen Importera bildsekvens och Spara som från ImageJ-programvaran för att konvertera ramdatauppsättningen i en 25 fps okomprimerad videofil.
      Den genererade videofilen är nu klar för cellspårningsanalys. Här samlades RGB-bilder (1280x1024 pixlar) in med en rumslig upplösning på 1,33 μm/pixel. En film med 24 timmars varaktighet (3,5 GB stack) med ett enda synfält (FOV) består av 720 bilder för varje villkor.
4. Dataanalys: Halvautomatisk extraktion av omärkta immunspår av Trackmate
   OBS: Här utförs immunmotilitetsanalys i 2D omärkta time-lapse-bilder med TrackMate⁵⁴, en verktygslåda med öppen källkod som finns i Fiji/ImageJ-programvarupaketet (https://imagej.nih.gov/ij/). Flera algoritmer tillhandahålls för att utföra automatiserad spårning av enstaka partiklar⁵⁵(SPT) av fläckliknande strukturer. De har applicerats effektivt på fluorescerande bilder, där objekt är ljusa över en mörk bakgrund med hög SNR (dvs. fluorescerande fläckar med underupplösning, märkta trafikvesiklar, kärnor)^{1,25,56,57,58}. SPT baseras huvudsakligen på två sekventiella steg. Först lokaliseras objekt med identifierade positioner i flera ramar (segmentering), som schematiseras iFigur 2. I det andra steget (partikellänkning) länkas detekterade fläckar över på varandra följande ramar för att uppskatta rörelse och rekonstruera deras banor i form av ett spår (Figur 3). Numeriska geoobjekt kan beräknas från varje extraherad X-, Y- och Z-koordinatmatris över tid. Utökad dokumentation redovisas i⁵⁴såväl som online (http://imagej.net/TrackMate), enligt självstudiekursen Komma igång med TrackMate. Processens noggrannhet kan inspekteras omedelbart och hantera ett intuitivt grafiskt användargränssnitt (guideliknande GUI) som gör det möjligt för användare att i varje steg justera inställningarna. Följande del visar kortfattat hur man använder Trackmate för bildbehandlings- och kvantifieringssteg, tillämpade på bilder i synligt ljus:
   1. Dra och släpp heltidsvideo- / bildstacken i Fiji-verktygsfältet.
   2. Inställning av kalibreringsstack (bild 2A).
      1. Kontrollera dimensionaliteten och tilldela bildegenskaperna genom att välja Bild> Egenskaper. Rutorna Fyll i längdenhet, pixeldimensioner och ramintervall.
         Anmärkning: För att utföra kalibreringen, använd mikrokanalernas kända längd (500 μm, figur 1C) och dividera med motsvarande uppmätta längd i pixlar. För 2D-tidsserier, se till att byta Z/T-fält och ange 1 som z-segment och rätt antal filmrutor. Om det inte görs kommer Trackmates kvantitativa utdata och parametrar att rapporteras i pixelenheter och tidsramar.
   3. Förbehandling av bilder.
      1. För att förbättra korrekt diskriminering av immunceller från en bullrig bakgrund, förbehandla ljusfältbilder för att kompensera artefakter. Kontrollera att datauppsättningar består av 8-bitars TIFF-bilder (intensitetsområde: 0–255).
         Ojämn belysning, låg SNR och kontaminering av små skräppartiklar i bilder i synligt ljus kan äventyra framgången för en cellspårningsprocess. Här förbehandlas tidsseriedataset genom bakgrundssubtraktion, justeringsfunktion för ljusstyrka / kontrast och genom lokal bildsubtraktion av en gaussisk oskärpa från originalbilder. Det finns andra olika analysverktyg tillgängliga i ImageJ för bearbetning och segmentering av faskontrast- eller ljusfältsbilder, inklusive Empirical Gradient Threshold (EGT)⁵⁹.
   4. Första kalibreringspanelen (bild 2A)
      1. Med bildstacken vald, starta Trackmate (Plugins >Tracking).  Revidera/bekräfta dimensionaliteten och tidsfönstret för data (dvs. pixelbredd och ramintervall).
         OBS: TrackMate läser automatiskt i rutan för bildegenskaper för att ge de slutliga spårningsresultaten i kalibrerade fysiska enheter (dvs. μm och minuter).
      2. Definiera en region av intresse för att beräkna extraheringen av immunspår genom att manuellt infoga värden eller genom att rita ett stängt område över den aktiva bilden och sedan trycka på knappen Uppdatera källa. För att extrahera globala immunmigrationsvägar, välj rektangulära regioner på höger sida av mikrokanaler (central kammare, figur 1E) respektive till vänster (tumörkammare, figur 1D). Om du vill analysera interaktioner mellan cancer och immun-hotspots ritar du cirkulära underregioner med hjälp av ROI-verktyg (gå till Redigera → urval → ange).
         OBS: När du kör den här verktygslådan för första gången på en ny biologisk applikation, spendera nödvändig tid för att optimera inställningarna för att rekonstruera spåren.
         OBS: Utför manuell spårning av cellbanorna (cirka 50-100 celler) för att empiriskt hitta rätt konfiguration och nästa för att validera som riktmärke tillförlitligheten för automatisk extraktion av rörelser. Arbeta dessutom initialt på ett mindre område för att enkelt kontrollera noggrannheten hos de valda parametrarna.
   5. Detektionssteg för immunfläckar (figur 2B)
      1. Välj standarddetektorn Laplacian of Gaussian (LoG). LoG-detektorn arbetar för att hitta ljusa, blobliknande, runda objekt och applicera ett Laplacian of Gaussian-filter på bilden inställd för mellanliggande spotstorlekar (5 till 20 pixlar i diameter).
      2. I Uppskattad blobdiameter (här 10–13 μm) anger du ett värde som är något större än den förväntade dekorfärgen. Öka tröskelvärdet (här 1-3 μm) tills extra falska bakgrundsfläckar minskas, eventuellt utan att ta bort objektfunktionerna. Identifieringar under tröskelvärdet (baserat på ett kvalitetsmått) ignoreras från efterföljande analys. Markera rutan för medianfilter och lokalisering av delpixlar för att förbättra kvaliteten på punktdetektering.
      3. Använd knappen Förhandsgranska för att visa och snabbt inspektera identifierade immunceller överlagrade på bilderna med magentafärgade cirklar.
         OBS: Fel under identifieringen kommer att ha en betydande inverkan på länkningsprocessen. Andra oönskade identifieringar kan korrigeras i de efterföljande menyerna med användardefinierade filter (dvs. efter punktintensitet, storlek eller position).
   6. När du är nöjd med valen trycker du på Nästa.
      Dessa inställningar kan variera beroende på experimentella inställningar och bildtagningsmetoder (t.ex. FOV, objektivförstoring, ljusfält eller fluorescerande bilder), celltyp (vidhäftande eller flytande celler), från långsam eller snabb rörlighet, typ av cellulärt beteende (interagerar eller inte) och låg / medium / hög densitet i observationsområdet.
   7. Fortsätt och hoppa över menyn Initial Thresholding. Välj fönstret Hyperstack Displayer.
   8. Ställ in filter på spotpanelen (bild 2C).
      1. Välj: Enhetlig färg. Filter som visas i figur 2C kan läggas till för att behålla märkta dekor med funktionsvärden som visas i ett histogram över eller under ett reversibelt tröskelvärde.
   9. Urvalssteg för spårare (figur 3A). Välj Simple LAP-tracker, som partikellänkningsalgoritm som ber om tre fält att fylla i (i det här fallet "Linking max distance": 30-50 μm, "Gap-closing max distance": 25-50 μm, "Gap-closing max frame gap": 4-6). Denna detektor hanterar gap-stängningshändelser, med kostnadslänkningsberäkning enbart baserat på deras respektive avstånd.
      OBS: Det maximalt tillåtna länkavståndet begränsar det rumsliga sökområdet för kandidatmatchningspunkter, vilket motsvarar den maximalt tillåtna förskjutningen mellan två efterföljande ramar (figur 3D).
      1. Ge större värden för maximal förskjutning när fragmenteringen av spår av mycket rörliga partiklar märks.
         Två länkar kommer inte att anslutas om ramen-till-ram-rörelsen är större än det angivna maximala avståndsvärdet. Om segment överbryggar dåligt två olika celler, minska värdet på maximal förskjutning.
      2. Försök att återansluta saknade fläckar, variera värdena för "det maximala avståndet för stängning av gap" och "det maximala ramgapet".
         Dessa parametrar hanterar gapstängningshändelser i icke-angränsande ramar. Fläckförsvinnande kan inträffa för vissa bildrutor (dvs. partiklar utanför fokus, celler som utelämnas och i synfältet, segmenteringsfel i en bullrig bild).
         OBS: För att hantera delnings- eller sammanslagningshändelser, välj LAP-länkare som detektor som introducerar länkande kostnadsmatrisstraff.
   10. Klicka på Nästa för att köra spårningsberäkningen. Tryck på Nästa.
   11. Panelen Filtrera spår (bild 3B). Ändra färgen på immunbanor genom att välja "Spår-ID" eller andra spårfunktioner i rullgardinsmenyn. Nu väljer du att ställa in interaktiva filter funktionella, för att förbättra kvaliteten på resultatet och se över proceduren.
       OBS: Falska fläckar uppstår från brus i bilden och förlust av funktionskvalitet. Detta kommer att generera korta segment medan celler av intresse kan spåras över många ramar.
       1. För att ta bort korta banor, försök att filtrera ut, baserat på antalet fläckar de innehåller. Sortera dessutom spår med en kombination av alternativ som spårförskjutning, spårvaraktighet eller minimal/medel/maximalhastighet för att utesluta falska eller oönskade spår (med färre bildrutor i förhållande till den totala tidsfördröjningens varaktighet eller med smutsiga eller inte rörliga partiklar) från vidare efterbehandling.
          OBS: Valet av filter kan variera beroende på den specifika applikationen och det biologiska systemet.
   12. Undersök alla spår i gränssnittet Visningsalternativ, bläddra igenom tiden och kontrollera hur exakt spåren matchar cellmigreringsvägarna. Rullgardinsmenyn innehåller färgkoder för dekor och banor för enkel visualisering och filtrering efter flera modaliteter (t.ex. kinetiska parametrar, intensitet, tidsmässig eller rumslig position).
       OBS: För att spåra högdensitetskulturer eller högrörliga celler, öka förvärvsbildhastigheten och minimera cellförskjutningen som reste i på varandra följande tidsintervall.
   13. Manuell korrigering av segmenterings- och länkfel (figur 3E).
       1. För att ytterligare förbättra kvaliteten på resultaten, redigera manuellt fläckar (skräppartiklar, stationära celler) och ta bort felaktiga spår som härrör från detekterade tumörgränser vid analys av tumör-immuninteraktions-ROI.
       2. Välj först verktyget TrackMate i verktygsfältet ImageJ. För att eliminera en befintlig plats i hela stacken, tryck på skift och skapa med muspekaren en ROI-mask över målpunkten (redigerad i en grön cirkel) och tryck sedan på DEL-tangenten.
       3. För att lägga till en ny plats (om spår saknas på grund av att fläckar försvinner) trycker du på A-tangenten och lägger musen på den spetsiga platsen. Upprepa beräkningsprocessen för spårlänkning efter det här steget.
   14. När du är nöjd väljer du Analys på panelen Visningsalternativ för att generera tre textfiler (bild 3C och 3F). Tabellen i "Fläckar i spårstatistik" ger de spatiotemporala koordinaterna för immunfläckar (X-Y-Z-positioner för cellerna märkta med tillhörande ram och spårnummer). "Länkar i spårstatistik" och "Spårstatistik" innehåller information om spåren: spårlängd, antal upptäckta luckor eller fläckar, spårets initiala och stoppram etc. Spara och exportera för varje datauppsättning.
       OBS: När du klickar på en rad i resultatfönstren aktiveras respektive plats, länk eller spår i time-lapse-videon för visuell inspektion. Upprepa filtreringsstegen för att välja/ta bort spår. Alla framtida exporterade data kommer att uppdateras. TIPS: Spåra initiala och stoppram- och spårvaraktighetsvärden kan utnyttjas för att beräkna tider för kontakt mellan cancer och immunceller vid bearbetning av ROI för interaktion.
   15. Tryck på knappen Spara för att generera en resulterande XML-fil som innehåller alla parametervärden, sökvägen till bilder och dekorpositionerna i tid. Kommandot '' Ladda TrackMate-fil '' (Plugins > Tracking) återställer hela processsessionen för varje filmfil individuellt.
   16. Gå till den sista panelen i det grafiska användargränssnittet som heter Välj en åtgärd. I listan använder du funktionen Captureoverlay > Execute för att producera en video med spår överlagrade. TIPS: Alternativet "Plot N-spots vs time" kan användas för att beräkna den rumsliga densiteten hos immunceller i en ROI (figur 6B, höger panel).
   17. Efterbehandlingsanalys och migreringsstatistik
       1. Analysera råa positionsdata direkt i Trackmate eller exportera data för att beräkna omfattande kinetiska parametrar²⁹ (dvs. total banlängd, euklidisk distans, inneslutningsförhållande, medelkvadratförskjutning⁵⁶, genomsnittlig eller momentan spårhastighet, stoppkoefficient, fördelning av migrationsvinklar, framåtmigrationsindex, genomsnittlig linjär hastighet) för att klassificera immuncellsmigrationsbeteende (t.ex. riktad eller diffusiv rörelse^{30, 31}) och svar på målcancerceller (t.ex. behandlad vs kontroll).
          OBS: Ytterligare användbara plugins som The Chemotaxis and Migration Tool (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) tillhandahåller olika grafer (t.ex. Rose eller sektordiagram, som visas i figur 6) och statistiska tester för avancerad analys och visualisering av experimentell migration och kemotaxidata. Att kombinera cellspårnings- och cellsegmenteringsalgoritmer^24,25,45 kan möjliggöra mätningar av morfologiska metriker på encellsnivå (dvs. cellytan^, huvud- och mindre axellängd och cellbildförhållandet).

2. 3D-immunkompetent cancer-on-chip-modell i en konkurrenskraftig analys

OBS: 3D-chipdesignen, som visas ifigur 4, består av 5 huvudfack: en central för det flytande immuncellsintaget, två sidoregioner för inbäddning av tumörceller i  hydrogelmatriser (150-250 μm höga) och mediaperfusionskammare. Immun- och tumörkammare är förbundna med två uppsättningar smala matriser av mikrokanaler (200×12×10 μm³, L×W×H, Figur 4E). Regelbundet fungerar 100 μm fördelade trapetsformade likbenta mikropelare (cirka 25–30 gränssnitt för varje sidogelregion, figur 4C) som barriärer för att begränsa gellösningen under injektion och utnyttjar balansen mellan ytspänning och kapillärkrafter^60,61 och ansluter tumörregioner till de två laterala ytterligare mediekamrarna för att ställa in ett gel-vätskegränssnitt (figur 5). De detaljerade egenskaperna hos 3D-kompetitivanalysen visas i figur 4. Preferensmigration av immunceller mot de två hydrogelfack som är värd för tumörceller som har genomgått olika behandlingar kan övervakas och kvantifieras. Den speciella konkurrenslayouten kan tillämpas för att undersöka en uppsjö av olika cancerbiologiska fenotyper (t.ex. läkemedelsresistenta vs aggressiva, primära eller metastatiska, responders vs non-responders). Dessutom kan de gelinbäddade regionerna enkelt integreras med olika cellpopulationer för att återskapa mer heterogena TME, inklusive stromakomponenter (fibroblaster, endotelceller)²³ eller för att simulera specifik immunsuppressiv miljö³⁴ (t.ex. makrofager) för dissekeringsmekanismer för läkemedelsresistens och tumörundvikande.
OBS: Nukleär och aktiv kaspasfärgning, genom att använda kommersiella kit för levande / döda analyser (t.ex. Thermo Fisher Scientific, Incucyte reagens), kan implementeras för att bedöma mitotiska eller apoptotiska dödshändelser, som rapporterats i Nguyen et ^al.33.

1. Beredning av matrislösning med celler och Laddning i enheten
   OBS: I följande experimentella miljö innehåller de två gelregionerna blandningar av humana A375M-melanomcellinjer, odlade i matrislösning (t.ex. Matrigel), exponerade för terapeutiska medel som används som monoterapi eller i kombination. Denna inställning gjorde det möjligt för oss att utvärdera effekten av en kombination av två läkemedel med avseende på enskilda på ett konkurrenskraftigt sätt och att kvantifiera deras förmåga att attrahera PBMC.
   1. Avfrostning av en matrislösning (t.ex. matrigel) genom att lägga på is i ett kylskåp på 4 °C en dag före experimentet.
      OBS: Utsätt inte produkten för flera frys-tina cykler eftersom den blir "klumpig". Andra syntetiska eller naturliga hydrogelprotokoll kan vara lämpliga att använda i denna inställning. Se ^33,34,35 för beredning av cancerceller i kollagenmatriser.
   2. Resuspendera humana melanomceller från A375, färgade med levande kompatibel PKH67 Green Fluorescent Cell Linker i matrislösning (2 mg ^ml-1). Om indicerat, tillsätt 5-aza-2'-deoxicytidin (DAC; 2,5 μM), benämnt DAC, och/eller IFN-α2b, benämnt IFN, vid rätt doser³².
      OBS: Matcha partiet # på matrisflaskans specifikationsblad. Baserat på koncentrationen, beräkna volymen medium som behövs för att göra upp till 2 mg ^ml-1 Justera den optimala proteinkoncentrationen och cancercellssuspensionskoncentrationen i enlighet med din ansökan av intresse.
   3. Pipettera försiktigt upp och ner för att undvika att bubblor bildas. Håll mikrocentrifugröret på is medan du blandar för att förhindra oönskad polymerisation.
   4. Efter sterilisering, placera enheterna på is (med en ishink och lock) för att undvika matrislösning stelning under hela proceduren för cellbelastning.
   5. Injicera långsamt de två IFN- och DAC/IFN-matris-/tumörcellblandningarna (2-4 μL) i vänster respektive höger gelport med 10 μL mikropipett med kalla spetsar (figur 5A). Applicera försiktigt tryck för att trycka matrislösningen från ena sidan tills den når den motsatta.
      OBS: Volymen matrislösning valdes för att undvika överflöd i intilliggande kanaler. Använd inte för stort pipetteringstryck för att förhindra att lösningen läcker ut i mediet och de centrala kanalerna. Om gelvägen blockeras längs kanalen under lastning, försök att sätta in lösningen från det andra inloppet tills gelfronterna möts. Håll kolven när du tar bort mikropipetten från inloppen, annars kommer undertrycket att aspirera matrislösningen.
   6. Placera apparaten i en inkubator i upprätt läge vid 37 °C och 5 %_CO2 i 30 minuter så att matrislösningen gelas (figur 5B). Hantera med vårdchips med inbäddad opolymeriserad gel för att förhindra läckage ur gelkanalen.
   7. Under tiden suspenderas PKH67-märkta PBMC (1x10⁶ celler) i 10 μL komplett DMEM (Dulbeccos modifierade Eagle's medium).
   8. Efter matrisgelering fylls mediekanalerna med (50–100 μl) samma alikvot odlingsmedium i alla sex behållarna för att förhindra geltorkning i flisen. Förvara i inkubatorn tills immuncellssuspensionssådd.
      OBS: Kontrollera under ett mikroskop den korrekta och homogena fördelningen av tumörceller i gelén och integriteten hos de polymeriserade gelbarriärerna. Delvis eller inte enhetliga gelade regioner eller bubblor i blandningen leder till för tidigt flöde av PBMC i gelmediekanaler vid experimentets startpunkt på grund av tryckinitiala fluktuationer.
   9. Aspirera media från de sex brunnarna och placera spetsen nära inloppet till en mediekanal för att injicera försiktigt med PBMC-cellsuspension med måttligt tryck. Den tidsmässiga laddningssekvensen visas i figur 5C:
      1. PBMC i 10 μL medium i den övre centrala brunnen.
      2. 50-100 μL medium i var och en av fyra brunnar av laterala kanaler.
      3. 40-90 μL medium i den övre centrala brunnen.
      4. 50-100 μL medium i den nedre centrala brunnen.
   10. Se till att PBMC-fördelningen förblir begränsad i den centrala kammaren efter lastningssteget. (Figur 7A).
       OBS: Om det inte är optimalt, justera koncentrationen om det behövs och upprepa såddstegen med orörda marker. Vid beräkning av volymer för de planerade experimentella förhållandena, hänvisa till ett överskott av chips (15-20%) för att ta hänsyn till potentiella fel och justeringar. Volymer och koncentrationer bör optimeras enligt den specifika applikationen.
   11. Placera monterade enheter på en plan yta i inkubatorn vid 37 °C och 5 %_CO2 för efterföljande fluorescensbildning. Hantera med vårdchips efter att ha laddat immunceller som flyter.
       OBS: Kompensera avdunstningsförluster av volymer i reservoarer genom att byta ut media var 2-3: e dag. För kemokinprofilering kan upp till 100 μL från var och en av två brunnar i kulturfack aspireras, se steg 2.7 i steg 1.
2. Automatiserad räkning av rekryterade PBMC i enkanaliga fluorescerande bilder i ImageJ
   OBS: Klassiska metoder för immunofluorescens för konfokal högupplöst avbildning kan tillämpas på on-chip-operationer som slutpunktsmätningar. Den grundläggande färgningsproceduren innefattar cell-on-chip-fixering, permeabilisering, blockering, antikroppsbindning, färgning av kärnor med tvättsteg däremellan. Omärkta immunceller infiltrerade i 3D-gelregioner med inbäddade cancermikromiljöer kan fixeras vid önskade tidpunkter och färgas för uttrycksmarkörer för aktivering / utmattning / mognad (t.ex. för CD8-celler, övervakning av CD69, CD95, PD1, TIM3-markörer). I Parlato et al.³⁵utvärderades fagocytos av SW620 apoptotiska celler med konfokalmikroskopi med hjälp av enheter monterade på 170 μm tjocka täckglas. IFN-DCs färgades och lade till anti-human HLA-DR-FITC Ab-alikvoter på chipet.
   För att beräkna omfattningen av infiltrerade fluorescerande färgade levande immunceller som utmanas med kompetitiva signaler ställs ett vanligt bildanalysarbetsflöde in enligt följande (Figur 7D-G):
   1. Förvärva, vid specifika tidpunkter, faskontrast och röda / gröna kanaler fluorescensmikrofotografier av vänster och höger gelregioner innehållande tumörceller som exponerats för enstaka eller kombinationer av farmakologiska regimer.
      OBS: Här togs bilder av ett EVOS-FL fluorescensmikroskop efter cellladdning (0 timmar), efter 48 timmar och efter 72 timmars inkubation (figur 7A-B). En 4x-10x förstoring användes för att förvärva den centrala kammaren, mikrokanalmatriserna och de två intilliggande sidokanalerna innehållande A375 plus IFN och A375 plus DAC / IFN.
      1. När du utför förvärvsåtgärder bör du överväga parametrarna för att mäta och undvika mättnad av funktioner som ska räknas. Optimala segmenteringsresultat beror på arten av de förvärvade bilderna, på grund av variationer i de biologiska proverna själva, färgningskvaliteten och mikroskopiteknikerna som används för användarorienterade applikationer.
   2. Ladda fluorescens enkanalsdata (i detta fall röd = PBMC) i Fiji genom att dra den till huvudfönstret (figur 7D). Duplicera bilden för att undvika att skriva över rådata under valet av förbearbetningsfilter tills slutlig segmentering.
      1. Om bilden är en färgbild (RGB) trycker du på Bild > Typ 8 eller 16-bitars för att konvertera till gråskala. Kontrollera att Redigera > Alternativ > Konverteringarär inställt på skala vid konvertering.
   3. Förbehandling av rådata via sanering av brus och artefakter.
      1. Gå till menyn Process > Subtrahera bakgrund genom att använda rullande bollalgoritmen för att korrigera ojämn brusbakgrund med stora rumsliga variationer av intensiteter. Ställ in radien på minst storleken på den största förgrundsartikeln. Välj rutan Förhandsgranskning för test- och felprocedur för att ge optimala resultat. För små värden kan felaktigt ta bort strukturer av intresse.
      2. Dra reglagen Minsta/Högsta i kommandot Intensitet och kontrast om du vill ändra intensitetsintervallet i histogrammet. Flytta skjutreglaget Maximum åt vänster för att öka ljusstyrkan, utan urblekningsfunktioner. Flytta bilden Minimum åt höger om du vill öka bildens kontrast så att mindre synliga element försvinner i bakgrunden. Klicka på Verkställ för att åtgärda ändringarna.
   4. Bildförbättring.
      1. Gå till Process > Filter och experimentera med Median, Gaussiska filter på bilder (Figur 7E).
         OBS: Förfiltreringsradie bör anpassas till bildbruspixlarna. Det icke-linjära medianfiltret ersätter pixelvärdet med medianvärdet för grannar för att minska salt- och pepparbrus. "Gaussisk oskärpa" används för att jämna ut en digital bild genom att ersätta pixlar med ett viktat genomsnitt av omgivande pixlar. Vikterna kommer från den gaussiska sannolikhetsfördelningen, så de närmaste pixlarna är mer inflytelserika.
      2. Gå valfritt till Process > Math > Gamma med markerad förhandsgranskningsruta för att öka kontrasten.
         OBS: Intensiteter som ställs in i B&C-panelen skalas mellan de två min- och maxgränserna. Värden < 1,0 accentuerar skillnader mellan låga intensiteter medan värden > 1,0 accentuerar skillnader mellan höga intensiteter. Gammakorrigering är funktionell för att hitta ett visningsområde som visar de svagaste objekten utan att mätta de ljusaste.
   5. Skapande av en binär bildmask.
      1. Gå till bild > justera > tröskelvärde. Den enklaste metoden för att bestämma tröskelvärden bygger på histogramanalys av intensitetsnivåer, som visas i figur 7F. I rullgardinsmenyn spelar du med olika globala tröskelmetoder (i vårt fall tillämpas Otsu).
      2. Bläddra manuellt eller skriv ett känt intervall av pixelintensiteter i histogrampanelerna, observera förändringen av det röda mönstret som täcker bilden som mest liknar det faktiska cellområdet. Återställningsknappen tar bort överlägget. När du är nöjd klickar du på Använd för att generera en binär version av bilden. Markera Alternativ för Process > Binary > för att styra hur bilder med tröskelvärden visas och hur objekt identifieras av partikelanalysatorn.
   6. Använd menykommandot Process/Binary/Watershed Particles för att dela delvis överlappande eller sammanslagna under tröskeln. Vattendrag kan ofta noggrant skära dem isär genom att lägga till en 1 pixel tjock linje. Utför morfologiska åtgärder som Dilate eller Erode-åtgärder för att antingen växa eller ta bort pixlar från under- eller övermättade pixlar.
      Mer information finns i avsnittet Menykommandon eller i MorphoLibJ, ett integrerat bibliotek baserat på matematisk morfologi för att bearbeta binära data.
   7. Kvantitativ beskrivning av bildfunktionen.
      1. När du har fått tillfredsställande objektigenkänning öppnar du partikelanalysatorn från Analysera > analysera partiklar. Partiklar kan uteslutas genom sin storlek och cirkularitet, uttryckt i pixlar eller i en kalibrerad måttenhet (kontrollera rätt skala i förhållande till mikroskopinställningar under Bild > egenskaper). För att inkludera allt, behåll standardvärdet 0-oändlighet och cirkularitetsstandardintervall på 0,00 - 1,00 (0 = rak linje, 1 = perfekt cirkel).
      2. Om du vill filtrera små "bruspixlar" eller funktioner som inte är intressanta ställer du in minsta och högsta intervall. Markera alternativen Inkludera hål, Visa, Kontur och Visa resultat i fönsterfältet. Exkludera på kanter tar bort partiklar som upptäcks på bildens kanter. Lägg till i Manager lägger till det erhållna valet till ROI-hanteraren för vidare analys och behåller partikelns positionsinformation.
         OBS: I "ROI Manager" är det möjligt att korrigera automatisk segmentering inspelad utdata (slå samman delade celler, dela sammanslagna celler). Välj, genom att använda urvalsverktyg i Fiji Toolbar, ROI i båda gelregionerna där cancerceller är inbäddade för att uppskatta immuninfiltration.
   8. Exportera de erhållna värdena till ett kalkylblad för att utföra statistisk analys enligt figur 7G. "Resultat" listar en datatabell i förhållande till numrerade konturerade partikelegenskaper som identifierats. "Sammanfatta" öppnar ett fönster med bildens namn, totalt antal och annan information för hela bilden.
      1. Gå till Analysera > Ange mått för att inkludera ett brett spektrum av parametrar.
   9. Spela in valfritt ett makro (genom att välja Plugins > Macros > Record) för att automatisera bearbetningsarbetsflödet och spara tidsanalys på stora datamängder.
      1. Använd samma bearbetningsrutin för att analysera grön fluorescenskanal i samma regioner för att analysera morfologiska förändringar av tumörceller i 3D-regioner¹⁶

Representative Results

Tumörimmuninfiltration är en parameter för värdens antitumörsvar. Tumörer är heterogena i sammansättning, densitet, plats och funktionellt tillstånd för infiltrerande leukocyter vilka interaktioner med cancerceller kan ligga till grund för kliniskt relevant information för att förutsäga sjukdomsförlopp och svar på terapi. I detta avseende kan mikrofluidisk teknik användas som komplementära och privilegierade in vitro-verktyg för att utforska tumörers immunkontext, samt för att övervaka svaret på cancerbehandlingar. Kopplingen av mikrofluidisk analys, levande cellavbildning och spårningsprogramvara kan skapa tillförlitliga kvantifieringsmetoder för att kvantifiera hur immunceller justerar sitt migrationsmönster i olika sammanhang. I det här kapitlet har vi rapporterat steg för att inrätta mångsidiga 2D- eller 3D-samkulturer av immun- och målcancerceller i ad hoc-mikrofluidiska enheter realiserade genom vanliga mjuklitografiska procedurer. I avsnitt 1 användes mikrofluidiska anordningar för att möjliggöra kemisk och fysisk kontakt mellan vidhäftande (MDA-MB-231 cancerceller) och icke-vidhäftande (PBMC) populationer. Vissa kemoterapeutiska medel (t.ex. antracykliner bland de andra) kan inducera "immunogen" apoptos av maligna celler, vilket ökar deras synlighet i immunkompetenta värdar. Cancerimmunogen celldöd (ICD) kännetecknas av frisättning av membranbundna och lösliga signaler som levereras av döende celler som fungerar som alarminer för immunceller. För att ge en kvantitativ validering av ICD-svar använder vi data som samlats in i mikrofluidikplattformen där leukocyter kan röra sig genom lämpligt byggda mikrokanalbroar mot sina målceller. Time-lapse-registreringar utfördes efter samladdning av PBMC, från friska givare (WT, vild typ), med humana MDA-MB-231 bröstcancerceller förbehandlade eller inte med antracyklin DOXO. Mikrofotografier genererades var 2: e minut, under två på varandra följande tidsintervall på 24 och 48 timmar. (Exempel Film S1 med 0-24 timmars intervall). Spårningsanalys av enskilda PBMCs som utmanades med döende (DOXO-behandlade) eller levande (PBS-behandlade) cancerceller gjordes med hjälp av Trackmate plug-in, vilket ses i Figur 6A (vänster panel). Relevanta kemotaxisvärden och migreringsdiagram genererades automatiskt med hjälp av kemotaxi och migreringsverktyget, som beskrivs i⁶². Cellbanorna extrapolerades alla till (x, y) = 0 vid tiden 24 h. Resultaten indikerade en annan migrationsprofil för immuncellerna när de samladdades med bröstcancerceller exponerade för DOXO eller PBS. När PBMC konfronterades med apoptotiska cancerceller korsade de mikrokanaler mot döende / döda celler (men inte för att leva obehandlade celler). Migration X/Y spindel- och rosplottar, presenterade i vänster panel Figur 6B-C, kartlades och jämfördes för att belysa effekten av immunogena inducerare på skillnader i immundynamik. Rosendiagram visar att PBMC migrerade huvudsakligen i nästan alla riktningar i kontrollexperimentet, endast en försumbar fraktion styrs upp gradienten genererad av prolifererande cancerceller. Omvänt markerar banorna för enskilda celler en stark biasrörelse längs riktningen för apoptotiska bröstcancerceller (negativ x-riktning). För att utvärdera riktad immuncellsmigration mot DOXO-behandlade eller PBS-behandlade cancerceller beräknas flera kemotaxisparametrar, inklusive: a) masscentrum (rumslig genomsnittlig punkt för alla slutpunkter); b) riktningen, c) framåtmigrationsindex (dvs den genomsnittliga cellförskjutningen i en riktning av intresse som betyder mot måltumörplatsen, i vårt fall). De senare värdena representerar ett mått på effektiviteten hos en cell att migrera i den riktning som ges kemotaktiska stimuli. Efter att ha nått den vänstra kammaren uppvisade en fraktion av leukocyter med en ökande densitet över 24-48 timmar långvariga (>60 min) kontakter med DOXO-behandlade MDA-MB-231. PBMCs misslyckas med att massivt migrera och engagera sig i sådana långsiktiga och ihållande interaktioner med levande cancerceller (vilket visas av representativa mikrofotografier av närmande PBMC i Figur 6A, höger). För att kvantifiera skillnader i tumör-immunsamspel avgränsades tumörregionen med en fast cirkel med diameter som sträcker sig 20-80 mikron, kallad "hotspot". Kvantifiering och analys från representativa synfält visas i Figur 6 (Höger panel, B-C).

I avsnitt 2 beskrivs en ny 3D-immunkompetent tumörmodell för att kvantifiera rekryteringen av immunceller som svar på anti-cancerkombinationer av epigenetiska läkemedel³² (DAC / IFN vs IFN ensam), vilket möjliggör jämförelse av två olika behandlingsförhållanden för A375-melanomceller samtidigt. Således var A375M-melanomceller, märkta med PKH67 grönt fluorescerande färgämne, inbäddade i Matrigelmatriser i närvaro av DAC och / eller IFN i varje gelkammare, medan PKH26 rödmärkta PBMC distribuerades homogent i den centrala fluidkammaren vid startpunkten (figur 7A). Vi jämförde samtidigt de två tumörmassorna i 3D-matriser för deras förmåga att attrahera PBMC. Vid 48 och 72 timmar styrs PBMC massivt in i mikrokanalerna på höger sida, vilket observeras i figur 7B.

En preferens homing av PBMCs mot gelmatrisen innehållande DAC / IFN-behandlad, snarare än IFN-behandlad, melanomplats observerades tydligt, medan dålig migrationshastighet var synlig mot A375-celler som exponerades för enstaka behandling (vänster chipsida). Den konkurrensutsatta inställningen är tillämplig för att undersöka en uppsjö av olika cancerbiologiska fenotyper (t.ex. läkemedelsresistenta vs aggressiva, primära eller metastatiska (t.ex. A375P vs A375M melanomceller) och responders vs icke-responders). Gelkammare kan bestå av komplexa samkulturer av maligna celler och flera icke-cancerösa tumörassocierade celler, såsom endotelceller, immunceller och fibroblaster³³ för att karakterisera läkemedelssvar på TME-nivå. Händelser av mitos och apoptotisk död hos cancerceller kan övervakas genom färgning med levande färgämnen³³. Immunfärgningsprocedurer på 3D-mikrofluidiska enheter kan anpassas för att utvärdera tillstånd för aktivering av infiltrerade immunceller i tumörställen genom konfokalmikroskopi³⁵. I den meningen kan dessa 3D-mikrofluidiska system efterlikna komplexa tumörstrukturer och multicellulära interaktioner och är därför värdefulla plattformar för mer tillförlitliga prekliniska läkemedelstester.

Figur 1. Plaimetri av den mikrofluidiska anordningen för montering av 2D-tumörimmuna samkulturer. (A) Verkligt mikrofotografi av 3 chips monterade i ett enda mikroskopglas. Reservoarerna är numrerade beroende på belastningssekvensen och är färgkodade som motsvarande kulturkammare som anges i legenden. Skalstång, 6 mm. (B) 3D CAD av chip bestående av tre huvudsakliga cellodlingsområden förbundna med mikrospår. C) Detaljer om den smala mikrospårsbron, som visar dimensionerna skräddarsydda för cancerceller och PBMCs storlek. D-E) Synligt ljusmikrofotografi förvärvades före tidsfördröjningens början, som visar fördelningen av cancerceller respektive PBMC i vänster och mellanliggande kammare. Skalstång, 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2. Trackmate-analyspipeline för lokalisering av immunfläckar i tidsseriebilder. A) Övre panelen: Skärmdump av Trackmate-bildkalibreringsmenyn. Nedre panelen: Fiji "Bildegenskapsmeny" för att ställa in tid och rumsliga enheter. B) Övre panel: Skärmdump av Trackmate "Spots detection" -menyn. Nedre panelen: Utdatabild med tillämpade olika värden på "Tröskel". C) Övre panel: Skärmdump av Trackmate "Spot filtering" -menyn som illustrerar några filter. Nedre panelen: Exempel på time-lapse-bild, som visar immunfläckar filtrerade efter position längs X i mellankammaren. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3. Trackmate-analyspipeline för rekonstruktion av immunspår i tidsseriebildsekvenser. A-C) Skärmbilder av Trackmate-menyer för spårbyggnad, spårfiltrering och för export av slutliga data. D) Exempel på genererade spår i förbehandlade timelapse-bilder som varierar inställningarna för länkdetektorn. E) Exempel på falska spår och dåliga länkar som härrör från detektering av tumörcellgränser. F) Spår markeras med grönt genom att välja rader i filen .txt resultat. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4. Schematisk översikt för 3D-immunkompetenta tumör-on-chips. A) Exempel på en mikrostrukturerad kiselmaster. Frimärken för PDMS mönstrades i SU-8 negativ resist i en renrumsanläggning utrustad med e-stråle och optisk litografi. B) PDMS-repliker tillverkades med vanliga mjuklitografiska metoder. Centralenheten har kamrarna färgade som de som ritas i 3D-rendering av chipet, avbildat i panelen DC) Svepelektronmikroskopi (SEM) förstorad vy av uppsättningen mikropelare lämpade för infångning av hydrogellösning. D)3D CAD som visar kamrarna, förbundna med mikrospår och lastbrunnarna. Streckade rutor hänvisas till SEM-fotografier av detaljer (panel C och E). E) SEM-fotografi av 10 μm höga anslutande mikrospår. F) 2D CAD-layout som visar dimensionerna av mikrostrukturer. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5. Schematiskt arbetsflöde för huvudladdningsprotokollsteg för montering av 3D-samkulturer. A) Övre panel: Scheman över injektionssteget av Matrigel lösning i varje gelsida. Nedre panelen: Verkligt fotografi av chipet som visar gelfrontens framsteg längs kanalen under laddningssteget. B) Scheman för Matrigelpolymerisationssteg. Nedre panel: Faskontrastmikroskopisk vy av gel-luftgränssnittet som bildas efter geleringssteget. Skalstång, 100 μm. C)Övre panel: Ritning, som visar laddning av celler och media med exemplariska volymer som används i protokollet. Nedre panelen: En 4X faskontrastbild av den monterade samkulturen vid 0h visas. Skalstång, 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6. Analys av migrationsprofiler och interaktionsbeteende hos PBMC mot döende/levande tumörkammare i tidsfönstret 24-48 h. Vänster panel. A) Skärmdumpar av förbehandlade timelapse-bilder överlagrade med immunfärgade spår, extraherade av Trackmate. Immunvägarna erhålls med ett enda FOV under de angivna experimentella betingelserna i intervallet 24 till 48 h i mellankammaren. B-C) Representativa migrationsspår och rosdiagram för PBMC odlade under de två olika förhållandena (n = 1550 PBMC kontra DOXO-behandlade cancerceller, DOXO + eller n = 1434 PBMC kontra kontrollcancerceller, DOXO-). Varje linje i xy-diagram visar en enda PBMC-bana och varje cirkel representerar den slutliga positionen för en enda cell i förhållande till den ursprungliga positionen. Startpunkterna sätts till (0,0) med hjälp av en koordinatomformning. Koordinaterna och förskjutningen av masscentrum för cellmigration visas under de angivna experimentella betingelserna. Masskoordinaternas centrum och förskjutning (beräknat som genomsnittligt euklidiskt avstånd för X- och Y-komponenterna) ger indikation på den genomsnittliga riktningen i vilken gruppen av celler huvudsakligen färdades och storleken på den totala cellrörelsen i tillståndsgrupper. Blå och gröna linjer markerar enskilda spår med ett euklidiskt avståndsvärde som är större/mindre än ett tröskelvärde (100 μm). D) Schema för numeriska data extraherade av ett cellspår. E-F) Box & Whiskers-diagram som visar riktningen (p<0,0001 Unpaired t test med Welchs korrigering) och FMI (p<0,0001 Unpaired t test med Welchs korrigering). Den vågräta linjen i rutor representerar medianvärden. FMI-värdena är medelvärdet för alla cellspår i varje villkorsgrupp. Höger panel. A) Skärmdumpar av Trackmate-extraherade ROI som visar differentiella interaktioner mellan PBMC och DOXO- eller PBS-behandlade cancerceller. B) Tidstäthet för PBMCs runt DOXO-behandlade eller kontrollera MDA-MB-231 cancerceller. Antal PBMC närvarande i utvalda ROI runt cancerceller för varje tillstånd. Värden som rapporteras är genomsnittet över 9 valda ROI från ett enda time-lapse FOV. Cancer hotspots definieras i en ROI (80 μm i diameter). Motsvarande värmekarta för densitet visas. Prickar representerar genomsnittligt antal celler beräknat över 9 cancerhotspots vid angivna tidpunkter. C) Fördelning av tider (min) av kontakter för varje experimentgrupp. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 7. Förmånlig rekrytering av PBMCs som svar på DAC plus IFN-läkemedelskombinationer i en konkurrenskraftig 3D-immunkompetent melanom på chipmodell. A) Fördelning av initialt laddade PBMC i den centrala kammaren för mikrofluidiska anordningar. Mikrofotografier förvärvas med EVOS-FL fluorescensmikroskop under 0-72 h-intervall. Röd fluorescens (PKH67-märkta celler) representerar PBMC från friska givare. PKH67-märkta (gröna) humana melanomceller inbäddade i Matrigel innehållande enkla eller dubbla kombinationsbehandlingar pläterades i laterala kamrar. B) A375-celler plus IFN till vänster jämfört med A375 plus DAC / IFN till höger. Fluorescensbilder visades vid 72 timmars samkultur. Avbruten gul ruta visar synligt massiv rekrytering i A375 plus DAC / IFN-sidan. C) PBMC räknas i fyra olika ROI från IFN-kammare vs DAC + IFN-kammare. Histogram representerar cellantal +/- S.D.; värmekarta uppräknade värden från varje ROI. Skalstänger, 200 μm. D-G) Scheman över segmenterings- och kvantifieringssteg för infiltrerade PBMC i gelmatriser tillämpade på enkanaliga fluorescensbilder. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil. Protokoll för mikrofabrikation Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande film 1. Time-lapses-sekvenser i en 2D-tumörimmun samkultur på chip. Mikrofotografier förvärvades var 2: e minut, i ett tidsintervall på 0-24 h med hjälp av ett kompakt mikroskop placerat i en standard cellodlingsinkubator. Vänster panel. Film av PBMCs från friska givare (WT, vild typ), pläterad med MDA-MB-231 kontrollerar bröstcancerceller. Höger panel. Film av en massiv migration av PBMCs WT mot chipkammaren där MDA-MB-231 DOXO-behandlade cancerceller laddas. 2D-chiplayout beskrivs i detalj i avsnitt 1 i protokollet och visas i figur 1. Klicka här för att ladda ner den här filmen.

Discussion

De beskrivna metoderna försöker utforma ett allmänt tillvägagångssätt för att rekapitulera, med modulerbar grad av komplexitet, två viktiga aspekter inom onkoimmunologin, som kan dra nytta av antagandet av mer relevanta in vitro-modeller. Den första handlar om tumörcellspopulationssidan, där hantering av enskilda cellegenskaper kan leda till en bättre beskrivning av heterogenitet och korrelerad biologisk och klinisk betydelse inklusive resistens mot terapi, propension till metastasering, stamcell och differentieringsgrad. Den andra sidan av historien representeras av TME, inklusive icke-cancerösa komponenter (immun- och stromaceller, blodkärl) och kemiskt / fysiskt landskap (ECM-beståndsdelar, kemokiner och andra lösliga faktorer som frigörs) som djupt kan forma både sjukdomens egenskaper och individens svar på terapi⁶³, särskilt till immunterapi. Det är värt att notera att export av det beskrivna tillvägagångssättet till andra forskningsområden kräver en djup förståelse för begränsningar och utmaningar som utvecklingen och antagandet av nya modeller medför.

Citerar en maxim som tillämpas i teknisk modellering ("modellera problemet inte systemet"), det måste optimeras vilket är det minsta antalet (cellulära, fysiska och kemiska) komponenter och förhållanden som behövs för att göra egen on-chip-modell biologiskt relevant och stabil under hela experimentet. Varje kombination av celltyper / mikromiljö / experimentell inställning måste därför väljas noggrant, utvärderas och kontinuerligt övervakas längs enskilda experiment och från session till session. Dessa kontroller inkluderar, som nämnts i protokollavsnitten, strikt kontroll av parametrar som volymer i mikrofluidiska anordningar som kan modifieras av fuktighetsförhållanden eller uppvärmning från belysningskällor, möjliga rörelser och icke-planaritet av steg som orsakar okontrollerad vätskedrift, men också viss slutpunktsverifiering av celltillstånd, livskraft och fenotypisk karakterisering. Ett kritiskt steg gäller beslutet att använda perfusionssystem för att skapa vaskulariserade (liknande) strukturer, eller för läkemedelsleverans^{på chip 33}, eftersom detta kan påverka experimenten när det gäller ökad komplexitet, cellodlingstid och modulering av de kemiska faktorerna i närvaro av flytande celler som immun.

I det följande sammanfattar vi de viktigaste kritiska och relevanta frågorna som finns i experimentella miljöer och i den senaste litteraturen.

ECM och kemisk landskapsdefinition
TME påverkas också starkt av de mekaniska 64,65 egenskaperna hos omgivningen^{63, 66}. Av denna anledning är valet av odlingsmatrisen grundläggande, särskilt när det handlar om immunceller som under vissa förhållanden kan svara på signaler som frigörs av själva matrisen. Relevanta framsteg förväntas i nästa framtid också från design och utveckling av nya material och hydrogeler (kännetecknas av olika styvhet, porositet, närvaro av lösliga faktorer, bland de andra parametrarna) som möjliggör en alltmer förfinad och kontrollerbar ECM, som efterliknar särdrag hos olika vävnader idag, olika patienter imorgon. Å andra sidan är det också viktigt att övervaka de förändringar som induceras av de olika cellpopulationerna i ECM och definiera strategier för att inkludera denna information i dynamiska och fenotypiska analyser.

Hantering av data
Vägen mot utplacering av tumör-on-chip-tekniker i ett kliniskt arbetsflöde kommer att dra nytta av ett enormt experimentellt arbete som äger rum längs flera håll. Organ-on-chip-modeller, som många in vitro-tekniker, är funktionella, åtminstone potentiellt, för att utföra mätningar med hög genomströmning / högt innehåll. Parallellisering av experimentella betingelser, inklusive positiva och negativa kontroller, och tekniska/biologiska replikat möjliggörs genom att integrera flera chips på samma platta. Ökningen av den kvantitativa genomströmningen spelar en avgörande roll för att översätta och validera dessa system i snabb läkemedels- eller genscreeningpipeline för immunterapier. Faktum är att flera företag redan har utvecklat plattformar i ett flerbrunnsformat, och olika bildmetoder testas för att möjliggöra övervakning av ett stort antal enheter samtidigt¹⁴. I de ovan beskrivna protokollen använde vi mikroskopglas som tilldelade upp till 3 chips, med möjlighet att visualisera upp till 12 experimentella förhållanden parallellt med hjälp av ett standardmikroskop multi-slide-bricka. Denna inställning är kompatibel med handpipettering och lämplig för specialorienterade justeringar som utförs i vår mikrofabrikationsanläggning. Tvärtom, när en stark parallellisering är nödvändig (flera screeningtester och kontroller) krävs installationsoptimeringar för att ställa in en högre automatiseringsnivå (dvs. användning av pipetteringsrobotar, flerbrunnar av plast).

Vid utformning av experiment måste en avvägning mellan rumslig och tidsmässig upplösning beaktas.

Den enorma mängden data, som produceras genom mikroskopi med högt innehåll, utgör en begränsande faktor när det gäller lagring, överföring och analys. Dessa frågor hanteras med beräkningsmetoder som implementerar maskininlärningsverktyg och hårdvara / mjukvaruresurser, vilket kan främja den framtida möjligheten att länka on-chip / in-silico-experiment^67,68 vid val av terapeutiska strategier^, och det representerar en ambitiös men ändå inte uppskjutbar möjlighet.

Mer än fluorescensavbildning
Fluorescensmärkning, med färgämnen eller reportergener, på grund av dess höga specificitet, representerar utan tvekan guldstandardmetoden för att identifiera olika cellpopulationer i samodlingsförhållanden och för att lösa molekylära egenskaper med hög SNR. I OOC-modeller används detta tillvägagångssätt ofta som referens och särskilt i heterogena tumör-på-chip-mikromiljöer kan det vara värdefullt att karakterisera fenotypen av immunceller som infiltreras och interagerar.

Ändå finns det ökande bevis för att effekter inducerade av fluoroforer, mödosamma färgningsprocedurer och belysningsrutiner måste övervakas och minimeras⁶⁹ eftersom det kan djupt påverka cellbeteende och tillstånd^70,71. Denna risk verkar särskilt gälla för bräckliga system, såsom immunceller^72,73. Fototoxiska reaktioner kan införa begränsningar när det gäller att definiera det tidsmässiga fönsterförvärvet av levande celler när de övervakas med hög rumslig och tidsmässig upplösning. Dessutom gör rikedomen i olika immundelpopulationer det omöjligt att diskriminera mellan dem endast genom fluorescerande färgning, med tanke på det begränsade antalet filter som vanligtvis finns tillgängliga på mikroskop.

För att ta itu med denna fråga, ur instrumentell synvinkel, visas nu nya etikettfria^{74-mikroskopitekniker} som holografisk⁵⁶ eller hyperspektral mikroskopi⁵⁷ på scenen. De lovar avancerade cellulära processklassificeringsstrategier utöver fluorescens och kan vara särskilt värdefulla för att studera känsliga prover. Ur dataanalyssynpunkt är avancerade beräkningsmetoder, baserade på djupinlärningsalgoritmer⁷⁵ (tränade av dataset för fluorescensbilder), dörröppnare för att utföra den så kallade "in silico-märkningen"^76,77. De har framgångsrikt tillämpats för att förutsäga fluorescerande markörer från ljusfältsbilder⁷⁸, vilket genererar märkta bilder, utan färgning av celler, vilket ökar ljusfältmikroskopins informativa kraft. Denna strategi kan också vara användbar för att spara tid och fluorescenskanaler för andra markörer. Vi tror att OOC-samhället kommer att dra nytta av dessa nya tekniker som möjliggör en mindre invasiv studie av cellpopulationers interaktion.

Analys av data
Mekanismer för interaktioner mellan immun- och målcancerceller kan undersökas genom spårning av cellrörelser^28,79. Time-lapse-spårningsexperiment i komplexa och heterogena samkulturer är extremt värdefulla för att extrahera cellmigrationsmönster, morfologiska och tillståndsförändringar och omfattande härstamningsinformation. Att utföra manuell analys är praktiskt taget endast möjligt för korta sekvenser med få celler men inte för systematiska experiment med hög genomströmning. Följaktligen är utvecklingen av beräkningsverktyg för cellspårning, antingen helt eller delvis automatiserad, ett viktigt forskningsområde inom bildanalys²⁴. Vanligtvis kräver konventionell cellspårning relativt hög provtagningsfrekvens och rumslig upplösning för att korrekt utföra segmenteringsuppgifter, vilket kan vara utmanande under många experimentella förhållanden. För att lokalisera celler finns det tillgängliga segmenterings- och spårningsverktyg med öppen åtkomst (t.ex. ImageJ-programvara²²) som presenteras i detta protokoll eller dedikerad proprietär programvara. I storskaliga studier tillämpade vi en proprietär programvara som heter Cell Hunter^16,31, utvecklad av University of Tor Vergata i Rom^, för att på ett helautomatiskt sätt skilja cancer och immunceller i multipopulationssammanhang. Skräddarsydda lösningar baserade på maskininlärning och neurala nätverksmetoder 80,81,82 börjar idag implementeras i mikroskopiprogramvarupaket ^83, från att förbättra SNR till att hantera kritiska förvärvsparametrar eller segmenteringssteg. Maskininlärning kan utnyttjas för att känna igen vanliga cellulära mönster (t.ex. rörelsestilar) för att karakterisera det biologiska svaret med avseende på mikromiljöfaktorer.

I Comes et ^al.41 tillämpades en förtränad Deep Learning Convolutional Neural Network-arkitektur för att klassificera om cancerceller utsätts eller inte utsätts för en läkemedelsbehandling genom att använda som en "markör" immuncellernas rörlighet, spårad från time-lapse-data från samkulturer av bröstcancerceller och PBMC i kollagenmatriser i mikroenheter, enligt beskrivningen i^{punkt 33}.

Utveckling av encelliga omics-metoder och ontologier
Vi påpekar behovet av en strategisk allians mellan encelliga omics-tekniker⁸⁴ (t.ex. proteomik, metabolomik, genomik) och on-chip-metoder: den molekylära detaljerade karakteriseringen, konjugerad till funktionell dynamisk information kan förbättra förståelsen av grundläggande mekanismer och klinisk beskrivning. I detta fall är nya instrument för att länka samman de två världarna i början⁸⁵. Den första utmaningen är att implementera encelliga omics-metoder direkt på onkoimmunologiska chips²². Dessutom skulle organ-on-chips kunna utnyttjas som plattformar för att testa potentiella mål som identifierats genom genomik- och proteomikanalyser^86,87. Ett andra länkverktyg, som fortfarande till stor del saknas, är ett strukturerat, standardiserat sätt att kommentera och lagra uppmätta systemresultat^88,89. Men det är precis vad vi behöver i framtiden för att bygga systematiska databaser med cellulära kvantitativa resultat och uppmätta egenskaper, för att bryta, härleda och korrelera dem med den inneboende biologiska informationen. Kort sagt, behovet av standardisering och systematisk analys av heterogena experimentella dataset kräver ett ontologiramverk.

Anpassa modeller
Organ-on-chip-teknik är lämplig för personalisering¹², eftersom celler och vävnader från enskilda patienter (eller kategorier av patienter) kan användas i enheterna under kontrollerade förhållanden, vilket leder till kliniskt relevanta avläsningar, användbara för att informera terapeutiska eller förebyggande strategier. Några exempel börjar dyka upp i litteraturen⁹⁰. För tumör-på-chip-modeller ställer denna utmaning naturligtvis flera tekniska och vetenskapliga frågor som måste lösas³⁶ (som TME-egenskapskontroll som syrekoncentration, cytokingradienter etc.). Viktigt är att utsikterna att göra onkologi- och onkoimmunologiska terapier mer effektiva samtidigt som skadliga effekter för varje patient minskas är attraktiva, ur ett livskvalitetsperspektiv som för optimering av vårdresurser.

Sammanfattningsvis är det uppenbart att detta område är ett autentiskt tvärvetenskapligt område och som sådant kräver en stor ansträngning för att skapa ett gemensamt språk och gemensamma mål mellan forskare, kliniker, industri, men också från olika discipliner (teknik, biologi, datavetenskap, medicin, kemi) för att hitta bra balans och nya lösningar⁹¹.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials
50 mL tubes	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	centrifuge tubes
5-aza-2'-deoxycytidine DAC	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	A3656	DNA-hypomethylating agent
6-well plates	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS3506	culture dishes
75 cm2 cell culture treated flask	Corning, New York, NY	430641U	culture flasks
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	CVCL_B222	human melanoma cell line
Doxorubicin hydrochloride	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	D1515	anthracycline antibiotic
Dulbecco's Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0728L	Culture medium for SK-MEL-28  cells
Dulbecco's Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB4004L	saline buffer solution
Fetal Bovine Serum	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECS0180L	ancillary for cell culture
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	separation of mononuclear cells from human blood.
hemocytometer	Neubauer		Cell counter
Heparinized vials	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Vials for venous blood collection
interferon alpha-2b	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	SRP4595	recombinant human cytokine
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3000D	ancillary for cell culture
Liquid nitrogen
Lympholyte cell separation media	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Separation of lymphocytes by density gradient centrifugation
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norway
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	growth factor reduced basement membrane matrix
MDA-MB-231	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	HTB-26	human breast cancer cell line
Penicillin/ Streptomycin 100X	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECB3001D	ancillary for cell culture
Pipet aid	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Liquid handling
PKH26 Red Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH26GL	red fluorescent cell dye
PKH67 Green fluorescent cell linker	Millipore-Sigma; St. Louis, MO	PKH67GL	green fluorescent cell dye
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM2001L	Culture medium for MDA-MB-231 cells
serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma; St. Louis, MO	CLS4486; CLS4487; CLS4488; CLS4489; CLS4490	Liquid handling
sterile tips (1-10 μL, 10-20 μL, 20-200 μL, 1000 μL)	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECTD00010; ECTD00020; ECTD00200; ECTD01005	tips for micropipette
Timer
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	cell stain to assess cell viability
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italy	ECM0920D	dissociation reagent for adherent cells
Cell culture equipment
EVOS-FL fluorescence microscope	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Fluorescent microscope for living cells
Humified cell culture incubator	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Direct Heat COIncubator; TC 230	Incubation of cell cultures at 37 °C, 5% CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Laboratory refrigerator (4 °C)	FDM
Laboratory Safety Cabinet (Class II)	Steril VBH 72 MP		Laminar flow hood
Optical microscope	Zeiss
Refrigerable centrifuge	Beckman Coulter
Thermostatic bath
Microfabrication materials
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	silanizing agent for bonding PDMS to plastic coverslip
Chromium quartz masks / 4"x4", HRC / No AZ	MB W&A,  Germany		optical masks for photolithography
Glass coverslip, D 263 M Schott glass,  (170 ± 5 µm)	Ibidi, Germany	10812
Hydrogen Peroxide solution 30%	Carlo Erba Reagents	412081	reagents for piranha solution
Methyl isobutyl ketone	Carlo Erba Reagents	461945	PMMA e-beam resist developer
Microscope Glass Slides (Pack of 50 slides) 76.2 mm x 25.4 mm	Sail Brand	7101	substrates for bonding chips
Miltex Biopsy Punch with Plunger, ID 1.0mm	Tedpella		dermal biopsy punches for chip reservoirs
PMMA  950 kDa	Allresist,Germany	AR-P. 679.04	Positive electronic resists for patterning optical masks
Polymer untreated coverslips	Ibidi, Germany	10813	substrates for bonding chips
Prime CZ-Si Wafer,  4”, (100), Boron Doped	Gambetti Xenologia Srl, Italy	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Reagents	415238
Propylene glycol monomethyl ether acetate (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 resists developer
SU-8 3005	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0001	Negative Photoresists
SU-8 3050	Micro resist technology,Germany	C1.02.003-0005	Negative Photoresists
Suite of Biopunch, ID 4.0 mm, 6.0 mm, 8.0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	dermal biopsy punches for chip reservoirs
Sulfuric acid 96%	Carlo Erba Reagents	410381	reagents for piranha solution
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Silicone Elastomer (PDMS)
Trimethylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	silanizing agent for SU-8 patterned masters
Microfabrication equipment
100 kV e-beam litography	Raith-Vistec EBPG 5HR
hotplate
Optical litography system	EV-420 double-face contact mask-aligner
Reactive Ion Etching system	Oxford plasmalab 80 plus system
Vacuum dessicator