Summary
מוצג כאן הוא פרוטוקול לייצור של מכשיר הדמיה ספרואידי. מכשיר זה מאפשר הדמיה פלואורסצנטית דינמית או אורך של ספירואידים תאים סרטניים. הפרוטוקול מציע גם הליך עיבוד תמונה פשוט לניתוח פלישת תאים סרטן.
Abstract
הפלישה של תאים סרטניים מן הגידול העיקרי לתוך הרקמות הבריאות הסמוכות הוא צעד מוקדם גרורות. תאים סרטניים פולשניים מהווים אתגר קליני גדול כי אין שיטה יעילה לחיסול שלהם פעם ההפצה שלהם מתבצעת. הבנה טובה יותר של המנגנונים המסדירים פלישת תאים סרטניים עלולה להוביל להתפתחות טיפולים חדשניים וחזקים. בשל הדמיון הפיזיולוגי שלהם לגידולים, ספרואידים מוטבע קולגן אני כבר מנוצל בהרחבה על ידי חוקרים כדי ללמוד את המנגנונים החלים פלישת תאים סרטניים לתוך המטריצה חוץ תאית (ECM). עם זאת, מבחנה זו מוגבלת על ידי (1) חוסר שליטה על הטמעת ספרואידים לתוך ECM; (2) עלות גבוהה של קולגן I ומנות תחתונות זכוכית, (3) תיוג אימונופלואורסצנטי לא אמין, בשל חדירה לא יעילה של נוגדנים וצבעים פלואורסצנטיים ו-(4) עיבוד תמונה וזמן רב וכימות הנתונים. כדי להתמודד עם אתגרים אלה, אנחנו אופטימיזציה פרוטוקול כדורי תלת מימדי (3D) כדי תמונה פלואורסצנטית שכותרתו תאים סרטניים מוטבע קולגן אני, או באמצעות קטעי וידאו לשגות בזמן או הדמיה אורך, ולנתח פלישת תאים סרטניים. ראשית, אנו מתארים את הייצור של מכשיר הדמיה ספרואידית (SID) כדי להטמיע ספירואידים באופן אמין ובנפח קולגן I מינימלי, מה שמפחית את עלות ההסמכה. לאחר מכן, אנו מתווים את השלבים לתיוג פלואורסצנטי חזק של ספרואידים חיים וקבועים. לבסוף, אנו מציעים מאקרו פיג'י קל לשימוש לעיבוד תמונה וכימות נתונים. בסך הכל, מתודולוגיה פשוטה זו מספקת פלטפורמה אמינה ובמחיר סביר כדי לפקח על פלישת תאים סרטן קולגן I. יתר על כן, פרוטוקול זה ניתן לשנות בקלות כדי להתאים לצרכים של המשתמשים.
Introduction
במהלך התקדמות הסרטן, תאים סרטניים יכולים לרכוש מוטיל פנוטיפ פולשני, המאפשר להם לברוח מסת הגידול לפלוש לתוך הרקמות שמסביב1. בסופו של דבר, תאים סרטניים פולשניים אלה יכולים להגיע ולגדול בתוך איברים משניים, תהליך הנקרא גרורות סרטן1. גרורות גורמות ליותר מ -90% ממקרי המוות הקשורים לסרטן2. אחת הסיבות לכך היא שבעוד שגידולים מקומיים ניתנים לניהול קליני, לא קיימות שיטות יעילות לחיסול תאים סרטניים פולשניים לאחר שהתרחשה התפשטות גרורתית. לכן, הופעתם של תאים סרטניים פולשניים והמעבר ממחלה מקומית למחלה פולשנית מהווים אתגר קליני גדול. קביעת האופן שבו תאים סרטניים ליזום ולקיים התנהגות פולשנית עלול להוביל להתפתחות של טיפולים חזקים הרומן.
מודל ספרואיד 3D הוא פלטפורמה אידיאלית לחקור את ההתנהגות המוטיב של תאים סרטניים תחת מבוקר, עדיין תנאים רלוונטייםמבחינה פיזיולוגית 3. ואכן, במהלך מבחנים אלה, ספירואידים של תאים סרטניים מוטבעים בתוך מטריצה חוץ תאית (ECM), למשל קולגן I, המחקה גידול פשוט יותר. לאחר מכן, ההדמיה משמשת כדי לדמיין את הפלישה של תאים סרטניים מהספרואיד לתוך מטריצת הקולגן. עם זאת, אתגרים מרובים מגבילים הליך זה.
האתגר הראשון מתרחש בשלב ההטבעה, שבו מטריצת הקולגן הנוזלי יכולה להתפשט על פני משטח הכלים, מה שגורם לספרואיד לגעת בתחתית המנה. כתוצאה מכך, תאים מהספרואיד מתפשטים על פני השטח הדו-ממדיים (דו-ממדיים), ושוברים את המורפולוגיה הכדורית התלת מימדית (3D). הגדלת נפח הקולגן היא פתרון יעיל אך יקר. כדי למנוע מהתאים להתפשט על פני השטח הדו-ממדיים, תוך שמירה על נפח מינימלי של קולגן, פיתחנו מכשיר הדמיה כדורי (SID) על ידי תוחם פולידימתילסילוקסן (PDMS) בעובי 1 מ"מ, בעל 3 חורים, מוכנס לתבנית תחתונה מזכוכית.
האתגר השני של מבחני הכדוריד הוא תיוג של תאים סרטניים בספרואידים, המוגבל על ידי חדירה לקויה של נוגדנים וצבעים פלואורסצנטיים, השפעה הגדלה עם גודל הכדורואיד. בעוד שהפתרון האידיאלי לתיוג תאים הוא הקמת קווי תאים המבטאים ביציבות חלבונים פלואורסצנטיים, אפשרות זו מוגבלת בעיקר לקווי תאים מונצחים ומוגבלת על ידי הזמינות של כימרות חלבון פלואורסצנטיות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול אופטימיזציה עבור כתמי immunofluorescence של ספרואידים קבועים, כמו גם את השימוש היעיל של צבע ציטופלסמי לתייג תאים מיד לפני הטמעת הכדורואיד.
האתגר השלישי של מבחני הכדוריד הוא היעדר פקודות מאקרו פשוטות של פיג'י לכימות אוטומטי למחצה של פלישת תאים לאורך זמן. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מתארים מתודולוגיה פשוטה לניתוח אזור הכדורואיד לאורך זמן. אנו ממחישים את היתרונות של פרוטוקול זה באמצעות קווי התאים 4T1 ו- 67NR כדוגמאות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור של התקן הדמיה ספירואידית (SID) כדי לייעל הטמעת ספרואיד (משך יום אחד)
- צור את המרווח באמצעות מדפסת תלת-ממד(איור 1A, B וקובץ משלים 1).
- לשקול יחס של 10:1 (wt/wt) של פולימר בסיס:crosslinker ב פלסטיק [למשל, 20 גרם של פולימר בסיס אתילבנזן ו 2 גרם של סיליקון שרסין crosslinker כדי ליצור polydimethylsiloxane (PDMS)].
- מערבבים היטב את פתרון ה-PDMS בספל הפלסטיק באמצעות פיפטה חד פעמית.
- מניחים את הפלסטיק בתא ואקום כדי להסיר את בועות האוויר מהתערובת. שחררו במהירות את לחץ הוואקום כדי להסיר את כמות האוויר הקטנה שנלכדה על פני השטח של התערובת ולפזר את בועות האוויר הנותרות.
- דגירה מרווח מודפס 3D ב 100 °C (70 °F) במשך 5 דקות כדי להגדיל את הגמישות שלה.
- נקה את שתי צלחות זכוכית שישמשו לבניית עובש PDMS ביסודיות על ידי ניגוב אותם עם 100% isopropanol. אם לוחות הזכוכית שימשו בעבר ליציקת PDMS, הקפד להסיר את כל PDMS הישן שנותר על ידי גירוד עדין של לוחות הזכוכית עם סכין גילוח ומחיקתם עם 100% isopropanol.
- בנה את התבנית על ידי הצבת מרווח מודפס 3D לשטוף בין שתי צלחות זכוכית נקיות.
- לאטום את התבנית באמצעות קליפים קלסר גדול על הקצוות החיצוניים של לוחות זכוכית. הנח שני קובצי אוגדן בקצה התחתון ואחד בפינה העליונה.
- בדוק את החלק העליון של התבנית כדי לוודא כי המרווח הוא סומק עם לוחות זכוכית. הדבר מבטיח שלא יהיו עיוותים וכי ייווצר גיליון זוגי של PDMS.
הערה: אם הגיליון המתקבל אינו בעובי אחיד, יש להתאים מעט את הקליפים. - חותכים את קצה פיפטה חד פעמית (~ 2 ס"מ מהקצה) ומוסיפים את תערובת PDMS בקצב איטי וקבוע לפינה השמאלית העליונה של התבנית. יוצקים את התערובת לאט כדי למנוע יצירת כיסי אוויר גדולים.
- מניחים את התבנית לתוך תא ואקום כדי להסיר בועות אוויר שנוצרו במהלך לשפוך.
- לרפא את PDMS על ידי דגירה התבנית ב 100 °C (60 °F) במשך 1 שעות.
- לשלוף את התבנית מן האינקובטור ולאפשר לו להתקרר לגעת.
- הסר את קליפי הקלסר ולוחות הזכוכית מהמרווח המכיל את ה- PDMS שנרפא.
- השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך דרך החותם שנוצר בכל ארבעת צידי התבנית בין המרווח לצלחת הזכוכית. עם כל ארבעת הצדדים חתוכים לתוך, להתחיל לפרק את התבנית כדי לחשוף את גיליון PDMS במרווח.
- יש לקלף בזהירות את גיליון ה-PDMS החדש מהמרווח באמצעות פינצטה.
- על מחצלת חיתוך, אגרוף החוצה 17.5 מ"מ קוטר דיסקים PDMS מהגיליון, ולאחר מכן אגרוף שלושה חורים מפוזרים באופן שווה 5.5 מ"מ קוטר, באמצעות אגרופים ביופסיה בגודל שונה. כאן דיסקי PDMS בעלי 3 גומות אלה מכונים "הכנסות"(איור 1C).
הערה: חתכים Nonuniform שנעשו לתוך PDMS, או לאגד פגום באמצעות טיפול פלזמה, עלול לגרום דליפות בעתיד. - נקה כל הכנסה על-ידי הסרה עדינה של חלקיקי אבק באמצעות סרט הדבקה.
- מקל את מוסיף על פיסת סרט דו צדדי לעטוף את הקלטת סביב המכסה של צלחת פטרי 10 ס"מ.
- מניחים את המכסה של צלחת פטרי במכונת הפלזמה, יחד עם הכלים התחתונים פתוחים זכוכית 35 מ"מ.
- הפעל את פני השטח של מוסיף של הזכוכית באמצעות טיפול פלזמה במשך 1 דקות ב 300 mTorr. שרביט פלזמה ידני יכול לשמש.
- באמצעות פינצטה, חבר במהירות את הצד החיובי, כלומר הצד המטופל, של הכנסה אחת(איור 1D)לחלק הזכוכית של צלחת תחתית זכוכית(איור 1E). חזור על הפעולה עבור כל הכלים.
- השתמש אצבע ואגודל מצביע כדי להפעיל לחץ אחיד תוך סיבוב צלחת תחתית הזכוכית. זה יבטיח אבטחה יציבה של הכנס לתבשיל התחתון זכוכית.
- דגירה את מזהי ה-SIDs(איור 1F)ב 60 °C (60 °F) במשך 20 דקות כדי לחזק את הדבקות בין זכוכית PDMS.
- בצע סבב שני של טיפול פלזמה על מזהי ה-SIDs, באמצעות אותן הגדרות כמו בשלב 1.21 או עם שרביט ידני. זה יהפוך את משטח PDMS חינם לדבוק פולי-L-ליצין בתמיסת הציפוי (ראה 1.26).
- הכן מחדש את הפתרונות הבאים.
- תמיסת ציפוי: 1x PBS המכיל 0.01% (vol/vol) פולי-L-ליצין [למשל, להוסיף 10 μL של 0.1% (vol/vol) פולי-L-ליצין ל 90 μL של 1x PBS].
- פתרון מוצלב: מים מזוקקים המכילים גלוטרלדהיד 1x (vol/vol) [למשל, להוסיף 10 μL של 10x glutaraldehyde ל 90 μL של מים מזוקקים].
- פתרון אחסון: 1x PBS המכיל 10x (vol /vol) פניצילין-סטרפטומיצין [למשל, להוסיף 1 מ"ל של 100x פניצילין-סטרפטומיצין ל 9 מ"ל של 1x PBS].
- הוסף 35 μL של פתרון ציפוי לכל חור דגירה במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר.
- שאפו את הפולי-ל-ליצין ושטוף את כל ה-SID 3 פעמים במים מזוקקים.
- הוסף 35 μL של פתרון crosslinking לכל דגירה חור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- שאפו את פתרון ההצלבה ושטוף את כל ה-SID 3 פעמים במים מזוקקים.
- מוסיפים 70% אתנול לכל SID ומניחים תחת אור אולטרה סגול (UV) במשך 30 דקות.
- מתחת למכסה המנוע, שאפו אתנול ושטוף את ה-SID 3 פעמים במים מזוקקים.
- הוסף פתרון אחסון של 2.5 מ"ל לכל SID.
הערה: בשלב זה, ניתן לאחסן את מזהי ה- SID ב- 4 °C (60 °F) למשך שבוע. זה נצפתה כי כוח הכריכה בין PDMS וזכוכית פוחתת עם הזמן. מעבר לשבוע, מומלץ למשתמשים לבדוק את מזהי ה- SID עבור דליפה פוטנציאלית לפני השימוש. כדי לעשות זאת, לשאוף את פתרון האחסון ולהוסיף 35 μL של 1x PBS לתוך כל חור. לאחר השימוש, ניתן לקלף את מוסיף PDMS מהמנות התחתונות מזכוכית. כדי להשיג ניקוי אופטימלי של הכלים התחתונים זכוכית, כמה שוטף עם isopropanol וחומצה הידרוכלורית יש להשתמש כדי להסיר שאריות PDMS.
2. היווצרות ספרואיד והטמעה בקולגן (משך 4 ימים)
הערה: להדמיה חיה של כדוריות, לאורך זמן או בקטעי וידאו לשגות בזמן, להשתמש בקו התא המבטא חלבון ציטופלסמי ו / או גרעיני פלואורסצנטי. אם קו תא כזה זמין, בצע את השלבים המתוארים בסעיף זה. לחלופין, בסעיף 3, פרוטוקול מוצע לתייג תאים סרטניים בספרואידים באמצעות צבע ציטופלסמי.
- טופס spheroids של 4T1 ו / או 67NR תאים באמצעות טכניקת טיפה תלויה, כפי שתואר קודם לכן4,5,6,7, עם 3,000 תאים / 40 טיפת μL וזמן דגירה של 3 ימים. הוסף את atelocollagen שור אני פתרון אחרון ולשמור על כל הפתרונות על קרח, בכל עת.
- זהה את הכדורואידים שנוצרו כראוי באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
- מלא צינור חרוט 15 מ"ל עם 8 מ"ל של מדיום מלא שחומם מראש.
- לאסוף ספרואידים עם פיפטה P1000 ולהעביר צינור חרוט 15 מ"ל. הרטב את קצה פיפטה על ידי pipetting כמה מדיום שלם פנימה והחוצה כדי למנוע spheroids להידבק לקירות הפנימיים של קצה פיפטה ולהגביל אובדן ספרואיד.
- אפשר לספרואידים לשקוע לתחתית הצינור ולשטוף בזהירות את הכדורואידים על ידי החלפת המדיום. חזור על הפעולה פעמיים.
- הכן 5 מ"ג / מ"ל קולגן אני פתרון על פי המלצות היצרן (הליך ג'לציה חלופי, ראה חישוב למופת להלן). החלף את המים המזוקקים במדיום מלא. בעת חישוב נפח המדיום לשימוש, קח בחשבון כי spheroids יתווספו 20 μL של מדיום מלא [למשל, עבור SID אחד, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL של קולגן 5 מ"ג / מ"ל אני נחוץ (להכין 20% תוספת כדי להסביר אובדן צינור בעת טיפול נוזלים צמיג); 2 2 μL של מדיום מלא + 10.8 μL של 10x PBS + 1.2 μL של 1 M NaOH + 54 μL של 10 מ"ג / מ"ל קולגן אני מלאי].
- לאסוף את כל spheroids ב 20 μL של בינוני, באמצעות פיפטה P200, ולהוסיף אותם לתמיסת קולגן אני מוכן בשלב 2.6.
- לאט לערבב את הפתרון על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי למנוע הטרוגניות בריכוז קולגן אני, הגבלת היווצרות בועה. שמור את הפתרון על קרח.
- הסר את פתרון האחסון מה- SID ושטוף 3 פעמים עם 3 מ"ל של 1x PBS. לאחר הכביסה הסופית, השאירו את ה- SID יבש כדי לא לדלל את פתרון הקולגן I.
- התחל טיימר ולחלק 30 μL של פתרון קולגן אני המכיל ספרואיד אחד לתוך אחד משלושת החורים של SID. יש לוודא שספרואיד יחיד כלול ב-30 μL.
- חזור על שלב 2.10 פעמיים נוספות כדי למלא את כל 3 החורים של SID.
- השתמש בקצה פיפטה של 10 μL כדי למרכז מחדש את הכדורואיד אם הוא ממוקם קרוב לגבול PDMS. אם שניים או שלושה ספרואידים בסופו של דבר מחלקים באחד החורים, אותו קצה פיפטה יכול לשמש כדי להפריד את הספרוידים אחד מהשני. עצור את שעון העצר.
הערה: היפוך לעתים קרובות של ה- SID הפוך ומהופך, לאורך כל תקופת הפילמור וההתמצקות של הקולגן I, מבטיח שהספרואיד ממוקם במרכז האנכי של שכבת ה- ECM ומונע פלישה לתאים בדו-מימד. יש להגדיל את תדירות ההיפוך (היפוך). כמו תדירות היפוך נשלטת על ידי ספרואיד "חלוקת זמן" נמדד 2.10-2.12, יש למזער את זמן החלוקה. במעבדה שלנו, חלוקת הזמן היא 2 דקות בממוצע. - כדי למרכז אנכית את הכדורואיד בשכבת הקולגן, הפוך את ה- SID כלפי מטה ודגר ב- 37 °C (60 °F) לזמן מחלק.
- הפוך את ה- SID הפוך והדגירה ב- 37 °C (69 °F) לזמן מחלק.
הערה: משך הזמן שהספרואידים מבלים בכיוון ההפוך צריך להיות שווה לזמן המושקע בכיוון ההפוך. - חזור על שלבים 2.13 ו 2.14 במשך 30 דקות, עד קולגן אני polymerizes.
- הוסף 2.5 מ"ל של מדיום מלא / SID ואם יש צורך, לרכוש תמונה של spheroids עבור נקודת הזמן הראשונית.
- חזור על שלבים 2.10-2.16 אם נעשה שימוש במזהי זהות מרובים.
3. תיוג פלואורסצנטי של ספרואידים
- הדמיה חיה (משך 6-7 ימים)
הערה: אם קיים קו תאים המבטא חלבון פלואורסצנטי ציטופלסמי ו/או גרעיני, בצע את השלבים המתוארים בסעיף 2. לחלופין, עבור תיוג ציטופלסמי, הפרוטוקול הבא מוצע.- בצע את שלבים 2.1-2.5 של הפרוטוקול המתואר בסעיף 2.
- לדלל את הצבע הציטופלסמי ל 25 מיקרומטר ב 200 μL של מדיום ללא סרום.
הערה: בעוד צבע ציטופלסמי אדום משמש בניסוי זה, כל צבע זמין אחר צריך להיות מתאים. תאים סרטניים תויגו בתוך ספרואידים באמצעות צבעים גרעיניים מדוללים ל 20 מיקרומטר ב 200 μL של מדיום ללא סרום (ראה טבלה של חומרים). - לאחר הכביסה הסופית, resuspend spheroids בתמיסת ציטופלזמית או גרעינית צבע דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות, מוגן מפני אור.
הערה: עם גישה זו, תיוג התאים במרכז ספרואיד לא יהיה יעיל. כדי להשיג תיוג של כל התאים, הדגירה ניתן להאריך בן לילה, על ידי הנחת המנה על נדנדה. חלופות מתוארות בדיון. - לשטוף ספרואידים 3 פעמים במדיום מלא.
- המשך לשלבים 2.6-2.17 של הפרוטוקול המתואר בסעיף 2.
- ספירואידים של תמונה באמצעות הדמיה של זמן לשגות כל 10 דקות במשך 24-72 שעות (איור 2),או באמצעות הדמיה אורך, מדי יום, עד 7 ימים (איור 3). השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי סריקת לייזר, מטרת אוויר 10x (צמצם מספרי 0.4 ומרחק עבודה של 3.1 מ"מ), 1024 x 1024 פיקסלים, זמן חשיפה 8 מיקרוס/פיקסל, חור סיכה 90 מיקרומטר, 6 x 15 מיקרומטר z-צעדים ו -3 שדות תצוגה-כל אחד המכיל ספרואיד אחד.
הערה: להדמיה של זמן לשגות, השתמש בעוצמת לייזר מינימלית וצייד את המיקרוסקופ בתא סביבתי בטמפרטורה, לחות ובקרת גזים. תרבית את הכדורואידים המוטבעים ב 37 °C (70 °F) עבור > 8 שעות או לילה לפני ההדמיה כדי למזער את הזמן על המיקרוסקופ.
- זיהומים אימונופלואורסצנטיים של ספרואידים (משך 2 ימים)
הערה: ההליך המתואר כאן מותאם וממוטב מפרוטוקולים שפורסמו בעבר8,9. ניתן להשתמש בשיטה זו לאחר הפרוטוקול המתואר בסעיפים 2 ו- 3.1.- הכן מחדש את הפתרונות הבאים.
- פתרון תיקון: 1x PBS המכיל 4% PFA (vol / vol) [למשל, להוסיף 5 מ"ל של 16% (vol / vol) PFA ל 15 מ"ל של 1x PBS].
- פתרון תיקון וחלחלות: 1x PBS המכיל 4% PFA (vol /vol) ו 0.5% טריטון X-100 (vol / vol) [למשל, להוסיף 50 μL של טריטון X-100 כדי 10 מ"ל של פתרון תיקון].
- פתרון חסימה: 1x PBS המכיל 1% FBS (vol /vol) ו 1% BSA (wt / vol) [למשל, להמיס 100 מ"ג של BSA ב 10 מ"ל של 1x PBS, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של FBS].
- תמיסת כביסה: 1x PBS המכיל 0.05% טווין 20 (vol/vol) [למשל, להוסיף 25 μL של Tween 20 עד 50 מ"ל של 1x PBS].
- הסר את מדיום התרבות מה- SID ושטוף פעם אחת עם PBS 1x חם.
- הוסיפו 2 מ"ל של פתרון תיקון וחלחל לכל SID ותדגרו בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- הסר את פתרון התיקון והחמירה והוסף 2 מ"ל של פתרון תיקון לכל SID ודגר בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
- לשטוף 3 פעמים עם פתרון הכביסה.
- הוסף 2 מ"ל של פתרון חסימה לכל SID ודגר ב 4 °C (70 °F) עבור 24 שעות עם רעידות קלות.
הערה: בשלב זה, דגימות ניתן לדגור ב 4 °C (69 °F), במהלך סוף השבוע. שים לב שזמן חסימה ארוך יותר עלול להפריע להליך תיוג המערכת החיסונית. - לדלל נוגדנים ראשוניים בחסימת פתרון.
- הוסף 150 μL של פתרון חסימה עם נוגדנים ראשוניים / גם בצלחת 48-באר.
- באמצעות פינצטה עדינה, בזהירות לנתק את התקע של קולגן אני המכיל ספרואיד ולהעביר לתוך באר. חזור על הפעולה אם מספר ספירואידים מסומנים בתווית. לנגב כל נוזל שעשוי להישאר בפינצטה בעת עבודה עם נוגדנים שונים, כדי למנוע זיהום.
- דגירה לילה ב 4 מעלות צלזיוס עם רעידות קלות.
- הוסף 300 μL של פתרון כביסה לבארות ריקות ומלאות.
- מעבירים בזהירות את תקע הקולגן שאני מכיל ספרואיד לבאר "שטיפה".
- לשטוף 3 פעמים עם פתרון כביסה במשך 2 שעות, בטמפרטורת החדר עם רעידות קלות.
הערה: העברת התקעים של קולגן אני המכיל ספרואיד, במקום לשאוף את הפתרונות, יכול לעזור להפחית את אובדן מדגם נזק מדגם. - לדלל נוגדנים משניים, 4',6-diamidino-2-פנילינדול (DAPI) ו /או פאלודין בחסימת פתרון.
- הוסף 150 μL של פתרון חסימה עם נוגדנים משניים, DAPI ו / או phalloidin לכל באר.
- באמצעות פינצטה, מעבירים בזהירות את תקע הקולגן המכיל את הכדורואידים לבאר. חזור על הפעולה אם מספר ספירואידים מסומנים בתווית.
- דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 שעות עם רעידות קלות.
- חזור על שלבים 3.2.11 ו- 3.2.12.
- לשטוף 3 פעמים עם פתרון כביסה במשך 30 דקות, בטמפרטורת החדר עם רעידות קלות.
- באמצעות סכין גילוח, חותכים תוסף PDMS בן 3 גומות לשלושה חלקים כך שכל חלק מכיל חור.
- הנח שתי חתיכות של PDMS על שקופית מיקרוסקופ.
- הוסף טיפה של פתרון הרכבה באמצעות עצה P200 עם סוף לחתוך. מנע היווצרות בועה.
- מעבירים בזהירות קולגן שאני מחבר לכל חור.
הערה: אם הכדורואיד היה ממוקם בחלק העליון של תקע הקולגן, הפוך את תקע הקולגן כך שהספרואיד יתקרב יותר לכיסוי הזכוכית. - מניחים כיסוי על גבי חותם באמצעות קלטת.
- תן את המדגם יבש בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, מוגן מפני אור.
- יש לאחסן דגימות ב-4 מעלות צלזיוס, מוגנות מפני אור עד להדמיה.
- הכן מחדש את הפתרונות הבאים.
4. עיבוד תמונה כדי לנתח פלישה לסרטן לאורך זמן
הערה: התבנית הנדרשת עבור מאקרו זה היא תמונה בעלת ערוץ יחיד x,y,t שנשמרה כקובץ .tiff.
- אם נרכשו פרוסות z מרובות (כלומר x,y,z,t תמונה), פתח את התמונה בפיג'י ובחר תמונה | ערימות | פרויקט זי. מומלץ להשתמש באפשרות 'עוצמה מרבית'. לחלופין, ניתן להשתמש בפרוסת z בודדת להפעלת המאקרו. שמור את התמונה כקובץ .tiff.
- צור תיקיית "עיבוד" נפרדת בשולחן העבודה.
- בחר | קובץ שמירה בשם | רצף תמונות. השתמש בתבנית TIFF, עדכן את מספר הספרות בהתאם למספר המסגרות, סמן את התיבה כדי להשתמש בתווית פרוסה כשם קובץ ובחר אישור. בחר את התיקיה "עיבוד" שנוצרה בשלב 2.
- פתח תמונה אחת מהתיקיה "עיבוד". זה צריך להיות x,y תמונה, המתאים לנקודת זמן אחת.
- בחר תמונה | כוונון | סף אוטומטי. בתפריט הנפתח בחר את השיטה נסה הכל וסמן את התיבה עבור אובייקטים לבנים על רקע שחור.
- מופיעה תמונת מונטאז' המציגה את התוצאה עבור כל שיטת סף אוטומטית.
- זהה את שיטת הסף האוטומטית הטובה ביותר, לדוגמה RenyIEntropy.
- כדי לאשר את הבחירה בשיטת הסף האוטומטית, פתח כל תמונה אחרת מהתיקיה "עיבוד" ובדוק את שיטת הסף שנבחרה באמצעות Image | כוונון | סף אוטומטי.
- סגור את כל התמונות.
- הורד את המאקרו SpheroidAreaTime (קובץ משלים 2).
- פתח את המאקרו של פיג'י על-ידי גרירה ושחרור.
- בשורה 58, עדכן את שיטת הסף האוטומטית לפי הצורך.
- בשורה 62, עדכן את טווח הגודל בהתאם למידות התא.
- בחר הפעל.
- בחר את התיקיה "עיבוד" והקלד "עיבוד" כתיקיית האב ולאחר מכן בחר אישור.
- לאחר שההפעלה תסתיים, שמור את הטבלה "סיכום". העמודה הראשונה מציינת את שם התמונה; העמודה השלישית מציינת את האזור הכדורי; העמודות השישית, השביעית והשמונה מציינות את הפרמטרים עבור אליפסה המותקנת על הכדור.
- התיקיה "עיבוד" מכילה כעת תמונה מעובדת עבור כל נקודת זמן, כאשר ההרחבה _SpheroidArea.
הערה: אם מרכז הכדורים עמום, מלא אותו בלבן באמצעות כלי הבחירה, עבור כל נקודות הזמן ולאחר מכן המשך לשלב 3. באופן דומה, ניתן למלא את החלל סביב הכדוריד בשחור כדי "לנקות" את התמונה. אם התמונה נקייה, הגב לקו 61 כדי להאיץ את ההפעלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בשל תאימות ביולוגית שלה, PDMS נמצא בשימוש נרחב עבור microfabrication של ברים מוגבלים, בולים ותבניות, אשר מהפכה micropatterning והתקנים microfluidic. בשיטה המתוארת כאן, הוא משמש ליצירת מזהי SD, בארות להתאמה אישית כי לייעל הטמעה ספרואידית הליך הדמיה. איור 1 מדגים את הרכיבים העיקריים המשמשים לייצור מזהי ה- SID. כדי להטיל את תבנית ה-PDMS, מרווח בעובי 1 מ"מ מודפס בתלת-ממד (איור 1A,B),הממוקם בין שתי לוחות הזכוכית, אטום בקליפים גדולים. מזיגה ואפייה PDMS בחלל בין הצלחות יוצר גיליון בעובי 1 מ"מ של PDMS. סכמת ה- SID (איור 1C) מציינת את ממדי ההתקן האופטימלי, אולם שינוי קל מתרחש במרחקי החורים, עקב ניקוב ידני של חורים באמצעות אגרופי ביופסיה (איור 1D). איור 1D,F מציין חתכים מעגליים נקיים עם חורים מרווחים באופן שווה בתוך תוסף PDMS.
השימוש ב- SIDs מאפשר הטמעה יעילה, ומכאן הקלטה של פלישת תאים סרטניים לתוך קולגן I באמצעות זמן לשגות (איור 2, וידאו 1) או אורך (איור 3) הדמיה. למרות השימוש באותם תדרי היפוך עבור כל מזהי ה-SID במהלך פולמור קולגן I, תנוחות ספרואיד בתוך תקע הקולגן ישתנו מעט. לכן, חשוב להשתמש במטרה עם מרחק עבודה ארוך (>1 מ"מ). אחרת, התמקדות והדמיה עשוי להיות קשה עבור spheroids ממוקם קרוב לחלק העליון של תקע קולגן. לעומת זאת, ספרואידים הממוקמים קרוב לתחתית תקע הקולגן, יהיו תאים שיעברו למשטח הזכוכית ויעברו על הזכוכית, במקום לפלוש למטריצת הקולגן I. קטעי וידאו של ספרואידים כאלה צריך להיות מושלך. עובי תקע הקולגן, כאן כ 800 מיקרומטר, נשלט על ידי נפח מחולק בכל חור של SID ומותאם למרחקי פלישה spheroids התערוכה בפרוטוקול זה. ניתן להוריד את עובי תקע הקולגן על ידי חלוקת נפח נמוך יותר של קולגן I בכל חור של ה- SID, בעת שימוש בספרואידים קטנים או פולשניים פחות.
לניתוח נכון של הפלישה באמצעות המאקרו פיג'י, זה קריטי עבור תאים סרטניים להיות מתויג כראוי במהלך הפגישה הדמיה. כפי שצוין בשלב 4.17., שלב עיבוד התמונה מאפשר תיקון תמונה אם התיוג הוא תת אופטימלי. בעוד שאנו מדגימים הדמיה אורך במהלך 6 ימים (איור 3), הדורש ביטוי יציב של חלבון ציטופלזמי ו / או גרעיני פלואורסצנטי, הדמיה אורך דומה יכול להתבצע על פני זמן קצר יותר באמצעות תיוג עם צבעים.
בעקבות הדמיה חיה, אנו מציגים כמה תוצאות מהליך האימונולאבלינג של הקדרין האפיתל (E-cadherin), קורטקטין ו- F-actin (איור 4). בדוגמאות אלה, השתמשנו בקווי התאים 4T1 ו- 67NR. איור 5 מציג איור שלב אחר שלב של הליך עיבוד התמונה באמצעות המאקרו של פיג'י כדי למדוד את אזור הספרואיד לאורך זמן.
איור 1: ייצור מזהי ה-SID. (A) ייצוג סכמטי בתצוגה העליונה של המרווח. (B)מרווח מודפס בתלת-ממד. (C) ייצוג סכמטי בתצוגה העליונה של ה- SID. מוסיף PDMS בן 3 גומות (D) מאוגד למנה תחתונה מזכוכית (E), ויוצר את ה- SID הסופי (F). הממדים במילימטרים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הדמיה חיה של ספרואידים. נציג 20 שעות ו 40 שעות timepoints מ וידאו 1, הקרנה מקסימלית של ספרואיד 4T1. תאי 4T1 סומנו באמצעות צבע ציטופלסמי. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
איור 3: הדמיה אורכית של ספרואידים. מיקרוגרפים מייצגים (הקרנה מרבית) של ספרואיד מעורב 4T1/67NR המחודד מדי יום. תאי 4T1 ו-67NR מבטאים ביציבות את הקרלט הציטופלסמי ואת החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP), בהתאמה. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
איור 4: הדמיית שפעת של ספרואידים. מיקרוגרפים מייצגים (הקרנה מקסימלית) של ספרואיד 4T1 קבוע 2 ימים לאחר הטמעה קולגן I. E-cadherin (ציאן, A), קורטקטין (צהוב, B) ו- F-actin (מגנטה, A ו- B) תויגו. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
איור 5: ניתוח עיבוד תמונה. איור שלב אחר שלב של הליך עיבוד התמונה באמצעות המאקרו פיג'י (A) כדי למדוד את האזור של ספרואיד לאורך זמן (B). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
וידאו 1: וידאו נציג של ספרואיד 4T1 בתמונה כל 10 דקות עבור 46 שעות ו 10 דקות. 4T1 תאים תויגו באמצעות צבע ציטופלסמי. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר.
קובץ משלים 1: דגם תלת-ממד של המרווח (קובץ STL). אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
קובץ משלים 2: מאקרו SpheroidAreaTime. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
מרווח ההדפסה בתלת-ממד תוכנן ליצור יריעות בעובי 1 מ"מ של PDMS שניתן להשתמש בהן כדי ליצור בקלות צורות שונות של PDMS, כנדרש על-ידי היישומים הניסיוניים. בשל הפשטות של הייצור שלה ואת החופש לשנות את העיצוב, שיטה זו של הליהוק PDMS נבחרה עבור העיצוב הראשוני של SID. אם נדרש נפח גבוה של מזהי אבטחה, ניתן לייעל את הייצור על-ידי יצירת תבנית המודפסת בתלת-ממד, שכבר מכילה דיסקי PDMS עם שלושה חורים במרווחים שווים, וצמצום התהליך לשלב אחד. זה יבטל את הצורך לנקב כל דיסק, יחד עם שלושת החורים הבאים, ולהפחית את זמן ההכנה הכולל.
בעוד ניקוב 3 חורים מפותח לשימוש עם 35 מ"מ זכוכית התחתון מנות, גדלים אחרים זמינים המאפשרים יותר חורים ומכאן, יותר spheroids להיות בתמונה במקביל. בנוסף, זכוכית כיסוי בגודל מותאם אישית זמינה גם מסחרית, אשר, בשילוב עם מחזיקים מודפסים 3D, יכול לאפשר מבחנים כדוריים בתפוקה גבוהה. עם גישה כזו, גורם מגביל הוא המהירות של רכישת נתונים- למשל, בהדמיה הקונפוקלית הרב-צבעית שלנו, רכישת מחסנית תלת-ממדית של ספרואיד יחיד דורשת כ-2.5 דקות. לכן, רכישת ערימות 3D עבור 3 ספרואידים ב- SID דורש כ 8 דקות. כתוצאה מכך, כדי לשמור על תדירות ההדמיה המועדפת עלינו במהירות של 10 דקות לכל מחסנית, איננו יכולים להגדיל את מספר החורים ב- SIDs.
כדי להקליט ולכמת את הפלישה של תאים סרטניים חיים במודל ספירואיד 3D, הדמיה שדה בהיר ניתן להשתמש5. עם זאת, מיקרוסקופיה פלואורסצנטית עדיפה, שכן היא מספקת ניגודיות מוגברת, וקלות ודיוק בעיבוד התמונה. אם לא ניתן להשתמש בדור של קו תאים המבטא חלבון פלואורסצנטי ציטופלסמי ו/או גרעיני, אנו מציעים את השימוש בצבועים הציטופלזמיים. כמו זמן השמירה של צבעים ציטופלסמיים בתוך התאים הוא שלושה ימים בתנאי ההדמיה שלנו, תאים צריכים להיות מסומנים לאחר תקופה של 3 ימים בירידה תלויה, ומיד לפני ההטבעה. תיוג תאים לאחר ההטבעה עשוי לתייג את הקולגן באופן לא ספציפי ולהפחית את תיוג התאים. הדמיה במשך יותר מ-3 ימים לאחר ההטבעה דורשת שימוש בפרוטוקול זריעתספרואידים שונה 10 או קווי תאים המבטאים ביציבות חלבונים פלואורסצנטיים.
יצרנו ודימוינו בהצלחה ספרואידים המכילים בין 60 ל-5,000 תאים/טיפה. ספרואידים קטנים הם אידיאליים עבור הקלטת פלישה על פני מספר ימים, כמו אזור הפלישה כולו שלהם יכול בקלות להתאים לשדה אחד של תצוגה של מטרות הגדלה גבוהה יותר (20x-30x). בנוסף, הם יכולים בקלות להיות מתויגים לאורך עם צבעים ציטופלזמיים או גרעיניים. לבסוף, בשל הפיזור המופחת, ניתן לדמיין ולחלק כל תא בספרואיד. עם זאת, ספרואידים קטנים בקושי נראים בעיניים עירומות ועשויים לדרוש תיוג נוסף עם סמני רקמות. לעומת זאת, ספירואידים גדולים יותר קלים יותר לטיפול, אך רגישים יותר לטביעה לתחתית המנה, בשל משקלם. יתר על כן, תאים במרכז ספרואיד לא תמיד מסומנים בעת שימוש צבעים, או גלוי באמצעות מיקרוסקופיה confocal, אשר יש עומק חדירה של כ 100 מיקרומטר. כדי לדמיין את כל התאים הסרטניים ברחבי spheroids גדול באמצעות הדמיה לשגות זמן, מיקרוסקופיה multiphoton ניתן להשתמש, המציע יתרון נוסף של הדמיה סיבי קולגן על ידי הדור ההרמוני השני (SHG) ללא צורך תיוג. כמו כן, הדמיה יכולה להיעשות עם מיקרוסקופיה גיליון אור8,11,12, מתן זמן רכישת תמונה מופחתת ומכאן המאפשר מבחני ספרואיד תפוקה גבוהה, אלא גם דורש יותר אחסון נתונים ועיבוד תמונה מתקדם. אם קטעי וידאו לשגות זמן אינם נדרשים, הליך התיוג שלנו עבור spheroids 3D קבוע ניתן לשלב עוד יותר עם ניקוי אופטי8,10. בנוסף, cryosectioning של spheroids מוטבע יכול לחסל בעיות עם חדירה של צבע או נוגדן במהלך תיוג, כמו גם חדירה של אור במהלך ההדמיה. בידינו, לעומת זאת, ההקפאה המוצלחת הוגבלה לשלבים מוקדמים של פלישה ותאים לא פולשניים, בשל האתגרים הטכניים בשימור גדילים פולשים ארוכים ושבירים.
הפרוטוקול שלנו תואם גם את השימוש בצבעים גרעיניים, כדי לתייג תאים סרטניים בתוך הכדורואידים, המאפשר מעקב תא יחיד אחר נתונים לשגות בזמן. תוסף פיג'י TrackMate13 יכול לשמש כדי להפוך מעקב תאים לאוטומטי ולחלץ פרמטרים תנועתיות של תאים בודדים, כגון מהירות, מהירות מיידית והתמדה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לחברי טמפל ביו-הנדסה על דיונים חשובים. אנו מודים לדיוויד אמברוז בליבת הזרימה (בית הספר לרפואה של לואיס כץ) על עזרתו במיון תאים ולטוני בוהם ממרכז הרעיונות (המכללה להנדסה, אוניברסיטת טמפל) על העזרה בהדפסה בתלת מימד. אנו מודים גם למשאבי המימון שלנו: חוקר מחקר האגודה האמריקנית למלחמה בסרטן גרנט 134415-RSG-20-034-01-CSM, לכבוש סרטן עכשיו / פרס החוקר הצעיר, המכונים הלאומיים לבריאות, R00 CA172360 ו R01 CA230777, כל BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
