Summary
Hier wird ein Protokoll für die Herstellung eines sphäroiden Bildgebungsgeräts vorgestellt. Dieses Gerät ermöglicht eine dynamische oder Längsfluoreszenzbildgebung von Krebszellsphäroiden. Das Protokoll bietet auch ein einfaches Bildverarbeitungsverfahren für die Analyse der Krebszellinvasion.
Abstract
Die Invasion von Krebszellen aus dem Primärtumor in das angrenzende gesunde Gewebe ist ein früher Schritt in der Metastasierung. Invasive Krebszellen stellen eine große klinische Herausforderung dar, da es keine effiziente Methode für ihre Eliminierung gibt, sobald ihre Verbreitung im Gange ist. Ein besseres Verständnis der Mechanismen zur Regulierung der Krebszellinvasion kann zur Entwicklung neuartiger potenter Therapien führen. Aufgrund ihrer physiologischen Ähnlichkeit mit Tumoren, Sphäroide in Kollagen eingebettet I wurden ausgiebig von Forschern verwendet, um die Mechanismen für die Invasion von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix (ECM) zu untersuchen. Dieser Test wird jedoch durch (1) einen Mangel an Kontrolle über die Einbettung von Spheroiden in das ECM begrenzt; (2) hohe Kosten für Kollagen-I- und Glasbodenschalen, (3) unzuverlässige immunfluoreszierende Kennzeichnung aufgrund des ineffizienten Eindringens von Antikörpern und Fluoreszenzfarbstoffen und (4) zeitaufwändige Bildverarbeitung und Quantifizierung der Daten. Um diesen Herausforderungen zu begegnen, haben wir das dreidimensionale (3D) Sphäroidprotokoll optimiert, um fluoreszierend markierte Krebszellen, die in Kollagen I eingebettet sind, entweder mithilfe von Zeitraffervideos oder Längsbildgebung abzubilden und die Invasion von Krebszellen zu analysieren. Zunächst beschreiben wir die Herstellung eines Sphäroid-Bildgebungsgeräts (SID), um Sphäroide zuverlässig und in ein minimales Kollagen-I-Volumen einzubetten, wodurch die Assay-Kosten gesenkt werden. Als Nächstes zeichnen wir die Schritte zur robusten Fluoreszenzkennzeichnung von lebenden und festen Sphäroiden ab. Schließlich bieten wir ein einfach zu bedienendes Fidschi-Makro für die Bildverarbeitung und Datenquantifizierung. Insgesamt bietet diese einfache Methode eine zuverlässige und erschwingliche Plattform, um die Krebszellinvasion in Kollagen I zu überwachen. Darüber hinaus kann dieses Protokoll leicht an die Bedürfnisse der Benutzer angepasst werden.
Introduction
Während der Krebsprogression können Krebszellen einen motilen und invasiven Phänotyp erwerben, der es ihnen ermöglicht, der Tumormasse zu entkommen und in das umgebende Gewebe einzudringen1. Schließlich können diese invasiven Krebszellen in sekundären Organen erreichen und wachsen, ein Prozess namens Krebsmetastasierung1. Metastasen verursachen mehr als 90% der krebsbedingten Todesfälle2. Ein Grund dafür ist, dass, während lokalisierte Tumoren klinisch überschaubar sind, keine effizienten Methoden zur Eliminierung invasiver Krebszellen existieren, sobald eine metastasierende Ausbreitung stattgefunden hat. Daher stellt das Auftreten invasiver Krebszellen und der Übergang von einer lokalisierten zu einer invasiven Krankheit eine große klinische Herausforderung dar. Die Bestimmung, wie Krebszellen ein invasives Verhalten initiieren und aufrecht erhalten, kann zur Entwicklung neuartiger potenter Therapien führen.
Das 3D-Sphäroidmodell ist eine ideale Plattform, um das motile Verhalten von Krebszellen unter kontrollierten, aber physiologisch relevanten Bedingungen zu untersuchen3. Tatsächlich werden in diesem Test Sphäroide von Krebszellen in die extrazelluläre Matrix (ECM) eingebettet, zum Beispiel Kollagen I, das einen vereinfachten Tumor imitiert. Dann wird die Bildgebung verwendet, um die Invasion von Krebszellen aus dem Sphäroid in die Kollagenmatrix zu visualisieren. Mehrere Herausforderungen schränken dieses Verfahren jedoch ein.
Die erste Herausforderung tritt bei der Einbettungsstufe auf, wo sich die flüssige Kollagenmatrix über die Telleroberfläche ausbreiten kann, wodurch das Sphäroid den Boden der Schale berührt. Folglich breiten sich Zellen aus dem Sphäroid auf der zweidimensionalen (2D) Oberfläche aus und brechen die dreidimensionale (3D) Sphäroidmorphologie. Die Erhöhung des Kollagenvolumens ist eine effiziente, aber kostspielige Lösung. Um zu verhindern, dass sich Zellen auf der 2D-Oberfläche ausbreiten und gleichzeitig ein minimales Kollagenvolumen beibehält, haben wir ein Sphäroid-Bildgebungsgerät (SID) entwickelt, indem wir einen 1 mm dicken 3-Loch-Polydimethylsiloxan (PDMS)-Einsatz auf eine Glasbodenschale begrenzt haben.
Die zweite Herausforderung des Sphäroid-Assays ist die Kennzeichnung von Krebszellen in Sphäroiden, die durch das schlechte Eindringen von Antikörpern und fluoreszierenden Farbstoffen begrenzt wird, ein Effekt, der mit der Sphäroidgröße zunimmt. Während die ideale Lösung für die Kennzeichnung von Zellen die Etablierung von Zelllinien ist, die fluoreszierende Proteine stabil ausdrücken, ist diese Option meist auf verewigte Zelllinien beschränkt und durch die Verfügbarkeit von fluoreszierenden Proteinchimären begrenzt. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung von festen Sphäroiden sowie die effiziente Verwendung eines zytoplasmatischen Farbstoffs zur Kennzeichnung von Zellen unmittelbar vor dem Einbetten des Sphäroids.
Die dritte Herausforderung des Sphäroid-Assays ist das Fehlen einfacher Fidschi-Makros für die halbautomatische Quantifizierung der Zellinvasion im Laufe der Zeit. Um dieser Herausforderung zu begegnen, beschreiben wir eine einfache Methode, um den Sphäroidbereich im Laufe der Zeit zu analysieren. Wir veranschaulichen die Vorteile dieses Protokolls anhand der Zelllinien 4T1 und 67NR als Beispiele.
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Protocol
1. Herstellung eines Spheroid Imaging Device (SID) zur Optimierung der Sphäroideinbettung (Dauer 1 Tag)
- Erstellen Sie den Abstandsraum mit einem 3D-Drucker(Abbildung 1A, B und Zusatzdatei 1).
- Ein 10:1 (Wt/Wt)-Verhältnis von Basispolymer:Verkreuzer in einem Kunststoffbecher [z.B. 20 g Ethylbenzol-Basispolymer und 2 g Silikonharzverlinker zur Herstellung von Polydimethylsiloxan (PDMS)] wiegen.
- Mischen Sie die PDMS-Lösung im Kunststoffbecher mit einer Einwegpipette gründlich.
- Legen Sie den Kunststoffbecher in eine Vakuumkammer, um die Luftblasen aus der Mischung zu entfernen. Lösen Sie schnell den Vakuumdruck, um die kleine Menge an Luft, die an der Oberfläche des Gemischs eingeschlossen ist, zu entfernen und die verbleibenden Luftblasen abzuleiten.
- Inkubieren Sie den 3D-gedruckten Abstandsraum bei 100 °C für 5 min, um seine Flexibilität zu erhöhen.
- Reinigen Sie die beiden Glasplatten, die verwendet werden, um die PDMS-Form gründlich zu konstruieren, indem Sie sie mit 100% Isopropanol abwischen. Wenn die Glasplatten zuvor verwendet wurden, um PDMS zu gießen, achten Sie darauf, alle verbleibenden alten PDMS zu entfernen, indem Sie die Glasplatten vorsichtig mit einer Rasierklinge kratzen und sie mit 100% Isopropanol abwischen.
- Konstruieren Sie die Form, indem Sie den 3D-gedruckten Abstandsraum bündig zwischen die beiden sauberen Glasplatten platzieren.
- Versiegeln Sie die Form mit großen Binderclips an den Außenkanten der Glasplatten. Platzieren Sie zwei Binderclips am unteren rand und einen auf der oberen Ecke.
- Prüfen Sie den oberen Teil der Form, um sicherzustellen, dass der Abstandsabstand mit den Glasplatten bündig ist. Dadurch wird sichergestellt, dass keine Verformungen vorhanden sind und ein gleichmäßiges Blatt PDMS erstellt wird.
HINWEIS: Wenn das resultierende Blatt nicht gleichmäßig dick ist, müssen die Clips leicht angepasst werden. - Schneiden Sie die Spitze einer Einweg-Pipette (ca. 2 cm von der Spitze) und fügen Sie die PDMS-Mischung mit einer langsamen und konstanten Rate in die obere linke Ecke der Form. Gießen Sie die Mischung langsam, um die Schaffung von großen Lufttaschen zu verhindern.
- Legen Sie die Form in eine Vakuumkammer, um Luftblasen zu entfernen, die sich während des Gießens gebildet haben.
- Heilen Sie das PDMS, indem Sie die Form bei 100 °C für 1 h inkubieren.
- Holen Sie die Form aus dem Inkubator und lassen Sie es abkühlen, um zu berühren.
- Entfernen Sie die Binderclips und Glasplatten aus dem Abstandsraum, der das ausgehärtete PDMS enthält.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die Dichtung zu durchschneiden, die auf allen vier Seiten der Form zwischen dem Abstandshalter und der Glasplatte erstellt wurde. Mit allen vier Seiten geschnitten, beginnen Sie, die Form auseinander zu ziehen, um die PDMS-Platte im Abstandsraum zu offenbaren.
- Das neue PDMS-Blatt vorsichtig mit einer Pinzette vom Abstandsraum abziehen.
- Auf einer Schneidmatte PDMS-Scheiben mit einem Durchmesser von 17,5 mm aus dem Blech herausstanzen und dann drei gleichmäßig verteilte Löcher mit 5,5 mm Durchmesser mit biopsieverschiedenen Stempeln unterschiedlicher Größe ausstanzen. Hier werden diese 3-Loch-PDMS-Festplatten als "Inserts" bezeichnet (Abbildung 1C).
HINWEIS: Ungleichmäßige Schnitte, die in das PDMS vorgenommen werden, oder eine fehlerhafte Bindung über Plasmabehandlung können zu zukünftigen Leckagen führen. - Reinigen Sie jeden Einsatz, indem Sie staubpartikel vorsichtig mit Klebeband entfernen.
- Stecken Sie die Einsätze auf ein Stück doppelseitiges Klebeband und wickeln Sie das Band um den Deckel einer 10 cm Petrischale.
- Legen Sie den Deckel der Petrischale in die Plasmamaschine, zusammen mit den offenen 35 mm Glasbodenschalen.
- Aktivieren Sie die Oberfläche der Einsätze und des Glases über Plasmabehandlung für 1 min bei 300 mTorr. Ein handgehaltener Plasmastab kann verwendet werden.
- Mit einer Pinzette schnell die Oberseite, d.h. behandelte Seite, eines Einsatzes (Abbildung 1D) an den Glasteil einer Glasbodenschale (Abbildung 1E) zu befestigen. Wiederholen Sie dies für alle Gerichte.
- Verwenden Sie Zeigerfinger und Daumen, um einen gleichmäßigen Druck anzuwenden, während Sie die Glasbodenschale drehen. Dadurch wird eine stabile Befestigung des Einsatzes an der Glasbodenschale gewährleistet.
- Inkubieren Sie die SIDs (Abbildung 1F) bei 60 °C für 20 min, um die Haftung zwischen Glas und PDMS zu stärken.
- Führen Sie eine zweite Runde der Plasmabehandlung auf den SIDs mit den gleichen Einstellungen wie in Schritt 1.21 oder mit dem Handstab durch. Dadurch haftet die freie PDMS-Oberfläche an dem Poly-L-Lysin in der Beschichtungslösung (siehe 1.26).
- Die folgenden Lösungen frisch vorbereiten.
- Beschichtungslösung: 1x PBS mit 0,01% (vol/vol) Poly-L-Lysin [z.B. 10 l 0,1% (vol/vol) Poly-L-Lysin zu 90 l von 1x PBS hinzufügen].
- Vernetzungslösung: Destilliertes Wasser mit 1x (vol/vol) Glutaraldehyd [z.B. 10 l 10x Glutaraldehyd zu 90 l destilliertem Wasser hinzufügen].
- Lagerungslösung: 1x PBS mit 10x (vol/vol) Penicillin-Streptomycin [z.B. 1 ml 100x Penicillin-Streptomycin zu 9 ml von 1x PBS hinzufügen].
- Fügen Sie 35 l Beschichtungslösung pro Loch hinzu und brüten Sie 1 h bei Raumtemperatur.
- Das Poly-L-Lysin ansaugen und den gesamten SID 3 Mal mit destilliertem Wasser abspülen.
- Fügen Sie 35 L Vernetzlösung pro Lochinkubat für 30 min bei Raumtemperatur hinzu.
- Die Vernetzungslösung ansaugen und den gesamten SID dreimal mit destilliertem Wasser abspülen.
- Fügen Sie 70% Ethanol in jede SID und legen Sie unter ultraviolettem (UV) Licht für 30 min.
- Unter der Haube Ethanol ansaugen und den SID dreimal mit destilliertem Wasser abspülen.
- Fügen Sie 2,5 ml Speicherlösung pro SID hinzu.
HINWEIS: In diesem Stadium können die SIDs eine Woche lang bei 4 °C gelagert werden. Es wurde beobachtet, dass die Bindungsfestigkeit zwischen PDMS und Glas im Laufe der Zeit abnimmt. Über eine Woche hinaus wird Benutzern empfohlen, die SIDs vor der Verwendung auf mögliche Leckagen zu testen. Um dies zu tun, aspirieren Sie die Speicherlösung und fügen Sie 35 l 1x PBS in jede Bohrung. Nach Gebrauch können PDMS-Einsätze von den Glasbodenschalen abgezogen werden. Um eine optimale Reinigung der Glasbodenschalen zu erreichen, sollten mehrere Wässen mit Isopropanol und Salzsäure verwendet werden, um PDMS-Rückstände zu entfernen.
2. Sphäroidbildung und Einbettung in Kollagen (Dauer 4 Tage)
HINWEIS: Verwenden Sie für die Live-Bildgebung von Sphäroiden längs oder in Zeitraffervideos eine Zelllinie, die ein zytoplasmatisches und/oder nukleares fluoreszierendes Protein ausdrückt. Wenn eine solche Zelllinie verfügbar ist, führen Sie die in diesem Abschnitt beschriebenen Schritte aus. Alternativ wird in Abschnitt 3 ein Protokoll vorgeschlagen, um Krebszellen in Sphäroiden mit einem zytoplasmatischen Farbstoff zu kennzeichnen.
- Form sphäroide von 4T1 und/oder 67NR Zellen mit der Hängendrop-Technik, wie zuvor beschrieben4,5,6,7, mit 3.000 Zellen/40 L Tröpfchen und einer 3-Tägigen Inkubationszeit. Fügen Sie das Rind atelocollagen I Lösung zuletzt und halten Sie alle Lösungen auf Eis, zu jeder Zeit.
- Identifizieren Sie die korrekt geformten Sphäroide mit einem Hellfeldmikroskop.
- Füllen Sie ein 15 ml kegelförmiges Rohr mit 8 ml vorgewärmten kompletten Medium.
- Sphäroide mit einer P1000 Pipette sammeln und in das 15 ml konische Rohr übertragen. Befeuchten Sie die Pipettenspitze, indem Sie ein komplettes Medium ein- und auspfeifen, um zu verhindern, dass Sphäroide an den Innenwänden der Pipettenspitze kleben und den Sphäroidverlust begrenzen.
- Lassen Sie Sphäroide auf den Boden des Rohres sinken und waschen Sie die Sphäroide vorsichtig, indem Sie das Medium austauschen. Wiederholen Sie dies zweimal.
- Bereiten Sie eine 5 mg/ml Kollagen-I-Lösung gemäß den Empfehlungen des Herstellers vor (alternatives Gelationsverfahren, siehe beispielhafte Berechnung unten). Ersetzen Sie das destillierte Wasser durch ein komplettes Medium. Bei der Berechnung des Zu verwendenden Mediumvolumens ist zu berücksichtigen, dass Sphäroide in 20 l des vollständigen Mediums zugesetzt werden [z. B., für eine SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 l von 5 mg/ml Kollagen I wird benötigt (vorbereiten 20 % extra für Pipettierverlust beim Umgang mit viskosen Flüssigkeiten zu berücksichtigen); 22 l des kompletten Mediums + 10,8 l von 10x PBS + 1,2 l von 1 M NaOH + 54 l von 10 mg/m CollageLn I Stock].
- Sammeln Sie alle Sphäroide in 20 L Medium, mit einer P200 Pipette, und fügen Sie sie der Kollagen I Lösung in Schritt 2.6 vorbereitet.
- Mischen Sie die Lösung langsam, indem Sie nach oben und unten pfeifen, um Heterogenität in der Kollagen-I-Konzentration zu vermeiden und die Blasenbildung zu begrenzen. Halten Sie die Lösung auf Eis.
- Entfernen Sie die Speicherlösung aus der SID(s) und waschen Sie sie 3 Mal mit 3 ml 1x PBS. Nach der letzten Wäsche, lassen Sie die SID(s) trocken, so dass nicht die Kollagen I Lösung verdünnen.
- Starten Sie einen Timer und geben Sie 30 l der Kollagen-I-Lösung, die ein Sphäroid enthält, in eines der drei Löcher der SID. Stellen Sie visuell sicher, dass ein einzelnes Sphäroid in den 30 l enthalten ist.
- Wiederholen Sie Schritt 2.10 zweimal, um alle 3 Löcher einer SID zu füllen.
- Verwenden Sie eine Pipette-Spitze von 10 L, um das Sphäroid neu zu zentrieren, wenn es sich in der Nähe des PDMS-Rahmens befindet. Wenn zwei oder drei Sphäroide in einer der Löcher abgegeben werden, kann dieselbe Pipettenspitze verwendet werden, um die Sphäroide voneinander zu trennen. Stoppen Sie den Timer.
HINWEIS: Das häufige Umkehren des SID auf dem Kopf und auf dem Kopf, während der gesamten Periode der Kollagen I Polymerisation und Erstarrung, stellt sicher, dass das Sphäroid in der vertikalen Mitte der ECM-Schicht positioniert ist, und verhindert ein Eindringen von Zellen in 2D. Die Häufigkeit des Invertierens (Flipping) sollte maximiert werden. Da die Kippfrequenz durch das in 2.10-2.12 gemessene Sphäroid "Dosierzeit" gesteuert wird, sollte die Dosierzeit minimiert werden. In unserem Labor beträgt die Abgabezeit durchschnittlich 2 min. - Um das Sphäroid in der Kollagenschicht vertikal zu zentrieren, drehen Sie die SID auf den Kopf und brüten bei 37 °C für die Dosierzeit.
- Drehen Sie die SID nach oben und inkubieren Sie bei 37 °C für die Dosierzeit.
HINWEIS: Die Zeitspanne, die die Sphäroide in der umgedrehten Ausrichtung verbringen, sollte der Zeit entsprechen, die in der Upside-up-Ausrichtung verbracht wird. - Wiederholen Sie die Schritte 2.13 und 2.14 für 30 min, bis das Kollagen I polymerisiert.
- Fügen Sie 2,5 ml komplettes Medium/SID hinzu, und erfassen Sie bei Bedarf ein Bild der Sphäroide für den anfangs zeitpunkt.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.10-2.16, wenn mehrere SIDs verwendet werden.
3. Fluoreszenzkennzeichnung von Sphäroiden
- Live-Bildgebung (Dauer 6-7 Tage)
HINWEIS: Wenn eine Zelllinie verfügbar ist, die ein zytoplasmatisches und/oder nukleares fluoreszierendes Protein exdrückt, führen Sie die in Abschnitt 2 beschriebenen Schritte aus. Alternativ wird für die zytoplasmatische Etikettierung das folgende Protokoll vorgeschlagen.- Befolgen Sie die Schritte 2.1-2.5 des protokolls, das in Abschnitt 2 beschrieben wird.
- Verdünnen Sie den zytoplasmatischen Farbstoff auf 25 m in 200 L serumfreiem Medium.
HINWEIS: Während in diesem Experiment ein roter zytoplasmatischer Farbstoff verwendet wird, sollte jede andere verfügbare Farbe geeignet sein. Krebszellen wurden in Sphäroiden mit Kernfarbstoffen beschriftet, die auf 20 'M in 200 'L serumfreiem Medium verdünnt wurden (siehe Tabelle der Materialien). - Nach der Endwäsche sphärische Sphäroide in der zytoplasmischen oder nuklearen Farbstofflösung resuspendieren und bei Raumtemperatur 20 min vor Licht schützen.
HINWEIS: Bei diesem Ansatz ist die Beschriftung der Zellen im Sphäroidzentrum nicht effizient. Um die Kennzeichnung aller Zellen zu erreichen, kann die Inkubation über Nacht verlängert werden, indem die Schale auf eine Wippe gesetzt wird. Alternativen werden in der Diskussion beschrieben. - Sphäroide 3 mal in komplettem Medium waschen.
- Fahren Sie mit den Schritten 2.6-2.17 des Protokolls fort, das in Abschnitt 2 beschrieben wird.
- Bildsphäroide mittels Zeitraffer-Bildgebung alle 10 min für 24-72 h (Abbildung 2) oder über Längsbildgebung, täglich, für bis zu 7 Tage(Abbildung 3). Verwenden Sie ein laserscannendes Konfokalmikroskop, 10x Luftobjektiv (0,4 numerische Blende und 3,1 mm Arbeitsabstand), 1024 x 1024 Pixel, Belichtungszeit 8 s/Pixel, Loch 90 'm, 6 x 15'm z-Schritte und 3 Sichtfelder, die jeweils ein Sphäroid enthalten.
HINWEIS: Verwenden Sie für die Zeitraffer-Bildgebung minimale Laserleistung und statten das Mikroskop mit einer Umgebungskammer mit Temperatur-, Feuchtigkeits- und Gassteuerung aus. Die eingebetteten Sphäroide bei 37 °C für > 8 h oder über Nacht vor der Bildgebung besanieren, um die Zeit auf dem Mikroskop zu minimieren.
- Immunfluoreszenzfärbung von Sphäroiden (Dauer 2 Tage)
HINWEIS: Das hier beschriebene Verfahren wird von den zuvor veröffentlichten Protokollen8,9angepasst und optimiert. Diese Methode kann nach dem in den Abschnitten 2 und 3.1 beschriebenen Protokoll verwendet werden.- Die folgenden Lösungen frisch vorbereiten.
- Befestigungslösung: 1x PBS mit 4% PFA (vol/vol) [z.B. 5 ml von 16% (vol/vol) PFA zu 15 ml von 1x PBS hinzufügen].
- Befestigungs- und Permeabilisierungslösung: 1x PBS mit 4% PFA (vol/vol) und 0,5% Triton X-100 (vol/vol) [z.B. 50 l Triton X-100 bis 10 ml Befestigungslösung hinzufügen].
- Blockierlösung: 1x PBS mit 1% FBS (vol/vol) und 1% BSA (wt/vol) [z.B. 100 mg BSA in 10 ml 1x PBS auflösen, dann 100 l FBS hinzufügen].
- Waschlösung: 1x PBS mit 0,05% Tween 20 (vol/vol) [z.B. 25 l Tween 20 bis 50 ml 1x PBS hinzufügen].
- Entfernen Sie das Kulturmedium aus der SID(s) und waschen Sie es einmal mit warmen 1x PBS.
- Fügen Sie 2 ml Befestigungs- und Permeabilisierungslösung pro SID hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 5 min.
- Entfernen Sie die Befestigungs- und Permeabilisierungslösung und fügen Sie 2 ml Befestigungslösung pro SID hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur 20 min.
- Waschen Sie 3 mal mit der Waschlösung.
- Fügen Sie 2 ml Blockierlösung pro SID hinzu und brüten bei 4 °C für 24 h mit leichtem Schütteln.
HINWEIS: Bei diesem Schritt können Proben bei 4 °C über das Wochenende inkubiert werden. Bitte beachten Sie, dass eine längere Sperrzeit das Immunfluoreszenz-Etikettierungsverfahren beeinträchtigen kann. - Verdünnung primärer Antikörper in der Blockierlösung.
- Fügen Sie 150 L Blockierlösung mit primären Antikörpern/Well in eine 48-Well-Platte ein.
- Mit feiner Pinzette, entfernen Sie vorsichtig den Stecker von Kollagen I enthält ein Sphäroid und in einen Brunnen übertragen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn mehrere Sphäroide beschriftet sind. Wischen Sie alle Flüssigkeiten, die bei der Arbeit mit verschiedenen Antikörpern auf der Pinzette verbleiben könnten, um eine Kontamination zu verhindern.
- Über Nacht bei 4 °C mit leichtem Schütteln inkubieren.
- Fügen Sie 300 L Waschlösung zu leeren und vollen Brunnen.
- Übertragen Sie vorsichtig den Kollagenstecker, den ich mit einem Sphäroid in einen "Waschbrunnen" habe.
- Waschen Sie 3 mal mit Waschlösung für 2 h, bei Raumtemperatur und mit leichtem Schütteln.
HINWEIS: Das Übertragen der Kollagenstecker, die ich mit einem Sphäroid enthält, anstatt die Lösungen zu aspimitieren, kann helfen, Probenverluste und Probenschäden zu reduzieren. - Verdünnung von sekundären Antikörpern, 4',6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) und/oder Phalloidin in Blockierlösung.
- Fügen Sie 150 L Blockierlösung mit sekundären Antikörpern, DAPI und/oder Phalloidin pro Brunnen hinzu.
- Mit einer Pinzette den Kollagenstecker mit den Sphäroiden vorsichtig in den Brunnen übertragen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, wenn mehrere Sphäroide beschriftet sind.
- Bei Raumtemperatur 1 h mit leichtem Schütteln bebrüten.
- Wiederholen Sie die Schritte 3.2.11 und 3.2.12.
- Waschen Sie 3 mal mit Waschlösung für 30 min, bei Raumtemperatur mit leichtem Schütteln.
- Schneiden Sie mit einer Rasierklinge einen 3-Loch-PDMS-Einsatz in drei Teile, so dass jedes Teil eine Bohrung enthält.
- Legen Sie zwei PDMS-Stücke auf ein Mikroskopschlitten.
- Fügen Sie einen Tropfen Montagelösung mit einer P200-Spitze mit dem Ende abgeschnitten. Verhindern Sie Blasenbildung.
- Übertragen Sie vorsichtig ein Kollagen, das ich in jedes Loch stecke.
HINWEIS: Wenn das Sphäroid an der Oberseite des Kollagensteckers positioniert wurde, invertieren Sie den Kollagenstecker, sodass das Sphäroid näher am Glasdeckel landet. - Legen Sie einen Coverslip auf die Oberseite und versiegeln Sie mit Klebeband.
- Lassen Sie die Probe bei Raumtemperatur 10 min trocknen, vor Licht geschützt.
- Proben bei 4 °C lagern, bis zur Bildgebung vor Licht geschützt.
- Die folgenden Lösungen frisch vorbereiten.
4. Bildverarbeitung zur Analyse der Krebsinvasion im Laufe der Zeit
HINWEIS: Das für dieses Makro erforderliche Format ist ein einkanaliges x,y,t-Bild, das als .tiff Datei gespeichert wird.
- Wenn mehrere Z-Slices(z. B. x,y,z,t-Bild) erfasst wurden, öffnen Sie das Bild in Fidschi, und wählen Sie Bild | Stacks | Z-Projekt. Es wird empfohlen, die Option Max Intensity zu verwenden. Alternativ kann ein einzelnes Z-Slice verwendet werden, um das Makro auszuführen. Speichern Sie das Bild als .tiff Datei.
- Erstellen Sie einen separaten Ordner "Verarbeitung" auf dem Desktop.
- Wählen Sie Datei| Speichern als | Bildsequenz. Verwenden Sie das TIFF-Format, aktualisieren Sie die Ziffernnummer entsprechend der Anzahl der Frames, aktivieren Sie das Kontrollkästchen, um die Slice-Beschriftung als Dateinamen zu verwenden, und wählen Sie Okaus. Wählen Sie den Ordner "Verarbeitung" aus, der in Schritt 2 erstellt wurde.
- Öffnen Sie ein Bild aus dem Ordner "Verarbeitung". Es sollte ein xy-Bild sein, das einem einzelnen Zeitpunkt entspricht.
- Bild | auswählen Anpassen | Auto-Schwellenwert. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Methode Alle ausprobieren und aktivieren Sie das Kontrollkästchen für weiße Objekte auf schwarzem Hintergrund.
- Es wird ein Montagebild angezeigt, das das Ergebnis für jede automatisierte Schwellenwertmethode anzeigt.
- Identifizieren Sie die beste automatisierte Schwellenwertmethode, z. B. RenyIEntropie.
- Um die Auswahl für die automatisierte Schwellenwertmethode zu bestätigen, öffnen Sie ein anderes Bild aus dem Ordner "Verarbeitung", und testen Sie die gewählte Schwellenwertmethode mit Image | Anpassen | Auto-Schwellenwert.
- Schließen Sie alle Bilder.
- Laden Sie das SpheroidAreaTime-Makro (Ergänzende Datei 2) herunter.
- Öffnen Sie das Fidschi-Makro per Drag-and-Drop.
- Aktualisieren Sie in Zeile 58 die automatisierte Schwellenwertmethode nach Bedarf.
- Aktualisieren Sie in Zeile 62 den Größenbereich entsprechend den Zellenabmessungen.
- Wählen Sie Ausführenaus .
- Wählen Sie den Ordner "Verarbeitung" aus, und geben Sie "Verarbeitung" als übergeordneten Ordner ein, und wählen Sie dann Okaus.
- Sobald der Lauf beendet ist, speichern Sie die Tabelle "Zusammenfassung". Die erste Spalte gibt den Namen des Bildes an. die dritte Spalte zeigt den Sphäroidbereich an; Die sechste, siebte und achte Spalte geben die Parameter für eine Ellipse an, die auf das Sphäroid montiert ist.
- Der Ordner "Verarbeitung" enthält nun ein verarbeitetes Bild für jeden Zeitpunkt, wobei die Erweiterung _SpheroidArea.
HINWEIS: Wenn das Sphäroidzentrum abgeseut ist, füllen Sie es mit den Auswahlwerkzeugen für alle Zeitpunkte mit Weiß aus, und fahren Sie dann mit Schritt 3 fort. Ebenso kann der Raum um das Sphäroid mit Schwarz gefüllt werden, um das Bild zu "reinigen". Wenn das Bild sauber ist, kommentieren Sie die Zeile 61, um den Lauf zu beschleunigen.
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Representative Results
Aufgrund seiner Biokompatibilität wird PDMS häufig für die Mikrofertigung von Grenzbrunnen, Briefmarken und Formen verwendet, was Mikromusterundung und mikrofluidische Geräte revolutionierte. In der hier beschriebenen Methode wird es verwendet, um SIDs zu erstellen, anpassbare Brunnen, die Sphäroid-Einbettung und Bildgebungsverfahren optimieren. Abbildung 1 zeigt die wichtigsten Komponenten, die bei der Herstellung der SIDs verwendet werden. Um die PDMS-Form zu gießen, wird ein 1-mm dicker Abstandsabstand 3D gedruckt (Abbildung 1A,B), zwischen den beiden Glasplatten platziert, mit großen Clips versiegelt. Das Gießen und Backen von PDMS im Raum zwischen den Platten bildet ein 1 mm dickes Blatt PDMS. Der SID-Schaltplan (Abbildung 1C) zeigt die Abmessungen des optimalen Geräts an, jedoch kommt es aufgrund des manuellen Lochens von Löchern mit Biopsiesstanzen zu geringfügigen Abweichungen in den Lochabständen (Abbildung 1D). Abbildung 1D,F zeigt saubere kreisförmige Schnitte mit gleichmäßig verteilten Löchern innerhalb des PDMS-Einsatzes an.
Die Verwendung der SIDs erleichtert eine effiziente Einbettung und damit die Aufzeichnung der Invasion von Krebszellen in Kollagen I mit Zeitraffer (Abbildung 2, Video 1) oder Längsbild ( Abbildung3) Bildgebung. Trotz der Verwendung der gleichen Inversionsfrequenzen für alle SIDs während der Kollagen-I-Polymerisation, sphäroide Positionen innerhalb des Kollagen-Steckers werden leicht variieren. Daher ist es wichtig, ein Ziel mit einem langen Arbeitsabstand (>1 mm) zu verwenden. Andernfalls kann es schwierig sein, sphäroide zu fokussieren und zu bilden, die sich in der Nähe der Oberseite des Kollagensteckers befinden. Im Gegensatz dazu haben Sphäroide, die sich in der Nähe des Bodens des Kollagensteckers befinden, Zellen, die sich auf die Glasoberfläche bewegen und auf dem Glas wandern, anstatt in die Kollagen-I-Matrix einzudringen. Videos solcher Sphäroide müssen verworfen werden. Die Dicke des Kollagensteckers, hier ca. 800 m, wird durch das in jedem Loch der SID abgegebene Volumen gesteuert und an Invasionsabstände angepasst, die Sphäroide in diesem Protokoll aufweisen. Die Dicke des Kollagensteckers kann gesenkt werden, indem in jedem Loch der SID ein geringeres Kollagenvolumen I bei Verwendung kleinerer oder weniger invasiver Sphäroide verwendet wird.
Für eine ordnungsgemäße Analyse der Invasion mit dem Fidschi-Makro ist es entscheidend, dass Krebszellen im Laufe der Bildgebungssitzung ordnungsgemäß gekennzeichnet werden. Wie in Schritt 4.17. erwähnt, ermöglicht der Bildverarbeitungsschritt eine Bildkorrektur, wenn die Beschriftung suboptimal ist. Während wir die Längsbildgebung im Laufe von 6 Tagen veranschaulichen(Abbildung 3), die die stabile Expression von zytoplasmatischem und/oder kernkraftfluoreszierendem Protein erfordert, könnte eine ähnliche Längsbildgebung über einen kürzeren Zeitpunkt mit der Etikettierung mit Farbstoffen durchgeführt werden.
Nach live-Bildgebung präsentieren wir einige Ergebnisse des Immunlabeling-Verfahrens für das Epithel-Cadherin (E-Cadherin), Cortactin und F-Actin (Abbildung 4). In diesen Beispielen haben wir die Zelllinien 4T1 und 67NR verwendet. Abbildung 5 zeigt eine schrittweise Darstellung des Bildverarbeitungsverfahrens mithilfe des Fidschi-Makros, um die Fläche des Sphäroids im Zeitverlauf zu messen.
Abbildung 1: Herstellung der SIDs. (A) Die obere Ansicht ist eine schematische Darstellung des Spacers. (B) 3D gedruckter Abstandsraum. (C) Die schaltplantische Darstellung der SID in der obersten Ansicht. Ein 3-Loch PDMS Einsätze (D) ist an eine Glasbodenschale gebunden (E), wodurch die endgültige SID (F) erstellt wird. Die Abmessungen sind in Millimetern. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Live-Bildgebung von Sphäroiden. Repräsentative 20 h und 40 h Zeitpunkte von Video 1, maximale Projektion eines 4T1 Sphäroids. 4T1-Zellen wurden mit einem zytoplasmatischen Farbstoff beschriftet. Maßstabsleiste, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Längsbildgebung von Sphäroiden. Repräsentative Mikrographien (maximale Projektion) eines gemischten 4T1/67NR Sphäroids, das täglich abgebildet wird. 4T1- und 67NR-Zellen drücken das zytoplasmatische mScarlet- bzw. das grüne fluoreszierende Protein (GFP) stabil aus. Maßstabsleiste, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Immunfluoreszenz-Bildgebung von Sphäroiden. Repräsentative Mikrographien (maximale Projektion) eines 4T1-Sphäroids, das 2 Tage nach der Einbettung in Kollagen I fixiert wurde. E-Cadherin (Cyan, A), Cortactin (gelb, B) und F-Actin (Magenta, A und B) wurden beschriftet. Maßstabsleiste, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Bildverarbeitungsanalyse. Schritt-für-Schritt-Illustration des Bildverarbeitungsverfahrens mit dem Fidschi-Makro (A), um die Fläche des Sphäroids im Zeitverlauf zu messen (B). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Video 1: Repräsentatives Video eines 4T1-Sphäroids, das alle 10 min für 46 h und 10 min abgebildet wird. 4T1-Zellen wurden mit einem zytoplasmatischen Farbstoff beschriftet. Skala Bar, 100 m. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Zusatzdatei 1: 3D-Modell des Abstands (STL-Datei). Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzende Datei 2: SpheroidAreaTime Makro. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
Der 3D-gedruckte Abstandsraum wurde entwickelt, um 1 mm dicke Blätter von PDMS zu erstellen, die dann verwendet werden können, um einfach verschiedene Formen von PDMS zu erstellen, wie es von den experimentellen Anwendungen gefordert wird. Aufgrund der Einfachheit der Fertigung und der Freiheit, das Design zu ändern, wurde diese Methode des PDMS-Castings für das ursprüngliche Design der SID gewählt. Wenn ein hohes SID-Volumen erforderlich ist, kann die Produktion effizienter gestaltet werden, indem eine 3D-gedruckte Form erstellt wird, die bereits PDMS-Festplatten mit drei gleichmäßig verteilten Löchern enthält, und den Prozess auf einen Schritt reduziert. Dies würde die Notwendigkeit beseitigen, jede Scheibe zusammen mit den folgenden drei Löchern auszustechen und die Gesamtvorbereitungszeit zu verringern.
Während der 3-Loch-Stanz für den Einsatz mit 35 mm Glasbodenschalen entwickelt wurde, sind andere Größen erhältlich, die mehr Löcher und damit mehr Sphäroide parallel darstellen können. Darüber hinaus ist auch kundenspezifisches Deckglas im Handel erhältlich, das in Kombination mit 3D-gedruckten Halterungen sphäroide Mitspalt-Assays mit hohem Durchsatz ermöglichen kann. Bei einem solchen Ansatz ist der begrenzende Faktor die Geschwindigkeit der Datenerfassung – zum Beispiel in unserer mehrfarbigen Zeitraffer-Konfokal-Bildgebung benötigt die Erfassung des 3D-Stacks eines einzelnen Sphäroids ca. 2,5 Minuten. Daher dauert das Erfassen von 3D-Stacks für 3 Sphäroide in der SID ca. 8 Minuten. Um unsere bevorzugte Bildfrequenz bei 10 Minuten pro Stapel beizubehalten, können wir daher die Anzahl der Löcher in den SIDs nicht erhöhen.
Um die Invasion lebender Krebszellen im 3D-Sphäroidmodell aufzuzeichnen und zu quantifizieren, kann die Lichtfeld-Bildgebung verwendet werden5. Die Fluoreszenzmikroskopie wird jedoch bevorzugt, da sie einen erhöhten Kontrast sowie eine einfache und präzise Bildverarbeitung bietet. Wenn die Erzeugung einer Zelllinie, die ein zytoplasmatisches und/oder nukleares fluoreszierendes Protein exdrückt, nicht möglich ist, schlagen wir die Verwendung der zytoplasmischen Farbstoffe vor. Da die Retentionszeit zytoplasmatischer Farbstoffe in Zellen drei Tage in unseren bildgebenden Bedingungen beträgt, sollten Zellen nach der 3-Tage-Periode im hängenden Tropfen und unmittelbar vor der Einbettung gekennzeichnet werden. Die Beschriftung von Zellen nach der Einbettung kann das Kollagen nicht spezifisch beschriften und die Zellbeschriftung reduzieren. Die Bildgebung für länger als 3 Tage nach der Einbettung erfordert die Verwendung eines anderen Sphäroid-Saatprotokolls10 oder Zelllinien, die fluoreszierendes Protein(e) stabil exezieren.
Wir haben erfolgreich Sphäroide mit 60 bis 5.000 Zellen/Tropfen gebildet und abgebildet. Kleine Sphäroide sind ideal für die Aufzeichnung von Invasionübertritten über mehrere Tage, da ihr gesamtes Invasionsgebiet leicht in ein einziges Sichtfeld mit höheren Vergrößerungszielen (20x-30x) passen kann. Darüber hinaus können sie leicht durchgängig mit zytoplasmischen oder nuklearen Farbstoffen gekennzeichnet werden. Schließlich kann aufgrund der reduzierten Streuung jede Zelle im Sphäroid visualisiert und segmentiert werden. Kleine Sphäroide sind jedoch mit bloßen Augen kaum sichtbar und erfordern möglicherweise eine zusätzliche Beschriftung mit Gewebemarkern. Im Gegensatz dazu sind größere Sphäroide leichter zu handhaben, aber aufgrund ihres Gewichts anfälliger für das Sinken auf den Boden der Schale. Darüber hinaus werden Zellen im Sphäroidzentrum nicht immer beschriftet, wenn Farbstoffe verwendet werden, oder sichtbar mit konfokaler Mikroskopie, die eine Eindringtiefe von etwa 100 Mikrometern hat. Um alle Krebszellen in den großen Sphäroiden mittels Zeitraffer-Bildgebung zu visualisieren, kann eine Multiphotonenmikroskopie verwendet werden, was einen zusätzlichen Vorteil der Visualisierung von Kollagenfasern durch die zweite harmonische Generation (SHG) ohne Beschriftung bietet. Auch die Bildgebung kann mit Lichtbogenmikroskopie8,11,12durchgeführt werden, was eine reduzierte Bildaufnahmezeit bietet und somit sphäroide Assays mit hohem Durchsatz ermöglicht, aber auch mehr Datenspeicherung und erweiterte Bildverarbeitung erfordert. Wenn Keine Zeitraffervideos erforderlich sind, kann unser Etikettierungsverfahren für feste 3D-Sphäroide mit optischem Clearing8,10kombiniert werden. Darüber hinaus kann die Kryosektion der eingebetteten Sphäroide Probleme mit dem Eindringen von Farbstoff oder Antikörpern während der Etikettierung sowie beim Eindringen von Licht während der Bildgebung beseitigen. In unseren Händen beschränkte sich die erfolgreiche Kryosektion jedoch aufgrund der technischen Herausforderungen bei der Erhaltung langer und fragiler invasiver Stränge auf frühe Stadien der Invasion und nicht-invasiver Zellen.
Unser Protokoll ist auch mit der Verwendung von Kernfarbstoffen kompatibel, um Krebszellen in den Sphäroiden zu kennzeichnen, was die Einzelzellverfolgung von Zeitrafferdaten ermöglicht. Das Fidschi-Plugin TrackMate13 kann verwendet werden, um Zellverfolgung zu automatisieren und Motilitätsparameter einzelner Zellen zu extrahieren, wie Geschwindigkeit, sofortige Geschwindigkeit und Persistenz.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Wir danken den Mitgliedern von Temple Bioengineering für wertvolle Diskussionen. Wir danken David Ambrose vom Flow Cytometry Core (Lewis Katz School of Medicine) für seine Unterstützung bei der Zellsortierung und Tony Boehm vom IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) für die Hilfe beim 3D-Druck. Wir danken auch unseren Fördergeldern: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 und R01 CA230777, alle an BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
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