Summary
Hier wordt een protocol gepresenteerd voor de fabricage van een sferoïde beeldvormingsapparaat. Dit apparaat maakt dynamische of longitudinale fluorescentiebeeldvorming van kankercelsferoïden mogelijk. Het protocol biedt ook een eenvoudige beeldverwerkingsprocedure voor de analyse van kankercelinvasie.
Abstract
De invasie van kankercellen van de primaire tumor in de aangrenzende gezonde weefsels is een vroege stap in uitzaaiingen. Invasieve kankercellen vormen een grote klinische uitdaging omdat er geen efficiënte methode bestaat voor hun eliminatie zodra hun verspreiding aan de gang is. Een beter begrip van de mechanismen die de invasie van kankercellen reguleren, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe krachtige therapieën. Vanwege hun fysiologische gelijkenis met tumoren, sferoïden ingebed in collageen ben ik uitgebreid gebruikt door onderzoekers om de mechanismen voor kankercelinvasie in de extracellulaire matrix (ECM) te bestuderen. Deze bepaling wordt echter beperkt door (1) een gebrek aan controle over de inbedding van sferoïden in het ECM; (2) hoge kosten van collageen I en glazen bodemschotels, (3) onbetrouwbare immunofluorescente etikettering, als gevolg van de inefficiënte penetratie van antilichamen en fluorescerende kleurstoffen en (4) tijdrovende beeldverwerking en kwantificering van de gegevens. Om deze uitdagingen aan te pakken, hebben we het driedimensionale (3D) sferoïde protocol geoptimaliseerd om fluorescerend gelabelde kankercellen die zijn ingebed in collageen I in beeld te brengen, hetzij met behulp van time-lapse video's of longitudinale beeldvorming, en de invasie van kankercellen te analyseren. Ten eerste beschrijven we de fabricage van een sferoïde imaging device (SID) om sferoïden betrouwbaar en in een minimaal collageen I-volume in te sluiten, waardoor de assaykosten worden verlaagd. Vervolgens definiëren we de stappen voor robuuste fluorescentieetikettering van levende en vaste sferoïden. Tot slot bieden we een gebruiksvriendelijke Fiji-macro voor beeldverwerking en gegevenskwantificering. Al met al biedt deze eenvoudige methodologie een betrouwbaar en betaalbaar platform om de invasie van kankercellen in collageen I te monitoren. Bovendien kan dit protocol eenvoudig worden aangepast aan de behoeften van de gebruikers.
Introduction
Tijdens kankerprogressie kunnen kankercellen een beweeglijk en invasief fenotype krijgen, waardoor ze aan de tumormassa kunnen ontsnappen en in de omliggende weefsels kunnen binnendringen1. Uiteindelijk kunnen deze invasieve kankercellen secundaire organen bereiken en groeien, een proces dat kankermetastasen1wordt genoemd. Uitzaaiingen veroorzaakt meer dan 90% van de kankergerelateerde sterfgevallen2. Een reden hiervoor is dat, hoewel gelokaliseerde tumoren klinisch beheersbaar zijn, er geen efficiënte methoden bestaan voor de eliminatie van invasieve kankercellen zodra gemetastaseerde verspreiding heeft plaatsgevonden. Daarom vormt de opkomst van invasieve kankercellen en de overgang van een gelokaliseerde naar een invasieve ziekte een grote klinische uitdaging. Het bepalen hoe kankercellen een invasief gedrag initiëren en ondersteunen, kan leiden tot de ontwikkeling van nieuwe krachtige therapieën.
Het 3D-sferoïdemodel is een ideaal platform om het beweeglijke gedrag van kankercellen onder gecontroleerde, maar fysiologisch relevante aandoeningen te onderzoeken3. Inderdaad, in deze test zijn sferoïden van kankercellen ingebed in extracellulaire matrix (ECM), bijvoorbeeld collageen I, dat een vereenvoudigde tumor nabootst. Vervolgens wordt beeldvorming gebruikt om de invasie van kankercellen van het sferoïde in de collageenmatrix te visualiseren. Meerdere uitdagingen beperken deze procedure echter.
De eerste uitdaging vindt plaats bij de insluitstap, waar de vloeibare collageenmatrix zich over het oppervlak van de schotel kan verspreiden, waardoor de sferoïde de onderkant van de schaal raakt. Bijgevolg verspreidden cellen van de sferoïde zich op het tweedimensionale (2D) oppervlak en braken de driedimensionale (3D) sferoïde morfologie. Het verhogen van het volume collageen is een efficiënte, maar kostbare oplossing. Om te voorkomen dat cellen zich op het 2D-oppervlak verspreiden, met behoud van een minimaal collageenvolume, ontwikkelden we een sferoïde beeldvormingsapparaat (SID) door een 1 mm dikke, 3-gaats polydimethylsiloxaan (PDMS) insert op een glazen bodemschaal te verbinden.
De tweede uitdaging van de sferoïdetest is het labelen van kankercellen in sferoïden, die wordt beperkt door de slechte penetratie van antilichamen en fluorescerende kleurstoffen, een effect dat toeneemt met de grootte van de sferoïden. Hoewel de ideale oplossing voor het labelen van cellen de instelling is van cellijnen die fluorescerend eiwit(en) stabiel uitdrukken, is deze optie meestal beperkt tot vereeuwigde cellijnen en wordt beperkt door de beschikbaarheid van fluorescerende eiwit chimera's. Hier beschrijven we een geoptimaliseerd protocol voor immunofluorescentiekleuring van vaste sferoïden, evenals het efficiënte gebruik van een cytoplasmatische kleurstof om cellen onmiddellijk voor het insluiten van de sferoïde te labelen.
De derde uitdaging van de sferoïde test is het ontbreken van eenvoudige Fiji-macro's voor semi-geautomatiseerde kwantificering van celinvasie in de loop van de tijd. Om deze uitdaging aan te pakken, beschrijven we een eenvoudige methodologie om het sferoïde gebied in de loop van de tijd te analyseren. We illustreren de voordelen van dit protocol aan de hand van de 4T1- en 67NR-cellijnen als voorbeelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fabricage van een Spheroid Imaging Device (SID) om spheroid embedding te optimaliseren (Duur 1 dag)
- Maak de afstandsruimte met een 3D-printer (figuur 1A, B en Aanvullend Bestand 1).
- Weeg een verhouding van 10:1 (wt/wt) van basepolymeer:crosslinker in een plastic beker af [bijv. 20 g ethylbenzeen basepolymeer en 2 g siliconenhars crosslinker om polydimethylsiloxaan (PDMS) te maken].
- Meng de PDMS-oplossing grondig in de plastic beker met behulp van een wegwerppipet.
- Plaats de plastic beker in een vacuümkamer om de luchtbellen uit het mengsel te verwijderen. Laat de vacuümdruk snel los om de kleine hoeveelheid lucht die aan het oppervlak van het mengsel is opgesloten te verwijderen en de resterende luchtbellen te verwijderen.
- Incubeer de 3D-geprinte afstandsruimte bij 100 °C gedurende 5 minuten om de flexibiliteit te vergroten.
- Reinig de twee glasplaten die worden gebruikt om de PDMS-mal grondig te construeren door ze af te vegen met 100% isopropanol. Als de glasplaten eerder werden gebruikt om PDMS te gieten, zorg er dan voor dat u eventuele resterende oude PDMS verwijdert door de glasplaten voorzichtig met een scheermesje te schrapen en af te vegen met 100% isopropanol.
- Construeer de mal door de 3D-geprinte afstandsregelaar tussen de twee schone glasplaten te plaatsen.
- Sluit de mal af met grote bindmiddelclips aan de buitenranden van de glasplaten. Plaats twee bindclips op de onderrand en één op de bovenhoek.
- Inspecteer het bovenste deel van de mal om ervoor te zorgen dat de afstandsruimte gelijk is met de glasplaten. Dit garandeert dat er geen vervormingen aanwezig zullen zijn en dat er een even blad PDMS wordt gemaakt.
OPMERKING: Als de resulterende plaat niet van uniforme dikte is, moeten de clips enigszins worden aangepast. - Snijd de punt van een wegwerppipet (~ 2 cm van de punt) en voeg het PDMS-mengsel in een langzaam en constant tempo toe aan de linkerbovenhoek van de mal. Giet het mengsel langzaam om het ontstaan van grote luchtzakken te voorkomen.
- Plaats de mal in een vacuümkamer om luchtbellen te verwijderen die zich tijdens het gieten hebben gevormd.
- Hard het PDMS uit door de mal gedurende 1 uur bij 100 °C te incuberen.
- Haal de mal uit de incubator en laat deze afkoelen om aan te raken.
- Verwijder de bindmiddelclips en glasplaten uit de afstandsruimte met het uitgeharde PDMS.
- Gebruik een scheermesje om door de afdichting te snijden die aan alle vier de zijden van de mal tussen de afstandhouder en de glasplaat is gemaakt. Als alle vier de zijden erin zijn gesneden, begint u de mal uit elkaar te trekken om het PDMS-blad in de afstandsruimte te onthullen.
- Verwijder voorzichtig het nieuwe PDMS-blad van de afstandsbalk met een pincet.
- Pons op een snijmat pdms-schijven met een diameter van 17,5 mm uit het blad en pons vervolgens drie gelijkmatig verdeelde gaten met een diameter van 5,5 mm, met behulp van biopsieponsen van verschillende grootte. Hier worden deze 3-holes PDMS-schijven "inserts" genoemd (Figuur 1C).
OPMERKING: Niet-uniforme snijwonden in het PDMS, of een defecte binding via plasmabehandeling, kunnen leiden tot toekomstige lekken. - Reinig elk inzetstuk door stofdeeltjes voorzichtig te verwijderen met behulp van tape.
- Plak de inzetstukken op een stuk dubbelzijdige tape en wikkel de tape om het deksel van een Petri-schaal van 10 cm.
- Plaats het deksel van de Petrischaal in de plasmamachine, samen met de open 35 mm glazen bodemschalen.
- Activeer het oppervlak van de wisselplaten en van het glas via plasmabehandeling gedurende 1 minuut op 300 mTorr. Een handplasmastok kan worden gebruikt.
- Bevestig met behulp van een pincet snel de onderste, d.w.z. behandelde zijde, van één inzetstuk (figuur 1D) aan het glazen deel van een glazen bodemschaal (figuur 1E). Herhaal dit voor alle gerechten.
- Gebruik de wijzervinger en duim om een gelijkmatige druk uit te oefenen tijdens het draaien van de glazen bodemschaal. Dit zorgt voor een stabiele veiligheid van het inzetstuk aan de glazen bodemschaal.
- Incubeer de SIDs (figuur 1F) gedurende 20 minuten bij 60 °C om de hechting tussen glas en PDMS te versterken.
- Voer een tweede ronde plasmabehandeling uit op de SIDs, met dezelfde instellingen als in stap 1.21 of met de hand-toverstok. Hierdoor zal het vrije PDMS-oppervlak zich hechten aan de poly-L-lysine in de coatingoplossing (zie 1.26).
- Bereid vers de volgende oplossingen.
- Coatingoplossing: 1x PBS met 0,01% (vol/vol) poly-L-Lysine [bijv. voeg 10 μL van 0,1% (vol/vol) poly-L-Lysine toe aan 90 μL 1x PBS].
- Crosslinking-oplossing: Gedestilleerd water dat 1x (vol/vol) glutaraldehyde bevat [voeg bijvoorbeeld 10 μL 10x glutaraldehyde toe aan 90 μL gedestilleerd water].
- Opslagoplossing: 1x PBS met 10x (vol/vol) Penicilline-Streptomycine [voeg bijvoorbeeld 1 ml penicilline-streptomycine toe aan 9 ml 1x PBS].
- Voeg per gat 35 μL coatingoplossing toe en broed gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Aspirateer de poly-L-Lysine en spoel de hele SID 3 keer af met gedestilleerd water.
- Voeg 35 μL crosslinking-oplossing toe per hole incubate gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Aspirateer de crosslinking oplossing en spoel de gehele SID 3 keer af met gedestilleerd water.
- Voeg 70% ethanol toe aan elke SID en plaats gedurende 30 minuten onder ultraviolet (UV) licht.
- Aspireer ethanol onder de motorkap en spoel de SID 3 keer af met gedestilleerd water.
- Voeg 2,5 ml opslagoplossing toe per SID.
OPMERKING: In dit stadium kunnen de SIDs een week bij 4 °C worden bewaard. Opgemerkt werd dat de bindingssterkte tussen PDMS en glas in de loop van de tijd afneemt. Na een week wordt gebruikers aangeraden om de SIDs voor gebruik te testen op mogelijke lekkage. Aspirateer hiervoor de opslagoplossing en voeg 35 μL 1x PBS toe aan elk gat. Na gebruik kunnen PDMS-inzetstukken van de glazen bodemschotels worden gepeld. Om een optimale reiniging van de glazen bodemschotels te bereiken, moeten verschillende wasbeurten met isopropanol en zoutzuur worden gebruikt om PDMS-residuen te verwijderen.
2. Sferoïdvorming en inbedding in collageen (Duur 4 dagen)
OPMERKING: Gebruik voor live beeldvorming van sferoïden, in de lengterichting of in timelapsevideo's, een cellijn die een cytoplasmatisch en/of nucleair fluorescerend eiwit uitdrukt. Als een dergelijke cellijn beschikbaar is, volgt u de stappen die in deze sectie worden beschreven. Als alternatief wordt in sectie 3 een protocol voorgesteld om kankercellen in sferoïden te labelen met behulp van een cytoplasmatische kleurstof.
- Vorm sferoïden van 4T1- en/of 67NR-cellen met behulp van de hangende druppeltechniek, zoals eerder beschreven4,5,6,7, met 3.000 cellen/40 μL druppel en een incubatietijd van 3 dagen. Voeg de runder atelocollagen I-oplossing als laatste toe en onderhoud alle oplossingen op ijs, te allen tijde.
- Identificeer de correct gevormde sferoïden met behulp van een helderveldmicroscoop.
- Vul een conische buis van 15 ml met 8 ml voorverwarmd compleet medium.
- Verzamel sferoïden met een P1000 pipet en breng over op de 15 ml conische buis. Maak de pipettip nat door een compleet medium in en uit te spuiten om te voorkomen dat sferoïden aan de binnenwanden van de pipetpunt blijven plakken en sferoïdverlies te beperken.
- Laat sferoïden naar de bodem van de buis zinken en was de sferoïden voorzichtig door het medium uit te wisselen. Herhaal dit twee keer.
- Bereid een 5 mg/ml collageen I-oplossing volgens de aanbevelingen van de fabrikant (alternatieve gelatieprocedure, zie voorbeeldige berekening hieronder). Vervang het gedestilleerde water door een compleet medium. Houd er bij de berekening van het te gebruiken mediumvolume rekening mee dat sferoïden worden toegevoegd in 20 μL volledig medium [bijv. voor één SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL van 5 mg/ml collageen Ik ben nodig (bereid 20 % extra voor om rekening te houden met pipettingverlies bij het hanteren van viskeuze vloeistoffen); 22 μL volledig medium + 10,8 μL van 10x PBS + 1,2 μL van 1 M NaOH + 54 μL van 10 mg/ml collageen I voorraad].
- Verzamel alle sferoïden in 20 μL medium, met behulp van een P200 pipet, en voeg ze toe aan de collageen I-oplossing bereid in stap 2.6.
- Meng de oplossing langzaam door op en neer te pipetten om heterogeniteit in de collageen I-concentratie te voorkomen, waardoor de vorming van bellen wordt beperkt. Houd de oplossing in het ijs.
- Verwijder de opslagoplossing van de SID(s) en was 3 keer met 3 ml 1x PBS. Laat de SID(s) na de laatste wasbeurt droog zodat de collageen I-oplossing niet wordt verdund.
- Start een timer en doseer 30 μL van de collageen I-oplossing met één sferoïde in een van de drie gaten van de SID. Zorg er visueel voor dat een enkele sferoïde zich in de 30 μL bevindt.
- Herhaal stap 2.10 nog twee keer om alle 3 gaten van een SID te vullen.
- Gebruik een pipettip van 10 μL om de sferoïde opnieuw te centreren als deze zich dicht bij de PDMS-rand bevindt. Als twee of drie sferoïden in een van de gaten terechtkomen, kan dezelfde pipetpunt worden gebruikt om de sferoïden van elkaar te scheiden. Stop de timer.
OPMERKING: Het vaak omkeren van de SID ondersteboven en ondersteboven, gedurende de hele periode van de collageen I-polymerisatie en stolling, zorgt ervoor dat de sferoïde zich in het verticale midden van de ECM-laag bevindt en voorkomt invasie van cellen in 2D. De frequentie van omkeren (flippen) moet worden gemaximaliseerd. Aangezien de flippingfrequentie wordt geregeld door de sferoïde "doseertijd" gemeten in 2.10-2.12, moet de doseertijd worden geminimaliseerd. In ons lab is de doseertijd gemiddeld 2 minuten. - Om de sferoïde verticaal in de collageenlaag te centreren, draait u de SID ondersteboven en broedt u op 37 °C voor de doseertijd.
- Draai de SID ondersteboven en incubeer bij 37 °C voor doseertijd.
OPMERKING: De tijd die de sferoïden in de onderstebovenstand doorbrengen, moet gelijk zijn aan de tijd die in de onderstebovenstand wordt doorgebracht. - Herhaal stap 2.13 en 2.14 gedurende 30 minuten, totdat het collageen I polymeriseert.
- Voeg 2,5 ml volledig medium/SID toe en verkrijg indien nodig een afbeelding van de sferoïden voor het begintijdpunt.
- Herhaal stap 2.10-2.16 als er meerdere SIDs worden gebruikt.
3. Fluorescentieetikettering van sferoïden
- Live beeldvorming (Duur 6-7 dagen)
OPMERKING: Als er een cellijn beschikbaar is die een cytoplasmatisch en/of nucleair fluorescerend eiwit uitdrukt, volgt u de stappen die in rubriek 2 worden beschreven. Als alternatief wordt voor cytoplasmatische etikettering het volgende protocol voorgesteld.- Volg stap 2.1-2.5 van het protocol dat in sectie 2 wordt beschreven.
- Verdun de cytoplasmatische kleurstof tot 25 μM in 200 μL serumvrij medium.
OPMERKING: Hoewel in dit experiment een rode cytoplasmatische kleurstof wordt gebruikt, moet elke andere beschikbare kleur geschikt zijn. Kankercellen werden geëtiketteerd in sferoïden met behulp van nucleaire kleurstoffen verdund tot 20 μM in 200 μL serumvrij medium (zie Tabel met materialen). - Na de laatste wasbeurt resuspend sferoïden in de cytoplasmatische of nucleaire kleurstofoplossing en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten, beschermd tegen licht.
OPMERKING: Met deze aanpak is het labelen van de cellen in het sferoïde centrum niet efficiënt. Om etikettering van alle cellen te bereiken, kan de incubatie 's nachts worden verlengd door de schaal op een rocker te plaatsen. Alternatieven worden beschreven in Discussie. - Was sferoïden 3 keer in volledig medium.
- Ga verder met stap 2.6-2.17 van het protocol dat in sectie 2 wordt beschreven.
- Beeldsferoïden via time-lapse beeldvorming om de 10 minuten gedurende 24-72 uur(figuur 2),of via longitudinale beeldvorming, dagelijks, gedurende maximaal 7 dagen (figuur 3). Gebruik een laserscan confocale microscoop, 10x luchtdoelstelling (0,4 numeriek diafragma en 3,1 mm werkafstand), 1024 x 1024 pixels, belichtingstijd 8 μs/pixel, pinhole 90 μm, 6 x 15 μm z-steps en 3 gezichtsvelden-elk met één sferoïde.
OPMERKING: Gebruik voor time-lapse beeldvorming minimaal laservermogen en rust de microscoop uit met een omgevingskamer met temperatuur, vochtigheid en gasregeling. Kweek de ingebedde sferoïden bij 37 °C gedurende > 8 uur of 's nachts voorafgaand aan de beeldvorming om de tijd op de microscoop te minimaliseren.
- Immunofluorescentiekleuring van sferoïden (Duur 2 dagen)
OPMERKING: De hier beschreven procedure is aangepast en geoptimaliseerd ten opzichte van eerder gepubliceerde protocollen8,9. Deze methode kan worden gebruikt na het protocol dat wordt beschreven in de secties 2 en 3.1.- Bereid vers de volgende oplossingen.
- Bevestigingsoplossing: 1x PBS met 4% PFA (vol/vol) [voeg bijvoorbeeld 5 ml van 16% (vol/vol) PFA toe aan 15 ml 1x PBS].
- Bevestigings- en permeabiliserende oplossing: 1x PBS met 4% PFA (vol/vol) en 0,5% Triton X-100 (vol/vol) [voeg bijvoorbeeld 50 μL Triton X-100 tot 10 ml bevestigingsoplossing toe].
- Blokkeringsoplossing: 1x PBS met 1% FBS (vol/vol) en 1% BSA (wt/vol) [los bijvoorbeeld 100 mg BSA op in 10 ml 1x PBS en voeg vervolgens 100 μL FBS toe].
- Wasoplossing: 1x PBS met 0,05% Tween 20 (vol/vol) [voeg bijvoorbeeld 25 μL Tween 20 tot 50 ml 1x PBS toe].
- Verwijder het kweekmedium van de SID(s) en was eenmalig met warme 1x PBS.
- Voeg 2 ml bevestigings- en permeabiliserende oplossing per SID toe en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Verwijder de bevestigings- en permeabiliserende oplossing en voeg 2 ml bevestigingsoplossing per SID toe en broed gedurende 20 minuten op kamertemperatuur.
- Was 3 keer met de wasoplossing.
- Voeg 2 ml blokkeeroplossing per SID toe en incubeer bij 4 °C gedurende 24 uur met mild schudden.
OPMERKING: Bij deze stap kunnen monsters worden geïncubeerd bij 4 °C, in het weekend. Houd er rekening mee dat een langere blokkeringstijd de immunofluorescentieetiketteringsprocedure kan verstoren. - Verdun primaire antilichamen in blokkerende oplossing.
- Voeg 150 μL blokkeeroplossing met primaire antilichamen/put toe in een plaat van 48 putten.
- Maak met een fijn pincet voorzichtig de plug van collageen I met een sferoïde los en breng over in een put. Herhaal dit als meerdere sferoïden zijn geëtiketteerd. Veeg eventuele vloeistof die op het pincet achterblijft bij het werken met verschillende antilichamen af om besmetting te voorkomen.
- Incubeer 's nachts bij 4 °C met mild schudden.
- Voeg 300 μL wasoplossing toe aan lege en volle putten.
- Breng de plug collageen I met een sferoïde voorzichtig over in een "was" put.
- Was 3 keer met wasoplossing gedurende 2 uur, op kamertemperatuur en met mild schudden.
OPMERKING: Het overbrengen van de pluggen van collageen I die een sferoïde bevatten, in plaats van de oplossingen aan te zuigen, kan helpen bij het verminderen van monsterverlies en monsterschade. - Verdun secundaire antilichamen, 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) en/of falloline in blokkerende oplossing.
- Voeg 150 μL blokkeeroplossing toe met secundaire antilichamen, DAPI en/of falloline per put.
- Breng met een pincet de collageenplug met de sferoïden voorzichtig over in de put. Herhaal dit als meerdere sferoïden zijn geëtiketteerd.
- Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur met mild schudden.
- Herhaal stap 3.2.11 en 3.2.12.
- Was 3 keer met wasoplossing gedurende 30 minuten, op kamertemperatuur met mild schudden.
- Snijd met behulp van een scheermesje een PDMS-insert met 3 gaten in drie delen, zodat elk onderdeel een gat bevat.
- Plaats twee stukjes PDMS op een microscoopschuif.
- Voeg een druppel montageoplossing toe met behulp van een P200-tip met het uiteinde afgesneden. Voorkom bellenvorming.
- Breng voorzichtig een collageen over dat ik in elk gat steek.
OPMERKING: Als de sferoïde aan de bovenkant van de collageenplug is geplaatst, draait u de collageenplug om zodat de sferoïde dichter bij de glazen afdeklip terechtkomt. - Plaats er een deppenlip op en sluit af met tape.
- Laat het monster 10 minuten drogen bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Bewaar monsters bij 4 °C, beschermd tegen licht tot beeldvorming.
- Bereid vers de volgende oplossingen.
4. Beeldverwerking om kankerinvasie in de loop van de tijd te analyseren
OPMERKING: De indeling die nodig is voor deze macro is een x,y,t-afbeelding met één kanaal die is opgeslagen als een .tiff bestand.
- Als er meerdere z-segmenten zijn verkregen(d.w.z. x,y,z,t-afbeelding), opent u de afbeelding in Fiji en selecteert u Afbeelding | Stapels | Z Project. Het wordt aanbevolen om de optie Maximale intensiteit te gebruiken. Als alternatief kan één z-segment worden gebruikt om de macro uit te voeren. Sla de afbeelding op als een .tiff bestand.
- Maak een aparte map 'Verwerking' op het bureaublad.
- Selecteer Bestand | Opslaan als | Afbeeldingsvolgorde. Gebruik de TIFF-indeling, werk het cijfernummer bij op basis van het aantal frames, schakel het selectievakje in om segmentlabel als bestandsnaam te gebruiken en selecteer Ok. Selecteer de map "Processing" die in stap 2 is gemaakt.
- Open één afbeelding vanuit de map "Processing". Het moet een x,y-afbeelding zijn, die overeenkomt met een enkel tijdspunt.
- Afbeelding selecteren | | aanpassen Automatische drempelwaarde. Schakel in het vervolgkeuzemenu de methode Alles proberen in en vink het selectievakje voor witte objecten op de zwarte achtergrond aan.
- Er wordt een montageafbeelding weergegeven met het resultaat voor elke geautomatiseerde drempelmethode.
- Identificeer de beste geautomatiseerde drempelmethode, bijvoorbeeld RenyIEntropy.
- Als u de keuze voor de geautomatiseerde drempelwaardemethode wilt bevestigen, opent u een andere afbeelding uit de map 'Verwerking' en test u de gekozen drempelwaardemethode met behulp van Afbeelding | | aanpassen Automatische drempelwaarde.
- Sluit alle afbeeldingen.
- Download de macro SpheroidAreaTime (Aanvullend Bestand 2).
- Open de Fiji-macro met slepen en neerzetten.
- Werk in regel 58 indien nodig de geautomatiseerde drempelmethode bij.
- Werk in regel 62 het groottebereik bij op basis van de celafmetingen.
- Selecteer Uitvoeren.
- Selecteer de map "Verwerking" en typ "Verwerking" als de bovenliggende map en selecteer vervolgens Ok.
- Zodra de uitvoering is afgelopen, slaat u de tabel "Samenvatting" op. De eerste kolom geeft de naam van de afbeelding aan; de derde kolom geeft het sferoïde gebied aan; de zesde, zevende en acht kolommen specificeren de parameters voor een ellips die op de sferoïde is gemonteerd.
- De map "Processing" bevat nu een verwerkte afbeelding voor elk tijdspunt, waarbij de extensie _SpheroidArea.
OPMERKING: Als het sferoïdecentrum zwak is, vult u het met wit met behulp van de selectiegereedschappen, voor alle tijdspunten, en gaat u verder met stap 3. Op dezelfde manier kan de ruimte rond de sferoïde worden gevuld met zwart om de afbeelding te "reinigen". Als de afbeelding schoon is, geeft u commentaar op regel 61 om de uitvoering te versnellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vanwege de biocompatibiliteit wordt PDMS veel gebruikt voor microfabrication van het beperken van putten, stempels en mallen, wat een revolutie teweegbracht in micropatterning en microfluïdische apparaten. In de hier beschreven methode wordt het gebruikt om SIDs te maken, aanpasbare putten die de insluit- en beeldvormingsprocedure van sferoïden optimaliseren. Figuur 1 illustreert de belangrijkste componenten die worden gebruikt bij de fabricage van de SIDs. Om de PDMS-mal te gieten, wordt een 1 mm dikke afstandsruimte 3D-geprint(figuur 1A,B),geplaatst tussen de twee glasplaten, verzegeld met grote clips. Het gieten en bakken van PDMS in de ruimte tussen de platen vormt een 1 mm dik vel PDMS. Het SID-schema (figuur 1C) geeft de afmetingen van het optimale apparaat aan, maar er treedt lichte variatie op in de gatafstanden, als gevolg van handmatig ponsen van gaten met behulp van biopsieponsen (figuur 1D). Figuur 1D,F geeft schone cirkelvormige sneden aan met gelijkmatig verdeelde gaten in de PDMS-insert.
Het gebruik van de SIDs vergemakkelijkt een efficiënte inbedding, en dus het registreren van de invasie van kankercellen in collageen I met behulp van time-lapse (figuur 2, Video 1) of longitudinale (figuur 3) beeldvorming. Ondanks het gebruik van dezelfde inversiefrequenties voor alle SIDs tijdens de collageen I-polymerisatie, zullen de sferoïdeposities in de collageenplug enigszins variëren. Daarom is het belangrijk om een objectief te gebruiken met een lange werkafstand (>1 mm). Anders kan scherpstellen en beeldvorming moeilijk zijn voor sferoïden die dicht bij de bovenkant van de collageenplug zijn geplaatst. Sferoïden die zich dicht bij de onderkant van de collageenplug bevinden, hebben daarentegen cellen die naar het glasoppervlak bewegen en op het glas migreren, in plaats van binnen te vallen in de collageen I-matrix. Video's van dergelijke sferoïden moeten worden weggegooid. De dikte van de collageenplug, hier ongeveer 800 μm, wordt geregeld door het volume dat in elk gat van de SID wordt afgegeven en aangepast aan invasieafstanden die sferoïden in dit protocol vertonen. De dikte van de collageenplug kan worden verlaagd door een lager volume collageen I in elk gat van de SID af te staan, bij het gebruik van kleinere of minder invasieve sferoïden.
Voor een goede analyse van de invasie met behulp van de Fiji-macro is het van cruciaal belang dat kankercellen in de loop van de beeldvormingssessie correct worden gelabeld. Zoals vermeld in stap 4.17. maakt de stap voor beeldverwerking afbeeldingscorrectie mogelijk als de etikettering suboptimaal is. Hoewel we longitudinale beeldvorming in de loop van 6 dagen illustreren(figuur 3),die de stabiele expressie van cytoplasmatisch en/of nucleair fluorescerend eiwit vereist, kan vergelijkbare longitudinale beeldvorming over een kortere tijd worden uitgevoerd met behulp van etikettering met kleurstoffen.
Na live beeldvorming presenteren we enkele resultaten van de immunolabelprocedure voor het epitheel cadherine (E-cadherine), cortactine en F-actine (figuur 4). In deze voorbeelden hebben we de cellijnen 4T1 en 67NR gebruikt. Figuur 5 toont stapsgewijze illustratie van de beeldverwerkingsprocedure met behulp van de Fiji-macro om het gebied van de sferoïde in de loop van de tijd te meten.
Figuur 1: Vervaardiging van de SIDs. (A) Schematische weergave van de bovenaanzicht van de afstandsruimter. (B) 3D-geprinte afstandsruimte. (C) Schematische weergave van de SID. Een PDMS-inzetstuk met 3 gaten (D) is gebonden aan een glazen bodemschaal (E), waardoor de uiteindelijke SID (F) ontstaat. De afmetingen zijn in millimeters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Live beeldvorming van sferoïden. Representatieve tijdpunten van 20 uur en 40 uur uit video 1, maximale projectie van een 4T1-sferoïde. 4T1-cellen werden geëtiketteerd met een cytoplasmatische kleurstof. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Longitudinale beeldvorming van sferoïden. Representatieve micrografen (maximale projectie) van een gemengd 4T1/67NR-sferoïde dat dagelijks wordt in beeld wordt genomen. 4T1- en 67NR-cellen drukken respectievelijk de cytoplasmatische mScarlet en het groene fluorescerende eiwit (GFP) stabiel uit. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Immunofluorescentie beeldvorming van sferoïden. Representatieve micrografen (maximale projectie) van een 4T1-sferoïde die 2 dagen na inbedding in collageen is vastgesteld I. E-cadherine (cyaan, A), cortactine (geel, B) en F-actine (magenta, A en B) werden geëtiketteerd. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Beeldverwerkingsanalyse. Stapsgewijze illustratie van de beeldverwerkingsprocedure met behulp van de Fiji-macro (A) om het gebied van de sferoïde in de loop van de tijd te meten (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: Representatieve video van een 4T1 sferoïde die elke 10 minuten gedurende 46 uur en 10 minuten wordt gelabeld. Schaalbalk, 100 μm. Klik hier om deze video te downloaden.
Aanvullend bestand 1: 3D-model van de afstandsruimte (STL-bestand). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullend bestand 2: SpheroidAreaTime macro. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De 3D-geprinte afstandhouder is ontworpen om 1 mm dikke vellen PDMS te maken die vervolgens kunnen worden gebruikt om eenvoudig verschillende vormen van PDMS te maken, zoals vereist door de experimentele toepassingen. Vanwege de eenvoud van de fabricage en de vrijheid om het ontwerp te veranderen, werd deze methode van PDMS-gieten gekozen voor het oorspronkelijke ontwerp van de SID. Als er een hoog volume SIDs nodig is, kan de productie efficiënter worden gemaakt door een 3D-geprinte mal te maken, die al PDMS-schijven met drie even verdeelde gaten bevat en het proces tot één stap te reduceren. Dit zou de noodzaak om elke schijf uit te slaan, samen met de daaropvolgende drie gaten, elimineren en de totale voorbereidingstijd verkorten.
Terwijl de 3-holes punch is ontwikkeld voor gebruik met 35 mm glazen bodemschotels, zijn er andere maten beschikbaar die meer gaten mogelijk maken en dus meer sferoïden parallel kunnen worden gebeeldhuild. Daarnaast is ook op maat gemaakt afdekglas in de handel verkrijgbaar, dat in combinatie met 3D-geprinte houders kan zorgen voor sferoïde assays met een hoge doorvoer. Bij een dergelijke aanpak is de beperkende factor de snelheid van het verkrijgen van gegevens, bijvoorbeeld in onze veelkleurige time-lapse confocale beeldvorming, het verkrijgen van 3D-stack van een enkele sferoïde vereist ongeveer 2,5 minuten. Daarom duurt het verkrijgen van 3D-stacks voor 3 sferoïden in de SID ongeveer 8 minuten. Als gevolg hiervan, om onze voorkeursfrequentie van beeldvorming op 10 minuten per stack te houden, kunnen we het aantal gaten in de SIDs niet vergroten.
Om de invasie van levende kankercellen in het 3D-sferoïdemodel vast te leggen en te kwantificeren, kan bright-field imaging worden gebruikt5. Fluorescentiemicroscopie heeft echter de voorkeur, omdat het zorgt voor meer contrast en gemak en precisie in de beeldverwerking. Als het genereren van een cellijn die een cytoplasmatisch en/of nucleair fluorescerend eiwit uitdrukt niet mogelijk is, stellen we het gebruik van de cytoplasmatische kleurstoffen voor. Aangezien de retentietijd van cytoplasmatische kleurstoffen in cellen drie dagen is in onze beeldvormingsomstandigheden, moeten cellen worden geëtiketteerd na de periode van 3 dagen in hangende druppel en onmiddellijk vóór de inbedding. Etikettering van cellen na insluiten kan het collageen niet specifiek labelen en celetikettering verminderen. Beeldvorming voor langer dan 3 dagen na inbedding vereist het gebruik van een ander sferoïde zaaiprotocol10 of cellijnen die stabiel fluorescerende eiwitten uitdrukken.
We hebben met succes sferoïden gevormd en gebeeldreerd die overal van 60 tot 5.000 cellen / druppel bevatten. Kleine sferoïden zijn ideaal voor het registreren van invasies gedurende meerdere dagen, omdat hun hele invasiegebied gemakkelijk in één gezichtsveld van hogere vergrotingsdoelstellingen (20x-30x) past. Bovendien kunnen ze gemakkelijk overal worden geëtiketteerd met cytoplasmatische of nucleaire kleurstoffen. Ten slotte kan elke cel in de sferoïde vanwege de verminderde verstrooiing worden gevisualiseerd en gesegmenteerd. Kleine sferoïden zijn echter nauwelijks zichtbaar met blote ogen en vereisen mogelijk extra etikettering met weefselmarkers. Grotere sferoïden zijn daarentegen gemakkelijker te hanteren, maar gevoeliger voor zinken naar de bodem van de schaal, vanwege hun gewicht. Bovendien worden cellen in het sferoïde centrum niet altijd geëtiketteerd bij het gebruik van kleurstoffen, of zichtbaar met behulp van confocale microscopie, die een penetratiediepte van ongeveer 100 micrometer heeft. Om alle kankercellen in de grote sferoïden te visualiseren met behulp van timelapse-beeldvorming, kan multifotonenmicroscopie worden gebruikt, wat een extra voordeel biedt van de visualisatie van collageenvezels door de tweede harmonische generatie (SHG) zonder dat etikettering nodig is. Beeldvorming kan ook worden gedaan met lichtplaatmicroscopie8,11,12,waardoor de tijd voor het verkrijgen van afbeeldingen wordt verkort en daarom sferoïde tests met een hoge doorvoer mogelijk zijn, maar ook meer gegevensopslag en geavanceerde beeldverwerking vereisen. Als time-lapse video's niet nodig zijn, kan onze etiketteringsprocedure voor vaste 3D-sferoïden verder worden gecombineerd met optische clearing8,10. Bovendien kan cryosectioning van de ingebedde sferoïden problemen met penetratie van kleurstof of antilichaam tijdens het labelen elimineren, evenals penetratie van licht tijdens beeldvorming. In onze handen was succesvolle cryosectioning echter beperkt tot vroege stadia van invasie en niet-invasieve cellen, vanwege de technische uitdagingen bij het behoud van lange en fragiele invasieve strengen.
Ons protocol is ook compatibel met het gebruik van nucleaire kleurstoffen, om kankercellen in de sferoïden te labelen, waardoor eencellige tracking van time-lapse-gegevens mogelijk is. De Fiji-plug-in TrackMate13 kan worden gebruikt om celtracering te automatiseren en beweeglijkheidsparameters van afzonderlijke cellen te extraheren, zoals snelheid, onmiddellijke snelheid en persistentie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen de leden van Temple Bioengineering bedanken voor waardevolle discussies. We danken David Ambrose van de flow cytometrie kern (Lewis Katz School of Medicine) voor zijn hulp bij celsortering en Tony Boehm van de IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) voor hulp bij het 3D printen. We danken ook onze financieringsmiddelen: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 en R01 CA230777, allemaal aan BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
