Summary
Présenté ici est un protocole pour la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde. Ce dispositif permet l’imagerie dynamique ou longitudinale de fluorescence des sphéroïdes de cellules cancéreuses. Le protocole offre également une procédure simple de traitement d’image pour l’analyse de l’invasion des cellules cancéreuses.
Abstract
L’invasion des cellules cancéreuses de la tumeur primaire dans les tissus sains adjacents est une étape tôt dans la métastase. Les cellules cancéreuses invasives posent un défi clinique majeur parce qu’il n’existe aucune méthode efficace pour leur élimination une fois leur diffusion en cours. Une meilleure compréhension des mécanismes régulant l’invasion des cellules cancéreuses peut conduire au développement de nouvelles thérapies puissantes. En raison de leur ressemblance physiologique avec les tumeurs, sphéroïdes intégrés dans le collagène, j’ai été largement utilisé par les chercheurs pour étudier les mécanismes régissant l’invasion des cellules cancéreuses dans la matrice extracellulaire (ECM). Toutefois, cet essai est limité par (1) un manque de contrôle sur l’intégration des sphéroïdes dans l’ECM; (2) coût élevé du collagène I et des plats de fond en verre, (3) étiquetage immunofluorescent peu fiable, en raison de la pénétration inefficace des anticorps et des colorants fluorescents et (4) du traitement et de la quantification d’images fastidieux des données. Pour relever ces défis, nous avons optimisé le protocole sphéroïde tridimensionnel (3D) pour l’image des cellules cancéreuses étiquetées fluorescentes intégrées au collagène I, soit à l’aide de vidéos en accéléré, soit d’une imagerie longitudinale, et nous analysons l’invasion des cellules cancéreuses. Tout d’abord, nous décrivons la fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde (SID) pour intégrer les sphéroïdes de manière fiable et dans un volume minimal de collagène I, réduisant le coût d’essai. Ensuite, nous délimélisons les étapes pour l’étiquetage robuste de fluorescence des sphéroïdes vivants et fixes. Enfin, nous offrons une macro Fidji facile à utiliser pour le traitement d’images et la quantification des données. Au total, cette méthodologie simple fournit une plate-forme fiable et abordable pour surveiller l’invasion des cellules cancéreuses dans le collagène I. En outre, ce protocole peut être facilement modifié pour répondre aux besoins des utilisateurs.
Introduction
Pendant la progression du cancer, les cellules cancéreuses peuvent acquérir un phénotype motile et invasif, leur permettant d’échapper à la masse tumorale et d’envahir les tissus environnants1. Finalement, ces cellules cancéreuses invasives peuvent atteindre et se développer à l’intérieur des organes secondaires, un processus appelé métastase du cancer1. La métastase cause plus de 90 % des décès liés au cancer2. L’une des raisons en est que, bien que les tumeurs localisées soient cliniquement gérables, il n’existe aucune méthode efficace pour l’élimination des cellules cancéreuses invasives une fois que la propagation métastatique s’est produite. Par conséquent, l’émergence de cellules cancéreuses invasives et la transition d’une maladie localisée à une maladie invasive posent un défi clinique majeur. Déterminer comment les cellules cancéreuses initient et soutiennent un comportement invasif peut mener au développement de nouvelles thérapies puissantes.
Le modèle sphéroïde 3D est une plate-forme idéale pour étudier le comportement motile des cellules cancéreuses dans des conditions contrôlées, mais physiologiquement pertinentes3. En effet, dans cet essai, les sphéroïdes des cellules cancéreuses sont intégrés à l’intérieur de la matrice extracellulaire (ECM), par exemple le collagène I, qui imite une tumeur simplifiée. Ensuite, l’imagerie est utilisée pour visualiser l’invasion des cellules cancéreuses du sphéroïde dans la matrice de collagène. Toutefois, de multiples défis limitent cette procédure.
Le premier défi se produit à l’étape d’intégration, où la matrice liquide de collagène peut se propager à travers la surface du plat, provoquant le sphéroïde de toucher le fond du plat. Par conséquent, les cellules du sphéroïde se sont propagées à la surface bidimensionnelle (2D), brisant la morphologie sphéroïde tridimensionnelle (3D). Augmenter le volume de collagène est une solution efficace, mais coûteuse. Pour empêcher les cellules de se propager sur la surface 2D, tout en maintenant un volume minimal de collagène, nous avons développé un dispositif d’imagerie sphéroïde (SID) en délimité un 1 mm d’épaisseur, polydimethylsiloxane 3 trous (PDMS) insert sur un plat de fond en verre.
Le deuxième défi de l’analyse sphéroïde est l’étiquetage des cellules cancéreuses dans les sphéroïdes, qui est limitée par la faible pénétration des anticorps et des colorants fluorescents, un effet qui augmente avec la taille des sphéroïdes. Alors que la solution idéale pour l’étiquetage des cellules est l’établissement de lignées cellulaires exprimant de façon stable les protéines fluorescentes, cette option est principalement limitée aux lignées cellulaires immortalisées et est limitée par la disponibilité de chimères protéiques fluorescentes. Ici, nous décrivons un protocole optimisé pour la coloration d’immunofluorescence des sphéroïdes fixes, aussi bien que l’utilisation efficace d’un colorant cytoplasmique pour étiqueter des cellules immédiatement avant d’intégrer le sphéroïde.
Le troisième défi de l’analyse sphéroïde est l’absence de macros fidjiennes simples pour la quantification semi-automatisée de l’invasion cellulaire au fil du temps. Pour relever ce défi, nous décrivons une méthodologie simple pour analyser la zone sphéroïde au fil du temps. Nous montrons les avantages de ce protocole en utilisant les lignées cellulaires 4T1 et 67NR comme exemples.
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Protocol
1. Fabrication d’un dispositif d’imagerie sphéroïde (SID) pour optimiser l’intégration sphéroïde (Durée 1 jour)
- Créez l’espaceur à l’aide d’une imprimante 3D(figure 1A, B et fichier supplémentaire 1).
- Pesez un rapport de 10:1 (wt/wt) de polymère de base : crosslinker dans une tasse en plastique [par exemple, 20 g de polymère de base éthylbenzene et 2 g de crosslinker de résine de silicone pour créer le polydimethylsiloxane (PDMS)].
- Bien mélanger la solution PDMS dans la tasse en plastique à l’aide d’une pipette jetable.
- Placer la tasse en plastique dans une chambre à vide pour enlever les bulles d’air du mélange. Relâchez rapidement la pression du vide pour éliminer la petite quantité d’air emprisonnée à la surface du mélange et dissiper les bulles d’air restantes.
- Incuber l’espaceur imprimé 3D à 100 °C pendant 5 min pour augmenter sa flexibilité.
- Nettoyez les deux plaques de verre qui seront utilisées pour construire le moule PDMS à fond en les essuyant avec 100% isopropanol. Si les plaques de verre ont déjà été utilisées pour lancer pdms, assurez-vous d’enlever tout vieux PDMS restant en raclant doucement les plaques de verre avec une lame de rasoir et en les essuyant avec 100% isopropanol.
- Construisez le moule en plaçant l’espaceur imprimé 3D entre les deux plaques de verre propres.
- Sceller le moule à l’aide de gros agrafes de liant sur les bords extérieurs des plaques de verre. Placez deux agrafes de liant sur le bord inférieur et une sur le coin supérieur.
- Inspectez la partie supérieure du moule pour vous assurer que l’espaceur est rincé avec les plaques de verre. Cela garantit qu’aucune déformation ne sera présente et qu’une feuille de PDMS sera créée.
REMARQUE : Si la feuille résultante n’est pas d’épaisseur uniforme, les clips doivent être ajustés légèrement. - Couper la pointe d’une pipette jetable (~2 cm de la pointe) et ajouter le mélange PDMS à un rythme lent et constant dans le coin supérieur gauche du moule. Verser le mélange lentement pour empêcher la création de grandes poches d’air.
- Placez le moule dans une chambre à vide pour enlever les bulles d’air qui se sont formées pendant la coulée.
- Guérir le PDMS en incubant le moule à 100 °C pendant 1 h.
- Récupérer le moule de l’incubateur et lui permettre de refroidir pour toucher.
- Retirez les agrafes de liant et les plaques de verre de l’espaceur contenant le PDMS durci.
- Utilisez une lame de rasoir pour couper à travers le joint qui a été créé sur les quatre côtés du moule entre l’espaceur et la plaque de verre. Avec les quatre côtés coupés en, commencer à démonter le moule pour révéler la feuille PDMS dans l’espaceur.
- Peler soigneusement la nouvelle feuille PDMS de l’espaceur à l’aide d’une pince à épiler.
- Sur un tapis de coupe, perforer les disques PDMS de 17,5 mm de diamètre de la feuille, puis percer trois trous de diamètre répartis uniformément de 5,5 mm, à l’aide de poinçons biopsie de taille différente. Ici, ces disques PDMS à 3 trous sont appelés « inserts » (Figure 1C).
REMARQUE : Les coupures non uniformes effectuées dans le PDMS, ou une liaison défectueux par traitement plasmatique, peuvent entraîner de futures fuites. - Nettoyez chaque insert en enlevant délicatement les particules de poussière à l’aide de ruban adhésif.
- Collez les inserts sur un morceau de ruban adhésif à double face et enroulez la bande autour du couvercle d’une boîte de Pétri de 10 cm.
- Placez le couvercle de la boîte de Petri dans la machine à plasma, ainsi que les plats ouverts en verre de 35 mm.
- Activez la surface des inserts et du verre par traitement plasmatique pendant 1 min à 300 mTorr. Une baguette de plasma à main peut être utilisée.
- À l’aide d’une pince à épiler, fixez rapidement l’avantage, c’est-à-dire le côté traité, d’un insert(figure 1D)à la partie vitrée d’un plat en verre (figure 1E). Répétez l’année pour tous les plats.
- Utilisez pointeur doigt et pouce pour appliquer une pression même tout en tournant le plat du fond en verre. Ceci assurera la sécurisation stable de l’insert au plat inférieur en verre.
- Incuber les SID (Figure 1F) à 60 °C pendant 20 min pour renforcer l’adhérence entre le verre et pdms.
- Effectuez une deuxième série de traitement plasmatique sur les SID, en utilisant les mêmes paramètres qu’à l’étape 1.21 ou avec la baguette main. Cela rendra la surface PDMS libre adhérer à la poly-L-lysine dans la solution de revêtement (voir 1.26).
- Préparez fraîchement les solutions suivantes.
- Solution de revêtement : 1x PBS contenant 0,01 % (vol/vol) poly-L-Lysine [p. ex., ajouter 10 μL de 0,1 % (vol/vol) poly-L-Lysine à 90 μL de 1x PBS].
- Solution de liaison croisée : Eau distillée contenant 1x (vol/vol) glutaraldehyde [p. ex., ajouter 10 μL de glutaraldehyde de 10 x à 90 μL d’eau distillée].
- Solution de stockage : 1x PBS contenant 10x (vol/vol) Pénicilline-Streptomycine [p. ex., ajouter 1 mL de pénicilline-streptomycine 100x à 9 mL de 1x PBS].
- Ajouter 35 μL de solution de revêtement par trou et incuber pendant 1 h à température ambiante.
- Aspirer le poly-L-Lysine et rincer l’ensemble du SID 3 fois à l’eau distillée.
- Ajouter 35 μL de solution de liaison croisée par trou incuber pendant 30 min à température ambiante.
- Aspirer la solution de liaison croisée et rincer l’ensemble du SID 3 fois à l’eau distillée.
- Ajouter 70 % d’éthanol dans chaque SID et placer sous la lumière ultraviolette (UV) pendant 30 min.
- Sous le capot, aspirer l’éthanol et rincer le SID 3 fois à l’eau distillée.
- Ajouter 2,5 mL de solution de stockage par SID.
REMARQUE : À ce stade, les SID peuvent être stockés à 4 °C pendant une semaine. On a observé que la force de liaison entre pdms et verre diminue avec le temps. Au-delà d’une semaine, il est recommandé aux utilisateurs de tester les DSR pour les fuites potentielles avant utilisation. Pour ce faire, aspirez la solution de stockage et ajoutez 35 μL de 1x PBS dans chaque trou. Après utilisation, les inserts PDMS peuvent être épluchés des plats en verre. Pour obtenir un nettoyage optimal des plats de fond en verre, plusieurs lavages à l’acide isopropanol et chlorhydrique devraient être utilisés pour éliminer les résidus de PDMS.
2. Formation sphéroïde et intégration dans le collagène (Durée 4 jours)
REMARQUE : Pour l’imagerie en direct des sphéroïdes, longituditinement ou dans des vidéos en accéléré, utilisez une lignée cellulaire exprimant une protéine fluorescente cytoplasmique et/ou nucléaire. Si une telle lignée cellulaire est disponible, suivez les étapes décrites dans cette section. Alternativement, dans la section 3, un protocole est proposé pour étiqueter les cellules cancéreuses dans les sphéroïdes à l’aide d’un colorant cytoplasmique.
- Former des sphéroïdes de cellules 4T1 et/ou 67NR à l’aide de la technique de chute suspendue, commedécrit précédemment 4,5,6,7, avec 3 000 cellules/40 gouttelettes de μL et un temps d’incubation de 3 jours. Ajoutez la solution bovine atelocollagen I en dernier et maintenez toutes les solutions sur la glace, en tout temps.
- Identifiez les sphéroïdes correctement formés à l’aide d’un microscope à champ lumineux.
- Remplissez un tube conique de 15 mL avec 8 mL de milieu complet préchauffé.
- Recueillir les sphéroïdes avec une pipette P1000 et transférer dans le tube conique de 15 mL. Mouillez la pointe pipette en pipetting un milieu complet dans et hors pour empêcher les sphéroïdes de coller aux parois intérieures de la pointe pipette et limiter la perte de sphéroïdes.
- Laissez les sphéroïdes couler au fond du tube et lavez soigneusement les sphéroïdes en échangeant le milieu. Répétez deux fois.
- Préparez une solution de collagène I de 5 mg/mL selon les recommandations du fabricant (autre procédure de gelation, voir calcul exemplaire ci-dessous). Remplacer l’eau distillée par un milieu complet. Lors du calcul du volume de milieu à utiliser, ez-vous compte du fait que les sphéroïdes seront ajoutés dans 20 μL de milieu complet [p. ex., pour un SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL de collagène 5 mg/mL J’en ai besoin (préparer 20 % de plus pour tenir compte de la perte de pipetage lors de la manipulation des liquides visqueux); 1 22 μL de milieu complet + 10,8 μL de 10 x PBS + 1,2 μL de 1 M NaOH + 54 μL de 10 mg/mL de collagène I stock].
- Recueillir tous les sphéroïdes dans 20 μL de milieu, à l’aide d’une pipette P200, et les ajouter à la solution de collagène I préparé à l’étape 2.6.
- Mélangez lentement la solution en pipetage de haut en bas pour éviter l’hétérogénéité dans la concentration de collagène I, limitant la formation de bulles. Gardez la solution sur la glace.
- Retirez la solution de stockage du SID(s) et lavez-la 3 fois avec 3 mL de 1x PBS. Après le lavage final, laisser sécher le SID afin de ne pas diluer la solution collagène I.
- Démarrez une mise à jour et distribuez 30 μL de la solution collagène I contenant un sphéroïde dans l’un des trois trous du SID. Assurez-vous visuellement qu’un seul sphéroïde est contenu dans le 30 μL.
- Répétez l’étape 2.10 deux fois de plus pour remplir les 3 trous d’un SID.
- Utilisez une pointe de pipette de 10 μL pour centrer à nouveau le sphéroïde s’il est situé près de la frontière PDMS. Si deux ou trois sphéroïdes finissent par être distribués dans l’un des trous, la même pointe de pipette peut être utilisée pour séparer les sphéroïdes les uns des autres. Arrêtez la chrono.
REMARQUE : L’inversion fréquente du SID à l’envers et à l’envers, tout au long de la période de polymérisation et de solidification du collagène I, garantit que le sphéroïde est positionné au centre vertical de la couche ECM et empêche l’invasion des cellules en 2D. La fréquence des inversions (retournements) doit être maximisée. Comme la fréquence de retournement est contrôlée par le « temps de distribution » sphéroïde mesuré en 2,10-2,12, le temps de distribution doit être réduit au minimum. Dans notre laboratoire, le temps de distribution est de 2 min en moyenne. - Pour centrer verticalement le sphéroïde dans la couche de collagène, retournez le SID à l’envers et incubez à 37 °C pour le temps de distribution.
- Retourner le SID à l’envers et incuber à 37 °C pour le temps de distribution.
REMARQUE : Le temps que les sphéroïdes passent dans l’orientation à l’envers doit être égal au temps passé dans l’orientation à l’envers. - Répétez les étapes 2.13 et 2.14 pendant 30 min, jusqu’à ce que le collagène I polymérise.
- Ajoutez 2,5 mL de support/SID complet et, si nécessaire, obtenez une image des sphéroïdes pour le point de temps initial.
- Répétez les étapes 2.10-2.16 si plusieurs SID sont utilisés.
3. Étiquetage par fluorescence des sphéroïdes
- Imagerie en direct (Durée 6-7 jours)
REMARQUE : Si une lignée cellulaire exprimant une protéine fluorescente cytoplasmique et/ou nucléaire est disponible, suivez les étapes décrites dans la section 2. Alternativement, pour l’étiquetage cytoplasmique, le protocole suivant est proposé.- Suivez les étapes 2.1-2.5 du protocole décrit dans la section 2.
- Diluer le colorant cytoplasmique à 25 μM dans 200 μL de milieu sans sérum.
REMARQUE : Bien qu’un colorant cytoplasmique rouge soit utilisé dans cette expérience, toute autre couleur disponible devrait convenir. Les cellules cancéreuses ont été étiquetées à l’intérieur des sphéroïdes à l’aide de sous-vêtements nucléaires dilués à 20 μM dans 200 μL de milieu sans sérum (voir tableau des matériaux). - Après le lavage final, resuspendez les sphéroïdes dans la solution de colorant cytoplasmique ou nucléaire et incubez à température ambiante pendant 20 min, à l’abri de la lumière.
REMARQUE : Avec cette approche, l’étiquetage des cellules dans le centre sphéroïde ne sera pas efficace. Pour obtenir l’étiquetage de toutes les cellules, l’incubation peut être prolongée pendant la nuit, en plaçant le plat sur un rocker. Des alternatives sont décrites dans discussion. - Laver les sphéroïdes 3 fois dans un milieu complet.
- Passez aux étapes 2.6-2.17 du protocole décrites à l’article 2.
- Sphéroïdes d’image par imagerie time-lapse toutes les 10 minutes pendant 24-72 h (figure 2), ou par imagerie longitudinale, quotidiennement, pendant jusqu’à 7 jours (figure 3). Utilisez un microscope confocal à balayage laser, un objectif d’air 10x (ouverture numérique de 0,4 et distance de travail de 3,1 mm), 1024 x 1024 pixels, temps d’exposition de 8 μs/pixel, sténopé 90 μm, 6 x 15 z-steps de μm et 3 champs de vue chacun contenant un sphéroïde.
REMARQUE : Pour l’imagerie en accéléré, utilisez une puissance laser minimale et équipez le microscope d’une chambre environnementale avec température, humidité et contrôle du gaz. Culture des sphéroïdes intégrés à 37 °C pour > 8 h ou toute la nuit avant l’imagerie afin de minimiser le temps passé au microscope.
- Coloration immunofluorescence des sphéroïdes (Durée 2 jours)
REMARQUE : La procédure décrite ici est adaptée et optimisée à partir des protocolesprécédemment publiés 8,9. Cette méthode peut être utilisée après le protocole décrit dans les sections 2 et 3.1.- Préparez fraîchement les solutions suivantes.
- Solution de fixation : 1x PBS contenant 4% de PFA (vol/vol) [p. ex., ajouter 5 mL de 16% (vol/vol) PFA à 15 mL de 1x PBS].
- Solution de fixation et de perméabilisation : 1x PBS contenant 4 % de PFA (vol/vol) et 0,5 % de Triton X-100 (vol/vol) [p. ex., ajouter 50 μL de Triton X-100 à 10 mL de solution de fixation].
- Solution de blocage : 1x PBS contenant 1 % de FBS (vol/vol) et 1 % de BSA (wt/vol) [p. ex., dissoudre 100 mg de BSA dans 10 mL de 1x PBS, puis ajouter 100 μL de FBS].
- Solution de lavage : 1x PBS contenant 0,05 % de Tween 20 (vol/vol) [p. ex., ajouter 25 μL de Tween 20 à 50 mL de 1 x PBS].
- Retirer le milieu de culture du SID(s) et laver une fois avec 1x PBS chaud.
- Ajouter 2 mL de solution de fixation et de perméabilisation par SID et incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Retirez la solution de fixation et de perméabilisation et ajoutez 2 mL de solution de fixation par SID et incubez à température ambiante pendant 20 min.
- Lavez-vous 3 fois avec la solution de lavage.
- Ajouter 2 mL de solution de blocage par SID et incuber à 4 °C pendant 24 h avec des secousses légères.
REMARQUE : À cette étape, les échantillons peuvent être incubés à 4 °C, au cours du week-end. Veuillez noter qu’un temps de blocage plus long pourrait interférer avec la procédure d’étiquetage de l’immunofluorescence. - Diluer les anticorps primaires dans la solution de blocage.
- Ajouter 150 μL de solution de blocage avec des anticorps primaires/puits dans une plaque de 48 puits.
- À l’aide d’une pince fine, détachez soigneusement le bouchon de collagène I contenant un sphéroïde et transférez-le dans un puits. Répétez si plusieurs sphéroïdes sont étiquetés. Essuyez tout liquide qui pourrait rester sur la pince à épiler lorsque vous travaillez avec différents anticorps, afin d’éviter la contamination.
- Incuber toute la nuit à 4 °C avec des secousses légères.
- Ajouter 300 μL de solution de lavage aux puits vides et pleins.
- Transférez soigneusement le bouchon de collagène I contenant un sphéroïde dans un puits de lavage.
- Laver 3 fois avec une solution de lavage de 2 h, à température ambiante et avec une légère secousse.
REMARQUE : Le transfert des bouchons de collagène I contenant un sphéroïde, au lieu d’aspirer les solutions, peut aider à réduire la perte d’échantillon et les dommages à l’échantillon. - Diluer les anticorps secondaires, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) et/ou phalloidin dans la solution de blocage.
- Ajouter 150 μL de solution de blocage avec des anticorps secondaires, DAPI et/ou phalloidin par puits.
- À l’aide d’une pince à épiler, transférer soigneusement la fiche de collagène contenant les sphéroïdes dans le puits. Répétez si plusieurs sphéroïdes sont étiquetés.
- Incuber à température ambiante pendant 1 h avec des secousses légères.
- Répétez les étapes 3.2.11 et 3.2.12.
- Laver 3 fois avec une solution de lavage pendant 30 min, à température ambiante avec une légère secousse.
- À l’aide d’une lame de rasoir, couper un insert PDMS de 3 trous en trois parties afin que chaque pièce contienne un trou.
- Placez deux morceaux de PDMS sur une lame de microscope.
- Ajoutez une goutte de solution de montage à l’aide d’une pointe P200 avec la fin coupée. Empêchez la formation de bulles.
- Transférer soigneusement un collagène que je branche dans chaque trou.
REMARQUE : Si le sphéroïde a été placé en haut de la fiche de collagène, inversez le bouchon de collagène de sorte que le sphéroïde se retrouve plus près du couvercle en verre. - Déposer un coverslip sur le dessus et sceller à l’aide de ruban adhésif.
- Laissez sécher l’échantillon à température ambiante pendant 10 min, à l’abri de la lumière.
- Conserver les échantillons à 4 °C, à l’abri de la lumière jusqu’à l’imagerie.
- Préparez fraîchement les solutions suivantes.
4. Traitement d’image pour analyser l’invasion du cancer au fil du temps
REMARQUE : Le format requis pour cette macro est une image x,y,t à canal unique enregistrée sous forme de .tiff fichier.
- Si plusieurs tranches z ont été acquises(c.-à-d. x,y,z,t image), ouvrez l’image aux Fidji et sélectionnez Image | Piles | Projet Z. Il est recommandé d’utiliser l’option Intensité maximale. Alternativement, une seule tranche z peut être utilisée pour exécuter la macro. Enregistrez l’image sous forme .tiff fichier.
- Créez un dossier « Traitement » distinct sur le bureau.
- Sélectionnez Fichier | Enregistrer comme | Séquence d’image. Utilisez le format TIFF, mettez à jour le nombre de chiffres en fonction du nombre d’images, cochez la case pour utiliser l’étiquette de tranche comme nom de fichier et sélectionnez Ok. Sélectionnez le dossier « Traitement » créé à l’étape 2.
- Ouvrez une image du dossier « Traitement ». Il devrait s’agir d’une image x,y, correspondant à un seul point de temps.
- Sélectionnez Image | Ajuster | Seuil automatique. Dans le menu dropdown sélectionnez la méthode Essayez tous et cochez la case pour les objets blancs sur fond noir.
- Une image de montage apparaît montrant le résultat de chaque méthode de seuil automatisé.
- Identifier la meilleure méthode de seuil automatisé, par exemple RenyIEntropy.
- Pour confirmer le choix de la méthode de seuil automatisé, ouvrez toute autre image à partir du dossier « Traitement » et testez la méthode de seuil choisie à l’aide de l’image | Ajuster | Seuil automatique.
- Fermez toutes les images.
- Télécharger la macro SpheroidAreaTime (Fichier supplémentaire 2).
- Ouvrez la macro Fidji par drag-and-drop.
- Dans la ligne 58, mettez à jour la méthode de seuil automatisé au besoin.
- Dans la ligne 62, mettre à jour la plage de taille en fonction des dimensions cellulaires.
- Sélectionnez Exécuter.
- Sélectionnez le dossier « Traitement » et tapez « Traitement » comme dossier Parent, puis sélectionnez Ok.
- Une fois la course terminée, enregistrez la table « Summary ». La première colonne indique le nom de l’image; la troisième colonne indique la zone sphéroïde; les sixième, septième et huit colonnes spécifient les paramètres d’une ellipse montée sur le sphéroïde.
- Le dossier « Traitement » contient maintenant une image traitée pour chaque point de temps, avec l’extension _SpheroidArea.
REMARQUE : Si le centre sphéroïde est faible, remplissez-le de blanc à l’aide des outils de sélection, pour tous les points de temps, puis passez à l’étape 3. De même, l’espace autour du sphéroïde peut être rempli de noir pour « nettoyer » l’image. Si l’image est propre, commentez la ligne 61 pour accélérer la course.
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Representative Results
En raison de sa biocompatibilité, PDMS est largement utilisé pour la microfabrication de puits de sécation, timbres et moules, qui a révolutionné le micropatterning et les dispositifs microfluidiques. Dans la méthode décrite ici, il est utilisé pour créer des SID, des puits personnalisables qui optimisent l’intégration sphéroïde et la procédure d’imagerie. La figure 1 illustre les principaux composants utilisés dans la fabrication des DS. Pour moulage du moule PDMS, un espaceur de 1 mm d’épaisseur est imprimé en 3D (Figure 1A,B), placé entre les deux plaques de verre, scellées avec de gros clips. Verser et cuire le PDMS dans l’espace entre les plaques forme une feuille de PDMS de 1 mm d’épaisseur. Le schéma SID (Figure 1C) indique les dimensions de l’appareil optimal, quelle que soit la légère variation se produit dans les distances de trou, en raison de poinçonnage manuel des trous à l’aide de poinçons biopsie (Figure 1D). Figure 1D,F indiquent des coupes circulaires propres avec des trous uniformément espacés dans l’insert PDMS.
L’utilisation des SID facilite l’intégration efficace, et donc l’enregistrement de l’invasion des cellules cancéreuses à l’intérieur du collagène I en utilisant time-lapse (Figure 2, Vidéo 1) ou longitudinale (Figure 3) imagerie. En dépit de l’utilisation des mêmes fréquences d’inversion pour tous les SID pendant la polymérisation de collagène I, les positions sphéroïdes à l’intérieur de la prise de collagène varieront légèrement. Par conséquent, il est important d’utiliser un objectif avec une longue distance de travail (>1 mm). Sinon, la mise au point et l’imagerie peuvent être difficiles pour les sphéroïdes placés près du haut de la fiche de collagène. En revanche, les sphéroïdes placés près du fond de la prise de collagène, auront des cellules qui se déplacent vers la surface du verre et migrent sur le verre, au lieu d’envahir dans la matrice de collagène I. Les vidéos de ces sphéroïdes doivent être jetées. L’épaisseur de la fiche de collagène, ici d’environ 800 μm, est contrôlée par le volume distribué dans chaque trou du SID et ajusté aux distances d’invasion que les sphéroïdes présentent dans ce protocole. L’épaisseur du bouchon de collagène peut être abaissée en distribuant un volume inférieur de collagène I dans chaque trou du SID, lors de l’utilisation de sphéroïdes plus petits ou moins invasifs.
Pour une analyse appropriée de l’invasion à l’aide de la macro fidjienne, il est essentiel que les cellules cancéreuses soient correctement étiquetées au cours de la séance d’imagerie. Comme indiqué dans l’étape 4.17., l’étape de traitement d’image permet la correction d’image si l’étiquetage est sous-optimal. Bien que nous montrions l’imagerie longitudinale sur une période de 6 jours (figure 3), ce qui nécessite l’expression stable de protéines cytoplasmiques et/ou fluorescentes nucléaires, une imagerie longitudinale similaire pourrait être effectuée sur une période plus courte en utilisant l’étiquetage avec des colorants.
Après l’imagerie en direct, nous présentons quelques résultats de la procédure d’immunolabeling pour la cadhérine épithéliale (E-cadherin), la cortactine et la F-actine (figure 4). Dans ces exemples, nous avons utilisé les lignes cellulaires 4T1 et 67NR. La figure 5 montre l’illustration étape par étape de la procédure de traitement de l’image à l’aide de la macro Fidji pour mesurer la zone du sphéroïde au fil du temps.
Figure 1 : Fabrication des DS. (A) Représentation schématique de vue supérieure de l’espaceur. (B) espaceur imprimé 3D. (C) Représentation schématique de vue supérieure du SID. Un inserts PDMS de 3 trous (D) est lié à un plat de fond en verre (E), la création du SID final (F). Les dimensions sont en millimètres. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Imagerie en direct des sphéroïdes. Représentant 20 h et 40 h points de temps de la vidéo 1, projection maximale d’un sphéroïde 4T1. Les cellules 4T1 ont été étiquetées à l’aide d’un colorant cytoplasmique. Barre d’échelle, 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Imagerie longitudinale des sphéroïdes. Micrographes représentatifs (projection maximale) d’un sphéroïde mixte 4T1/67NR photographié quotidiennement. Les cellules 4T1 et 67NR expriment stably le mScarlet cytoplasmique et la protéine fluorescente verte (GFP), respectivement. Barre d’échelle, 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Imagerie immunofluorescence des sphéroïdes. Des micrographes représentatifs (projection maximale) d’un sphéroïde 4T1 fixé 2 jours après l’intégration dans le collagène I. E-cadherin (cyan, A), la cortactine (jaune, B) et F-actin (magenta, A et B) ont été étiquetés. Barre d’échelle, 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 : Analyse du traitement d’image. Illustration étape par étape de la procédure de traitement d’image à l’aide de la macro Fidji (A) pour mesurer la zone du sphéroïde au fil du temps (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Vidéo 1 : Vidéo représentative d’un sphéroïde 4T1 photographié toutes les 10 minutes pendant 46 h et 10 min. Les cellules 4T1 ont été étiquetées à l’aide d’un colorant cytoplasmique. Barre d’échelle, 100 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.
Fichier supplémentaire 1: Modèle 3D de l’espaceur (fichier STL). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Fichier supplémentaire 2: Macro SpheroidAreaTime. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
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Discussion
L’espaceur imprimé en 3D a été conçu pour créer des feuilles de PDMS de 1 mm d’épaisseur qui peuvent ensuite être utilisées pour créer facilement diverses formes de PDMS, comme l’exigent les applications expérimentales. En raison de la simplicité de sa fabrication et de la liberté de modifier la conception, cette méthode de moulage PDMS a été choisie pour la conception initiale du SID. Si un volume élevé de DIS est nécessaire, la production peut être rendue plus efficace en créant un moule imprimé en 3D, qui contient déjà des disques PDMS avec trois trous également espacés, et en réduisant le processus à une étape. Cela éliminerait la nécessité de percer chaque disque, ainsi que les trois trous suivants, et diminuerait le temps de préparation global.
Alors que le poinçon de 3 trous est développé pour une utilisation avec des plats de fond en verre de 35 mm, d’autres tailles sont disponibles qui permettent plus de trous et donc, plus de sphéroïdes à l’image en parallèle. En outre, le verre de couverture sur mesure est également disponible dans le commerce, qui, en combinaison avec des supports imprimés 3D, peut permettre des analyses sphéroïdes à haut débit. Avec une telle approche, le facteur limitant est la vitesse d’acquisition de données - par exemple, dans notre imagerie confocale multicolore en accéléré, l’acquisition d’une pile 3D d’un seul sphéroïde nécessite environ 2,5 minutes. Par conséquent, l’acquisition de piles 3D pour 3 sphéroïdes dans le SID nécessite environ 8 minutes. Par conséquent, pour maintenir notre fréquence préférée d’imagerie à 10 minutes par pile, nous ne pouvons pas augmenter le nombre de trous dans les DS.
Pour enregistrer et quantifier l’invasion des cellules cancéreuses vivantes dans le modèle sphéroïde 3D, l’imagerie par champ lumineux peut êtreutilisée 5. Cependant, la microscopie de fluorescence est préférée, car elle fournit le contraste accru, et la facilité et la précision dans le traitement d’image. Si la génération d’une lignée cellulaire exprimant une protéine fluorescente cytoplasmique et/ou nucléaire n’est pas possible, nous proposons l’utilisation des colorants cytoplasmiques. Comme le temps de rétention des dyes cytoplasmiques à l’intérieur des cellules est de trois jours dans nos conditions d’imagerie, les cellules doivent être étiquetées après la période de 3 jours dans la chute suspendue, et immédiatement avant l’intégration. L’étiquetage des cellules post-intégration peut non spécifiquement étiqueter le collagène et réduire l’étiquetage cellulaire. L’imagerie pendant plus de 3 jours après l’intégration nécessite l’utilisation d’un protocole d’ensemencementsphéroïde différent 10 ou de lignées cellulaires exprimant habilement les protéines fluorescentes.
Nous avons réussi à former et à imager des sphéroïdes contenant entre 60 et 5 000 cellules/gouttes. Les petits sphéroïdes sont idéaux pour enregistrer l’invasion sur plusieurs jours, car toute leur zone d’invasion peut facilement s’insérer dans un seul champ de vision des objectifs de grossissement plus élevé (20x-30x). En outre, ils peuvent facilement être étiquetés partout avec des dyes cytoplasmiques ou nucléaires. Enfin, en raison de la réduction de la dispersion, chaque cellule du sphéroïde peut être visualisée et segmentée. Cependant, les petits sphéroïdes sont à peine visibles à l’œil nu et peuvent nécessiter un étiquetage supplémentaire avec des marqueurs tissulaires. En revanche, les sphéroïdes plus grands sont plus faciles à manipuler, mais plus susceptibles de couler au fond du plat, en raison de leur poids. En outre, les cellules dans le centre sphéroïde ne sont pas toujours étiquetées lors de l’utilisation de dyes, ou visibles à l’aide de microscopie confoccale, qui a une profondeur de pénétration d’environ 100 micromètres. Pour visualiser toutes les cellules cancéreuses dans les grands sphéroïdes à l’aide de l’imagerie en accéléré, la microscopie multiphoton peut être utilisée, offrant un avantage supplémentaire de visualisation des fibres de collagène par deuxième génération harmonique (SHG) sans avoir besoin d’étiquetage. En outre, l’imagerie peut être faite avec la microscopie de feuille delumière 8,11,12, fournissant le temps réduit d’acquisition d’image et permettant ainsi des analyses sphéroïdes à haut débit, mais exigeant également plus de stockage de données et le traitement avancé d’image. Si des vidéos en accéléré ne sont pas nécessaires, notre procédure d’étiquetage pour les sphéroïdes 3D fixes peut être combinée avec la compensationoptique 8,10. En outre, la cryosection des sphéroïdes incorporés peut éliminer les problèmes de pénétration du colorant ou de l’anticorps pendant l’étiquetage, ainsi que la pénétration de la lumière pendant l’imagerie. Dans nos mains, cependant, le cryosectioning réussi a été limité aux premiers stades de l’invasion et des cellules non invasives, en raison des défis techniques dans la conservation des brins envahissants longs et fragiles.
Notre protocole est également compatible avec l’utilisation de dyes nucléaires, pour étiqueter les cellules cancéreuses à l’intérieur des sphéroïdes, permettant un suivi cellulaire unique des données en accéléré. Le plugin Fidji TrackMate13 peut être utilisé pour automatiser le suivi cellulaire et extraire les paramètres de motilité des cellules individuelles, telles que la vitesse, la vitesse instantanée et la persistance.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier les membres de Temple Bioengineering pour leurs précieuses discussions. Nous remercions David Ambrose au noyau de cytométrie de flux (Lewis Katz School of Medicine) pour son aide au tri cellulaire et Tony Boehm du IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) pour son aide dans l’impression 3D. Nous remercions également nos ressources de financement : American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 et R01 CA230777, tous à BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
