Summary
ここで提示される、スフェロイドイメージング装置の製造のためのプロトコルである。この装置は癌細胞スフェロイドの動的または縦方向の蛍光のイメージ投射を可能にする。プロトコルはまた癌細胞の浸潤の分析のための簡単な画像処理手順を提供する。
Abstract
原発性腫瘍から隣接する健康組織への癌細胞の侵入は、転移の初期段階である。浸潤性癌細胞は、播種が進行すると排除するための効率的な方法が存在しないため、大きな臨床的課題を提起する。がん細胞の浸潤を調節するメカニズムをよりよく理解することは、新しい強力な治療法の開発につながる可能性があります。その生理学的に腫瘍に類似しているため、コラーゲンIに埋め込まれたスフェロイドは、細胞外マトリックス(ECM)への癌細胞浸潤を支配するメカニズムを研究するために研究者によって広く利用されてきた。しかし、このアッセイは(1)ECMへのスフェロイドの埋め込みに対する制御の欠如によって制限される。(2)コラーゲンIおよびガラス底皿の高コスト、(3)信頼性の低い免疫蛍光標識、抗体および蛍光色素の非効率的な浸透及び(4)時間のかかる画像処理及びデータの定量。これらの課題に対処するために、3次元(3D)スフェロイドプロトコルを最適化し、コラーゲンIに埋め込まれた蛍光標識癌細胞を、タイムラプスビデオまたは縦断イメージングを使用して画像化し、癌細胞の浸潤を分析しました。まず、スフェロイドを確実に、かつ最小限のコラーゲンI体積に埋め込むスフェロイドイメージング装置(SID)の製造を説明し、アッセイコストを低減する。次に、生および固定スフェロイドのロバスト蛍光標識のステップを説明します。最後に、画像処理とデータ定量のための使いやすいフィジーマクロを提供します。全体として、この単純な方法論は、コラーゲンIの癌細胞浸潤を監視するための信頼性の高い、手頃な価格のプラットフォームを提供します。さらに、このプロトコルはユーザーのニーズに合わせて簡単に変更できます。
Introduction
癌進行の間に、癌細胞は、運動性および侵襲的表現型を獲得することができ、腫瘍塊を逃れ、周囲の組織1に侵入することを可能にする。最終的には、これらの浸潤性癌細胞は、二次器官内に到達して増殖し、癌転移1と呼ばれるプロセスである。転移は癌関連死の90%以上を引き起こす2.その理由の1つは、局所的な腫瘍は臨床的に管理可能であるが、転移性広がりに一度起こった後に浸潤癌細胞を排除するための効率的な方法が存在しないことです。したがって、浸潤性癌細胞の出現と、局在性から侵襲的な疾患への移行は、大きな臨床的課題を提起している。がん細胞が侵襲的な行動をどのように開始し、維持するかを決定することは、新しい強力な治療法の開発につながる可能性があります。
3Dスフェロイドモデルは、制御下にある癌細胞の運動性挙動を調査するのに理想的なプラットフォームであり、しかも生理学的に関連する条件3.実際、このアッセイでは、癌細胞のスフェロイドが細胞外マトリックス(ECM)の内部に埋め込まれている、例えばコラーゲンIは、単純化された腫瘍を模倣する。次いで、イメージングを使用して、スフェロイドからコラーゲンマトリックスへの癌細胞の浸潤を可視化する。ただし、複数の課題によってこの手順が制限されます。
最初の課題は、液体コラーゲンマトリックスが皿表面全体に広がり、回転楕円体が皿の底に触れる埋め込みステップで起こります。その結果、回転楕円体の細胞が2次元(2D)表面に広がり、3次元(3D)回転楕円体形態を破る。コラーゲンの量を増やすことは効率的ですが、コストのかかるソリューションです。細胞が2D表面に広がるのを防ぐために、コラーゲンの最小量を維持しながら、ガラス底皿に1mmの厚さ、3穴のポリジメチルシロキサン(PDMS)インサートを囲むスフェロイドイメージング装置(SID)を開発しました。
スフェロイドアッセイの第2の課題は、抗体および蛍光色素の浸透不良によって制限されるスフェロイドにおける癌細胞の標識であり、スフェロイドサイズに伴って増大する効果である。細胞の標識に理想的なソリューションは、安定して蛍光タンパク質を発現する細胞株の確立であるが、このオプションは、ほとんどが不死化細胞株に限定され、蛍光タンパク質キメラの入手可能性によって制限される。ここでは、固定スフェロイドの免疫蛍光染色に最適化されたプロトコルと、球状体を埋め込む直前に細胞にラベルを付ける細胞質色素の効率的な使用について述べています。
スフェロイドアッセイの3番目の課題は、時間の経過に関する細胞浸潤の半自動化定量化のための単純なフィジーマクロの欠如です。この課題に対処するために、時間の経過に合ったスフェロイド領域を分析する簡単な方法論を説明します。例として4T1および67NRセルラインを用いて、このプロトコルの利点を説明する。
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Protocol
1. スフェロイド埋め込みを最適化するためのスフェロイドイメージングデバイス(SID)の製作(所要時間1日)
- 3D プリンタを使用してスペーサーを作成します (図 1A、B、補助ファイル 1)。
- プラスチックカップ中のベースポリマー:架橋剤の比を10:1(wt/wt)に計量する[例えば、エチルベンゼンベースポリマー20g、シリコーン樹脂架橋器2gをポリジメチルシロキサン(PDMS)]を作成する。
- 使い捨てピペットを使用して、プラスチックカップにPDMS溶液を十分に混ぜます。
- プラスチックカップを真空チャンバーに入れ、気泡を混合液から取り除きます。真空圧を素早く放出し、混合物の表面に閉じ込められた少量の空気を除去し、残りの気泡を放散します。
- 3Dプリントスペーサーを100°Cで5分間インキュベートし、柔軟性を高めます。
- PDMSモールドを100%イソプロパノールで拭いて徹底的に構築するために使用される2つのガラスプレートをきれいにしてください。ガラス板をPDMSのキャストに使用していた場合は、ガラス板をカミソリの刃でそっと削り取り、100%イソプロパノールで拭いて、残りの古いPDMSを取り除いてください。
- 3D プリントされたスペーサーを 2 つのクリーンなガラスプレートの間に入れることで、金型を構築します。
- ガラス板の外側の端に大きなバインダークリップを使用して、金型をシールします。下端に 2 つのバインダー クリップを配置し、上端に 1 つを配置します。
- モールドの上部を調べて、スペーサーがガラスプレートと一緒にフラッシュされていることを確認します。これにより、変形が存在しない、および PDMS の偶数シートが作成されることを保証します。
注: 作成されるシートの厚さが均一でない場合は、クリップを少し調整する必要があります。 - 使い捨てのピペットの先端(先端から2cm)を切り、PDMS混合物を金型の左上隅にゆっくりと一定の速度で加えます。大きなエアポケットの作成を防ぐためにゆっくりと混合物を注ぎます。
- 鋳型を真空チャンバーに入れ、注ぎ口の間に形成された気泡を取り除きます。
- 100°Cで1時間インキュベートしてPDMSを硬化させる。
- インキュベーターから金型を取り出し、冷却して触れるようにします。
- 硬化したPDMSを含むスペーサーからバインダークリップとガラスプレートを取り外します。
- カミソリの刃を使用して、スペーサーとガラス板の間の金型の4つの側面すべてに作成されたシールを切断します。4つの側面をすべて切り取り、モールドを引き離してスペーサーのPDMSシートを明らかにします。
- ピンセットを使用して、スペーサーの新しいPDMSシートを慎重に剥がします。
- 切断マット上で、シートから直径17.5mmのPDMSディスクをパンチアウトし、異なるサイズの生検パンチを使用して、直径5.5mmの穴を均等に分配した3つの穴をパンチします。ここでは、これらの3ホールPDMSディスクを「挿入」と呼びます(図1C)。
注意:PDMSに行われた不均一な切断、またはプラズマ処理による結合不良は、将来の漏れをもたらす可能性があります。 - テープを使用してほこりを取り除くことで、各インサートを洗浄します。
- 挿入物を両面テープに貼り付け、10cmのペトリ皿の蓋にテープを巻きます。
- プラズママシンにペトリ皿の蓋を、開いた35mmガラス底皿と一緒に置きます。
- 300 mTorrで1分間プラズマ処理を行い、挿入物とガラスの表面を活性化します。ハンドヘルドプラズマ杖を使用できます。
- ピンセットを使用して、ガラス底皿のガラス部分に1つのインサート(図1D)の逆さま、すなわち処理された側面(図1D)を素早く取り付ける(図1E)。すべての料理に対して繰り返します。
- ポインタの指と親指を使用して、ガラス底皿を回転させながら均一な圧力を加えます。これにより、ガラス底皿への挿入物の安定した固定を保証します。
- 60°Cで60°Cで20分間培養し、ガラスとPDMSの密着性を強化します。
- ステップ 1.21 またはハンドヘルド杖と同じ設定を使用して、SID 上で 2 回目のプラズマ処理を行います。これにより、コーティング溶液中のポリL-リジンに対するフリーPDMS表面の接着が行われます(1.26参照)。
- 次のソリューションを新たに準備します。
- コーティング溶液:0.01%(vol/vol)ポリL-リジンを含む1x PBS[例えば、0.1%(vol/vol)ポリL-リジンの10 μLを1x PBSの90 μLに加える]。
- 架橋溶液:1x(vol/vol)グルタルアルデヒドを含む蒸留水[例えば、10xグルタルアルデヒド10μLを90μLの蒸留水に加える]。
- 貯蔵溶液:10x(vol/vol)ペニシリンストレプトマイシンを含有する1x PBS[例えば、100xペニシリンストレプトマイシンの1mLを1x PBSの9 mLに加える]。
- 各穴ごとに35 μLのコーティング溶液を加え、室温で1時間インキュベートします。
- ポリL-リジンを吸引し、蒸留水でSID全体を3回リンスします。
- 各穴ごとに35 μLの架橋溶液を加えて、室温で30分間インキュベートします。
- 架橋液を吸引し、蒸留水でSID全体を3回リンスします。
- 各SIDに70%エタノールを加え、紫外線(UV)光の下で30分間置きます。
- ボンネットの下で、エタノールを吸引し、蒸留水でSIDを3回リンスします。
- 各 SID ごとに 2.5 mL のストレージ ソリューションを追加します。
注:この段階では、SIDは1週間4°Cで保存することができます。PDMSとガラス間の結合強度は経時減少することが観察された。1 週間を超えて、ユーザーは使用前に潜在的な漏出の可能性がある SID をテストすることをお勧めします。これを行うには、ストレージ溶液を吸引し、各穴に35 μLの1x PBSを加えます。使用後、PDMSインサートはガラス底皿を剥がすことができます。ガラス底皿の最適な洗浄を達成するために、イソプロパノールと塩酸を用いた洗浄液を使用してPDMS残基を除去する必要があります。
2. スフェロイド形成とコラーゲンへの埋め込み(所要時間4日間)
注:縦方向またはタイムラプスビデオで、スフェロイドのライブイメージングには、細胞質および/または核蛍光タンパク質を発現する細胞株を使用してください。このようなセルラインが使用可能な場合は、このセクションで説明する手順に従います。あるいは、セクション3では、細胞質染料を用いてスフェロイド中の癌細胞に標識するプロトコルが提案されている。
- 4,5,6,7の4,000個の細胞/40 μL液滴および3日間のインキュベーション時間を用いて、4T1および/または67NR細胞のスフェロイドを形成する。牛アテロコラーゲンI溶液を最後に加え、常に氷の上のすべての溶液を維持します。
- 明視野顕微鏡を用いて正しく形成されたスフェロイドを特定する。
- 15 mL円錐形チューブに8 mLの温め込み完了培地を充填します。
- P1000ピペットでスフェロイドを収集し、15 mL円錐管に移します。ピペットチップの内側壁にスフェロイドが付着するのを防ぎ、回転楕円体の損失を制限するために、ピペットチップを完全な媒体の内外にピペットで湿らします。
- スフェロイドをチューブの底に沈め、慎重に媒体を交換して回転楕円体を洗浄します。2 回繰り返します。
- メーカーの推奨に従って5 mg/mLコラーゲンI溶液を調製します(代替ゲル化手順、下記の例示的な計算を参照)。蒸留水を完全な媒体に交換します。使用する媒体の体積を計算する際には、スフェロイドが完全な媒体の20 μLで添加されることを考慮に入れる[例えば、 1つのSID、3 x 30 + (3 x 30)x 20%=5mg/mLコラーゲンIの108 μLが必要です(粘性流体を処理する際のピペット損失を考慮して20%余分に準備します);10x PBSの22 μL + 10x PBS 1.2 μL + 1 M NaOH + 54 μL 10 mmg m/mlの10mgの1.2 μL
- P200ピペットを使用して20μLの培地ですべてのスフェロイドを収集し、ステップ2.6で調製したコラーゲンI溶液に追加します。
- コラーゲンI濃度の不均一性を避けるために上下にピペットを入れ、気泡形成を制限して溶液をゆっくりと混ぜます。氷の上にソリューションを保ちます。
- ストレージ溶液をSIDから取り出し、3mLの1x PBSで3回洗います。最後の洗浄後、コラーゲンI溶液を希釈しないように、SID(複数可)を乾燥させておきます。
- タイマーを開始し、1つのスフェロイドを含むコラーゲンI溶液の30μLをSIDの3つの穴の1つに分配します。視覚的に、単一のスフェロイドが30μLに含まれていることを確認します。
- ステップ 2.10 をさらに 2 回繰り返して、SID のすべての 3 つの穴を埋めます。
- PDMS境界の近くに位置する場合は、10 μL のピペットチップを使用して、回転楕円体の中央を再設定します。2つまたは3つのスフェロイドが穴の1つに分配された場合、同じピペットチップを使用して、スフェロイドを互いに分離することができます。タイマーを停止します。
注:頻繁に逆さまと逆さまにSIDの反転、コラーゲンI重合と凝固の期間を通じて、スフェロイドは、ECM層の垂直中心に配置されていることを保証し、2Dで細胞の侵入を防ぐことができます。反転(反転)の頻度を最大化する必要があります。反転周波数は2.10-2.12で測定されたスフェロイド「分配時間」によって制御されるように、分配時間を最小限に抑える必要があります。私たちの研究室では、塗布時間は平均で2分です。 - コラーゲン層のスフェロイドを垂直に中央に合うように、SIDを逆さまに反転させ、37°Cでインキュベートして塗布時間を取ります。
- SIDを上下に反転させ、37°Cでインキュベートして、塗布時間を過ぎます。
注: 回転楕円体が上下逆方向に費やす時間の長さは、上下逆方向に費やされた時間と等しい必要があります。 - ステップ2.13と2.14を30分間繰り返し、コラーゲンIが重合するまで繰り返します。
- 完全な媒体/SIDの2.5 mLを加え、必要に応じて、初期のタイムポイントのための回転楕円体のイメージを取得します。
- 複数の SID が使用されている場合は、手順 2.10 ~ 2.16 を繰り返します。
3. スフェロイドの蛍光標識
- ライブイメージング(期間6-7日)
注: 細胞質および核蛍光タンパク質を発現する細胞株が利用可能な場合は、セクション 2 に記載されている手順に従ってください。あるいは、細胞質標識に関しては、以下のプロトコルが提案される。- セクション 2 で説明されているプロトコルの手順 2.1 ~ 2.5 に従います。
- 細胞質染料を200μLの無血清培地で25μMに希釈します。
注: 赤い細胞質色素がこの実験で使用されている間、他の利用可能な色は適切である必要があります。がん細胞は、無血清培地200μLで20μMに希釈した核色素を用いてスフェロイド内部に標識した( 材料表を参照)。 - 最終洗浄後、細胞質または核色素溶液中のスフェロイドを再懸濁し、光から保護された室温で20分間インキュベートします。
注: この方法では、回転楕円体の中心にあるセルのラベリングは効率的ではありません。すべての細胞の標識を達成するために、インキュベーションは、ロッカーの上に皿を置くことによって、一晩延長することができる。代替案については、「ディスカッション」で説明します。 - スフェロイドを完全培地で3回洗浄します。
- セクション 2 で説明されているプロトコルのステップ 2.6-2.17 に進みます。
- 24-72時間(図2)の10分毎にタイムラプスイメージングを介した画像スフェロイド(図2)、または縦方向イメージングを介して、毎日、最大7日間(図3)。レーザー走査共焦点顕微鏡、10x空気対物(0.4個の開口および3.1 mm作動距離)、1024 x 1024ピクセル、露出時間8μs/ピクセル、ピンホール90μm、6 x 15 μm zステップおよび3つの視野を使用して、1つの回転楕円体を含む各視野を有する。
注:タイムラプスイメージングには、最小限のレーザーパワーを使用し、温度、湿度、ガス制御を備えた環境チャンバを顕微鏡に装備してください。埋め込まれたスフェロイドを>8時間またはイメージング前の一晩に37°Cで培養し、顕微鏡上での時間を最小限に抑える。
- スフェロイドの蛍光染色(所要時間2日間)
注: ここで説明する手順は、以前に公開されたプロトコル8,9から調整され、最適化されています。この方法は、セクション 2 と 3.1 で概説されているプロトコルの後に使用できます。- 次のソリューションを新たに準備します。
- 固定溶液:4%PFA(vol/vol)を含有する1x PBS[例えば、16%(vol/vol)PFAの5mLを1x PBSの15mLに加える]。
- 固定および透過性溶液:4%PFA(vol/vol)および0.5%トリトンX-100(vol/vol)を含む1x PBS[例えば、トリトンX-100から10mLの固定溶液を50 μL追加]。
- ブロッキング溶液:1%FBS(vol/vol)および1%BSA(wt/vol)を含む1x PBS[例えば、10mLの1x PBSに100mgのBSAを溶解し、FBSの100 μLを加える]。
- 洗浄液:0.05%Tween 20(vol/vol)を含む1x PBS[例えば、1x PBSの20〜50mLの25 μLを加える]。
- 培養液をSIDから取り出し、温かい1倍PBSで1回洗います。
- SIDあたり2mLの固定および透過性溶液を加え、室温で5分間インキュベートします。
- 固定および透過性溶液を取り除き、1SID当たり2mLの固定溶液を加え、室温で20分間インキュベートします。
- 洗浄液で3回洗浄します。
- SIDあたり2mLのブロッキング溶液を加え、軽い振盪で4°Cで24時間インキュベートします。
注:このステップでは、サンプルは週末に4°Cでインキュベートすることができます。ブロッキング時間が長いほど、免疫蛍光標識手順に支障をきたす可能性があることにご注意ください。 - ブロッキング溶液中の希薄な一次抗体。
- 48ウェルプレートに150μLのブロッキング溶液を一次抗体/ウェルで加えます。
- 細かいピンセットを使用して、スフェロイドを含むコラーゲンIのプラグを慎重に取り外し、井戸に移します。複数の回転楕円体にラベルが付いている場合に繰り返します。異なる抗体を使用する場合は、ピンセットに残っている液体を拭き取り、汚染を防ぎます。
- 穏やかな揺れで4°Cで一晩インキュベート。
- 300 μL の洗浄液を空のウェルとフルウェルに追加します。
- スフェロイドを含むコラーゲンIのプラグを「洗浄」によく入れて慎重に移します。
- 洗浄液を2時間、室温で、軽い揺れで3回洗浄します。
注:溶液を吸引する代わりに、スフェロイドを含むコラーゲンIのプラグを移すので、サンプルの損失とサンプルの損傷を減らすのに役立ちます。 - 希薄二次抗体、4'、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)および/またはファロイジンをブロッキング溶液に含む。
- 2次抗体、DAPIおよび/またはファロイジンを用いたブロッキング溶液を150 μL加えます。
- ピンセットを使用して、慎重にウェルにスフェロイドを含むコラーゲンプラグを転送します。複数の回転楕円体にラベルが付いている場合に繰り返します。
- 穏やかな揺れで室温で1時間インキュベートする。
- ステップ 3.2.11 および 3.2.12 を繰り返します。
- 洗浄液で3回洗浄し、室温で軽い揺れで洗浄します。
- カミソリの刃を使用して、3ホールのPDMSインサートを3つの部分に切り、各部品に穴が開きます。
- 2枚のPDMSを顕微鏡スライドに置きます。
- P200先端を使用して、端部を切り取って、取り付けソリューションを一滴追加します。バブル形成を防ぐ。
- 各穴に慎重にコラーゲンIプラグを移します。
注:スフェロイドがコラーゲンプラグの上部に配置されている場合は、スフェロイドがガラスカバースリップに近づくようにコラーゲンプラグを反転します。 - カバースリップを上に置き、テープを使用してシールします。
- 試料を室温で10分間乾燥させ、光から保護します。
- 光からイメージングまで保護された4°Cでサンプルを保存します。
- 次のソリューションを新たに準備します。
4. 時間の経過に関するがんの侵入を分析する画像処理
注: このマクロに必要なフォーマットは、.tiffファイルとして保存された単一チャネルの X、Y、t イメージです。
- 複数の Z スライス (x、y、z、t イメージ) が取得された場合は、フィジーでイメージを開き、[イメージ | スタック |Zプロジェクト。[最大強度]オプションを使用することをお勧めします。または、1 つの z スライスを使用してマクロを実行することもできます。イメージを.tiffファイルとして保存します。
- デスクトップに別の「処理中」フォルダを作成します。
- ファイル|の選択|として保存イメージ シーケンス。TIFF 形式を使用して、フレーム数に応じて数字を更新し、スライス ラベルをファイル名として使用するチェックボックスをオンにして、[OK]を選択します。手順 2 で作成した「処理」フォルダを選択します。
- 「処理中」フォルダから1つの画像を開きます。これは、単一のタイムポイントに対応する x、y イメージである必要があります。
- イメージ|の選択|を調整する自動しきい値:ドロップダウンメニューで[すべて試す]メソッドを選択し、黒い背景の白いオブジェクトのチェックボックスをオンにします。
- 各自動しきい値法の結果を示すモンタージュ画像が表示されます。
- 最適な自動しきい値方法 (RenyIEntropyなど) を特定します。
- 自動しきい値の選択を確認するには、「処理」フォルダから他の画像を開き、画像|を使用して選択したしきい値方法をテストします 。|を調整する自動しきい値。
- すべての画像を閉じます。
- SpheroidAreaTime マクロ (補足ファイル 2)をダウンロードします。
- フィジーのマクロをドラッグ アンド ドロップで開きます。
- 58 行目で、必要に応じて自動しきい値方式を更新します。
- 62行目で、セルの寸法に従ってサイズ範囲を更新します。
- [ ファイルを実行 ] を選択します。
- [処理] フォルダを選択し、[親] フォルダとして [処理] に入力し 、[OK]をクリックします。
- 実行が終了したら、テーブル「概要」を保存します。最初の列はイメージの名前を示します。3 番目の列は、回転楕円体領域を示します。6 列目、7 列目、8 列目は、回転楕円体に取り付けられた楕円のパラメータを指定します。
- 「処理中」フォルダには、_SpheroidArea 各時間の処理済みイメージが含まれるようになりました。
注: 回転楕円体の中心が薄暗い場合は、すべてのタイムポイントの選択ツールを使用して白で塗りつぶし、手順 3 に進みます。同様に、回転楕円体の周りのスペースは、画像を「きれいに」するために黒で塗りつぶすことができます。画像がクリーンな場合は、61行目にコメントを付けて実行速度を上げます。
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Representative Results
PDMSは生体適合性により、微細パターン化やマイクロ流体デバイスに革命を起こした閉じ込め井戸、スタンプ、金型の微細加工に広く使用されています。ここで説明する方法では、スフェロイド埋め込みおよびイメージング手順を最適化する、カスタマイズ可能なウェルであるSIDを作成するために使用されます。図 1は、SID の製造に使用される主要なコンポーネントを示しています。PDMSモールドを鋳造するために、厚さ1mmのスペーサを3Dプリント(図1A、B)で、2枚のガラスプレートの間に配置し、大きなクリップで密封します。プレート間のスペースにPDMSを注ぎ、焼き付け、1mm厚いPDMSを形成する。SID回路図(図1C)は、最適なデバイスの寸法を示し、しかし、バイオプシーパンチを使用して穴のパンチを手動で打ち抜くので、穴の距離にわずかな変動が生じる(図1D)。図 1D,Fは、PDMS インサート内に等間隔の穴があるクリーンな円形カットを示しています。
このSIDを使用すると効率的な埋め込みが容易になり、それゆえ、タイムラプス(図2、ビデオ1)または縦方向(図3)イメージングを用いて、コラーゲンI内部の癌細胞の浸潤を記録する。コラーゲンI重合中に全てのSIDに対して同じ反転周波数を使用しているにもかかわらず、コラーゲンプラグ内部のスフェロイド位置はわずかに変化する。したがって、長い作業距離(>1 mm)で目標を使用することが重要です。それ以外の場合、コラーゲンプラグの上部に近い位置に配置されたスフェロイドの場合、焦点を合わせ、イメージングすることは困難である可能性があります。対照的に、コラーゲンプラグの底部に近い位置に配置されたスフェロイドは、コラーゲンIマトリックスに侵入するのではなく、ガラス表面に移動してガラス上に移動する細胞を有するであろう。このようなスフェロイドのビデオは破棄する必要があります。コラーゲンプラグの厚さは、ここで約800μm、SIDの各穴に分配される体積によって制御され、このプロトコルで示されるスフェロイドの浸入距離に調節される。コラーゲンプラグの厚さは、より小さいまたはより少ない侵襲性のスフェロイドを使用する場合、SIDの各穴にコラーゲンIの低い体積を分配することによって低下させることができる。
フィジーマクロを使用した侵入の適切な分析のためには、イメージングセッションの過程で癌細胞に適切な標識が設定されていることが重要です。ステップ4.17で述べたように、画像処理ステップは、ラベリングが最適でない場合に画像補正を可能にする。6日間の間に縦断イメージングを示していますが(図3)、細胞質および核蛍光タンパク質の安定な発現を必要とするが、同様の縦断イメージングは、染料による標識を用いてより短時間で行うことができる。
ライブイメージングの後、上皮カドヘリン(E-カドヘリン)、コルタクチンおよびF-アクチンの免疫標識手順からいくつかの結果を提示する(図4)。これらの例では、4T1および67NRセルラインを使用しました。 図 5 は、フィジー マクロを使用して回転楕円体の面積を時間の経過に従って測定する画像処理手順の手順を示しています。
図1:SIDの製作(A) スペーサーのトップビューの概略表現。(B)3D プリントスペーサー。(C) SID のトップ ビューの概略図を表示します。3ホールのPDMSインサート(D)はガラス底皿(E)に結合され、最終SID(F)を作成します。寸法はミリメートル単位です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2:スフェロイドのライブイメージング。ビデオ1から20時間および40時間のタイムポイントを代表し、4T1スフェロイドの最大投影。4T1細胞は、細胞質染料を用いて標識した。スケールバー、100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:スフェロイドの縦方向イメージング。毎日画像化された混合4T1/67NRスフェロイドの代表的な顕微鏡写真(最大投影)。4T1および67NR細胞は、それぞれ細胞質mScarletおよび緑色蛍光タンパク質(GFP)を安定的に発現する。スケールバー、100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図4:スフェロイドの蛍光イメージング4T1スフェロイド固定の代表的な顕微鏡写真(最大投影)は、コラーゲンI.Eカドヘリン(シアン、A)、コルタクチン(黄色、B)およびFアクチン(マゼンタ、AおよびB)に埋め込んだ2日後に固定された。スケールバー、100 μm. この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図5:画像処理解析フィジーマクロ(A)を使用して、時間の経過に伴う回転楕円体の面積を測定する画像処理手順のステップバイステップの図(B) この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:46時間及び10分毎に10分毎に画像化された4T1スフェロイドの代表的な映像を、細胞質色素を用いて標識した。 スケールバー、100 μm. このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 1: スペーサーの 3D モデル (STL ファイル)。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2: SpheroidAreaTime マクロ。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
3Dプリントされたスペーサーは、実験アプリケーションの要求に応じて、PDMSの様々な形状を簡単に作成するために使用できるPDMSの1mm厚いシートを作成するように設計されました。その製作のシンプルさと設計を変更する自由のために、PDMS鋳造のこの方法はSIDの初期設計のために選ばれました。大量のSIDが必要な場合、3つの等間隔の穴を持つPDMSディスクをすでに含む3Dプリント金型を作成し、プロセスを1ステップに減らすことで、生産をより効率的にすることができます。これにより、各ディスクをパンチアウトし、その後の3つの穴を開ける必要がなくなり、全体の準備時間が短縮されます。
3穴パンチは35ミリメートルガラス底皿で使用するために開発されていますが、他のサイズはより多くの穴を可能にし、したがって、より多くの回転楕円体を平行に画像化することができます。さらに、カスタムサイズのカバーガラスも市販されており、3Dプリントホルダーと組み合わせて、ハイスループットのスフェロイドアッセイを可能にします。このようなアプローチでは、制限要因はデータ取得の速度であり、例えば、我々の多色タイムラプス共焦点イメージングでは、単一のスフェロイドの3Dスタックを取得するには約2.5分が必要です。したがって、SID 内の 3 つのスフェロイドの 3D スタックを取得するには、約 8 分かかります。その結果、スタックあたり10分でイメージングの好ましい周波数を維持するために、SIDの穴の数を増やすことはできません。
3Dスフェロイドモデルにおける生きた癌細胞の浸潤を記録・定量化するために、明視野イメージング5を用いることができる。しかし、蛍光顕微鏡は、コントラストの向上、画像処理の容易さおよび精度を提供するため好ましい。細胞質および核蛍光タンパク質を発現する細胞株の生成が不可能な場合は、細胞質染料の使用を提案する。細胞内の細胞質染料の保持時間は、イメージング条件では3日間であるため、細胞は3日間の吊り下げの期間の後、そして埋め込む直前に標識する必要があります。細胞の後埋め込みの標識は、コラーゲンに非特異的に標識し、細胞の標識を減少させる。埋め込み後3日を超えるイメージングでは、蛍光タンパク質を安定して発現する異なるスフェロイド播種プロトコル10 または細胞株を使用する必要がある。
60~5,000個の細胞/ドロップを含むスフェロイドの形成と画像化に成功しました。小さなスフェロイドは、その全体の侵略領域は、より高い拡大(20x-30x)目標の単一の視野に容易に収まるように、複数の日にわたって侵入を記録するのに理想的です。さらに、それらは細胞質か核染料で全面的に容易に標識することができる。最後に、散乱が減少するため、回転楕円体の各セルを視覚化し、セグメント化することができます。しかし、小さなスフェロイドは裸眼でほとんど見えないので、組織マーカーで追加の標識が必要な場合があります。対照的に、より大きな回転楕円体は扱いが容易であるが、その重量のために皿の底に沈む可能性が高い。さらに、スフェロイド中心の細胞は、染料を使用する場合には必ずしも標識されないか、約100マイクロメートルの浸透深さを有する共焦点顕微鏡を使用して見える。タイムラプスイメージングを用いて大きなスフェロイド全体ですべてのがん細胞を可視化するために、多光子顕微鏡を使用することができ、標識を必要とせずに第二高調波発生(SHG)によるコラーゲン繊維の可視化の付加的な利点を提供する。また、光シート顕微鏡8、11、12でイメージングを行い、画像取得時間を短縮し、高スループットのスフェロイドアッセイを可能にしますが、より多くのデータストレージと高度な画像処理を必要とします。タイムラプスビデオが必要でない場合、固定3Dスフェロイドのラベリング手順は、光クリアリング8、10とさらに組み合わせることができます。さらに、埋め込まれたスフェロイドの凍結切除は、標識中の色素または抗体の浸透、ならびにイメージング中の光の浸透に関する問題を排除することができます。しかし、私たちの手では、長く脆弱な侵襲性の鎖の保存における技術的な課題のために、成功した凍結切断は侵略および非侵襲的細胞の初期段階に限定された。
当社のプロトコルは、核染料を使用して、スフェロイド内の癌細胞にラベルを付け、タイムラプスデータの単一細胞追跡を可能にする。フィジープラグインTrackMate13 は、セル追跡を自動化し、速度、瞬時の速度と持続性などの単一のセルの運動性パラメータを抽出するために使用することができます。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
テンプルバイオエンジニアリングの会員の皆様に貴重なご意見をお寄りいただき、ありがとうございました。私たちは、フローサイトメトリーコア(ルイス・カッツ医学部)のデビッド・アンブローズが細胞選別を支援し、IDEASハブ(テンプル大学工学部)のトニー・ベームが3Dプリンティングを手伝ってくれたことに感謝します。我々はまた、我々の資金資源に感謝します:アメリカ癌学会研究学者グラント134415-RSG-20-034-01-CSM、今すぐがんを征服/若い研究者賞、国立衛生研究所、R00 CA172360とR01 CA230777、すべてBGに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
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