Summary
Præsenteret her er en protokol for fremstilling af en sfæroid billedbehandling enhed. Denne enhed muliggør dynamisk eller langsgående fluorescens imaging af kræft celle sfæroider. Protokollen tilbyder også en simpel billedbehandling procedure for analyse af kræft celle invasion.
Abstract
Invasionen af kræftceller fra den primære tumor i de tilstødende sunde væv er et tidligt skridt i metastaser. Invasive kræftceller udgør en stor klinisk udfordring, fordi der ikke findes nogen effektiv metode til deres eliminering, når deres udbredelse er i gang. En bedre forståelse af de mekanismer, der regulerer kræft celle invasion kan føre til udvikling af nye potente behandlinger. På grund af deres fysiologiske lighed med tumorer, sfæroider indlejret i kollagen jeg har været flittigt udnyttet af forskere til at studere de mekanismer, der styrer kræft celle invasion i den ekstracellulære matrix (ECM). Denne analyse er imidlertid begrænset af (1) manglende kontrol over indlejringen af sfæroider i ECM; (2) høje omkostninger til kollagen I- og glasbundsretter, 3) upålidelig immunfluorescerende mærkning på grund af ineffektiv indtrængen af antistoffer og fluorescerende farvestoffer og 4) tidskrævende billedbehandling og kvantificering af dataene. For at løse disse udfordringer optimerede vi den tredimensionelle (3D) sfæroide protokol til at billedet fluorescerende mærket kræftceller indlejret i kollagen I, enten ved hjælp af time-lapse videoer eller langsgående billeddannelse, og analysere kræft celle invasion. For det første beskriver vi fremstillingen af en sfæroid billedbehandling enhed (SID) til at integrere sfæroider pålideligt og i en minimal kollagen jeg volumen, hvilket reducerer analysen omkostninger. Dernæst afgrænser vi trinene for robust fluorescensmærkning af levende og faste sfæroider. Endelig tilbyder vi en brugervenlig Fiji-makro til billedbehandling og datakvantificering. Alt i alt giver denne enkle metode en pålidelig og overkommelig platform til at overvåge kræftcelleinvasion i kollagen I. Desuden kan denne protokol let ændres, så den passer til brugernes behov.
Introduction
Under kræft progression, kræftceller kan erhverve en broget og invasiv fænotype, gør det muligt for dem at undslippe tumor masse og invadere i de omkringliggende væv1. Til sidst, disse invasive kræftceller kan nå og vokse inde sekundære organer, en proces kaldet kræft metastase1. Metastase forårsager mere end 90% af kræftrelaterede dødsfald2. En af grundene til dette er, at mens lokaliserede tumorer er klinisk håndterbare, ingen effektive metoder findes til eliminering af invasive kræftceller, når metastatisk spredning har fundet sted. Derfor udgør fremkomsten af invasive kræftceller og overgangen fra en lokaliseret til en invasiv sygdom en stor klinisk udfordring. Bestemmelse af, hvordan kræftceller indlede og opretholde en invasiv adfærd kan føre til udvikling af nye potente behandlinger.
3D-sfæroidmodellen er en ideel platform til at undersøge kræftcellernes bevægelige adfærd under kontrollerede, men fysiologisk relevante forhold3. Faktisk, i denne analyse, sfæroider af kræftceller er indlejret inde i ekstracellulære matrix (ECM), for eksempel kollagen I, som efterligner en forenklet tumor. Derefter bruges billeddannelse til at visualisere invasionen af kræftceller fra kugleformet ind i kollagenmatrixen. Flere udfordringer begrænser dog denne procedure.
Den første udfordring opstår ved indlejringstrinnet, hvor den flydende kollagenmatrix kan sprede sig over skåloverfladen, hvilket får kugleformet til at røre bunden af skålen. Derfor spredes celler fra kugleformet på den todimensionale (2D) overflade og bryder den tredimensionale (3D) sfæroide morfologi. At øge mængden af kollagen er en effektiv, men dyr løsning. For at forhindre celler i at sprede sig på 2D-overfladen, samtidig med at vi opretholdt et minimalt volumen kollagen, udviklede vi en sfæroid billedenhed (SID) ved at afgrænse en 1 mm tyk, 3-hullers polydimethylsiloxan (PDMS) indsætte på en glasbundsskål.
Den anden udfordring af sfæroid assay er mærkning af kræftceller i sfæroider, som er begrænset af den dårlige penetration af antistoffer og fluorescerende farvestoffer, en effekt, der stiger med sfæroid størrelse. Mens den ideelle løsning til mærkning af celler er etablering af cellelinjer, der stabilt udtrykker fluorescerende protein (r), er denne mulighed for det meste begrænset til udødeliggjorte cellelinjer og er begrænset af tilgængeligheden af fluorescerende protein kimærer. Her beskriver vi en optimeret protokol for immunfluorescensfarvning af faste sfæroider samt effektiv brug af et cytoplasmisk farvestof til at mærke celler umiddelbart før indlejring af kugleformet.
Den tredje udfordring af sfæroid assay er manglen på enkle Fiji makroer til semi-automatiseret kvantificering af celle invasion over tid. For at løse denne udfordring beskriver vi en simpel metode til at analysere sfæroidområdet over tid. Vi illustrerer fordelene ved denne protokol ved hjælp af 4T1- og 67NR-cellelinjerne som eksempler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af en sfæroid imaging enhed (SID) for at optimere sfæroid indlejring (Varighed 1 dag)
- Opret afstandsstykket ved hjælp af en 3D-printer(Figur 1A, B og supplerende fil 1).
- Der afvejes et forhold på 10:1 (wt/wt) af basispolymeren:crosslinker i en plastikkop [f.eks. 20 g ethylbenzenbasepolymer og 2 g silikoneharpiks crosslinker for at skabe polydimethylsiloxan (PDMS)].
- Bland PDMS-opløsningen grundigt i plastikkoppen ved hjælp af en engangspipette.
- Placer plastikkoppen i et vakuumkammer for at fjerne luftboblerne fra blandingen. Slip hurtigt vakuumtrykket for at fjerne den lille mængde luft, der er fanget på overfladen af blandingen, og dissipate de resterende luftbobler.
- 3D-printet afstandsstykket inkuberes ved 100 °C i 5 min. for at øge fleksibiliteten.
- Rengør de to glasplader, der vil blive brugt til at konstruere PDMS formen grundigt ved at tørre dem med 100% isopropanol. Hvis glaspladerne tidligere blev brugt til at støbe PDMS, skal du sørge for at fjerne eventuelle resterende gamle PDMS ved forsigtigt at skrabe glaspladerne med et barberblad og tørre dem af med 100% isopropanol.
- Konstruere formen ved at placere 3D trykte afstandsstykke flush i-mellem de to rene glasplader.
- Forsegl formen ved hjælp af store bindemiddelclips på glaspladernes udvendige kanter. Placer to bindemiddelclips på den nederste kant og et i øverste hjørne.
- Undersøg den øverste del af formen for at sikre, at afstandsstykket flugter med glaspladerne. Dette garanterer, at der ikke vil være nogen deformationer til stede, og at der oprettes et lige ark PDMS.
BEMÆRK: Hvis det resulterende ark ikke er af ensartet tykkelse, skal clipsene justeres en smule. - Skær spidsen af en engangs pipette (~ 2 cm fra spidsen) og tilsæt PDMS blandingen i en langsom og konstant hastighed til øverste venstre hjørne af formen. Hæld blandingen langsomt for at forhindre oprettelsen af store luftlommer.
- Placer formen i et vakuumkammer for at fjerne luftbobler, der dannes under hældningen.
- PDMS hærdes ved inkubation af formen ved 100 °C i 1 time.
- Hent formen fra inkubatoren og lad den køle af for at røre ved.
- Fjern bindemiddelklemmerne og glaspladerne fra den afstandsstykke, der indeholder det hærdede PDMS.
- Brug et barberblad til at skære gennem forseglingen, der blev skabt på alle fire sider af formen mellem afstandsstykket og glaspladen. Med alle fire sider skåret i, begynde at trække fra hinanden formen til at afsløre PDMS ark i afstandsstykket.
- Skræl forsigtigt det nye PDMS-ark af afstandsstykket ved hjælp af pincet.
- På en skæremåtte, punch ud 17,5 mm diameter PDMS diske fra arket, og derefter punch tre jævnt fordelt 5,5 mm diameter huller, ved hjælp af forskellig størrelse biopsi slag. Her kaldes disse 3-hullers PDMS-diske "inserts" (Figur 1C).
BEMÆRK: Ikke-ensartet udskæringer, der foretages i PDMS, eller en defekt binding via plasmabehandling kan resultere i fremtidige lækager. - Rengør hvert skær ved forsigtigt at fjerne eventuelle støvpartikler ved hjælp af tape.
- Sæt indsatserne på et stykke dobbeltsidet tape, og pak båndet rundt om låget på en 10 cm petriskål.
- Læg låget på petriskålen i plasmamaskinen sammen med de åbne 35 mm glasbundsretter.
- Overfladen af indsatserne og glasset aktiveres via plasmabehandling i 1 min ved 300 mTorr. En håndholdt plasmastav kan bruges.
- Ved hjælp af pincet, hurtigt vedhæfte opadrettede, dvs behandlet side, af en indsats(Figur 1D)til glasdelen af et glas bund fad(Figur 1E). Gentag for alle retter.
- Brug pegefinger og tommelfinger til at anvende et jævnt tryk, mens du roterer glasbundsskålen. Dette vil sikre en stabil fastgørelse af indsatsen til glasbundsskålen.
- Skuber SID'erne (Figur 1F) ved 60 °C i 20 minutter for at styrke vedhæftningen mellem glas og PDMS.
- Udfør en anden runde plasmabehandling på SID'erne ved hjælp af de samme indstillinger som i trin 1.21 eller med den håndholdte tryllestav. Dette vil gøre den frie PDMS-overflade klæbende til poly-L-lysin i belægningsopløsningen (se 1.26).
- Forbered følgende løsninger på ny.
- Coatingopløsning: 1x PBS indeholdende 0,01% (vol/vol) poly-L-Lysin [f.eks. tilsættes 10 μL på 0,1% (vol/vol) poly-L-Lysin til 90 μL 1x PBS].
- Krydsningsopløsning: Destilleret vand indeholdende 1x (vol/vol) glutaraldehyd [f.eks. tilsættes 10 μL 10x glutaraldehyd til 90 μL destilleret vand].
- Opbevaringsopløsning: 1x PBS indeholdende 10x (vol/vol) Penicillin-Streptomycin [f.eks. tilsættes 1 ml penicillin-streptomycin til 9 ml 1x PBS].
- Der tilsættes 35 μL belægningsopløsning pr. hul og inkuberes i 1 time ved stuetemperatur.
- Aspirat poly-L-Lysin og skyl hele SID 3 gange med destilleret vand.
- Der tilsættes 35 μL crosslinkingopløsning pr. hulinkubat i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Indsug crosslinking-opløsningen, og skyl hele SID'et 3 gange med destilleret vand.
- Tilsæt 70% ethanol i hvert SID og sted under ultraviolet (UV) lys i 30 min.
- Under emhætten, aspirat ethanol og skyl SID 3 gange med destilleret vand.
- Tilføj 2,5 ml storageløsning pr. SID.
BEMÆRK: På nuværende tidspunkt kan SID'erne opbevares ved 4 °C i en uge. Det blev bemærket, at bindingsstyrken mellem PDMS og glas falder over tid. Ud over en uge anbefales det, at brugerne tester SID'erne for potentiel lækage før brug. For at gøre dette skal opbevaringsopløsningen aspireres, og der tilsættes 35 μL 1x PBS i hvert hul. Efter brug kan PDMS-skær skrælles af glasbundsretterne. For at opnå optimal rengøring af glasbundsretterne bør der anvendes flere vaske med isopropanol og saltsyre til at fjerne PDMS-rester.
2. Sfæroid dannelse og indlejring i kollagen (Varighed 4 dage)
BEMÆRK: Brug en cellelinje, der udtrykker et cytoplasmisk og/eller nukleart fluorescerende protein, til livebilleddannelse af sfæroider, i længderetningen eller i time-lapse-videoer. Hvis en sådan cellelinje er tilgængelig, skal du følge de trin, der er beskrevet i dette afsnit. Alternativt foreslås det i afsnit 3 en protokol at mærke kræftceller i sfæroider ved hjælp af et cytoplasmisk farvestof.
- Form spheroids af 4T1 og/eller 67NR celler ved hjælp af hængende dråbe teknik, som tidligere beskrevet4,5,6,7, med 3.000 celler/40 μL dråbe og en 3-dages inkubationstid. Tilsæt kvæg atelocollagen I-opløsningen til sidst og vedligehold alle opløsninger på is til enhver tid.
- Identificer de korrekt dannede sfæroider ved hjælp af et lysfeltsmikroskop.
- Fyld et 15 mL konisk rør med 8 mL forvarmet komplet medium.
- Saml spheroids med en P1000 pipette og overføre til 15 mL koniske rør. Våd pipettespidsen ved at pipetter nogle komplette medium ind og ud for at forhindre sfæroider i at klæbe til indersiden af pipettespidsen og begrænse sfæroidtab.
- Lad sfæroider synke til bunden af røret og vask forsigtigt sfæroiderne ved at udskifte mediet. Gentag to gange.
- Forbered en 5 mg/mL kollagen I-opløsning i henhold til producentens anbefalinger (alternativ geleringsprocedure, se eksemplarisk beregning nedenfor). Udskift det destillerede vand med komplet medium. Ved beregningen af den mængde medium, der skal anvendes, skal der tages hensyn til, at der i 20 μL af det komplette medium [f.eks. 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL på 5 mg/mL kollagen I er nødvendig (forbered 20 % ekstra for at tage højde for rørtab ved håndtering af tyktflydende væsker); 22 μL komplet medium + 10,8 μL 10x PBS + 1,2 μL af 1 M NaOH + 54 μL på 10 mg/mL kollagen I-lager].
- Saml alle sfæroider i 20 μL medium ved hjælp af en P200-pipette, og tilsæt dem til kollagen I-opløsningen tilberedt i trin 2.6.
- Bland langsomt opløsningen ved at pipettere op og ned for at undgå heterogenitet i kollagen I-koncentrationen, hvilket begrænser bobledannelsen. Hold opløsningen på is.
- Fjern opbevaringsopløsningen fra SID'er, og vask 3 gange med 3 ml 1x PBS. Efter den endelige vask, lad SID (r) tørre for ikke at fortynde kollagen I opløsning.
- Start en timer, og dispenser 30 μL af kollagen I-opløsningen, der indeholder en kugleformet, i et af sid'ets tre huller. Visuelt sikre, at en enkelt kugleformet er indeholdt i 30 μL.
- Gentag trin 2.10 to gange mere for at udfylde alle de 3 huller i et SID.
- Brug en 10 μL pipettespids til at centrere kugleformen igen, hvis den er placeret tæt på PDMS-kanten. Hvis to eller tre sfæroider ender med at blive udleveret i et af hullerne, kan samme pipettespids bruges til at adskille spheroiderne fra hinanden. Stop timeren.
BEMÆRK: Ofte invertering af SID på hovedet og på hovedet, i hele perioden af kollagen I polymerisering og størkning, sikrer, at kugleformet er placeret i den lodrette midten af ECM lag, og forhindrer invasion af celler i 2D. Hyppigheden af invertering (spejlvendelse) bør maksimeres. Da spejlvendefrekvensen styres af kugleformet "dispensertid" målt i 2.10-2.12, skal dispenseringstiden minimeres. I vores laboratorium er dispenseringstiden i gennemsnit 2 minutter. - Hvis du vil centrere kugleformet lodret i kollagenlaget, skal du vende SID'et på hovedet og inkubere ved 37 °C for at dispensere tid.
- Vend SID'et på hovedet, og inkuber ved 37 °C for dispenseringstid.
BEMÆRK: Den tid, som sfæroiderne bruger i hovedet, skal svare til den tid, der bruges i opadgående retning. - Gentag trin 2.13 og 2.14 i 30 minutter, indtil kollagenen jeg polymeriserer.
- Tilføj 2,5 mL komplet medium/SID, og hent om nødvendigt et billede af spheroiderne til det første tidspunkt.
- Gentag trin 2.10-2.16, hvis der bruges flere SID'er.
3. Fluorescensmærkning af sfæroider
- Live imaging (Varighed 6-7 dage)
BEMÆRK: Hvis der findes en cellelinje, der udtrykker et cytoplasmisk og/eller nukleart fluorescerende protein, skal du følge de trin, der er beskrevet i afsnit 2. Alternativt foreslås følgende protokol til cytoplasmisk mærkning.- Følg trin 2.1-2.5 i protokollen, der er beskrevet i afsnit 2.
- Det cytoplasmiske farvestof fortyndes til 25 μM i 200 μL serumfrit medium.
BEMÆRK: Mens der anvendes et rødt cytoplasmisk farvestof i dette eksperiment, skal enhver anden tilgængelig farve være egnet. Kræftceller blev mærket inde i sfæroider ved hjælp af nukleare farvestoffer fortyndet til 20 μM i 200 μL serumfrit medium (se materialetabel). - Efter den endelige vask, resuspend spheroids i cytoplasmiske eller nukleare farvestof opløsning og inkubere ved stuetemperatur i 20 min, beskyttet mod lys.
BEMÆRK: Med denne fremgangsmåde vil mærkningen af cellerne i sfæroidcentret ikke være effektiv. For at opnå mærkning af alle celler kan inkubationen forlænges natten over ved at placere skålen på en rocker. Alternativer er beskrevet i Diskussion. - Vask sfæroider 3 gange i komplet medium.
- Fortsæt til trin 2.6-2.17 i protokollen, der er beskrevet i afsnit 2.
- Billedspriteroider via time-lapse-billedbehandling hvert 10. minut i 24-72 timer (figur 2) eller dagligt via langsgående billeddannelse i op til 7 dage (figur 3). Brug et laserscanningskonfokalt mikroskop, 10x luftmål (0,4 numerisk blænde og 3,1 mm arbejdsafstand), 1024 x 1024 pixels, eksponeringstid 8 μs/pixel, pinhole 90 μm, 6 x 15 μm z-trin og 3 synsfelter, der hver indeholder en sfæroid.
BEMÆRK: Til time-lapse-billeddannelse skal du bruge minimal laserkraft og udstyre mikroskopet med et miljøkammer med temperatur, fugtighed og gaskontrol. Dyrkning af de indlejrede kugleformede 37 °C i > 8 timer eller natten over før billeddannelse for at minimere tiden på mikroskopet.
- Immunfluorescens farvning af sfæroider (Varighed 2 dage)
BEMÆRK: Den procedure, der er beskrevet her, er tilpasset og optimeret fra tidligere offentliggjorte protokoller8,9. Denne metode kan anvendes efter den protokol, der er beskrevet i afsnit 2 og 3.1.- Forbered følgende løsninger på ny.
- Fastgørelsesopløsning: 1x PBS, der indeholder 4% PFA (vol./vol.) [f.eks. tilsættes 5 ml 16% (vol/vol) PFA til 15 ml 1x PBS].
- Fastgørelses- og permeabiliseringsopløsning: 1x PBS indeholdende 4% PFA (vol./vol.) og 0,5% Triton X-100 (vol./vol.) [f.eks. tilsættes 50 μL Triton X-100 til 10 ml fastgørelsesopløsning].
- Blokeringsopløsning: 1x PBS indeholdende 1% FBS (vol./vol.) og 1% BSA (wt/vol) [f.eks. opløses 100 mg BSA i 10 ml 1x PBS, og derefter tilsættes 100 μL FBS].
- Vaskeopløsning: 1x PBS indeholdende 0,05% Tween 20 (vol/vol.) [f.eks. tilsættes 25 μL på mellem 20 og 50 ml 1x PBS].
- Fjern dyrkningsmediet fra SID'et/sid'et(e) og vask én gang med varm 1x PBS.
- Der tilsættes 2 ml fastgørelses- og gennemtrængningsopløsning pr. SID, og der inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Fjern fastgørelses- og gennemtrængningsopløsningen, og tilsæt 2 ml fastgørelsesopløsning pr. SID og inkubat ved stuetemperatur i 20 minutter.
- Vask 3 gange med vaskeopløsningen.
- Der tilsættes 2 ml blokeringsopløsning pr. SID, og der inkuberes ved 4 °C i 24 timer med mild omrystning.
BEMÆRK: På dette trin kan prøverne inkuberes ved 4 °C i løbet af weekenden. Bemærk, at en længere blokeringstid kan forstyrre vaccinationsmærkningsproceduren. - Primære antistoffer fortyndes i blokeringsopløsningen.
- Der tilsættes 150 μL blokeringsopløsning med primære antistoffer/brønd i en 48-brønds plade.
- Brug fine pincet, forsigtigt løsne stikket af kollagen jeg indeholder en sfæroid og overføre til en brønd. Gentag dette, hvis flere sfæroider er mærket. Tør enhver væske, der kan forblive på pincet, når du arbejder med forskellige antistoffer, for at forhindre forurening.
- Inkuber natten over ved 4 °C med mild omrystning.
- Der tilsættes 300 μL vaskeopløsning til tomme og fulde brønde.
- Forsigtigt overføre stikket af kollagen jeg indeholder en kugleformet i en "vask" godt.
- Vask 3 gange med vaskeopløsning i 2 timer, ved stuetemperatur og med mild rysten.
BEMÆRK: Overførsel af stik af kollagen jeg indeholder en kugleformet, i stedet for at indsugning af løsningerne, kan bidrage til at reducere prøvetab og prøve skader. - Sekundære antistoffer fortyndes, 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og/eller falloidin i blokeringsopløsning.
- Der tilsættes 150 μL blokeringsopløsning med sekundære antistoffer, DAPI og/eller falloidin pr. brønd.
- Brug pincet, omhyggeligt overføre kollagen stikket indeholder sfæroider i brønden. Gentag dette, hvis flere sfæroider er mærket.
- Inkuber ved stuetemperatur i 1 time med mild rysten.
- Gentag trin 3.2.11 og 3.2.12.
- Vask 3 gange med vaskeopløsning i 30 minutter ved stuetemperatur med mild rysten.
- Brug et barberblad til at skære et 3-hullers PDMS-skær i tre dele, så hver del indeholder et hul.
- Placer to stykker PDMS på et mikroskop dias.
- Tilføj en dråbe monteringsopløsning ved hjælp af en P200-spids, hvor enden er afskåret. Undgå bobledannelse.
- Overfør forsigtigt en kollagen, jeg sætter i hvert hul.
BEMÆRK: Hvis kugleformet var placeret øverst på kollagenproppen, skal du vende kollagenproppen, så kugleformet ender tættere på glasovertrækspladen. - Placer en coverslip på toppen og forsegle ved hjælp af tape.
- Lad prøven tørre ved stuetemperatur i 10 minutter, beskyttet mod lys.
- Prøver opbevares ved 4 °C, der er beskyttet mod lys indtil billeddannelse.
- Forbered følgende løsninger på ny.
4. Billedbehandling til at analysere kræftinvasion over tid
BEMÆRK: Det format, der kræves til denne makro, er et billede med en enkelt kanal x,y,t, der er gemt som en .tiff fil.
- Hvis der er anskaffet flere z-udsnit(dvs. x,y,z,t-billede), skal du åbne billedet i Fiji og vælge Billede | Stakke | Z-projekt. Det anbefales at bruge indstillingen Maks. Alternativt kan et enkelt z-udsnit bruges til at afspille makroen. Gem billedet som en .tiff fil.
- Opret en separat "Behandlingsmappe" på skrivebordet.
- Vælg | Gem som | Billedsekvens. Brug TIFF-formatet, opdater cifretallet i overensstemmelse med antallet af rammer, markér afkrydsningsfeltet for at bruge udsnitsetiket som filnavn, og vælg OK. Vælg mappen "Behandling", der blev oprettet i trin 2.
- Åbn ét billede fra mappen "Behandler". Det skal være et x,y-billede, der svarer til et enkelt tidspunkt.
- Vælg | Juster | Automatisk tærskel. Vælg metoden Prøv alle i rullemenuen, og markér afkrydsningsfeltet for hvide objekter på sort baggrund.
- Der vises et montagebillede, der viser resultatet for hver automatiseret tærskelmetode.
- Identificer den bedste automatiserede tærskelmetode, f.eks.
- Hvis du vil bekræfte valget af den automatiserede tærskelmetode, skal du åbne et hvilket som helst andet billede fra mappen "Behandler" og teste den valgte tærskelmetode ved hjælp af Image | Juster | Automatisk tærskel.
- Luk alle billeder.
- Hent makroen SpheroidAreaTime (Supplementary File 2).
- Åbn Fiji-makroen ved træk og slip.
- I linje 58 skal du opdatere den automatiserede tærskelmetode efter behov.
- Opdater størrelsesområdet i linje 62 i henhold til celledimensionerne.
- Vælg Kør.
- Vælg mappen "Behandling", og skriv "Behandling" som overordnet mappe, og vælg derefter OK.
- Når kørslen er, skal du gemme tabellen Oversigt. Den første kolonne angiver navnet på billedet. den tredje kolonne angiver kugleformet område sjette, syvende og otte kolonner angiver parametrene for en ellipse monteret på kugleformet.
- Mappen "Behandler" indeholder nu et behandlet billede for hvert tidspunkt, hvor filtypenavnet _SpheroidArea.
BEMÆRK: Hvis kugleformede center er svag, fylde den med hvid ved hjælp af markeringsværktøjer, for alle timepoints, og derefter gå videre til trin 3. På samme måde kan rummet omkring kugleformet fyldes med sort for at "rense" billedet. Hvis billedet er rent, skal du kommentere linje 61 for at gøre kørslen hurtigere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grund af sin biokompatibilitet anvendes PDMS i vid udstrækning til mikrofabrikation af begrænsende brønde, frimærker og forme, som revolutionerede mikromaling og mikrofluidiske enheder. I den metode, der er beskrevet her, bruges den til at oprette SID'er, der kan tilpasses brønde, der optimerer sfæroidintegrering og billedbehandlingsprocedure. Figur 1 illustrerer de vigtigste komponenter, der anvendes ved fremstillingen af SID'erne. For at kaste PDMS-formen er en 1 mm tyk afstandsstykke 3D-printet (Figur 1A,B), placeret mellem de to glasplader, forseglet med store klip. Hældning og bagning af PDMS i mellemrummet mellem pladerne danner et 1 mm tykt ark PDMS. SID-skemaet (Figur 1C) angiver dimensionerne på den optimale enhed, men der opstår en lille variation i hulafstandene på grund af manuel stansning af huller ved hjælp af biopsislag (Figur 1D). Figur 1D,F angiver rene cirkulære snit med jævnt fordelte huller i PDMS-indsatsen.
Brug af SID'er letter effektiv indlejring, og dermed registrering af invasionen af kræftceller inde i kollagen jeg ved hjælp af time-lapse (Figur 2, Video 1) eller langsgående (Figur 3) billeddannelse. På trods af at bruge de samme inversionsfrekvenser til alle SID'er under kollagen I polymerisering, vil sfæroide positioner inde i kollagenproppen variere lidt. Derfor er det vigtigt at bruge et mål med en lang arbejdsafstand (>1 mm). Ellers kan fokusering og billeddannelse være svært for sfæroider placeret tæt på toppen af kollagen stikket. I modsætning hertil vil spheroids placeret tæt på bunden af kollagen stikket, har celler, der flytter til glasoverfladen og migrere på glasset, i stedet for at invadere ind i kollagen I matrix. Videoer af sådanne sfæroider skal kasseres. Tykkelsen af kollagenproppen, her ca. 800 μm, styres af det volumen, der udleveres i hvert hul i SID'et og justeres til invasionsafstande, som sfæroider udviser i denne protokol. Tykkelsen af kollagen stikket kan sænkes ved at dispensere en lavere mængde kollagen I i hvert hul i SID, når du bruger mindre eller mindre invasive sfæroider.
For korrekt analyse af invasionen ved hjælp af Fiji makro, er det afgørende for kræftceller, der skal korrekt mærket i løbet af billedbehandling session. Som nævnt i trin 4.17. giver billedbehandlingstrinnet mulighed for billedkorrektion, hvis mærkningen er suboptimal. Mens vi illustrerer langsgående billeddannelse i løbet af 6 dage (Figur 3), som kræver et stabilt udtryk for cytoplasmisk og/eller nukleart fluorescerende protein, kan lignende langsgående billeddannelse udføres over kortere tid ved hjælp af mærkning med farvestoffer.
Efter levende billeddannelse præsenterer vi nogle resultater fra immunolabelingsproceduren for epitelkahylen (E-cadherin), cortactin og F-actin (Figur 4). I disse eksempler brugte vi cellelinjerne 4T1 og 67NR. Figur 5 viser en trinvis illustration af billedbehandlingsproceduren ved hjælp af Fiji-makroen til at måle området for kugleformet over tid.
Figur 1: Fremstilling af SID'erne. (A)Skematisk repræsentation af afstandsstykket i øverste visning. (B) 3D-printet afstandsstykke. (C) Skematisk repræsentation af SID'et i øverste visning. En 3-hullers PDMS-skær (D) er bundet til en glasbundsskål (E), hvilket skaber det endelige SID (F). Dimensionerne er i millimeter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Levende billeddannelse af sfæroider. Repræsentant 20 timer og 40 timer tidspunkter fra Video 1, maksimal projektion af en 4T1 sfæroid. 4T1 celler blev mærket ved hjælp af et cytoplasmisk farvestof. Skalalinje, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Langsgående billeddannelse af sfæroider. Repræsentative mikrografer (maksimal projektion) af en blandet 4T1/67NR sfæroid afbildet dagligt. 4T1- og 67NR-celler udtrykker henholdsvis det cytoplasmiske mScarlet og det grønne fluorescerende protein (GFP). Skalalinje, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Immunfluorescensbilleddannelse af sfæroider. Repræsentative mikrografer (maksimal projektion) af en 4T1 kugleformet fast 2 dage efter indlejring i kollagen I. E-cadherin (cyan, A), cortactin (gul, B) og F-actin (magenta, A og B) blev mærket. Skalalinje, 100 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Billedbehandlingsanalyse. Trinvis illustration af billedbehandlingsproceduren ved hjælp af Fiji-makroen (A) til måling af sfæroidens område over tid (B). Klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: Repræsentativ video af en 4T1 sfæroid afbildet hver 10 min i 46 timer og 10 min. 4T1 celler blev mærket ved hjælp af en cytoplasmisk farvestof. Skala bar, 100 μm. Klik her for at downloade denne video.
Supplerende fil 1: 3D-model af afstandsstykket (STL-fil). Klik her for at hente denne fil.
Supplerende fil 2: Makroen SpheroidAreaTime. Klik her for at hente denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den 3D-printede afstandsstykke er designet til at skabe 1 mm tykke ark PDMS, som derefter kan bruges til nemt at oprette forskellige former for PDMS, som krævet af forsøgsprogrammerne. På grund af enkelheden i dens fremstilling og friheden til at ændre designet blev denne metode til PDMS-støbning valgt til det oprindelige design af SID. Hvis der kræves stor mængde SID'er, kan produktionen gøres mere effektiv ved at oprette en 3D-printet form, som allerede indeholder PDMS-diske med tre lige store huller, og reducere processen til et trin. Dette ville fjerne behovet for at punch ud hver disk, sammen med de efterfølgende tre huller, og mindske den samlede forberedelsestid.
Mens 3-hullers punch er udviklet til brug med 35 mm glas bund retter, andre størrelser er tilgængelige, som giver mulighed for flere huller og dermed flere sfæroider, der skal afbildes parallelt. Derudover er brugerdefineret størrelse dækglas også kommercielt tilgængeligt, hvilket i kombination med 3D-printede holdere kan give mulighed for højoverførselsstudselser. Med en sådan tilgang er begrænsende faktor hastigheden af dataindsamling - for eksempel i vores flerfarvede time-lapse confocal imaging kræver det ca. 2,5 minutter at erhverve 3D-stak af en enkelt kugleformet. Derfor kræver det ca. 8 minutter at anskaffe 3D-stakke til 3 sfæroider i SID'et. Som et resultat, for at opretholde vores foretrukne frekvens af billeddannelse på 10 minutter pr stak, kan vi ikke øge antallet af huller i SID'erne.
For at registrere og kvantificere invasionen af levende kræftceller i 3D-sfæroidmodellen kan lysfeltsbilleddannelse bruges5. Fluorescensmikroskopi foretrækkes dog, da det giver øget kontrast og lethed og præcision i billedbehandlingen. Hvis det ikke er muligt at frembringe en cellelinje, der udtrykker et cytoplasmisk og/eller nukleart fluorescerende protein, foreslår vi anvendelse af de cytoplasmiske farvestoffer. Da retentionstiden for cytoplasmiske farvestoffer inde i cellerne er tre dage i vores billeddannelsesforhold, skal cellerne mærkes efter 3-dages perioden i hængende dråbe og umiddelbart før indlejringen. Mærkning af celler efter integrering kan ikke specifikt mærke kollagen, og reducere cellemærkning. Billeddannelse i mere end 3 dage efter indlejring kræver brug af en anden sfæroid såning protokol10 eller cellelinjer stably udtrykke fluorescerende protein (r).
Vi har med succes dannet og afbildet sfæroider, der indeholder alt fra 60 til 5.000 celler / drop. Små sfæroider er ideelle til optagelse af invasion over flere dage, da hele deres invasionsområde let kan passe ind i et enkelt synsfelt af højere forstørrelsesmål (20x-30x). Derudover kan de nemt mærkes overalt med cytoplasmiske eller nukleare farvestoffer. Endelig, på grund af den reducerede spredning, kan hver celle i kugleformet visualiseres og segmenteres. Små sfæroider er dog næppe synlige med blotte øjne og kan kræve yderligere mærkning med vævsmarkører. I modsætning hertil er større sfæroider lettere at håndtere, men mere modtagelige for at synke til bunden af skålen på grund af deres vægt. Desuden er celler i sfæroidcentret ikke altid mærket, når de bruger farvestoffer, eller synlige ved hjælp af konfokal mikroskopi, som har penetrationsdybde på ca. 100 mikrometer. For at visualisere alle kræftceller i hele de store sfæroider ved hjælp af time-lapse imaging, multiphoton mikroskopi kan bruges, der tilbyder en ekstra fordel af kollagen fibre visualisering af anden harmoniske generation (SHG) uden behov for mærkning. Også, billedbehandling kan gøres med lys-ark mikroskopi8,11,12, hvilket giver reduceret billedopsamling tid og dermed giver mulighed for høj-throughput sfæroid assays, men kræver også mere datalagring og avanceret billedbehandling. Hvis time-lapse-videoer ikke er påkrævet, kan vores mærkningsprocedure for faste 3D-sfæroider kombineres yderligere med optisk clearing8,10. Derudover kan kryosectioning af de indlejrede sfæroider eliminere problemer med indtrængning af farvestof eller antistof under mærkning samt indtrængning af lys under billeddannelse. I vores hænder var vellykket kryosectioning imidlertid begrænset til tidlige stadier af invasion og ikke-invasive celler på grund af de tekniske udfordringer i bevarelsen af lange og skrøbelige invasive tråde.
Vores protokol er også kompatibel med brugen af nukleare farvestoffer, at mærke kræftceller inde i spheroids, så enkelt celle sporing af time-lapse data. Fiji-plugin trackmate13 kan bruges til at automatisere cellesporing og udtrække motilitetsparametre for enkelte celler, såsom hastighed, øjeblikkelig hastighed og vedholdenhed.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmer af Temple Bioengineering for værdifulde diskussioner. Vi takker David Ambrose på flow cytometry kerne (Lewis Katz School of Medicine) for hans hjælp med celle sortering og Tony Boehm fra IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) for at få hjælp med 3D-udskrivning. Vi takker også vores finansiering ressourcer: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 og R01 CA230777, alle til BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
