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Biology

3डी स्फेरॉइड मॉडल में कैंसर सेल आक्रमण का समय-हल फ्लोरेसेंस इमेजिंग और विश्लेषण

Published: January 30, 2021 doi: 10.3791/61902
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Bioengineering Department, Temple University, 2Cancer Biology Program, Fox Chase Cancer Center

Summary

यहां प्रस्तुत एक गोलाकार इमेजिंग डिवाइस के निर्माण के लिए एक प्रोटोकॉल है। यह डिवाइस कैंसर सेल स्फेरॉइड के गतिशील या देशांतर फ्लोरेसेंस इमेजिंग को सक्षम बनाता है। प्रोटोकॉल कैंसर सेल आक्रमण के विश्लेषण के लिए एक सरल छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया भी प्रदान करता है।

Abstract

प्राथमिक ट्यूमर से आसन्न स्वस्थ ऊतकों में कैंसर की कोशिकाओं पर आक्रमण मेटास्टेसिस में एक प्रारंभिक कदम है। आक्रामक कैंसर कोशिकाओं को एक प्रमुख नैदानिक चुनौती है क्योंकि कोई कुशल विधि उनके उंमूलन के लिए मौजूद एक बार उनके प्रसार चल रहा है मुद्रा । कैंसर सेल आक्रमण को विनियमित तंत्र की एक बेहतर समझ उपन्यास शक्तिशाली चिकित्सा के विकास के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । ट्यूमर के लिए उनकी शारीरिक समानता के कारण, कोलेजन में एम्बेडेड स्फेरॉइड मुझे शोधकर्ताओं द्वारा एक्सेसेलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में कैंसर सेल आक्रमण को नियंत्रित करने वाले तंत्रों का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर उपयोग किया गया है। हालांकि, यह परख (1) ईसीएम में गोलाकार के एम्बेडिंग पर नियंत्रण की कमी से सीमित है; (2) कोलेजन I और ग्लास बॉटम डिश की उच्च लागत, (3) अविश्वसनीय इम्यूनोफ्लोर्सेंट लेबलिंग, एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट रंगों की अक्षम पैठ के कारण और (4) समय लेने वाली छवि प्रसंस्करण और डेटा की मात्राकरण। इन चुनौतियों का समाधान करने के लिए, हमने तीन आयामी (3 डी) स्फेरॉइड प्रोटोकॉल को कोलेजन I में एम्बेडेड कैंसर कोशिकाओं को लेबल करने के लिए अनुकूलित किया, या तो समय-चूक वीडियो या देशांतर इमेजिंग का उपयोग करके, और कैंसर सेल आक्रमण का विश्लेषण करें। सबसे पहले, हम परख लागत को कम करने, मज़बूती से और एक न्यूनतम कोलेजन I मात्रा में स्फेरॉइड को एम्बेड करने के लिए एक गोलाय इमेजिंग डिवाइस (एसआईडी) के निर्माण का वर्णन करते हैं। इसके बाद, हम लाइव और फिक्स्ड स्फेरॉइड के मजबूत फ्लोरेसेंस लेबलिंग के लिए कदम चित्रित करते हैं। अंत में, हम छवि प्रसंस्करण और डेटा क्वांटिफिकेशन के लिए एक आसान-से-उपयोग फिजी मैक्रो प्रदान करते हैं। कुल मिलाकर, यह सरल पद्धति कोलेजन I में कैंसर सेल आक्रमण की निगरानी के लिए एक विश्वसनीय और किफायती मंच प्रदान करती है। इसके अलावा, उपयोगकर्ताओं की जरूरतों को पूरा करने के लिए इस प्रोटोकॉल को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

Introduction

कैंसर की प्रगति के दौरान, कैंसर की कोशिकाएं एक गतिशील और आक्रामक फेनोटाइप प्राप्त कर सकती हैं, जिससे वे ट्यूमर द्रव्यमान से बचने और आसपास के ऊतकों में आक्रमण करने में सक्षम हो सकते हैं1। अंततः, ये आक्रामक कैंसर कोशिकाएं माध्यमिक अंगों के अंदर पहुंच और विकसित हो सकती हैं, एक प्रक्रिया जिसे कैंसर मेटास्टेसिस 1 कहाजाताहै। मेटास्टेसिस कैंसर से संबंधित मौतों के ९०% से अधिक का कारण बनता है2। इसका एक कारण यह है कि, जबकि स्थानीयकृत ट्यूमर चिकित्सकीय रूप से प्रबंधनीय हैं, एक बार मेटास्टैटिक प्रसार होने के बाद आक्रामक कैंसर कोशिकाओं के उन्मूलन के लिए कोई कुशल तरीके मौजूद नहीं हैं। इसलिए, आक्रामक कैंसर कोशिकाओं का उद्भव और एक स्थानीयकृत से एक आक्रामक बीमारी में संक्रमण एक प्रमुख नैदानिक चुनौती प्रस्तुत कर रहा है। यह निर्धारित करना कि कैंसर की कोशिकाएं कैसे शुरू करती हैं और एक आक्रामक व्यवहार को बनाए रखती हैं, जिससे उपन्यास शक्तिशाली उपचारों का विकास हो सकता है।

3 डी स्फेरोइड मॉडल नियंत्रित, अभी तक शारीरिक रूप से प्रासंगिक स्थितियों3के तहत कैंसर कोशिकाओं के गतिशील व्यवहार की जांच करने के लिए एक आदर्श मंच है। दरअसल, इस परख में, कैंसर कोशिकाओं के गोलाकार एक्सट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) के अंदर एम्बेडेड होते हैं, उदाहरण के लिए कोलेजन I, जो एक सरलीकृत ट्यूमर की नकल करता है। फिर, इमेजिंग का उपयोग कोलेजन मैट्रिक्स में गोलाकार से कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण की कल्पना करने के लिए किया जाता है। हालांकि, कई चुनौतियां इस प्रक्रिया को सीमित करते हैं।

पहली चुनौती एम्बेडिंग चरण पर होती है, जहां तरल कोलेजन मैट्रिक्स डिश की सतह में फैल सकता है, जिससे स्फेरॉइड डिश के नीचे को छू सकता है। नतीजतन, स्फेरॉइड से कोशिकाएं त्रि-आयामी (3 डी) स्फेरॉइड आकृति विज्ञान को तोड़ते हुए दो आयामी (2D) सतह पर फैलती हैं। कोलेजन की मात्रा बढ़ाना एक कुशल, लेकिन महंगा समाधान है। कोशिकाओं को 2D सतह पर फैलने से रोकने के लिए, कोलेजन की न्यूनतम मात्रा को बनाए रखते हुए, हमने एक ग्लास बॉटम डिश पर 1 मिमी मोटी, 3-होल पॉलीडिमेथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) को डालने के द्वारा एक गोलाकार इमेजिंग डिवाइस (एसआईडी) विकसित किया।

स्पेरोइड परख की दूसरी चुनौती गोलाकारों में कैंसर कोशिकाओं की लेबलिंग है, जो एंटीबॉडी और फ्लोरोसेंट रंगों के खराब प्रवेश से सीमित है, एक प्रभाव जो गोलाकार आकार के साथ बढ़ता है। जबकि लेबलिंग कोशिकाओं के लिए आदर्श समाधान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस) को व्यक्त करने वाली सेल लाइनों की स्थापना है, यह विकल्प ज्यादातर अमर कोशिका लाइनों तक सीमित है और फ्लोरोसेंट प्रोटीन कल्पना की उपलब्धता से सीमित है। यहां, हम फिक्स्ड स्फेरॉइड के इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला करने के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, साथ ही गोलाकार को एम्बेड करने से तुरंत पहले कोशिकाओं को लेबल करने के लिए साइटोप्लाज्मिक डाई का कुशल उपयोग करते हैं।

स्पेरोइड परख की तीसरी चुनौती समय के साथ सेल आक्रमण के अर्ध-स्वचालित मात्राकरण के लिए सरल फिजी मैक्रो की कमी है। इस चुनौती से निपटने के लिए, हम समय के साथ गोलाकार क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए एक सरल पद्धति का वर्णन करते हैं। हम उदाहरण के रूप में 4T1 और 67NR सेल लाइनों का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल के फायदों का वर्णन करते हैं।

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Protocol

1. स्फेरॉइड एम्बेडिंग (अवधि 1 दिन) को अनुकूलित करने के लिए एक स्पेरोइड इमेजिंग डिवाइस (एसआईडी) का निर्माण

  1. 3डी प्रिंटर(चित्रा 1A, बी और सप्लीमेंट्री फाइल 1)का उपयोग करके स्पेसर बनाएं।
  2. बेस पॉलीमर के 10:1 (wt/wt) अनुपात का वजन करें: एक प्लास्टिक कप में क्रॉसलिंकर [उदाहरण के लिए, 20 ग्राम एथिलबेनजेन बेस बहुलक और 2 ग्राम सिलिकॉन राल क्रॉसलिंकर पॉलीडिमिथाइलसिलॉक्सेन (पीडीएमएस)] बनाने के लिए।
  3. डिस्पोजेबल पिपेट का उपयोग करके प्लास्टिक कप में पीडीएमएस समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं।
  4. मिश्रण से हवा के बुलबुले को हटाने के लिए प्लास्टिक कप को वैक्यूम कक्ष में रखें। मिश्रण की सतह पर फंसी हवा की छोटी मात्रा को हटाने और शेष हवा के बुलबुले को नष्ट करने के लिए वैक्यूम दबाव को जल्दी से छोड़ दें।
  5. इसके लचीलेपन को बढ़ाने के लिए 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर 3डी प्रिंटेड स्पेसर को इनक्यूबेट करें।
  6. पीडीएमएस मोल्ड को 100% आइसोप्रोपेनॉल से पोंछते हुए अच्छी तरह से बनाने के लिए उपयोग की जाने वाली दो ग्लास प्लेटों को साफ करें। यदि कांच की प्लेटों का उपयोग पहले पीडीएमएस डालने के लिए किया जाता था, तो किसी भी शेष पुराने पीडीएमएस को धीरे से एक रेजर ब्लेड के साथ ग्लास प्लेटों को स्क्रैप करके और उन्हें 100% आइसोप्रोपेनॉल के साथ पोंछते हुए हटाना सुनिश्चित करें।
  7. दो साफ ग्लास प्लेटों के बीच में 3 डी मुद्रित स्पेसर फ्लश रखकर मोल्ड का निर्माण करें।
  8. कांच की प्लेटों के बाहर किनारों पर बड़े बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग कर मोल्ड सील। नीचे किनारे पर दो बांधने की मशीन क्लिप रखें और एक शीर्ष कोने पर।
  9. यह सुनिश्चित करने के लिए मोल्ड के शीर्ष भाग का निरीक्षण करें कि स्पेसर ग्लास प्लेटों के साथ फ्लश हो। यह गारंटी देता है कि कोई विरूपण मौजूद नहीं होगा और पीडीएमएस की एक भी शीट बनाई जाएगी ।
    नोट: यदि परिणामस्वरूप शीट एक समान मोटाई की नहीं है, क्लिप थोड़ा समायोजित करने की जरूरत है ।
  10. एक डिस्पोजेबल पिपेट (टिप से ~ 2 सेमी) की नोक काटें और मोल्ड के शीर्ष बाएं कोने में धीमी और स्थिर दर पर पीडीएमएस मिश्रण जोड़ें। बड़े हवा की जेब के निर्माण को रोकने के लिए मिश्रण को धीरे-धीरे डालें।
  11. डालना के दौरान बनने वाले हवा के बुलबुले को हटाने के लिए मोल्ड को वैक्यूम चैंबर में रखें।
  12. 1 घंटे के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर मोल्ड इनक्यूबेटिंग करके पीडीएमएस का इलाज करें।
  13. इनक्यूबेटर से मोल्ड को पुनः प्राप्त करें और इसे छूने के लिए ठंडा करने की अनुमति दें।
  14. ठीक पीडीएमएस वाले स्पेसर से बाइंडर क्लिप और ग्लास प्लेट्स निकालें।
  15. स्पेसर और ग्लास प्लेट के बीच मोल्ड के सभी चार किनारों पर बनाई गई सील के माध्यम से काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें। सभी चार पक्षों में कटौती के साथ, अलग मोल्ड खींच शुरू करने के लिए spacer में PDMS चादर प्रकट करते हैं ।
  16. चिमटी का उपयोग करके स्पेसर के नए पीडीएमएस शीट को सावधानी से छीलें।
  17. एक काटने चटाई पर, शीट से 17.5 मिमी व्यास पीडीएमएस डिस्क को पंच करें, और फिर विभिन्न आकार बायोप्सी घूंसे का उपयोग करके तीन समान रूप से वितरित 5.5 मिमी व्यास छेद पंच करें। यहां इन 3-होल पीडीएमएस डिस्क को "आवेषण"(चित्रा 1C)के रूप में संदर्भित किया जाता है।
    नोट: पीडीएमएस में किए गए गैर-वर्दी कटौती, या प्लाज्मा उपचार के माध्यम से एक दोषपूर्ण बांध, भविष्य लीक में परिणाम हो सकता है ।
  18. टेप का उपयोग करके किसी भी धूल कणों को धीरे-धीरे हटाकर प्रत्येक डालें को साफ करें।
  19. आवेषण को दो तरफा टेप के एक टुकड़े पर चिपकाएं और टेप को 10 सेमी पेट्री डिश के ढक्कन के चारों ओर लपेटें।
  20. पेट्री डिश के ढक्कन को प्लाज्मा मशीन में रखें, साथ ही खुले 35 एमएम ग्लास बॉटम डिश के साथ।
  21. 300 मीटरोर पर 1 मिनट के लिए प्लाज्मा उपचार के माध्यम से आवेषण और कांच की सतह को सक्रिय करें। एक हाथ से आयोजित प्लाज्मा छड़ी का इस्तेमाल किया जा सकता है।
  22. चिमटी का उपयोग करना, जल्दी से उल्टा देते हैं, यानी, एक डालने के पक्ष का इलाज(चित्रा 1D)एक ग्लास बॉटम डिश(चित्रा 1E)के ग्लास भाग में। सभी व्यंजनों के लिए दोहराएं।
  23. ग्लास बॉटम डिश को घुमाते समय एक भी दबाव लागू करने के लिए सूचक उंगली और अंगूठे का उपयोग करें। यह ग्लास बॉटम डिश में डालने की स्थिर सुरक्षा सुनिश्चित करेगा।
  24. ग्लास और पीडीएमएस के बीच आसंजन को मजबूत करने के लिए 20 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर एसआईडीएस(चित्रा 1F)को इनक्यूबेट करें।
  25. SIDs पर प्लाज्मा उपचार के दूसरे दौर प्रदर्शन, कदम 1.21 में या हाथ से आयोजित छड़ी के साथ के रूप में एक ही सेटिंग्स का उपयोग कर. यह मुफ्त पीडीएमएस सतह कोटिंग समाधान में पॉली-एल-लिसाइन का पालन करेगा (1.26 देखें)।
  26. निम्नलिखित समाधानों को नए सिरे से तैयार करें।
    1. कोटिंग समाधान: 1x पीबीएस जिसमें 0.01% (vol/vol) पॉली-एल-लिसिन [उदाहरण के लिए, 0.1% (vol/vol) पॉली-एल-लिसिन को 1x पीबीएस के 90 माइक्रोन में 10 माइक्रोन जोड़ें]।
    2. क्रॉसलिंकिंग समाधान: आसुत पानी जिसमें 1x (vol/vol) ग्लूटारल्डिहाइड [उदाहरण के लिए, 10x ग्लूटारल्डिहाइड के 10 माइक्रोन को 90 माइक्रोन आसुत पानी में जोड़ें]।
    3. भंडारण समाधान: 1x पीबीएस जिसमें 10x (vol/vol) पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन [उदाहरण के लिए, 1x पीबीएस के 9 एमसीएल में 100x पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन का 1 मिलियनल जोड़ें]।
  27. प्रत्येक छेद के प्रति कोटिंग समाधान के 35 μL जोड़ें और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट।
  28. पॉली-एल-लिसिन को एस्पिरेट करें और पूरे सिड को डिस्टिल्ड पानी से 3 बार कुल्ला करें।
  29. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए प्रत्येक छेद इनक्यूबेट के प्रति क्रॉसलिंकिंग समाधान के 35 μL जोड़ें।
  30. क्रॉसलिंकिंग समाधान को एस्पिरेट करें और पूरे सिड को आसुत पानी से 3 बार कुल्लाएं।
  31. प्रत्येक सिड में 70% इथेनॉल जोड़ें और 30 मिनट के लिए पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश के तहत रखें।
  32. हुड के नीचे, इथेनॉल को एस्पिरेट करें और सिड को आसुत पानी के साथ 3 बार कुल्ला करें।
  33. प्रत्येक एसआईडी में 2.5 एमएल स्टोरेज सॉल्यूशन जोड़ें।
    नोट: इस स्तर पर, सिडीएस को एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है। यह देखा गया कि समय के साथ पीडीएमएस और ग्लास के बीच बाध्यकारी शक्ति कम हो जाती है। एक सप्ताह से अधिक, उपयोगकर्ताओं को उपयोग से पहले संभावित रिसाव के लिए एसआईडी का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। ऐसा करने के लिए, भंडारण समाधान को एस्पिरेट करें और प्रत्येक छेद में 1x पीबीएस के 35 माइक्रोन जोड़ें। उपयोग के बाद, पीडीएमएस आवेषण को ग्लास बॉटम व्यंजन से छील दिया जा सकता है। ग्लास बॉटम व्यंजनों की इष्टतम सफाई प्राप्त करने के लिए, पीडीएमएस अवशेषों को हटाने के लिए आइसोप्रोपैनॉल और हाइड्रोक्लोरिक एसिड के साथ कई वॉश का उपयोग किया जाना चाहिए।

2. गोलाकार गठन और कोलेजन में एम्बेडिंग (अवधि 4 दिन)

नोट: स्फेरॉइड की लाइव इमेजिंग के लिए, देशांतर या समय-चूक वीडियो में, एक सेल लाइन का उपयोग करें जो साइटोप्लाज्मिक और/या परमाणु फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है । यदि ऐसी सेल लाइन उपलब्ध है, तो इस अनुभाग में वर्णित चरणों का पालन करें। वैकल्पिक रूप से, धारा 3 में, एक प्रोटोकॉल एक साइटोप्लाज्मिक डाई का उपयोग कर स्फेरॉइड में कैंसर कोशिकाओं को लेबल करने का प्रस्ताव है।

  1. हैंगिंग ड्रॉप तकनीक का उपयोग करके 4T1 और/या 67NR कोशिकाओं के फार्म, जैसा कि पहले4,5,6,7, ३,०००कोशिकाओं/४० μL बूंद और एक 3 दिन इनक्यूबेशन समय के साथ वर्णित है । गोजातीय एटलोकोलेजिन मैं समाधान पिछले जोड़ें और बर्फ पर सभी समाधान बनाए रखने, हर समय।
  2. एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सही ढंग से गठित गोलाकार की पहचान करें।
  3. प्री-गरम पूर्ण माध्यम के 8 एमएल के साथ 15 एमएल शंकु नली भरें।
  4. एक P1000 पिपेट के साथ गोलाकार ले लीजिए और 15 एमएल शंकु नली में स्थानांतरित करें। पिपेट टिप की अंदर की दीवारों से चिपके रहने और गोलाकारों को रोकने के लिए कुछ पूर्ण माध्यम में और बाहर पाइपट टिप को पाइपेट टिप को गीला करें।
  5. स्फेरॉइड को ट्यूब के नीचे तक डूबने दें और माध्यम का आदान-प्रदान करके स्फेरॉइड को ध्यान से धोएं। दो बार दोहराएं।
  6. निर्माता की सिफारिशों (वैकल्पिक जेलेशन प्रक्रिया, नीचे अनुकरणीय गणना देखें) के अनुसार 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन I समाधान तैयार करें। आसुत जल को पूर्ण माध्यम से बदलें। उपयोग किए जाने वाले माध्यम की मात्रा की गणना करते समय, ध्यान रखें कि गोलाकार को पूर्ण माध्यम के 20 माइक्रोन में जोड़ा जाएगा [उदाहरण के लिए, एक सिड के लिए, 3 x 30 + (3 x 30) x 20% = 108 μL 5 मिलीग्राम/ 10x पीबीएस + 1.2 माइक्रोन के 10x पीबीएस + 1.2 माइक्रोन के पूर्ण माध्यम + 22 माइक्रोन 10 मिलीग्राम/एमएल कोलेजन आई स्टॉक के 10 मिलीग्राम/
  7. P200 पिपेट का उपयोग करके, माध्यम के 20 माइक्रोन में सभी गोलाकारों को इकट्ठा करें, और उन्हें चरण 2.6 में तैयार कोलेजन I समाधान में जोड़ें।
  8. धीरे-धीरे कोलेजन आई एकाग्रता में विषमता से बचने के लिए ऊपर और नीचे पाइपिंग करके समाधान मिलाएं, बुलबुला गठन को सीमित करें। इसका घोल बर्फ पर रखें।
  9. सिड (एस) से स्टोरेज समाधान निकालें और 1x पीबीएस के 3 एमएल के साथ 3 बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, सिड (ओं) सूखी तो कोलेजन मैं समाधान पतला नहीं छोड़ दें ।
  10. एक टाइमर शुरू करें और कोलेजन I समाधान के 30 माइक्रोन को सिड के तीन छेदों में से एक में एक स्फेरोइड से बांटें। नेत्रहीन यह सुनिश्चित करें कि 30 माइक्रोन में एक ही गोलाकार निहित है।
  11. एक सिड के सभी 3 छेद को भरने के लिए दो बार और कदम 2.10 दोहराएं।
  12. यदि यह पीडीएमएस सीमा के करीब स्थित है तो स्पेरोइड को फिर से केंद्रित करने के लिए 10 माइक्रोल पिपेट टिप का उपयोग करें। यदि दो या तीन स्फेरॉइड एक छेद में तिरस्कृत हो जाते हैं, तो एक ही पिपेट टिप का उपयोग एक दूसरे से स्फेरॉइड को अलग करने के लिए किया जा सकता है। टाइमर बंद करो।
    नोट: कोलेजन आई पॉलीमराइजेशन और जमना की अवधि के दौरान सिड को उल्टा और उल्टा करना, यह सुनिश्चित करता है कि स्पेरोइड ईसीएम परत के ऊर्ध्वाधर केंद्र में तैनात है, और 2D में कोशिकाओं के आक्रमण को रोकता है। उलटा (फ्लिपिंग) की आवृत्ति को अधिकतम किया जाना चाहिए। चूंकि फ्लिपिंग फ्रीक्वेंसी को 2.10-2.12 में मापा गया स्फेरॉइड "डिस्पेंसिंग टाइम" द्वारा नियंत्रित किया जाता है, इसलिए वितरण समय को कम किया जाना चाहिए। हमारी प्रयोगशाला में, वितरण समय औसतन 2 मिनट है।
  13. कोलेजन परत में गोलाकार को खड़ी करने के लिए, सिड को उल्टा करें और समय बांटने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  14. सिड को उल्टा करें और समय बांटने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    नोट: स्फेरॉइड उल्टा अभिविन्यास में खर्च होने वाले समय की लंबाई उल्टा अभिविन्यास में बिताए गए समय के बराबर होनी चाहिए।
  15. 30 मिनट के लिए चरण 2.13 और 2.14 दोहराएं, जब तक कि कोलेजन मैं बहुलक न हो जाए।
  16. पूर्ण माध्यम/सिड का 2.5 एमएल जोड़ें और यदि आवश्यक हो, तो प्रारंभिक समय बिंदु के लिए स्फेरॉइड की छवि प्राप्त करें।
  17. यदि कई एसआईडी का उपयोग किया जाता है तो चरण 2.10-2.16 दोहराएं।

3. स्फेरॉइड की फ्लोरेसेंस लेबलिंग

  1. लाइव इमेजिंग (अवधि 6-7 दिन)
    नोट: यदि एक सेल लाइन एक साइटोप्लाज्मिक और/या परमाणु फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त उपलब्ध है, धारा 2 में वर्णित कदमों का पालन करें । वैकल्पिक रूप से, साइटोप्लाज्मिक लेबलिंग के लिए, निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रस्तावित है।
    1. धारा 2 में वर्णित प्रोटोकॉल के चरण 2.1-2.5 का पालन करें।
    2. सीरम मुक्त माध्यम के 200 माइक्रोन में साइटोप्लाज्मिक डाई को 25 माइक्रोन में पतला करें।
      नोट: जबकि इस प्रयोग में एक लाल साइटोप्लाज्मिक डाई का उपयोग किया जाता है, किसी भी अन्य उपलब्ध रंग उपयुक्त होना चाहिए। कैंसर कोशिकाओं को सीरम-मुक्त माध्यम के 200 माइक्रोन में 20 माइक्रोन तक पतला परमाणु रंगों का उपयोग करके गोलाकारों के अंदर लेबल किया गया था (सामग्री की तालिकादेखें)।
    3. अंतिम धोने के बाद, साइटोप्लाज्मिक या परमाणु डाई समाधान में गोलाकार को फिर से खर्च करें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें, प्रकाश से संरक्षित।
      नोट: इस दृष्टिकोण के साथ, स्फेरॉइड केंद्र में कोशिकाओं की लेबलिंग कुशल नहीं होगी। सभी कोशिकाओं की लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, इनक्यूबेशन को रातभर बढ़ाया जा सकता है, पकवान को एक घुमाव पर रखकर। चर्चा में विकल्प बताए गए हैं।
    4. पूरे माध्यम में 3 बार स्फेरॉइड धोएं।
    5. धारा 2 में वर्णित प्रोटोकॉल के 2.6-2.17 चरणों में आगे बढ़ें।
    6. 24-72 घंटे(चित्रा2) के लिए हर 10 मिनट में समय-चूक इमेजिंग के माध्यम से छवि गोलाकार, या देशांतर इमेजिंग के माध्यम से, दैनिक, 7 दिनों तक(चित्रा 3)के लिए। लेजर स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप, 10x एयर ऑब्जेक्टिव (0.4 न्यूमेरिकल अपर्चर और 3.1 एमएम वर्किंग डिस्टेंस), 1024 x 1024 पिक्सल, एक्सपोजर टाइम 8 माइक्रोन/पिक्सल, पिनहोल 90 माइक्रोन, 6 x 15 माइक्रोन जेड-स्टेप्स और व्यू के 3 फील्ड्स का इस्तेमाल करें- हरमें एक ही सोइडफेर होता है।
      नोट: समय चूक इमेजिंग के लिए, न्यूनतम लेजर शक्ति का उपयोग करें और तापमान, आर्द्रता और गैस नियंत्रण के साथ एक पर्यावरण कक्ष के साथ माइक्रोस्कोप से लैस । माइक्रोस्कोप पर समय को कम करने के लिए इमेजिंग से पहले 37 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेडेड स्फेरॉइड को संस्कृति और 8 घंटे या रात भर।
  2. स्फेरॉइड (अवधि 2 दिन) का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    नोट: यहां वर्णित प्रक्रिया को पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल8,9से अनुकूलित और अनुकूलित किया गया है । इस विधि का उपयोग धारा 2 और 3.1 में उल्लिखित प्रोटोकॉल के बाद किया जा सकता है।
    1. निम्नलिखित समाधानों को नए सिरे से तैयार करें।
      1. फिक्सिंग समाधान: 4% पीएफए (vol/vol) वाले 1x पीबीएस [उदाहरण के लिए, 1x पीबीएस के 15 एमएल में 16% (vol/vol) पीएफए के 5 एमएल जोड़ें] ।
      2. फिक्सिंग और पारमेबिलिंग समाधान: 1x पीबीएस जिसमें 4% पीएफए (vol/vol) और 0.5% ट्राइटन एक्स-100 (vol/vol) [उदाहरण के लिए, फिक्सिंग समाधान के ट्राइटन एक्स-100 से 10 मिलियन के 50 माइक्रोन जोड़ें]।
      3. अवरुद्ध समाधान: 1x पीबीएस जिसमें 1% एफबीएस (vol/vol) और 1% बीएसए (wt/vol) [उदाहरण के लिए, 1x PBS के 10 मिलीएल में बीएसए के 100 मिलीग्राम को भंग करें, फिर एफबीएस के 100 μL जोड़ें]।
      4. वाशिंग समाधान: 1x पीबीएस जिसमें 0.05% ट्वीन 20 (vol/vol) [उदाहरण के लिए, 1x पीबीएस के ट्वीन 20 से 50 एमएल के 25 माइक्रोन जोड़ें]।
    2. सिड (ओं) से संस्कृति माध्यम निकालें और गर्म 1x पीबीएस के साथ एक बार धो लें।
    3. सिड प्रति फिक्सिंग और पारमेबिलाइजिंग समाधान के 2 एमएल जोड़ें और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    4. फिक्सिंग और पार करने वाले समाधान को हटा दें और प्रति सिड समाधान फिक्सिंग के 2 एमएल जोड़ें और 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
    5. धुलाई के घोल से 3 बार धोएं।
    6. प्रति सिड अवरुद्ध समाधान के 2 मिलीएल जोड़ें और हल्के झटकों के साथ 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस कदम पर, नमूनों को सप्ताहांत में 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड किया जा सकता है। कृपया ध्यान दें कि एक लंबा अवरुद्ध समय इम्यूनोफ्लोरेसेंस लेबलिंग प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकता है।
    7. समाधान को अवरुद्ध करने में प्राथमिक एंटीबॉडी को पतला करें।
    8. एक ४८-अच्छी तरह से थाली में प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ अवरुद्ध समाधान के १५० μL जोड़ें ।
    9. ठीक चिमटी का उपयोग करना, ध्यान से कोलेजन मैं एक गोलाकार युक्त और एक अच्छी तरह से हस्तांतरण के प्लग अलग । यदि कई गोलाकार लेबल हैं तो दोहराएं। संदूषण को रोकने के लिए, विभिन्न एंटीबॉडी के साथ काम करते समय चिमटी पर बने रहने वाले किसी भी तरल को मिटा दें।
    10. हल्के झटकों के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट।
    11. खाली और पूर्ण कुओं के लिए धोने के समाधान के 300 μL जोड़ें।
    12. ध्यान से कोलेजन के प्लग को स्थानांतरित करें जिसमें मैं एक स्फेरोइड को "वॉश" अच्छी तरह से स्थानांतरित करता हूं।
    13. कमरे के तापमान पर और हल्के झटकों के साथ, 2 घंटे के लिए धोने के समाधान के साथ 3 बार धोएं।
      नोट: समाधान को कम करने के बजाय, एक स्फेरॉइड युक्त कोलेजन के प्लग स्थानांतरित करने से नमूना हानि और नमूना क्षति को कम करने में मदद मिल सकती है।
    14. कमजोर माध्यमिक एंटीबॉडी, 4', 6-diamidino-2-फेनीलिंडोल (DAPI) और/
    15. माध्यमिक एंटीबॉडी, DAPI और/या अच्छी तरह से phalloidin के साथ अवरुद्ध समाधान के १५० μL जोड़ें ।
    16. चिमटी का उपयोग करके, स्फेरॉइड युक्त कोलेजन प्लग को अच्छी तरह से सावधानी से स्थानांतरित करें। यदि कई गोलाकार लेबल हैं तो दोहराएं।
    17. हल्के मिलाते हुए के साथ 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट।
    18. चरण 3.2.11 और 3.2.12 दोहराएं।
    19. हल्के मिलाते हुए कमरे के तापमान पर, 30 मिनट के लिए धोने के समाधान के साथ 3 बार धोएं।
    20. रेजर ब्लेड का उपयोग करके, एक 3-होल पीडीएमएस को तीन भागों में डालें ताकि प्रत्येक भाग में एक छेद हो।
    21. पीडीएमएस के दो टुकड़ों को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर रखें।
    22. अंत कट ऑफ के साथ P200 टिप का उपयोग करके बढ़ते समाधान की एक बूंद जोड़ें। बुलबुला गठन को रोकें।
    23. ध्यान से एक कोलेजन मैं प्रत्येक छेद में प्लग स्थानांतरित।
      नोट: यदि स्फेरॉयड कोलेजन प्लग के शीर्ष पर तैनात किया गया था, तो कोलेजन प्लग को उलट दें ताकि स्फेरॉइड ग्लास कवरलिप के करीब समाप्त हो जाए।
    24. टेप का उपयोग कर शीर्ष और सील पर एक कवरलिप रखें।
    25. नमूना 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सूखी, प्रकाश से संरक्षित करते हैं।
    26. 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें, इमेजिंग तक प्रकाश से संरक्षित।

4. छवि प्रसंस्करण समय के साथ कैंसर आक्रमण का विश्लेषण करने के लिए

नोट: इस मैक्रो के लिए आवश्यक प्रारूप एक एकल चैनल x, y, टी छवि एक .tiff फ़ाइल के रूप में सहेजा गया है ।

  1. यदि कई जेड-स्लाइस(यानी एक्स, वाई, जेड, टी छवि) का अधिग्रहण किया गया था, तो फिजी में छवि खोलें और इमेज | का चयन करें ढेर | जेड परियोजना। मैक्स तीव्रता विकल्प का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है। वैकल्पिक रूप से, मैक्रो को चलाने के लिए एक जेड-स्लाइस का उपयोग किया जा सकता है। .tiff फ़ाइल के रूप में छवि को सहेजें।
  2. डेस्कटॉप पर एक अलग "प्रोसेसिंग" फ़ोल्डर बनाएं।
  3. फाइल | का चयन करें | के रूप में बचाओ इमेज सीक्वेंस। झगड़ा प्रारूप का उपयोग करें, फ्रेम की संख्या के अनुसार अंक संख्या को अपडेट करें, फ़ाइल नाम के रूप में स्लाइस लेबल का उपयोग करने के लिए बॉक्स की जांच करें और ठीक करेंचुनें। स्टेप 2 में बनाए गए "प्रोसेसिंग" फोल्डर का चयन करें।
  4. "प्रोसेसिंग" फ़ोल्डर से एक छवि खोलें। यह एक एक्स, वाई छवि होना चाहिए, जो एक ही समय बिंदु के अनुरूप हो।
  5. इमेज | का चयन करें | समायोजित करें ऑटो दहलीज। ड्रॉपडाउन मेनू में विधि का चयन करें सभी की कोशिश करो और काले पृष्ठभूमि पर सफेद वस्तुओं के लिए बॉक्स की जांच करें।
  6. एक असेंबल छवि प्रत्येक स्वचालित थ्रेसिंग विधि के लिए परिणाम दिखाती दिखाई देती है।
  7. सबसे अच्छा स्वचालित थ्रेसिंग विधि की पहचान करें, उदाहरण के लिए रेनीयएनट्रोपी।
  8. स्वचालित थ्रेसिंग विधि के विकल्प की पुष्टि करने के लिए, "प्रोसेसिंग" फ़ोल्डर से किसी भी अन्य छवि को खोलें और इमेज | का उपयोग करके चुनी हुई थ्रेसहोल्डिंग विधि का परीक्षण करें | समायोजित करें ऑटो दहलीज।
  9. सभी छवियों को बंद करें।
  10. स्पेरोइडएरियाटाइम मैक्रो(सप्लीमेंट्री फाइल 2)डाउनलोड करें।
  11. ड्रैग-एंड-ड्रॉप द्वारा फिजी मैक्रो खोलें।
  12. लाइन 58 में, आवश्यकतानुसार स्वचालित थ्रेसिंग विधि को अपडेट करें।
  13. लाइन 62 में, सेल आयामों के अनुसार आकार सीमा को अपडेट करें।
  14. रनका चयन करें ।
  15. "प्रोसेसिंग" फ़ोल्डर का चयन करें और पैरेंट फ़ोल्डर के रूप में "प्रोसेसिंग" में टाइप करें, फिर ओकेचुनें।
  16. एक बार रन खत्म हो जाने के बाद, टेबल "सारांश" को बचाएं। पहला कॉलम छवि के नाम को इंगित करता है; तीसरा कॉलम गोलाकार क्षेत्र को इंगित करता है; छठे, सातवें और आठ कॉलम स्पेरोइड पर लगे एलिप्से के लिए मापदंडों को निर्दिष्ट करते हैं।
  17. "प्रोसेसिंग" फ़ोल्डर में अब प्रत्येक बार बिंदु के लिए एक प्रसंस्कृत छवि होती है, जिसमें विस्तार _SpheroidArea होता है।
    नोट: यदि गोलाकार केंद्र मंद है, तो सभी टाइमपॉइंट के लिए चयन उपकरणों का उपयोग करके इसे सफेद रंग से भरें, और फिर 3 चरण के लिए आगे बढ़ें। इसी तरह, गोलाकार के आसपास की जगह को छवि को "साफ" करने के लिए काले रंग से भरा जा सकता है। यदि छवि साफ है, तो रन को गति देने के लिए लाइन 61 पर टिप्पणी करें।

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Representative Results

इसकी जैव अनुकूलता के कारण, पीडीएमएस का व्यापक रूप से कुओं, टिकटों और मोल्डों को सीमित करने के माइक्रोफैब्रिकेशन के लिए उपयोग किया जाता है, जिसने माइक्रोपैटर्निंग और माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में क्रांति ला दी। यहां वर्णित विधि में, इसका उपयोग एसआईडी, अनुकूलन योग्य कुओं को बनाने के लिए किया जाता है जो स्फेरोइड एम्बेडिंग और इमेजिंग प्रक्रिया को अनुकूलित करते हैं। चित्रा 1 एसआईडी के निर्माण में उपयोग किए जाने वाले प्रमुख घटकों को दिखाता है। पीडीएमएस मोल्ड को कास्ट करने के लिए, एक 1-मिमी मोटी स्पेसर 3-डी मुद्रित(चित्रा 1A,बी)है, जो दो ग्लास प्लेटों के बीच रखा गया है, जो बड़ी क्लिप के साथ सील किया गया है। प्लेटों के बीच अंतरिक्ष में पीडीएमएस डालने और पकाना पीडीएमएस की 1-मिमी मोटी चादर बनाता है। सिड योजनाबद्ध(चित्रा 1 सी)इष्टतम डिवाइस के आयामों को इंगित करता है, हालांकि बायोप्सी घूंसे(चित्रा 1D)का उपयोग करके छेद के मैनुअल छिद्रण के कारण छेद दूरी में मामूली भिन्नता होती है। चित्रा 1डी, एफ पीडीएमएस डालने के भीतर समान रूप से दूरी छेद के साथ साफ परिपत्र कटौती का संकेत मिलता है।

एसआईडी का उपयोग करने से कुशल एम्बेडिंग की सुविधा होती है, और इसलिए कोलेजन के अंदर कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण की रिकॉर्डिंग मैं समय-चूक(चित्रा 2, वीडियो 1)या देशांतर(चित्रा 3)इमेजिंग का उपयोग करता हूं। कोलेजन I बहुलीकरण के दौरान सभी एसआईडी के लिए एक ही उलटा आवृत्तियों का उपयोग करने के बावजूद, कोलेजन प्लग के अंदर गोलाकार स्थितियां थोड़ी भिन्न होंगी। इसलिए, लंबी कार्य दूरी (>1 मिमी) के साथ एक उद्देश्य का उपयोग करना महत्वपूर्ण है। अन्यथा, कोलेजन प्लग के शीर्ष के करीब तैनात स्फेरॉइड के लिए फोकसिंग और इमेजिंग मुश्किल हो सकती है। इसके विपरीत, कोलेजन प्लग के नीचे के करीब स्थित स्फेरॉइड में कोशिकाएं होंगी जो कांच की सतह पर जाती हैं और कोलेजन आई मैट्रिक्स में हमला करने के बजाय ग्लास पर माइग्रेट होती हैं। ऐसे स्फेरॉइड के वीडियो को त्यागने की आवश्यकता है। कोलेजन प्लग की मोटाई, यहां लगभग 800 माइक्रोन, सिड के प्रत्येक छेद में तिरस्कृत मात्रा द्वारा नियंत्रित किया जाता है और इस प्रोटोकॉल में आक्रमण दूरी स्फेरॉइड प्रदर्शन करने के लिए समायोजित किया जाता है। छोटे या कम आक्रामक स्फेरॉइड का उपयोग करते समय, सिड के प्रत्येक छेद में कोलेजन I की कम मात्रा को वितरित करके कोलेजन प्लग की मोटाई को कम किया जा सकता है।

फिजी मैक्रो का उपयोग करके आक्रमण के उचित विश्लेषण के लिए, कैंसर कोशिकाओं को इमेजिंग सत्र के दौरान ठीक से लेबल किया जाना महत्वपूर्ण है। जैसा कि चरण 4.17 में उल्लेख किया गया है, छवि प्रसंस्करण चरण छवि सुधार के लिए अनुमति देता है यदि लेबलिंग उप-इष्टतम है। जबकि हम 6 दिनों(चित्रा 3)के दौरान देशांतर इमेजिंग का वर्णन करते हैं, जिसके लिए साइटोप्लाज्मिक और/या परमाणु फ्लोरोसेंट प्रोटीन की स्थिर अभिव्यक्ति की आवश्यकता होती है, तो रंगों के साथ लेबलिंग का उपयोग करके कम समय में इसी तरह की देशांतर इमेजिंग की जा सकती है ।

लाइव इमेजिंग के बाद, हम एपिथेलियल कैडेरिन (ई-कैडेरिन), कोर्टेक्टिन और एफ-ऐक्टिन(चित्रा 4)के लिए इम्यूनोलबेलिंग प्रक्रिया से कुछ परिणाम प्रस्तुत करते हैं। इन उदाहरणों में, हमने 4T1 और 67NR सेल लाइनों का उपयोग किया। चित्रा 5 समय के साथ गोलाकार के क्षेत्र को मापने के लिए फिजी मैक्रो का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया के कदम-दर-कदम चित्रण दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: एसआईडी का निर्माण। (A)स्पेसर का टॉप व्यू योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । (B)3डी प्रिंटेड स्पेसर। (ग)एसआईडी का टॉप व्यू योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व । एक 3-होल पीडीएमएस आवेषण(डी)एक ग्लास बॉटम डिश(ई)से बंधा हुआ है, जो अंतिम सिड(एफ)बनाता है। आयाम मिलीमीटर में हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: स्फेरॉइड की लाइव इमेजिंग। वीडियो 1 से प्रतिनिधि 20 एच और 40 एच टाइमपॉइंट, 4T1 स्फेरॉइड का अधिकतम प्रक्षेपण। 4T1 कोशिकाओं को साइटोप्लाज्मिक डाई का उपयोग करके लेबल किया गया था। स्केल बार, 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: गोलाकारों की देशांतर इमेजिंग। एक मिश्रित 4T1/67NR spheroid छवि के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ (अधिकतम प्रक्षेपण) दैनिक । 4T1 और 67NR कोशिकाएं क्रमशः साइटोप्लाज्मिक एमएसकारलेट और ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) को व्यक्त करती हैं। स्केल बार, 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: स्फेरॉइड की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग। कोलेजन आई ई-कैडेरिन (सियान, ए), कोर्टेक्टिन (पीला, बी) और एफ-ऐक्टिन (मैजेंटा, ए और बी) में एम्बेड करने के 2 दिन बाद तय किए गए 4T1 स्फेरॉइड के प्रतिनिधि माइक्रोग्राफ (अधिकतम प्रक्षेपण) को लेबल किया गया था । स्केल बार, 100 माइक्रोन. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 5
चित्रा 5: छवि प्रसंस्करण विश्लेषण। समय के साथ गोलाकार(बी)के क्षेत्र को मापने के लिए फिजी मैक्रो(ए)का उपयोग करके छवि प्रसंस्करण प्रक्रिया का चरण-दर-चरण चित्रण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

वीडियो 1: 4T1 स्फेरॉइड इमेज्ड के प्रतिनिधि वीडियो को 46 एच और 10 मिनट के लिए हर 10 मिनट पर चित्रित किया गया था। 4T1 कोशिकाओं को साइटोप्लाज्मिक डाई का उपयोग करके लेबल किया गया था। स्केल बार, 100 माइक्रोन. कृपया इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 1: स्पेसर (एसटीएल फाइल) का 3डी मॉडल। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

पूरक फ़ाइल 2: स्पेरोइडएरियाटाइम मैक्रो। इस फाइल को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

3 डी मुद्रित स्पेसर को पीडीएमएस की 1-मिमी मोटी चादरें बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया था जिसका उपयोग प्रयोगात्मक अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक पीडीएमएस के विभिन्न आकारों को आसानी से बनाने के लिए किया जा सकता है। इसके निर्माण की सादगी और डिजाइन को बदलने की स्वतंत्रता के कारण, पीडीएमएस कास्टिंग की इस विधि को सिड के प्रारंभिक डिजाइन के लिए चुना गया था। यदि एसआईडी की उच्च मात्रा की आवश्यकता होती है, तो उत्पादन को 3डी-मुद्रित मोल्ड बनाकर अधिक कुशल बनाया जा सकता है, जिसमें पहले से ही तीन समान रूप से दूरी वाले छेद के साथ पीडीएमएस डिस्क शामिल हैं, और प्रक्रिया को एक कदम तक कम कर सकते हैं। यह बाद के तीन छेद के साथ-साथ प्रत्येक डिस्क को पंच करने की आवश्यकता को समाप्त करेगा, और समग्र तैयारी के समय को कम करेगा।

जबकि 3-होल पंच 35 मिमी ग्लास बॉटम व्यंजनों के साथ उपयोग के लिए विकसित किया गया है, अन्य आकार उपलब्ध हैं जो अधिक छेद के लिए अनुमति देते हैं और इसलिए, समानांतर में अधिक स्फेरॉइड इमेज किए जाते हैं। इसके अलावा, कस्टम-आकार कवर ग्लास भी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, जो 3 डी मुद्रित धारकों के संयोजन में, उच्च थ्रूपुट स्पफेरोइड परख के लिए अनुमति दे सकता है। इस तरह के दृष्टिकोण के साथ, सीमित कारक डेटा अधिग्रहण की गति है- उदाहरण के लिए, हमारे बहुरंगी समय-चूक कॉन्फोकल इमेजिंग में, एक स्फेरॉइड के 3डी स्टैक प्राप्त करने के लिए लगभग 2.5 मिनट की आवश्यकता होती है। इसलिए, सिड में 3 स्फेरॉइड के लिए 3डी स्टैक प्राप्त करने के लिए लगभग 8 मिनट की आवश्यकता होती है। नतीजतन, प्रति स्टैक 10 मिनट पर इमेजिंग की हमारी पसंदीदा आवृत्ति को बनाए रखने के लिए, हम एसआईडी में छेद की संख्या में वृद्धि नहीं कर सकते।

3 डी स्फेरोइड मॉडल में जीवित कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण को रिकॉर्ड और मात्रा में निर्धारित करने के लिए, उज्ज्वल क्षेत्र इमेजिंग का उपयोग5किया जा सकता है। हालांकि, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी को पसंद किया जाता है, क्योंकि यह छवि प्रसंस्करण में इसके विपरीत और आसानी और सटीकता प्रदान करता है। यदि साइटोप्लाज्मिक और/या परमाणु फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली सेल लाइन की पीढ़ी संभव नहीं है, तो हम साइटोप्लाज्मिक रंगों के उपयोग का प्रस्ताव करते हैं । चूंकि कोशिकाओं के अंदर साइटोप्लाज्मिक रंगों का अवधारण समय हमारी इमेजिंग स्थितियों में तीन दिन है, इसलिए कोशिकाओं को फांसी की बूंद में 3 दिन की अवधि के बाद और एम्बेडिंग से तुरंत पहले लेबल किया जाना चाहिए। कोशिकाओं की लेबलिंग पोस्ट-एम्बेडिंग गैर-विशेष रूप से कोलेजन को लेबल कर सकती है, और सेल लेबलिंग को कम कर सकती है। एम्बेडिंग के बाद 3 दिनों से अधिक समय तक इमेजिंग के लिए एक अलग स्फेरॉइड सीडिंग प्रोटोकॉल10 या सेल लाइनों के उपयोग की आवश्यकता होती है जो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एस) को स्थिर रूप से व्यक्त करते हैं।

हम सफलतापूर्वक गठन और ६० से ५,००० कोशिकाओं/ड्रॉप कहीं भी युक्त spheroids । छोटे स्फेरॉइड कई दिनों में आक्रमण रिकॉर्ड करने के लिए आदर्श हैं, क्योंकि उनका पूरा आक्रमण क्षेत्र आसानी से उच्च आवर्धन (20x-30x) उद्देश्यों के एक क्षेत्र-दृश्य में फिट हो सकता है। इसके अलावा, उन्हें आसानी से साइटोप्लाज्मिक या परमाणु रंगों के साथ लेबल किया जा सकता है। अंत में, कम बिखरने के कारण, गोलाकार में प्रत्येक कोशिका की कल्पना और खंडित किया जा सकता है। हालांकि, छोटे गोलाकार नग्न आंखों के साथ मुश्किल से दिखाई देते हैं और ऊतक मार्कर के साथ अतिरिक्त लेबलिंग की आवश्यकता हो सकती है। इसके विपरीत, बड़े गोलाकार को संभालना आसान होता है, लेकिन उनके वजन के कारण पकवान के नीचे डूबने के लिए अधिक संवेदनशील होता है। इसके अलावा, स्पेरोइड सेंटर में कोशिकाओं को हमेशा रंगों का उपयोग करते समय लेबल नहीं किया जाता है, या कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके दिखाई देता है, जिसमें लगभग 100 माइक्रोमीटर की पैठ गहराई होती है। समय-चूक इमेजिंग का उपयोग करके बड़े गोलाकारों में सभी कैंसर कोशिकाओं की कल्पना करने के लिए, मल्टीफोटोन माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया जा सकता है, लेबलिंग की आवश्यकता के बिना दूसरी हार्मोनिक पीढ़ी (एसएचजी) द्वारा कोलेजन फाइबर दृश्य का एक अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है। इसके अलावा, इमेजिंगप्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी8,11,12के साथ किया जा सकता है, जो कम छवि अधिग्रहण समय प्रदान करता है और इसलिए उच्च-थ्रूपुट स्पफेरॉइड परख के लिए अनुमति देता है, लेकिन अधिक डेटा भंडारण और उन्नत छवि प्रसंस्करण की भी आवश्यकता होती है। यदि समय-चूक वीडियो की आवश्यकता नहीं है, तो फिक्स्ड 3डी स्फेरॉइड के लिए हमारी लेबलिंग प्रक्रिया को ऑप्टिकल समाशोधन8,10के साथ जोड़ा जा सकता है। इसके अलावा, एम्बेडेड स्फेरॉइड का क्रायोसेक्शनिंग लेबलिंग के दौरान डाई या एंटीबॉडी के प्रवेश के साथ मुद्दों को खत्म कर सकता है, साथ ही इमेजिंग के दौरान प्रकाश की पैठ भी कर सकता है। हमारे हाथों में, हालांकि, सफल क्रायोसेक्शनिंग लंबे और नाजुक आक्रामक किस्में के संरक्षण में तकनीकी चुनौतियों के कारण आक्रमण और गैर-आक्रामक कोशिकाओं के शुरुआती चरणों तक सीमित था।

हमारा प्रोटोकॉल परमाणु रंगों के उपयोग के साथ भी संगत है, स्फेरॉइड के अंदर कैंसर कोशिकाओं को लेबल करने के लिए, समय-चूक डेटा की एकल सेल ट्रैकिंग को सक्षम करता है। फिजी प्लगइन ट्रैकमेट13 का उपयोग सेल ट्रैकिंग को स्वचालित करने और एकल कोशिकाओं के गतिशीलता मापदंडों को निकालने के लिए किया जा सकता है, जैसे वेग, तात्कालिक गति और दृढ़ता।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मूल्यवान चर्चाओं के लिए टेंपल बायोइंजीनियरिंग के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहते हैं । हम 3 डी प्रिंटिंग के साथ मदद के लिए आइडिया हब (कॉलेज ऑफ इंजीनियरिंग, टेंपल यूनिवर्सिटी) से सेल छंटाई और टोनी बोहेम के साथ उनकी सहायता के लिए फ्लो साइटोमेट्री कोर (लुईस काट्ज स्कूल ऑफ मेडिसिन) में डेविड एम्ब्रोस को धन्यवाद देते हैं। हम भी हमारे धन संसाधनों का शुक्रिया अदा करते हैं: अमेरिकन कैंसर सोसायटी रिसर्च स्कॉलर ग्रांट १३४४१५-आरएसजी-20-034-01-सीएसएम, अब कैंसर को जीतें/युवा अन्वेषक पुरस्कार, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान, R00 CA172360 और R01 CA230777, सभी बीजी के लिए ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 N NaOH Honeywell Fluka 60-014-44
10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) Gibco SH30028.LS
16% paraformaldehyde (PFA) Alfa Aesar 43368-9M
1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) Gibco 20012027
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Invitrogen D1306
48-well plate Falcon T1048
Alexa Fluor 647 phalloidin Life Technologies A20006
Anti cortactin antibody Abcam ab33333 1 to 200 dilution
Anti E-cadherin antibody Invitrogen 13-1900 1 to 100 dilution
Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) Advanced Biomatrix 501050ML
Bovine serum albumin (BSA) Sigma Aldrich A4503-50G
CellTracker Red CMTPX Dye Invitrogen C34552
Conical tubes Falcon 352095
Coverslips FisherBrand 12-548-5E
Disposable container Staples Plastic cups
Disposable transfer pipette Thermo Scientific 202
DMEM Fisher Scientific 11965118
Double-faced tape Scotch
Ethanol Sigma Aldrich E7023-500ML
Fetal bovine serum (FBS) Bio-Techne S11550
Fluoromount-G eBioscience 00-4958-02
Glutaraldehyde Sigma Aldrich G5882-100mL
Hoescht nuclear stain Thermo Fischer 62249
Isopropanol Thermo Fischer S25371A
MatTek dish (glass bottom dish) MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Methyl cellulose Sigma Aldrich M6385-100G
MilliQ water
Penicilin/streptomycin solution Thermo Fischer 15140122
Petri dish Corning 353003
Pipet tips Fisherbrand 02-707
Pipets Gilson F167300
Poly-L-Lysine Sigma P8920
Primary antibodies, user specific
Rat Tail Collagen I Corning 47747-218
Razor Blade Personna 74-0001
Secondary antibodies, user specific
Slides Globe Scientific 1354W-72
Sylgard 184 Silicone Dow Corning 4019862
Tape Scotch
Triton X100 Sigma Aldrich 10789704001
Tween 20 Sigma Aldrich 655204-100ML

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References

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जीव विज्ञान अंक 167 कैंसर स्फेरॉइड आक्रमण फ्लोरोसेंट लेबलिंग देशांतर इमेजिंग समय-चूक माइक्रोस्कोपी माइक्रोफैब्रिकेशन
3डी स्फेरॉइड मॉडल में कैंसर सेल आक्रमण का समय-हल फ्लोरेसेंस इमेजिंग और विश्लेषण
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Perrin, L., Tucker, T.,… More

Perrin, L., Tucker, T., Gligorijevic, B. Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model. J. Vis. Exp. (167), e61902, doi:10.3791/61902 (2021).

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