Summary
여기에 제시된 스페로이드 이미징 장치의 제조를 위한 프로토콜이 있습니다. 이 장치는 암 세포 스페로이드의 동적 또는 세로 형광 이미징을 가능하게합니다. 이 프로토콜은 또한 암세포 침입의 분석을 위한 간단한 화상 처리 절차를 제공합니다.
Abstract
1차 종양에서 인접한 건강한 조직으로암세포의 침입은 전이의 초기 단계이다. 침략적인 암세포는 그들의 보급이 진행되는 후에 그들의 제거를 위한 능률적인 방법이 없기 때문에 중요한 임상 도전을 제기합니다. 암 세포 침략을 통제하는 기계장치의 더 나은 이해는 새로운 강력한 치료의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다. 종양에 그들의 생리적 유사성 때문에, 콜라겐에 내장된 spheroids 나는 세포외 매트릭스로 암 세포 침략을 관장하는 기계장치를 연구하기 위하여 연구원에 의해 광범위하게 이용되었습니다 (ECM). 그러나, 이러한 분석은 (1) ECM에 스페로이드를 포함시키는 것에 대한 통제의 부족에 의해 제한됩니다. (2) 콜라겐 I 및 유리 바닥 접시의 높은 비용, (3) 신뢰할 수 없는 면역 형광 라벨링, 항체및 형광 염료의 비효율적인 침투및 (4) 시간이 많이 소요되는 이미지 처리 및 데이터의 정량화로 인해. 이러한 과제를 해결하기 위해, 우리는 시간 경과 비디오 또는 세로 이미징을 사용하여 콜라겐 I에 내장 된 형광 라벨 암 세포를 이미지하고 암세포 침공을 분석하기 위해 3차원 (3D) 스페로이드 프로토콜을 최적화했습니다. 먼저, 스페로이드 이미징 장치(SID)의 제조를 사용하여 스페로이드를 안정적으로 그리고 최소한의 콜라겐 I 부피로 조립하여 분석 비용을 절감하는 방법을 설명합니다. 다음으로, 우리는 라이브 및 고정 스페로이드의 강력한 형광 라벨링을위한 단계를 설명합니다. 마지막으로 이미지 처리 및 데이터 정량화를 위해 사용하기 쉬운 피지 매크로를 제공합니다. 전부, 이 간단한 방법론은 콜라겐 I에 있는 암 세포 침략을 감시하는 믿을 수 있고 적당한 플랫폼을 제공합니다. 또한 이 프로토콜은 사용자의 요구에 맞게 쉽게 수정할 수 있습니다.
Introduction
암 진행 중, 암세포는 연약하고 침습적인 표현형을 취득하여 종양 질량을 탈출하고 주변 조직1로침입할 수 있다. 결국, 이러한 침습성 암세포는 이차 기관 내부에 도달하고 성장할 수 있으며, 암 전이1이라고불리는 과정이다. 전이는 암 관련 사망의 90% 이상을 유발합니다2. 이에 대한 한 가지 이유는 국소화된 종양이 임상적으로 관리가 가능하지만, 일단 전이성 확산이 발생하자 침습적인 암세포의 제거를 위한 효율적인 방법이 존재하지 않는다는 것이다. 따라서 침습적인 암세포의 출현과 국소화된 질환으로의 전환은 주요 임상적 과제를 제기하고 있다. 암세포가 어떻게 침략적인 행동을 시작하고 유지하는지 결정하는 것은 새로운 강력한 치료의 발달로 이끌어 낼 수 있습니다.
3D 스페로이드 모델은 통제하에 암세포의 운동성 거동을 조사하기 에 이상적인 플랫폼이지만 생리적으로 관련된 조건3. 실제로, 이 분석에서, 암세포의 스페로이드는 단순화된 종양을 모방하는 콜라겐 I를, 예를 들면 세포외 매트릭스 (ECM) 안에 내재되어 있습니다. 이어서, 이미징은 스페로이드에서 콜라겐 매트릭스로 암세포의 침입을 시각화하는 데 사용된다. 그러나 여러 가지 과제는 이 절차를 제한합니다.
첫 번째 과제는 액체 콜라겐 매트릭스가 접시 표면에 퍼져 스페로이드가 접시의 바닥을 만질 수있는 포함 단계에서 발생합니다. 따라서, 스페로이드로부터의 세포는 2차원(2D) 표면에 퍼지며, 3차원(3D) 스페로이드 형태를 파괴한다. 콜라겐의 양을 늘리는 것은 효율적이지만 비용이 많이 드는 솔루션입니다. 2D 표면에 세포가 퍼지는 것을 방지하기 위해, 콜라겐의 최소 볼륨을 유지하면서, 우리는 유리 바닥 접시에 삽입 1mm 두께, 3 홀 폴리 디메틸실록산 (PDMS)을 경계하여 스페로이드 이미징 장치 (SID)를 개발했다.
스페로이드 분석법의 두 번째 과제는 스페로이드에 암세포의 라벨링으로, 항체와 형광염의 침투가 불량하여 제한되며, 이는 스페로이드 크기로 증가하는 효과이다. 세포 라벨링에 이상적인 해결책은 형광 단백질을 안정적으로 표현하는 세포주 설립이지만,이 옵션은 대부분 불멸의 세포주로 제한되며 형광 단백질 키메라의 가용성에 의해 제한됩니다. 여기서, 우리는 고정 스페로이드의 면역 형광 염색에 대한 최적화 된 프로토콜뿐만 아니라, 스페로이드를 포함하기 직전에 세포염염료를 라벨링하는 세포염염의 효율적인 사용을 설명합니다.
스페로이드 분석의 세 번째 도전은 시간이 지남에 따라 세포 침공의 반 자동 정량화에 대한 간단한 피지 매크로의 부족이다. 이 문제를 해결하기 위해 시간이 지남에 따라 스페로이드 영역을 분석하는 간단한 방법론을 설명합니다. 우리는 4T1 및 67NR 세포주를 예로 사용하여이 프로토콜의 장점을 설명합니다.
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Protocol
1. 스페로이드 임베딩을 최적화하기 위해 스페로이드 이미징 장치(SID)의 제조(기간 1일)
- 3D프린터(그림 1A, B 및 보충 파일 1)를사용하여 스페이서를 만듭니다.
- 플라스틱 컵에 10:1(wt/wt) 염기 폴리머:크로스링커의 무게를 내밀면 플라스틱 컵에 [예를 들어, 20 g의 에틸벤젠 베이스 폴리머와 실리콘 수지 크로스링커 2 g)를 생성하여 폴리디메틸실록산(PDMS)을 생성한다.
- 일회용 파이펫을 사용하여 플라스틱 컵에 PDMS 용액을 철저히 혼합합니다.
- 플라스틱 컵을 진공 챔버에 넣고 혼합물에서 기포를 제거합니다. 진공 압력을 신속하게 방출하여 혼합물 표면에 갇힌 소량의 공기를 제거하고 나머지 기포를 방출합니다.
- 3D 프린팅 스페이서를 100°C에서 5분 동안 배양하여 유연성을 높입니다.
- 100% 이소프로판올로 닦아 PDMS 금형을 완전히 구성하는 데 사용되는 두 개의 유리 판을 청소하십시오. 유리 판이 이전에 PDMS를 캐스팅하는 데 사용된 경우 면도날로 유리 판을 부드럽게 긁어 내고 100 % 이소 프로파놀로 닦아 남은 오래된 PDMS를 제거해야합니다.
- 3D 인쇄 된 스페이서를 두 개의 깨끗한 유리 판 사이에 배치하여 금형을 구성합니다.
- 유리 판의 외부 가장자리에 큰 바인더 클립을 사용하여 금형을 밀봉합니다. 아래쪽 가장자리에 바인더 클립 2개와 상단 모서리에 하나씩 놓습니다.
- 스페이서가 유리 판으로 플러시되도록 금형의 상단 부분을 검사합니다. 이렇게 하면 변형이 존재하지 않으며 PDF의 균일 한 시트가 생성됩니다.
참고: 결과 시트가 균일한 두께가 아닌 경우 클립을 약간 조정해야 합니다. - 일회용 파이펫 의 끝을 잘라 (끝에서 ~ 2cm) 금형의 왼쪽 상단 모서리에 느리고 일정한 속도로 PDMS 혼합물을 추가합니다. 큰 공기 주머니의 생성을 방지하기 위해 천천히 혼합물을 부어.
- 금형을 진공 챔버에 넣고 붓는 동안 형성된 기포를 제거합니다.
- 1시간 동안 100°C에서 금형을 배양하여 PDMS를 치료한다.
- 인큐베이터에서 금형을 검색하고 식히면 식힙니다.
- 경화 PDMS를 포함하는 스페이서에서 바인더 클립과 유리 판을 제거합니다.
- 면도날을 사용하여 스페이서와 유리 판 사이의 금형의 네 면 모두에 생성 된 씰을 잘라냅니다. 네 면이 모두 잘린 후 금형을 떼어 내어 스페이서에 PDMS 시트를 표시합니다.
- 핀셋을 사용하여 스페이서에서 새 PDMS 시트를 조심스럽게 벗깁니다.
- 커팅 매트에 시트에서 17.5mm 직경 PDMS 디스크를 펀치한 다음, 다른 크기의 생검 펀치를 사용하여 5.5mm 직경의 구멍에 고르게 분포된 3개의 펀치를 펀치합니다. 여기서 이러한 3홀 PDMS 디스크는 "삽입"(도1C)이라고합니다.
참고: PDMS로 만든 부균일한 절단 또는 플라즈마 처리를 통한 결함이 있는 결합은 향후 누출될 수 있습니다. - 테이프를 사용하여 먼지 입자를 부드럽게 제거하여 각 인서트를 청소하십시오.
- 인서트를 양면 테이프에 붙이고 테이프를 10cm 페트리 접시뚜껑에 감쌉니다.
- 페트리 접시 뚜껑을 플라즈마 기계에 넣고 35mm 유리 바닥 접시를 놓습니다.
- 300 mTorr에서 1 분 동안 플라즈마 처리를 통해 인서트와 유리의 표면을 활성화합니다. 휴대용 플라즈마 지팡이를 사용할 수 있습니다.
- 핀셋을 사용하여 유리 바닥 접시의 유리 부분에 하나의 인서트(도1D)의접면, 즉 처리된 측면을 빠르게 부착합니다(그림1E). 모든 요리에 대해 반복하십시오.
- 포인터 손가락과 엄지 손가락을 사용하여 유리 바닥 접시를 회전시키면서 균일한 압력을 가합니다. 이렇게 하면 유리 바닥 접시에 인서트가 안정적으로 보호됩니다.
- 유리와 PDMS 사이의 접착력을 강화하기 위해 20분 동안 60°C에서 SID(도1F)를배양한다.
- 1.21 단계 또는 휴대용 지팡이와 동일한 설정을 사용하여 SI에서 두 번째 플라즈마 처리를 수행합니다. 이렇게 하면 무료 PDMS 표면이 코팅 용액의 폴리 L-리신을 부착하게 됩니다(참조 1.26 참조).
- 다음 솔루션을 새로 준비합니다.
- 코팅 용액: 0.01%(vol/vol) 폴리-L-Lysine을 함유하는 1x PBS[예: 0.1%(vol/vol) 폴리-L-리신을 1x PBS의 90μL에 10μL를 추가한다].
- 교차 연결 솔루션: 1x(vol/vol) 글루타랄데히드를 함유한 증류수 [예: 증류수 90μL에 10배 글루타랄데히드 10μL추가].
- 스토리지 솔루션: 10x(vol/vol) 페니실린-연쇄절제술신을 함유한 PBS 1x[예를 들어, 100x 페니실린-스트렙토마이신 1mL의 1mL를 1x PBS의 9mL에 추가].
- 각 구멍당 35 μL의 코팅 용액을 추가하고 실온에서 1 시간 동안 인큐베이션하십시오.
- 폴리 L-리신을 흡인하고 증류수로 SID 전체를 3번 헹구세요.
- 각 구멍 인큐베이트당 35 μL의 교차 연결 용액을 실온에서 30분 간 추가합니다.
- 교차 연결 용액을 흡인하고 증류수로 전체 SID3 시간을 헹구세요.
- 각 SID에 70% 에탄올을 넣고 자외선(UV) 빛 아래에서 30분 동안 배치합니다.
- 후드 아래, 에탄올을 흡입하고 증류수로 SID3 번 헹구세요.
- 각 SID당 2.5mL의 스토리지 솔루션을 추가합니다.
참고: 이 단계에서 는 1주일 동안 4°C로 SI를 저장할 수 있습니다. PDMS와 유리 사이의 결합 강도는 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다. 1주일 이내 사용 전에 잠재적 인 누출에 대한 SI를 테스트하는 것이 좋습니다. 이렇게 하려면 저장 용액을 흡인하고 각 구멍에 1x PBS35 μL을 추가합니다. 사용 후 PDMS 인서트가 유리 바닥 접시에서 벗겨질 수 있습니다. 유리 바닥 접시의 최적의 세척을 달성하기 위해, 이소프로판놀과 염산여러 세척을 PDMS 잔류물을 제거하는 데 사용되어야한다.
2. 스페로이드 형성 및 콜라겐에 포함 (지속 시간 4 일)
참고: 스페로이드의 라이브 이미징의 경우, 세로 또는 시간 경과 비디오에서 세포질 및/또는 핵 형광 단백질을 표현하는 세포주를 사용하십시오. 이러한 세포줄을 사용할 수 있는 경우 이 섹션에 설명된 단계를 따릅니다. 대안적으로, 섹션 3에서, 프로토콜은 세포질 염료를 사용하여 스페로이드에 있는 암세포를 표지하기 위하여 제안됩니다.
- 4T1 및/또는 67NR 세포의 형태 스페로이드는 이전에 설명된 바와 같이4,5,6,7,3,000세포/40 μL 물방울 및 3일 잠복기 시간을 갖는다. 소 아틸로콜라겐 I 솔루션을 마지막으로 추가하고 항상 얼음에 대한 모든 솔루션을 유지합니다.
- 밝은 필드 현미경을 사용하여 올바르게 형성된 스페로이드를 식별합니다.
- 15mL 원문 튜브를 8mL의 사전 따뜻하게 된 완전한 배지로 채웁니다.
- P1000 파이펫으로 스페로이드를 수집하고 15mL 원전 튜브로 옮김합니다. 파이펫 팁의 내부 벽에 스페로이드가 달라붙는 것을 방지하고 스페로이드 손실을 제한하기 위해 완전한 매체를 피펫으로 적시고 파이펫 팁을 적시세요.
- 스페로이드가 튜브 바닥으로 가라앉고 배지를 교환하여 스페로이드를 조심스럽게 씻을 수 있도록 합니다. 두 번 반복합니다.
- 제조 업체의 권장 사항에 따라 5 mg/mL 콜라겐 I 솔루션을 준비 (대체 젤화 절차, 아래 모범 계산 참조). 증류수를 완전한 매체로 대체합니다. 사용할 매체의 부피를 계산할 때, 스페로이드가 완전한 매체의 20 μL에 추가된다는 점을 고려하십시오[예를 들어, 하나의 SID에 대해, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 5 mg / mL 콜라겐의 108 μL이 필요합니다 (점성 유체를 처리 할 때 파이프 팅 손실을 고려하기 위해 20 % 추가 준비); 22 μL + 10x PBS + 1M NaOH + 5μL 의 1.2 μL 1 M NaOH + 5μL 1M NaOH + 5μL 1M NaOH + 54 μL 1M M M
- P200 파이펫을 사용하여 20 μL의 모든 스페로이드를 수집하여 2.6 단계에서 준비된 콜라겐 I 용액에 추가합니다.
- 콜라겐 I 농도의 이질성을 피하기 위해 위아래로 파이프팅하여 용액을 천천히 혼합하여 거품 형성을 제한합니다. 얼음에 용액을 유지합니다.
- SID에서 저장 용액을 제거하고 1x PBS3mL로 3번 세척합니다. 마지막 세척 후, SID를 건조하게 두어 콜라겐 I 용액을 희석시키지 않도록 하십시오.
- 타이머를 시작하고 SID의 세 구멍 중 하나에 하나의 스페로이드를 포함하는 콜라겐 I 용액의 30 μL을 분배합니다. 시각적으로 단일 스페로이드가 30 μL에 포함되어 있는지 확인합니다.
- SID의 모든 3 홀을 채우기 위해 2.10 단계를 두 번 더 반복하십시오.
- 10 μL 파이펫 팁을 사용하여 PDMS 테두리 에 가까운 경우 스페로이드의 중심을 다시 배치합니다. 두 개 또는 세 개의 스페로이드가 구멍 중 하나에 분배되면 동일한 파이펫 팁을 사용하여 스페로이드를 서로 분리할 수 있습니다. 타이머를 중지합니다.
참고: 시드를 거꾸로 거꾸로 거꾸로 하는 경우가 많으며, 콜라겐 I 중합 및 고화 기간 동안, 스페로이드가 ECM 층의 수직 중앙에 위치하고, 2D에서 세포의 침입을 방지합니다. 반전(뒤집기)의 빈도를 최대화해야 합니다. 플립 주파수는 2.10-2.12로 측정된 스페로이드 "디스펜싱 시간"에 의해 제어되기 때문에, 분배 시간을 최소화해야 한다. 우리의 실험실에서, 분배 시간은 평균 2 분입니다. - 콜라겐 층에서 스페로이드를 수직으로 중심으로 SID를 거꾸로 뒤집어 37°C에서 배양하여 분배 시간을 분배합니다.
- SID를 거꾸로 뒤집고 37°C에서 배양하여 분배 시간을 설정합니다.
참고: 스페로이드가 거꾸로 된 방향으로 보내는 시간은 거꾸로 된 방향으로 소요되는 시간과 같아야 합니다. - 콜라겐 I가 중합될 때까지 30분 동안 2.13 및 2.14 단계를 반복합니다.
- 완전한 중간/SID의 2.5mL를 추가하고 필요한 경우 초기 타임포인트에 대한 스페로이드 이미지를 획득합니다.
- 여러 개의 SI를 사용하는 경우 2.10-2.16 단계를 반복합니다.
3. 스페로이드의 형광 라벨링
- 라이브 이미징(6-7일)
참고: 세포질 및/또는 핵 형광 단백질을 발현하는 세포주가 유효한 경우, 섹션 2에 기술된 단계를 따르십시오. 또는, 세포질 라벨링에 대해 다음 프로토콜이 제안된다.- 섹션 2에 설명된 프로토콜의 단계 2.1-2.5를 따릅니다.
- 혈청이 없는 배지의 200 μL에서 세포질 염료를 25 μM로 희석시.
참고: 이 실험에서 적색 세포질 염료를 사용하지만 사용 가능한 다른 색상이 적합해야 합니다. 암세포는 혈청 이없는 배지의 200 μL에서 20 μM로 희석된 핵 염료를 사용하여 스페로이드 내부에 표지되었다(재료표참조). - 마지막 세척 후, 세포질 또는 핵 염료 용액에서 스페로이드를 다시 중단하고 20 분 동안 실온에서 배양하여 빛으로부터 보호합니다.
참고: 이 접근법으로 스페로이드 중심에 있는 셀의 라벨링은 효율적이지 않습니다. 모든 세포의 라벨링을 달성하기 위해, 잠복기는 로커에 접시를 배치하여 하룻밤 연장 할 수 있습니다. 대안은 토론에 설명되어 있습니다. - 스페로이드를 완전한 매체로 3번 씻으세요.
- 섹션 2에 설명된 프로토콜의 2.6-2.17 단계로 진행한다.
- 24-72h(그림 2)또는 경도 영상을 통해 매일, 최대 7일 동안 시간 경과 이미징을 통한 이미지 스페로이드(그림3). 레이저 스캐닝 공초점 현미경, 10배 공기 목표(0.4 숫자 조리개 및 3.1mm 작동 거리), 1024 x 1024 픽셀, 노출 시간 8 μs/픽셀, 핀홀 90 μm, 6 x 15 μm z-steps 및 3개의 시야를 사용하여 각각 하나의 스퍼로이드를 함유하고 있습니다.
참고: 시간 경과 이미징의 경우 최소한의 레이저 전원을 사용하고 현미경에 온도, 습도 및 가스 제어가 있는 환경 챔버를 장착하십시오. 임베디드 스페로이드는 현미경의 시간을 최소화하기 위해 이미징 전에 37°C에서 > 8h 또는 하룻밤 사이에 배양한다.
- 스페로이드의 면역 불면 염색 (기간 2 일)
참고: 여기에 설명된 절차는 이전에 게시된 프로토콜8,9에서조정되고 최적화됩니다. 이 메서드는 섹션 2 및 3.1에 설명된 프로토콜 이후에 사용할 수 있습니다.- 다음 솔루션을 새로 준비합니다.
- 고정 솔루션: 4% PFA(vol/vol)를 함유한 1x PBS[예: 16%(vol/vol) PFA 5mL를 1x PBS15mL에 추가합니다.
- 고정 및 퍼메아빌리징 솔루션: 4% PFA(vol/vol) 및 0.5% 트리톤 X-100(vol/vol)을 포함하는 1x PBS[예: 트리톤 X-100 ~ 10mL 고정 용액의 50 μL 추가].
- 차단 솔루션: 1% FBS(vol/vol) 및 1% BSA(wt/vol)를 함유하는 1x PBS[예를 들어, 1x PBS의 10mL에 100 mg의 BSA를 용인한 다음 FBS 100 μL]를 추가합니다.
- 세척 용액: 0.05% Tween 20 (vol/vol)을 함유하는 1x PBS [예를 들어, 1x PBS의 20 ~50mL 의 25 μL을 추가하십시오].
- SID에서 배양 배지를 제거하고 따뜻한 1x PBS로 한 번 씻으시다.
- SID 당 2mL의 고정 및 충류 용액을 추가하고 실온에서 5 분 동안 배양하십시오.
- 고정 및 충류 용액을 제거하고 SID 당 2mL의 고정 솔루션을 추가하고 실온에서 20 분 동안 배양하십시오.
- 세탁 용액으로 3 번 씻으시면 씻습니다.
- SID 당 블로킹 용액 2mL을 추가하고 4 °C에서 가벼운 흔들림으로 24 시간 동안 배양하십시오.
참고: 이 단계에서는 주말 동안 샘플이 4°C에서 배양될 수 있습니다. 더 긴 차단 시간이 면역 형광 라벨링 절차를 방해 할 수 있습니다. - 차단 용액에 1 차적인 항체를 희석하십시오.
- 48웰 플레이트에 1차 항체/웰블로 150 μL의 블로킹 용액을 추가합니다.
- 미세 핀셋을 사용 하 여, 조심스럽게 스페로이드를 포함 하는 콜라겐의 플러그를 분리 하 고 우물로 전송. 여러 스페로이드가 레이블이 지정되면 반복합니다. 오염을 방지하기 위해 다른 항체로 작업 할 때 핀셋에 남아있을 수있는 액체를 닦아.
- 가벼운 흔들림으로 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오.
- 300 μL의 세척 용액을 넣고 비어 있고 전체 우물에 넣습니다.
- 스페로이드를 함유한 콜라겐의 플러그를 "워시"로 잘 옮기는 것을 주의 깊게 전달합니다.
- 실온과 가벼운 흔들림으로 2시간 동안 세탁용으로 3회 세척합니다.
참고: 스페로이드를 함유한 콜라겐 1의 플러그를 전달하면 용액을 흡입하는 대신 시료 손실 및 시료 손상을 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. - 이차 항체, 4',6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI) 및/또는 블로킹 용액의 판로이드를 희석시.
- 이차 항체, DAPI 및/또는 phalloidin을 잘 하여 150 μL의 블로킹 용액을 추가합니다.
- 핀셋을 사용하여 스페로이드가 들어 있는 콜라겐 플러그를 조심스럽게 우물로 옮킨다. 여러 스페로이드가 레이블이 지정되면 반복합니다.
- 실온에서 1시간 동안 가벼운 흔들림으로 배양합니다.
- 3.2.11 및 3.2.12 단계를 반복합니다.
- 온화한 흔들림으로 실온에서 30 분 동안 세척 용액으로 3 번 씻으시면 하십시오.
- 면도날을 사용하여 3홀 PDMS 인서트를 세 부분으로 잘라 각 부품에 구멍이 들어 있도록 합니다.
- 현미경 슬라이드에 PDMS 의 두 조각을 배치합니다.
- 끝이 잘려낸 P200 팁을 사용하여 장착 용액 한방울을 추가합니다. 거품 형성을 방지합니다.
- 각 구멍에 꽂는 콜라겐을 조심스럽게 옮기십시오.
참고: 스페로이드가 콜라겐 플러그의 상단에 위치한 경우, 콜라겐 플러그를 뒤집어 서스페로이드가 유리 커버슬립에 더 가깝게 됩니다. - 상단에 커버슬립을 놓고 테이프를 사용하여 밀봉합니다.
- 샘플이 빛으로부터 보호된 10분 동안 실온에서 건조시키십시오.
- 빛으로부터 이미징까지 보호되는 샘플을 4°C에서 저장합니다.
- 다음 솔루션을 새로 준비합니다.
4. 시간이 지남에 따라 암 침범을 분석하는 이미지 처리
참고: 이 매크로에 필요한 형식은 .tiff 파일로 저장된 단일 채널 x y,t 이미지입니다.
- 여러 z슬라이스(예: x, y,z,t 이미지)를 획득한 경우 피지에서 이미지를 열고 이미지를 | 스택 | Z 프로젝트. 최대 강도 옵션을 사용하는 것이 좋습니다. 또는 단일 z 슬라이스를 사용하여 매크로를 실행할 수 있습니다. 이미지를 .tiff 파일로 저장합니다.
- 바탕 화면에 별도의 "처리" 폴더를 만듭니다.
- 파일 | 선택 | 저장 이미지 시퀀스. TIFF 형식을 사용하고, 프레임 수에 따라 숫자 번호를 업데이트하고, 상자에서 슬라이스 레이블을 파일 이름으로 사용하고 확인을선택합니다. 2단계에서 만든 "처리" 폴더를 선택합니다.
- "처리" 폴더에서 하나의 이미지를 엽니다. 단일 타임포인트에 해당하는 x,y 이미지여야 합니다.
- 이미지 | 선택 조정 | 자동 임계값. 드롭다운 메뉴에서 메서드를 선택하고 검은색 배경의 흰색 개체에 대해 확인합니다.
- 각 자동화된 임계값 설정 방법에 대한 결과를 보여주는 몽타주 이미지가 나타납니다.
- 레니엔트로피와같은 최고의 자동화된 임계값 을 식별합니다.
- 자동화된 임계값 설정 방법에 대한 선택을 확인하려면 "처리" 폴더에서 다른 이미지를 열고 이미지 | 사용하여 선택한 임계값 을 테스트합니다. 조정 | 자동 임계값.
- 모든 이미지를 닫습니다.
- 스페로이드에어로타임매크로(보조 파일 2)를다운로드하십시오.
- 드래그 앤 드롭으로 피지 매크로를 엽니다.
- 58호선에서는 필요에 따라 자동화된 임계값 을 업데이트합니다.
- 선 62에서 셀 치수에 따라 크기 범위를 업데이트합니다.
- 실행 을선택합니다.
- "처리" 폴더를 선택하고 "처리"를 부모 폴더로 입력한 다음 확인을 선택합니다.
- 실행이 끝나면 테이블 "요약"을 저장합니다. 첫 번째 열은 이미지의 이름을 나타냅니다. 세 번째 열은 스페로이드 영역을 나타냅니다. 여섯 번째, 일곱 번째 및 8개의 열은 스페로이드에 장착된 타원에 대한 매개변수를 지정합니다.
- 이제 "처리" 폴더에는 확장 _SpheroidArea 있는 각 시간 지점에 대한 처리된 이미지가 포함되어 있습니다.
참고: 스페로이드 중심이 어둡으면 선택 도구를 사용하여 모든 타임포인트에 흰색으로 채운 다음 3단계로 진행합니다. 마찬가지로, 스페로이드 주변의 공간은 이미지를 "청소"하기 위해 검은색으로 채워질 수 있습니다. 이미지가 깨끗한 경우 실행 속도를 높이기 위해 61줄을 주석합니다.
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Representative Results
생체 적합성으로 인해 PDMS는 마이크로 패턴 및 미세 유체 장치에 혁명을 일으킨 유정, 우표 및 금형을 제한하는 미세 제조에 널리 사용됩니다. 여기에 설명된 방법에서, 스페로이드 임베딩 및 이미징 절차를 최적화하는 맞춤형 웰인 SID를 만드는 데 사용됩니다. 도 1은 SI의 제조에 사용되는 주요 구성 요소를 보여 줍니다. PDMS 금형을 캐스팅하기 위해 1mm 두께의 스페이서가 3D인쇄(도 1A,B)가두 유리 판 사이에 배치되어 큰 클립으로 밀봉됩니다. 플레이트 사이의 공간에서 PDMS를 붓고 굽는 것은 1mm 두께의 PDMS 시트를 형성합니다. SID 회로도(도1C)는최적의 장치의 치수를 나타내지만, 생검 펀치를 이용한 구멍의 수동 펀칭으로 인해 구멍 거리에서 약간의 변화가 발생한다(도1D). 그림 1D, F는 PDMS 인서치 내에서 균일하게 간격이 있는 구멍이 있는 깨끗한 원형 컷을 나타냅니다.
SID를 사용하면 효율적인 포함을 용이하게 하고, 따라서 시간경과(도 2,비디오 1)또는세로(도 3)영상을 사용하여 콜라겐 I 내부암세포의 침입을 기록한다. 콜라겐 I 중합 화 동안 모든 SI에 대해 동일한 반전 주파수를 사용했음에도 불구하고 콜라겐 플러그 내부의 스페로이드 위치는 약간 다릅니다. 따라서 장거리(>1 mm)로 목표를 사용하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면, 콜라겐 플러그의 상단에 가까운 스페로이드에 대한 초점 과 이미징어려울 수 있습니다. 대조적으로, 콜라겐 플러그의 바닥에 가까이 위치한 스페로이드는 콜라겐 I 매트릭스로 침입하는 대신 유리 표면으로 이동하고 유리로 이동하는 세포를 갖게 됩니다. 이러한 스페로이드의 비디오를 폐기해야합니다. 콜라겐 플러그의 두께는 약 800 μm이며, SID의 각 구멍에 분배된 부피에 의해 제어되고 이 프로토콜에 스페로이드가 전시하는 침수 거리로 조정된다. 콜라겐 플러그의 두께는 SID의 각 구멍에 콜라겐 I의 더 낮은 부피를 분배하여 낮출 수 있으며, 더 작거나 덜 침습적인 스페로이드를 사용할 때.
피지 매크로를 사용 하 여 침략의 적절 한 분석을 위해, 그것은 제대로 이미징 세션의 과정을 통해 표시 하는 암 세포에 대 한 중요 하다. 4.17 단계에서 언급했듯이, 이미지 처리 단계는 라벨링이 최적이 아닌 경우 이미지 보정을 허용합니다. 우리는 세포질 및/또는 핵 형광 단백질의 안정적 발현을 요구하는 6 일동안세로 화상 진찰을 예시하는 동안, 유사한 세로 화상 진찰은 염료로 라벨링을 사용하여 짧은 시간 동안 수행될 수 있었습니다.
라이브 이미징에 이어 상피 카데린(E-cadherin), 코타틴 및 F-actin(도4)에대한 면역 라벨링 절차에서 몇 가지 결과를 제시합니다. 이러한 예에서는 4T1 및 67NR 세포주를 사용했습니다. 도 5는 시간이 지남에 따라 피지 매크로를 사용하여 이미지 처리 절차의 단계별 그림을 보여줍니다.
그림 1: SI의 제작. (A)스페이서의 최상위 뷰 회로도 표현. (B)3D 프린팅 스페이서. (C)SID의 최고 보기 회로도 표현. 3홀 PDMS 인서트(D)는 유리 바닥 접시(E)에 묶여 최종SID(F)를 생성한다. 치수는 밀리미터입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 스페로이드의 라이브 이미징. 비디오 1에서 20h 및 40 시간 포인트, 4T1 스페로이드의 최대 프로젝션. 4T1 세포는 세포질염을 사용하여 표지되었다. 스케일 바, 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 스페로이드의 세로 이미징. 매일 이미지된 혼합 4T1/67NR 스페로이드의 대표적인 현미경(최대 투영). 4T1 및 67NR 세포는 각각 세포질 mScarlet 및 녹색 형광 단백질 (GFP)을 안정적으로 표현합니다. 스케일 바, 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 스페로이드의 면역 형광 화상 진찰. 콜라겐 I. E-cadherin (시안, A), 코락틴 (노란색, B) 및 F 액틴 (마젠타, A 및 B)에 포함 된 후 2 일 고정 된 4T1 스페로이드의 대표적인 현미경 (최대 투영)이 표지되었다. 스케일 바, 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 이미지 처리 분석. 피지매크로(A)를이용하여 이미지 처리 절차의 단계별 일러스트레이션을 통해 시간이 지남에 따라 스페로이드의 면적을 측정한다(B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: 46시간 10분마다 10분마다 촬영된 4T1 스페로이드의 대표적인 비디오는 세포질염을 사용하여 표지하였다. 스케일 바, 100 μm. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 1 : 스페이서 (STL 파일)의 3D 모델. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 파일 2: 스페로이드AreaTime 매크로. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
3D 프린팅 스페이서는 실험 응용 프로그램에서 요구하는 대로 PDMS의 다양한 모양을 쉽게 만드는 데 사용할 수 있는 1mm 두께의 PDMS 시트를 생성하도록 설계되었습니다. 제작의 단순성과 디자인을 변경할 수 있는 자유로 인해 이 PDMS 주조 방법은 SID의 초기 설계를 위해 선택되었습니다. 대량의 SI가 필요한 경우 이미 세 개의 간격 구멍이 있는 PDMS 디스크가 포함된 3D 프렌팅 금형을 만들고 공정을 한 단계로 줄임으로써 생산효율을 높일 수 있습니다. 이렇게 하면 후속 세 개의 구멍과 함께 각 디스크를 펀치아웃하고 전체 준비 시간이 줄어듭니다.
3홀 펀치는 35mm 유리 바닥 접시와 함께 사용할 수 있도록 개발되었지만, 다른 크기로 더 많은 구멍을 뚫을 수 있으므로 더 많은 스페로이드를 병렬로 이미지화할 수 있습니다. 또한, 맞춤형 크기의 커버 글래스도 시판되어 있으며, 3D 프린팅 홀더와 함께 높은 처리량 스페로이드 어필을 허용할 수 있습니다. 이러한 접근 방식을 통해 제한 요소는 데이터 수집 속도(예: 다색 시간 경과 공초점 이미징에서 단일 스페로이드의 3D 스택을 획득하는 데 약 2.5분이 필요합니다. 따라서 SID에서 3개의 스페로이드에 대해 3D 스택을 획득하려면 약 8분이 필요합니다. 그 결과, 스택당 10분에서 선호하는 이미징 빈도를 유지하기 위해 SI의 구멍 수를 늘릴 수 없습니다.
3D 스페로이드 모델에서 살아있는 암세포의 침입을 기록하고 정량화하기 위해, 밝은 필드 이미징을 사용할 수 있다5. 그러나, 형광 현미경 검사는 이미지 처리에서 향상된 대비, 및 용이성 및 정밀도를 제공하기 때문에 바람직하다. 세포질 및/또는 핵 형광 단백질을 발현하는 세포주의 생성이 불가능한 경우, 우리는 세포질 염료의 사용을 제안합니다. 세포 내부의 세포질 염료의 보존 시간은 우리의 화상 진찰 조건에서 3 일이기 때문에, 세포는 매달려 있는 투하에 있는 3 일 기간 후에, 그리고 임베드 의 직전에 표지되어야 합니다. 세포 의 라벨링 포스트 포함은 특별히 콜라겐에 라벨을 부착하고 세포 라벨링을 줄일 수 있습니다. 3일 이상 화상 진찰은 형광 단백질(들)을 안정적으로 발현하는 다른 스페로이드 파종프로토콜(10) 또는 세포주를 사용해야 한다.
우리는 성공적으로 형성하고 60에서 5,000 세포 / 드롭어디서나 포함하는 스페로이드를 이미지. 작은 스페로이드는 전체 침략 영역이 쉽게 더 높은 배율 (20x-30x) 목표의 단일 필드 보기에 들어갈 수 있기 때문에, 며칠 동안 침략을 기록하는 데 이상적입니다. 또한 세포질 이나 핵 염료로 쉽게 표시 할 수 있습니다. 마지막으로, 산란이 감소하여 스페로이드내의 각 셀을 시각화하고 분할할 수 있다. 그러나, 작은 스페로이드는 육안으로 거의 볼 수 있으며 조직 마커와 추가 라벨이 필요할 수 있습니다. 대조적으로, 더 큰 스페로이드는 취급하기 쉽지만, 그들의 무게 때문에 접시의 바닥에 가라앉기 위하여 더 쉽습니다. 더욱이, 스페로이드 센터의 세포는 염료를 사용할 때 항상 표지되지 않으며, 약 100 마이크로미터의 침투 깊이를 가지는 공초점 현미경 을 사용하여 볼 수 있습니다. 시간 경과 영상을 사용하여 대형 스페로이드 전체에 모든 암세포를 시각화하기 위해 다광체 현미경 검사를 사용하여 라벨링 없이 제2 고조파 생성(SHG)에 의한 콜라겐 섬유 시각화의 추가적인 이점을 제공합니다. 또한, 이미징은 광시트 현미경검사법 8,11,12로수행하여 이미지 획득 시간을 단축하여 고처리량 스페로이드 분석법을 허용하지만 더 많은 데이터 저장 및 고급 이미지 처리를 요구합니다. 시간 경과 비디오가 필요하지 않은 경우 고정 된 3D 스페로이드에 대한 라벨링 절차가 광학 클리어링8,10과더 결합 될 수 있습니다. 또한, 임베디드 스페로이드의 극저온 절제는 표지 동안 염료 또는 항체의 침투와 관련된 문제뿐만 아니라 이미징 중 빛의 침투에 대한 문제를 제거할 수 있습니다. 그러나 우리의 손에는 길고 깨지기 쉬운 침습적 가닥을 보존하는 기술적 어려움으로 인해 성공적인 극저온 절제는 침략과 비침습적 세포의 초기 단계로 제한되었습니다.
우리의 프로토콜은 또한 핵 염료의 사용과 호환되며, 스페로이드 내부에 암세포를 라벨링하여 시간 경과 데이터의 단일 세포 추적을 가능하게합니다. 피지 플러그인 TrackMate13 셀 추적을 자동화 하 고 단일 세포의 운동 성 매개 변수를 추출 하는 데 사용할 수 있습니다., 속도 등, 순간 속도 및 지속성.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
우리는 귀중한 토론을 위해 템플 생명 공학의 회원들에게 감사드립니다. 우리는 3D 프린팅에 도움을 위해 아이디어 허브 (공학 대학, 템플 대학)에서 세포 분류와 토니 Boehm에 대한 그의 도움에 대한 흐름 세포 측정 코어 (루이스 카츠 의과 대학)에서 데이비드 암브로스 감사합니다. 우리는 또한 우리의 자금 자원에 감사: 미국 암 학회 연구 학자 보조금 134415-RSG-20-034-01-CSM, 지금 암 정복 / 젊은 조사자 상, 건강의 국립 연구소, R00 CA172360 및 R01 CA230777, 모두 BG에.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
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