Summary
Presenteras här är ett protokoll för tillverkning av en sfäroid imaging enhet. Denna enhet möjliggör dynamisk eller longitudinell fluorescensavbildning av cancercellssfäroider. Protokollet erbjuder också en enkel bildbehandlingsprocedur för analys av cancercellsinvasion.
Abstract
Invasionen av cancerceller från den primära tumören i de intilliggande friska vävnaderna är ett tidigt steg i metastasering. Invasiva cancerceller utgör en stor klinisk utmaning eftersom det inte finns någon effektiv metod för att eliminera dem när deras spridning är igång. En bättre förståelse för mekanismerna som reglerar cancercellsinvasion kan leda till utveckling av nya potenta terapier. På grund av deras fysiologiska likhet med tumörer har sfäroider inbäddade i kollagen jag i stor utsträckning använts av forskare för att studera mekanismerna för cancercellsinvasion i den extracellulära matrisen (ECM). Denna analys begränsas dock av (1) bristande kontroll över inbäddningen av sfäroider i ECM. (2) Höga kostnader för kollagen I- och glasbottenfat, 3) otillförlitlig immunofluorescerande märkning på grund av ineffektiv penetration av antikroppar och fluorescerande färgämnen och (4) tidskrävande bildbehandling och kvantifiering av uppgifterna. För att hantera dessa utmaningar optimerade vi det tredimensionella (3D) sfäroidprotokollet för att avbilda fluorescerande märkta cancerceller inbäddade i kollagen I, antingen med hjälp av timelapse-videor eller longitudinell avbildning och analysera cancercellsinvasion. Först beskriver vi tillverkningen av en sfäroid imaging enhet (SID) för att bädda in sfäroider tillförlitligt och i en minimal kollagen I volym, minska analys kostnaden. Därefter avgränsar vi stegen för robust fluorescensmärkning av levande och fasta sfäroider. Slutligen erbjuder vi ett lättanmätt Fiji-makro för bildbehandling och datak kvantifiering. Sammantaget ger denna enkla metodik en pålitlig och prisvärd plattform för att övervaka cancercellsinvasion i kollagen I. Dessutom kan detta protokoll enkelt ändras för att passa användarnas behov.
Introduction
Under cancerprogression kan cancerceller förvärva en motil och invasiv fenotyp, vilket gör det möjligt för dem att undkomma tumörmassan och invadera in i de omgivandevävnaderna 1. Så småningom kan dessa invasiva cancerceller nå och växa inuti sekundära organ, en process som kallas cancermetastas1. Metastasering orsakar mer än 90% av cancerrelaterade dödsfall2. En anledning till detta är att även om lokaliserade tumörer är kliniskt hanterbara, finns det inga effektiva metoder för eliminering av invasiva cancerceller när metastaserad spridning har inträffat. Därför utgör uppkomsten av invasiva cancerceller och övergången från en lokaliserad till en invasiv sjukdom en stor klinisk utmaning. Att bestämma hur cancerceller initierar och upprätthåller ett invasivt beteende kan leda till utveckling av nya potenta terapier.
3D-sfäroidmodellen är en idealisk plattform för att undersöka cancercellernas motila beteende under kontrollerade, men fysiologiskt relevanta förhållanden3. I denna analys är sfäroider av cancerceller inbäddade i extracellulär matris (ECM), till exempel kollagen I, som efterliknar en förenklad tumör. Sedan används avbildning för att visualisera invasionen av cancerceller från sfäroiden till kollagenmatrisen. Flera utmaningar begränsar dock denna procedur.
Den första utmaningen uppstår vid inbäddningssteget, där den flytande kollagenmatrisen kan sprida sig över skålytan, vilket gör att sfäroiden vidrör botten av skålen. Följaktligen spreds celler från sfäroiden på den tvådimensionella (2D) ytan och bröt den tredimensionella (3D) sfäroidmorfologin. Att öka volymen av kollagen är en effektiv men kostsam lösning. För att förhindra att celler sprids på 2D-ytan, samtidigt som vi upprätthåller en minimal volym kollagen, utvecklade vi en sfäroid avbildningsenhet (SID) genom att begränsa en 1 mm tjock, 3-håls polydimethylsiloxane (PDMS) insats på en glasbottenform.
Den andra utmaningen med den sfäroida analysen är märkningen av cancerceller i sfäroider, vilket begränsas av dålig penetration av antikroppar och fluorescerande färgämnen, en effekt som ökar med sfäroidstorleken. Medan den idealiska lösningen för märkning av celler är upprättandet av cellinjer som stabilt uttrycker fluorescerande protein(er), är detta alternativ mestadels begränsat till odödliga cellinjer och begränsas av tillgången på fluorescerande protein chimeras. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för immunofluorescensfärgning av fasta sfäroider, samt effektiv användning av ett cytoplasmiskt färgämne för att märka celler omedelbart innan sfäroiden bäddas in.
Den tredje utmaningen med sfäroidanalysen är bristen på enkla Fiji-makron för halvautomatisk kvantifiering av cellinvasion över tid. För att möta denna utmaning beskriver vi en enkel metodik för att analysera sfäroidområdet över tid. Vi illustrerar fördelarna med detta protokoll med hjälp av 4T1 och 67NR cellinjer som exempel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tillverkning av en Spheroid Imaging Device (SID) för att optimera sfäroid inbäddning (varaktighet 1 dag)
- Skapa distansen med en 3D-skrivare (bild 1A, B och kompletterande fil 1).
- Väg in ett 10:1 (wt/wt) förhållande mellan baspolymer:tvärlänk i en plastkopp [t.ex. 20 g etylbensbaspolymer och 2 g silikonhartskorslänker för att skapa polydietylsiloxan (PDMS)].
- Blanda PDMS-lösningen noggrant i plastkoppen med en engångspipett.
- Placera plastkoppen i en vakuumkammare för att ta bort luftbubblorna från blandningen. Släpp snabbt vakuumtrycket för att avlägsna den lilla mängd luft som fastnat på blandningens yta och skingra de återstående luftbubblorna.
- Inkubera den 3D-utskrivna distansen vid 100 °C i 5 minuter för att öka dess flexibilitet.
- Rengör de två glasplattorna som kommer att användas för att konstruera PDMS-formen noggrant genom att torka av dem med 100% isopropanol. Om glasplattorna tidigare användes för att gjuta PDMS, var noga med att ta bort eventuella återstående gamla PDMS genom att försiktigt skrapa glasplattorna med ett rakblad och torka dem med 100% isopropanol.
- Konstruera formen genom att placera den 3D-utskrivna distansen spolning mellan de två rena glasplattorna.
- Försegla formen med stora bindemedelsklämmor på glasplattorna. Placera två bindemedelsklämmor på nederkanten och ett i det övre hörnet.
- Inspektera den övre delen av formen för att säkerställa att distansen är i linje med glasplattorna. Detta garanterar att inga deformationer kommer att finnas och att ett jämnt blad med PDMS kommer att skapas.
OBS: Om det resulterande arket inte är av enhetlig tjocklek måste klämmorna justeras något. - Skär spetsen på en engångspipett (~ 2 cm från spetsen) och tillsätt PDMS-blandningen med långsam och konstant hastighet till det övre vänstra hörnet av formen. Häll blandningen långsamt för att förhindra skapandet av stora luftfickor.
- Placera formen i en vakuumkammare för att ta bort luftbubblor som bildas under hällen.
- Härda PDMS genom att inkubera formen vid 100 °C i 1 timme.
- Hämta formen från inkubatorn och låt den svalna för att röra.
- Ta bort bindemedelsklämmorna och glasplattorna från distansen som innehåller det härdade PDMS.
- Använd ett rakblad för att skära igenom tätningen som skapades på alla fyra sidor av formen mellan distansen och glasplattan. Med alla fyra sidorna inskurna, börja dra isär formen för att avslöja PDMS-arket i distansen.
- Skala försiktigt av det nya PDMS-arket från distansen med pincett.
- På en skärmatta, stansa ut PDMS-skivor med 17,5 mm diameter från arket och stansa sedan tre jämnt fördelade hål med diametern 5,5 mm med hjälp av biopsislag i olika storlekar. Här kallas dessa 3-håls PDMS-diskar för "skär" (Figur 1C).
OBS: Ickeuniforma skärsår som görs i PDMS, eller en felaktig bindning via plasmabehandling, kan leda till framtida läckor. - Rengör varje skär genom att försiktigt ta bort dammpartiklar med tejp.
- Fäst inläggen på en bit dubbelsidig tejp och linda tejpen runt locket på en 10 cm Petri-skål.
- Placera locket på Petri-skålen i plasmamaskinen, tillsammans med de öppna 35 mm glasbottenfaten.
- Aktivera ytan på skären och glaset via plasmabehandling i 1 min vid 300 mTorr. En handhållen plasmastav kan användas.
- Använd pincett, fäst snabbt uppsidan,dvs. Upprepa för alla rätter.
- Använd pekarfingret och tummen för att applicera ett jämnt tryck medan du roterar glasets bottenform. Detta säkerställer en stabil fastsättning av insatsen i glasbottenformen.
- Inkubera SIDs(figur 1F)vid 60 °C i 20 minuter för att stärka vidhäftningen mellan glas och PDMS.
- Utför en andra omgång plasmabehandling på SIM-korten med samma inställningar som i steg 1.21 eller med den handhållna trollstaven. Detta kommer att göra den fria PDMS-ytan fäst vid poly-L-lysinet i beläggningslösningen (se 1.26).
- Förbered följande lösningar på nytt.
- Beläggningslösning: 1x PBS innehållande 0,01% (vol/vol) poly-L-Lysin [t.ex. tillsätt 10 μL 0,1% (vol/vol) poly-L-Lysin till 90 μL 1x PBS].
- Korslänkningslösning: Destillerat vatten som innehåller 1x (vol/vol) glutaraldehyd [t.ex. tillsätt 10 μL 10x glutaraldehyd till 90 μL destillerat vatten].
- Förvaringslösning: 1x PBS innehållande 10x (vol/vol) Penicillin-Streptomycin [t.ex. tillsätt 1 ml 100x Penicillin-Streptomycin till 9 ml 1x PBS].
- Tillsätt 35 μL beläggningslösning per hål och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Aspirera poly-L-Lysin och skölj hela SID 3 gånger med destillerat vatten.
- Tillsätt 35 μL tvärlänkningslösning per hål inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur.
- Aspirera korslänkningslösningen och skölj hela SID 3 gånger med destillerat vatten.
- Tillsätt 70% etanol i varje SID och placera under ultraviolett (UV) ljus i 30 min.
- Under huven, aspirera etanol och skölj SID 3 gånger med destillerat vatten.
- Tillsätt 2,5 ml lagringslösning per sid.
OBS: I detta skede kan SIDs förvaras vid 4 °C i en vecka. Det observerades att bindningsstyrkan mellan PDMS och glas minskar med tiden. Efter en vecka rekommenderas användare att testa SIM-korten för potentiellt läckage före användning. För att göra det, aspirera lagringslösningen och tillsätt 35 μL 1x PBS i varje hål. Efter användning kan PDMS-skär skalas av från glasbottenfaten. För att uppnå optimal rengöring av glasbottenfaten bör flera tvättar med isopropanol och saltsyra användas för att avlägsna PDMS-rester.
2. Sfäroidbildning och inbäddning i kollagen (Varaktighet 4 dagar)
OBS: För levande avbildning av sfäroider, längsgående eller i timelapse-videor, använd en cellinje som uttrycker ett cytoplasmiskt och/eller nukleärt fluorescerande protein. Om en sådan cellinje är tillgänglig följer du stegen som beskrivs i det här avsnittet. Alternativt föreslås i avsnitt 3 ett protokoll för att märka cancerceller i sfäroider med hjälp av ett cytoplasmiskt färgämne.
- Bilda sfäroider av 4T1- och/eller 67NR-celler med hjälp av hängande droppteknik, somtidigare beskrivits 4,5,6,7, med 3 000 celler/40 μL droppe och en 3-dagars inkubationstid. Tillsätt bovin atelocollagen I-lösningen sist och behåll alla lösningar på is, hela tiden.
- Identifiera de korrekt formade sfäroiderna med hjälp av ett ljust fältmikroskop.
- Fyll ett koniskt rör på 15 ml med 8 ml förvärmt komplett medium.
- Samla sfäroider med en P1000-pipett och överför till det koniska röret på 15 ml. Blöt pipettspetsen genom att pipettera något komplett medium in och ut för att förhindra att sfäroider fastnar på pipettspetsens innerväggar och begränsar sfäroidförlusten.
- Låt sfäroider sjunka till botten av röret och tvätta noggrant sfäroiderna genom att byta medium. Upprepa två gånger.
- Förbered en 5 mg/ml kollagen I-lösning enligt tillverkarens rekommendationer (alternativt geleringsförfarande, se föredömlig beräkning nedan). Ersätt det destillerade vattnet med komplett medium. Vid beräkning av den volym medium som ska användas, ta hänsyn till att sfäroider kommer att tillsättas i 20 μL av fullständigt medium [t.ex. för ett SID, 3 x 30 + (3 x 30) x 20 % = 108 μL 5 mg/ml kollagen I behövs (förbered 20 % extra för att ta hänsyn till rörförlust vid hantering av trögflytande vätskor).22 μL komplett medium + 10,8 μL 10x PBS + 1,2 μL 1 M NaOH + 54 μL 10 mg/ml kollagen I lager].
- Samla alla sfäroider i 20 μL medium, med en P200-pipett, och tillsätt dem till kollagen I-lösningen som bereds i steg 2.6.
- Blanda lösningen långsamt genom att pipetting upp och ner för att undvika heterogenitet i kollagen I koncentrationen, begränsa bubbelbildning. Håll lösningen på is.
- Ta bort lagringslösningen från SID/erna och tvätta 3 gånger med 3 ml 1x PBS. Efter den slutliga tvätten, lämna SID/erna torra så att kollagenet I-lösningen inte späds ut.
- Starta en timer och dela ut 30 μL av kollagen I-lösningen som innehåller en sfäroid i ett av sidens tre hål. Se visuellt till att en enda sfäroid finns i 30 μL.
- Upprepa steg 2.10 två gånger till för att fylla alla 3 hålen i ett SID.
- Använd en 10 μL pipettspets för att centrera sfäroiden igen om den är placerad nära PDMS-gränsen. Om två eller tre sfäroider hamnar i ett av hålen kan samma pipettspets användas för att separera sfäroiderna från varandra. Stoppa timern.
OBS: Ofta invertering av SID upp och ner och upp och upp, under hela perioden av kollagen I polymerisation och stelning, säkerställer att sfäroiden är placerad i den vertikala mitten av ECM-skiktet och förhindrar invasion av celler i 2D. Frekvensen av invertering (vändning) bör maximeras. Eftersom vändfrekvensen styrs av den sfäroida "dispenseringstiden" mätt i 2.10-2.12, bör dispenseringstiden minimeras. I vårt labb är dispenseringstiden i genomsnitt 2 min. - För att vertikalt centrera sfäroiden i kollagenskiktet, vänd SID upp och ner och inkubera vid 37 °C för dispenseringstid.
- Vänd SID upp och upp och inkubera vid 37 °C för dispenseringstid.
OBS: Den tid som sfäroiderna tillbringar i upp och ner-orienteringen bör vara lika med den tid som tillbringas i upp och upp-orienteringen. - Upprepa steg 2.13 och 2.14 i 30 min, tills kollagenet jag polymeriserar.
- Lägg till 2,5 ml komplett medium/SID och vid behov skaffa en bild av sfäroiderna för den ursprungliga tidspunkten.
- Upprepa steg 2.10-2.16 om flera SIM-kort används.
3. Fluorescensmärkning av sfäroider
- Live imaging (Varaktighet 6-7 dagar)
OBS: Om en cellinje som uttrycker ett cytoplasmiskt och/eller nukleärt fluorescerande protein finns tillgänglig, följ de steg som beskrivs i avsnitt 2. Alternativt, för cytoplasmic märkning, föreslås följande protokoll.- Följ steg 2.1-2.5 i protokollet som beskrivs i avsnitt 2.
- Späd cytoplasmafärgen till 25 μM i 200 μL serumfritt medium.
OBS: Medan ett rött cytoplasmiskt färgämne används i detta experiment, bör alla andra tillgängliga färger vara lämpliga. Cancerceller märktes inuti sfäroider med hjälp av nukleära färgämnen utspädda till 20 μM 200 μL serumfritt medium (se Materialförteckning ). - Efter den slutliga tvätten, återanvända sfäroider i cytoplasmic eller nukleära färgämne lösning och inkubera vid rumstemperatur i 20 min, skyddad mot ljus.
OBS: Med den här metoden kommer märkningen av cellerna i sfäroidcentret inte att vara effektiv. För att uppnå märkning av alla celler kan inkubationen förlängas över natten genom att placera skålen på en vipp. Alternativ beskrivs i Diskussion. - Tvätta sfäroider 3 gånger i komplett medium.
- Fortsätt till steg 2.6-2.17 i protokollet som beskrivs i avsnitt 2.
- Bildsfäroider via timelapse-avbildning var 10:e minut i 24–72 timmar (figur 2), eller via longitudinell avbildning, dagligen, i upp till 7 dagar (figur 3). Använd ett konfokalt laserskanningsmikroskop, 10x luftmål (0,4 numerisk bländare och 3,1 mm arbetsavstånd), 1024 x 1024 pixlar, exponeringstid 8 μs/pixel, pinhole 90 μm, 6 x 15 μm z-steg och 3 synfält som var och en innehåller en sfäroid.
OBS: För timelapse-avbildning, använd minimal laserkraft och utrusta mikroskopet med en miljökammare med temperatur, luftfuktighet och gaskontroll. Odla de inbäddade sfäroiderna vid 37 °C i > 8 timmar eller över natten före avbildning för att minimera tiden på mikroskopet.
- Immunofluorescens färgning av sfäroider (Varaktighet 2 dagar)
OBS: Proceduren som beskrivs här är anpassad och optimerad från tidigare publicerade protokoll8,9. Den här metoden kan användas efter det protokoll som beskrivs i avsnitten 2 och 3.1.- Förbered följande lösningar på nytt.
- Fästlösning: 1x PBS som innehåller 4% PFA (vol/vol) [t.ex. tillsätt 5 ml 16% (vol/vol) PFA till 15 mL 1x PBS].
- Fixerings- och permeabiliserande lösning: 1x PBS innehållande 4% PFA (vol/vol) och 0,5% Triton X-100 (vol/vol) [t.ex. tillsätt 50 μL Triton X-100 till 10 ml fästlösning].
- Blockeringslösning: 1x PBS som innehåller 1% FBS (vol/vol) och 1% BSA (wt/vol) [t.ex. lös 100 mg BSA i 10 ml 1x PBS och tillsätt sedan 100 μL FBS].
- Tvättlösning: 1x PBS innehållande 0,05% interpolering 20 (vol/vol) [t.ex. tillsätt 25 μL tween 20 till 50 ml 1x PBS].
- Ta bort odlingsmediet från SID/erna och tvätta en gång med varm 1x PBS.
- Tillsätt 2 ml fixerings- och permeabiliserande lösning per SID och inkubera vid rumstemperatur i 5 minuter.
- Ta bort fixerings- och permeabiliseringslösningen och tillsätt 2 ml fästlösning per SID och inkubera vid rumstemperatur i 20 min.
- Tvätta 3 gånger med tvättlösningen.
- Tillsätt 2 ml blockeringslösning per SID och inkubera vid 4 °C i 24 timmar med mild skakning.
OBS: I detta steg kan prover inkuberas vid 4 °C under helgen. Observera att en längre blockeringstid kan störa immunfluorescensmärkningsproceduren. - Späd primära antikroppar i blockeringslösningen.
- Tillsätt 150 μL blockeringslösning med primära antikroppar/brunn i en 48-brunnsplatta.
- Använd fina pincett, lossa försiktigt kontakten med kollagen som jag innehåller en sfäroid och överför till en brunn. Upprepa om flera sfäroider är märkta. Torka av eventuell vätska som kan finnas kvar på pincetten när du arbetar med olika antikroppar för att förhindra kontaminering.
- Inkubera över natten vid 4 °C med mild skakning.
- Tillsätt 300 μL tvättlösning till tomma och fulla brunnar.
- Överför försiktigt kontakten med kollagen jag innehåller en sfäroid till en "tvätta" brunn.
- Tvätta 3 gånger med tvättlösning i 2 timmar, vid rumstemperatur och med mild skakning.
OBS: Överföring av kontakterna av kollagen I som innehåller en sfäroid, istället för att aspirera lösningarna, kan bidra till att minska provförlust och provskador. - Späd sekundära antikroppar, 4',6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) och/eller fallooidin i blockerande lösning.
- Tillsätt 150 μL blockeringslösning med sekundära antikroppar, DAPI och/eller falloidin per brunn.
- Använd pincett, överför försiktigt kollagenpluggen som innehåller sfäroiderna i brunnen. Upprepa om flera sfäroider är märkta.
- Inkubera vid rumstemperatur i 1 timme med mild skakning.
- Upprepa steg 3.2.11 och 3.2.12.
- Tvätta 3 gånger med tvättlösning i 30 min, vid rumstemperatur med mild skakning.
- Skär ett 3-håls PDMS-skär i tre delar med hjälp av ett rakblad så att varje del innehåller ett hål.
- Placera två bitar PDMS på en mikroskopbild.
- Tillsätt en droppe monteringslösning med en P200-spets med änden avskuren. Förhindra bubbelbildning.
- Överför försiktigt ett kollagen som jag ansluter till varje hål.
OBS: Om sfäroiden var placerad högst upp på kollagenpluggen, vänd in kollagenpluggen så att sfäroiden hamnar närmare glaslocket. - Placera ett täckskydd ovanpå och försegla med tejp.
- Låt provet torka i rumstemperatur i 10 minuter, skyddat mot ljus.
- Förvara provexemplar vid 4 °C, skyddade mot ljus fram till avbildning.
- Förbered följande lösningar på nytt.
4. Bildbehandling för att analysera cancerinvasion över tid
Det format som krävs för det här makrot är en x,y,t-bild med en kanal som sparas som en .tiff fil.
- Om flera z-segment har förvärvats (dvs. x,y,z,t-bilden) öppnar du bilden i Fiji och väljer Bild | Staplar | Z-projektet. Vi rekommenderar att du använder alternativet Maxintensitet. Alternativt kan ett enda z-segment användas för att köra makrot. Spara bilden som en .tiff fil.
- Skapa en separat "Bearbetningsmapp" på skrivbordet.
- Välj | Spara som | Bildsekvens. Använd TIFF-formatet, uppdatera siffernumret enligt antalet bildrutor, markera kryssrutan om du vill använda segmentetiketten som filnamn och välj Ok. Välj mappen "Bearbetning" som skapats i steg 2.
- Öppna en bild från mappen "Bearbeta". Det ska vara en x,y-bild som motsvarar en enda tidspunkt.
- Välj Bild | Justera | Automatiskt tröskelvärde. Markera metoden Prova alla på den nedrullningsbara menyn och markera rutan för vita objekt på svart bakgrund.
- En montagebild visas som visar resultatet för varje automatiserad tröskelmetod.
- Identifiera den bästa automatiserade tröskelmetoden, till exempel RenyIEntropy.
- Om du vill bekräfta valet för den automatiska tröskelvärdesmetoden öppnar du alla andra bilder från mappen "Bearbetning" och testar den valda tröskelvärdesmetoden med | Justera | Automatiskt tröskelvärde.
- Stäng alla bilder.
- Ladda ner makrot SpheroidAreaTime (Kompletterande fil 2).
- Öppna Fiji-makrot genom att dra och släppa.
- I rad 58 uppdaterar du den automatiska tröskelmetoden efter behov.
- I rad 62 uppdaterar du storleksområdet enligt celldimensionerna.
- Välj Kör.
- Välj mappen "Bearbeta" och skriv in "Bearbetning" som överordnad mapp och välj sedan Ok.
- När körningen är över sparar du tabellen "Sammanfattning". Den första kolumnen anger bildens namn. Den tredje kolumnen anger sfäroidområdet. Den sjätte, sjunde och åtta kolumnen anger parametrarna för en ellips monterad på sfäroiden.
- Mappen "Bearbetning" innehåller nu en bearbetad bild för varje tidpunkt, med tillägget _SpheroidArea.
OBS: Om sfäroidcentret är svagt fyller du det med vitt med markeringsverktygen, för alla tidspunkter, och fortsätter sedan till steg 3. På samma sätt kan utrymmet runt sfäroiden fyllas med svart för att "rengöra" bilden. Om bilden är ren kommenterar du rad 61 för att påskynda körningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
På grund av sin biokompatibilitet används PDMS ofta för mikrotillverkning av begränsande brunnar, frimärken och mögel, vilket revolutionerade mikropapper och mikrofluidiska enheter. I metoden som beskrivs här används den för att skapa SIM-kort, anpassningsbara brunnar som optimerar sfäroid inbäddning och avbildningsprocedur. Figur 1 illustrerar de viktigaste komponenterna som används vid tillverkning av SIM-kort. För att gjuta PDMS-formen är en 1 mm tjock distans 3D-utskriven (Figur 1A,B), placerad mellan de två glasplattorna, förseglade med stora klämmor. Hällning och bakning av PDMS i utrymmet mellan plattorna bildar ett 1 mm tjockt ark PDMS. SID-schemat(figur 1C)anger dimensionerna på den optimala anordningen, men en liten variation uppstår i hålavstånden på grund av manuell stansning av hål med hjälp av biopsistanser (figur 1D). Bild 1D, F indikerar rena cirkulära snitt med jämnt fördeliga hål i PDMS-insatsen.
Att använda SIDs underlättar effektiv inbäddning, och därmed inspelning av invasionen av cancerceller inuti kollagen I med tidsfördröjning(figur 2, video 1)eller longitudinell (figur 3) avbildning. Trots att man använder samma inversionsfrekvenser för alla SIDs under kollagen I-polymerisationen, kommer sfäroidpositionerna inuti kollagenpluggen att variera något. Därför är det viktigt att använda ett mål med långt arbetsavstånd (>1 mm). Annars kan det vara svårt att fokusera och avbilda för sfäroider placerade nära toppen av kollagenpluggen. Däremot kommer sfäroider placerade nära botten av kollagenpluggen att ha celler som rör sig till glasytan och migrerar på glaset, istället för att invadera in i kollagen I-matrisen. Videor av sådana sfäroider måste kasseras. Tjockleken på kollagenpluggen, här cirka 800 μm, styrs av volymen som dispenseras i varje hål i SID och justeras till invasionsavstånd som sfäroider uppvisar i detta protokoll. Tjockleken på kollagenpluggen kan sänkas genom att dispensera en lägre volym kollagen I i varje hål i SID, när du använder mindre eller mindre invasiva sfäroider.
För korrekt analys av invasionen med fijimakroet är det viktigt att cancercellerna är korrekt märkta under avbildningssessionen. Som anges i steg 4.17. tillåter bildbehandlingssteget bildkorrigering om märkningen är suboptimal. Medan vi illustrerar longitudinell avbildning under loppet av 6 dagar (figur 3), som kräver ett stabilt uttryck av cytoplasmiskt och/eller nukleärt fluorescerande protein, kan liknande longitudinell avbildning utföras under en kortare tid med märkning med färgämnen.
Efter live imaging presenterar vi några resultat från immunolabeling förfarandet för epitelial cadherin (E-cadherin), cortactin och F-aktin (Figur 4). I dessa exempel använde vi 4T1 och 67NR cellinjer. Figur 5 visar steg-för-steg-illustration av bildbehandlingsproceduren med fijimakroet för att mäta sfäroidens område över tid.
Figur 1: Tillverkning av KI-kort. (A) Top view schematisk representation av distansen. B)3D-utskriven distans. C)Överst i sid-sidans schematiska representation. En 3-håls PDMS-insats(D)är bunden till en glasbottenform (E), vilket skapar den slutliga SID (F). Måtten är i millimeter. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2: Levande avbildning av sfäroider. Representativa 20 h och 40 h tidspunkter från video 1, maximal projektion av en 4T1 sfäroid. 4T1 celler var märkta med hjälp av ett cytoplasmic färgämne. Skalbar, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Longitudinell avbildning av sfäroider. Representativa mikrografer (maximal projektion) av en blandad 4T1/67NR sfäroid avbildas dagligen. 4T1- och 67NR-celler uttrycker stabilt cytoplasmic mScarlet respektive grönt fluorescerande protein (GFP). Skalbar, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunofluorescensavbildning av sfäroider. Representativa mikrografer (maximal projektion) av en 4T1 sfäroid som fastställts 2 dagar efter inbäddning i kollagen I. E-cadherin (cyan, A), cortactin (gul, B) och F-aktin (magenta, A och B) var märkta. Skalbar, 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Analys av bildbehandling. Steg-för-steg-illustration av bildbehandlingsproceduren med fijimakroet(A)för att mäta sfäroidens område över tid (B). Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Video 1: Representativ video av en 4T1 sfäroid avbildas varje 10 min i 46 h och 10 min. 4T1 celler var märkta med hjälp av ett cytoplasmic färgämne. Skala bar, 100 μm. Klicka här för att ladda ner den här videon.
Kompletterande fil 1: 3D-modell av distansen (STL-fil). Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: SpheroidAreaTime makro. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den 3D-utskrivna distansen utformades för att skapa 1 mm tjocka ark PDMS som sedan kan användas för att enkelt skapa olika former av PDMS, vilket krävs av de experimentella applikationerna. På grund av enkelheten i dess tillverkning och friheten att ändra designen valdes denna metod för PDMS-gjutning för SID: s ursprungliga design. Om det krävs en hög volym AV SIM-kort kan produktionen effektiviseras genom att skapa en 3D-utskriven form, som redan innehåller PDMS-diskar med tre lika fördelade hål, och minska processen till ett steg. Detta skulle eliminera behovet av att stansa ut varje skiva, tillsammans med de efterföljande tre hålen, och minska den totala förberedelsetiden.
Medan 3-håls stansen är utvecklad för användning med 35 mm glasbottenfat, finns andra storlekar tillgängliga som möjliggör fler hål och därmed fler sfäroider att avbildas parallellt. Dessutom är specialtillverkat täckglas också kommersiellt tillgängligt, vilket i kombination med 3D-tryckta hållare kan möjliggöra sfäroidanalyser med hög genomströmning. Med ett sådant tillvägagångssätt är begränsande faktor hastigheten på dataförvärv- till exempel i vår flerfärgade tidsfördröjning konfokal avbildning, att förvärva 3D-stack av en enda sfäroid kräver cirka 2,5 minuter. Därför kräver det cirka 8 minuter att förvärva 3D-staplar för 3 sfäroider i SID. Som ett resultat, för att upprätthålla vår föredragna frekvens av avbildning vid 10 minuter per stapel, kan vi inte öka antalet hål i SIM-korten.
För att registrera och kvantifiera invasionen av levande cancerceller i 3D-sfäroidmodellen kan ljusfältsavbildning användas5. Fluorescensmikroskopi föredras dock, eftersom det ger ökad kontrast och lätthet och precision i bildbehandlingen. Om genereringen av en cellinje som uttrycker ett cytoplasmiskt och/eller nukleärt fluorescerande protein inte är möjlig, föreslår vi användning av cytoplasmiska färgämnen. Eftersom retentionstiden för cytoplasmafärgämnen inuti celler är tre dagar i våra avbildningsförhållanden, bör cellerna märkas efter 3-dagarsperioden i hängande droppe och omedelbart före inbäddningen. Märkning av celler efter inbäddning kan inte specifikt märka kollagenet och minska cellmärkningen. Avbildning längre än 3 dagar efter inbäddning kräver användning av ett annat sfäroidt såddprotokoll10 eller cellinjer som stabilt uttrycker fluorescerande proteiner.
Vi har framgångsrikt bildat och avbildat sfäroider som innehåller allt från 60 till 5 000 celler/droppe. Små sfäroider är idealiska för inspelning av invasion under flera dagar, eftersom hela deras invasionsområde lätt kan passa in i ett enda synfält för högre förstoringsmål (20x-30x). Dessutom kan de enkelt märkas hela tiden med cytoplasmiska eller nukleära färgämnen. Slutligen, på grund av den minskade spridningen, kan varje cell i sfäroiden visualiseras och segmenteras. Små sfäroider är dock knappt synliga med nakna ögon och kan kräva ytterligare märkning med vävnadsmarkörer. Däremot är större sfäroider lättare att hantera, men mer mottagliga för att sjunka till botten av skålen, på grund av deras vikt. Dessutom är celler i sfäroidcentret inte alltid märkta när de använder färgämnen, eller synliga med konfokal mikroskopi, som har penetrationsdjup på cirka 100 mikrometer. För att visualisera alla cancerceller i de stora sfäroiderna med hjälp av timelapse-avbildning kan multifotonmikroskopi användas, vilket ger en extra fördel med visualisering av kollagenfibrer av andra harmoniska generationen (SHG) utan behov av märkning. Avbildning kan också göras med ljusplåtsmikroskopi8,11,12, vilket ger minskad bildförvärvstid och därmed möjliggör sfäroidanalyser med hög genomströmning, men kräver också mer datalagring och avancerad bildbehandling. Om timelapse-videor inte krävs kan vårt märkningsförfarande för fasta 3D-sfäroider kombineras ytterligare med optisk clearing8,10. Dessutom kan kryosectioning av de inbäddade sfäroiderna eliminera problem med penetration av färgämne eller antikroppar under märkning, liksom penetration av ljus under avbildning. I våra händer begränsades dock framgångsrika cryosectioning till tidiga stadier av invasion och icke-invasiva celler, på grund av de tekniska utmaningarna i bevarandet av långa och bräckliga invasiva strängar.
Vårt protokoll är också kompatibelt med användning av nukleära färgämnen, för att märka cancerceller inuti sfäroiderna, vilket möjliggör enkelcellig spårning av timelapsdata. Fiji plugin TrackMate13 kan användas för att automatisera cellspårning och extrahera motilitetsparametrar för enstaka celler, såsom hastighet, omedelbar hastighet och uthållighet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Temple Bioengineering för värdefulla diskussioner. Vi tackar David Ambrose vid flödescytometrikärnan (Lewis Katz School of Medicine) för hans hjälp med cellsortering och Tony Boehm från IDEAS Hub (College of Engineering, Temple University) för hjälp med 3D-utskriften. Vi tackar också våra finansieringsresurser: American Cancer Society Research Scholar Grant 134415-RSG-20-034-01-CSM, Conquer Cancer Now / Young Investigator Award, National Institutes of Health, R00 CA172360 och R01 CA230777, alla till BG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 N NaOH | Honeywell Fluka | 60-014-44 | |
| 10X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | SH30028.LS | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) | Alfa Aesar | 43368-9M | |
| 1X Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 20012027 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
| 48-well plate | Falcon | T1048 | |
| Alexa Fluor 647 phalloidin | Life Technologies | A20006 | |
| Anti cortactin antibody | Abcam | ab33333 | 1 to 200 dilution |
| Anti E-cadherin antibody | Invitrogen | 13-1900 | 1 to 100 dilution |
| Bovine atelocollagen I solution (Nutragen) | Advanced Biomatrix | 501050ML | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A4503-50G | |
| CellTracker Red CMTPX Dye | Invitrogen | C34552 | |
| Conical tubes | Falcon | 352095 | |
| Coverslips | FisherBrand | 12-548-5E | |
| Disposable container | Staples | Plastic cups | |
| Disposable transfer pipette | Thermo Scientific | 202 | |
| DMEM | Fisher Scientific | 11965118 | |
| Double-faced tape | Scotch | ||
| Ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bio-Techne | S11550 | |
| Fluoromount-G | eBioscience | 00-4958-02 | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882-100mL | |
| Hoescht nuclear stain | Thermo Fischer | 62249 | |
| Isopropanol | Thermo Fischer | S25371A | |
| MatTek dish (glass bottom dish) | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Methyl cellulose | Sigma Aldrich | M6385-100G | |
| MilliQ water | |||
| Penicilin/streptomycin solution | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Petri dish | Corning | 353003 | |
| Pipet tips | Fisherbrand | 02-707 | |
| Pipets | Gilson | F167300 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Primary antibodies, user specific | |||
| Rat Tail Collagen I | Corning | 47747-218 | |
| Razor Blade | Personna | 74-0001 | |
| Secondary antibodies, user specific | |||
| Slides | Globe Scientific | 1354W-72 | |
| Sylgard 184 Silicone | Dow Corning | 4019862 | |
| Tape | Scotch | ||
| Triton X100 | Sigma Aldrich | 10789704001 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | 655204-100ML |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Noone, A., et al. SEER Cancer statistics review 1975-2015, based on November 2017 SEER data submission. , (2019).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Foty, R. A Simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiment. , e2720 (2011).
- Berens, E. B., Holy, J. M., Riegel, A. T., Wellstein, A. A cancer cell spheroid assay to assess invasion in a 3D setting. Journal of Visualized Experiments. 2015, (2015).
- Tönisen, F., et al. EP4 receptor promotes invadopodia and invasion in human breast cancer. European Journal of Cell Biology. 96, 218-226 (2017).
- Bayarmagnai, B., et al. Invadopodia-mediated ECM degradation is enhanced in the G1 phase of the cell cycle. Journal of Cell Sciences. 132, 227116 (2019).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14, 1756-1771 (2019).
- Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294, 1708-1712 (2001).
- Boutin, M. E., et al. A high-throughput imaging and nuclear segmentation analysis protocol for cleared 3D culture models. Science Reports. 8, 11135 (2018).
- Pampaloni, F., Richa, R., Ansari, N., Stelzer, E. H. K. Live spheroid formation recorded with light sheet-based fluorescence microscopy. Methods in Molecular Biology. 1251, 43-57 (2015).
- Marcello, M., Richards, R., Mason, D., Sée, V. Live imaging of cell invasion using a multicellular spheroid model and light-sheet microscopy. Advances in Experimental Medicine and. Dmitriev, R. I. , Springer International Publishing. 155-161 (2017).
- Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
