Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

تمايز الخلايا السليفة العصبية الناجمة عن الحقل الكهربائي في الأجهزة الدقيقة

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61917
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

Summary

في هذه الدراسة، نقدم بروتوكولا لتمايز الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة فقط عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC) في نظام ميكروفلويديك.

Abstract

تلعب المجالات الكهربائية الفسيولوجية (EF) أدوارا حيوية في هجرة الخلايا والتمايز والانقسام والموت. تصف هذه الورقة نظام زراعة الخلايا الدقيقة الذي تم استخدامه لدراسة تمايز الخلايا على المدى الطويل باستخدام المجهر. يتكون النظام microfluidic من المكونات الرئيسية التالية: رقاقة كهربائية شفافة بصريا ، وسخان شفاف لأكسيد القصدير (ITO) ، ومضخة تعبئة وسائط الثقافة ، وإمدادات الطاقة الكهربائية ، ومكبر صوت عالي التردد ، ومضاعف EF ، ومرحلة آلية قابلة للبرمجة X-Y-Z ، ومجهر مقلوب على النقيض من الطور مجهز بكاميرا رقمية. النظام microfluidic مفيد في تبسيط الإعداد التجريبي العام ، وبالتالي ، فإن استهلاك الكاشف والعينة. يتضمن هذا العمل التمييز بين الخلايا الجذعية العصبية والخلايا السلف (NPCs) الناجمة عن التحفيز المباشر لنبض التيار (DC). في المتوسط صيانة الخلايا الجذعية، وNPCs الماوس (mNPCs) تفرقت في الخلايا العصبية، والخلايا الفلكية، وoligodendrocytes بعد التحفيز نبض العاصمة. وتشير النتائج إلى أن العلاج البسيط لنبض DC يمكن أن يتحكم في مصير ال MNPCs ويمكن استخدامه لتطوير استراتيجيات علاجية لاضطرابات الجهاز العصبي. يمكن استخدام النظام زراعة الخلايا في قنوات متعددة، لتحفيز EF على المدى الطويل، للمراقبة المورفولوجية الخلية، والحصول التلقائي على صورة الفاصل الزمني. هذا النظام microfluidic ليس فقط يقصر الوقت التجريبي المطلوب، ولكن أيضا يزيد من دقة السيطرة على البيئة الدقيقة.

Introduction

يمكن أن تكون الخلايا السليفة العصبية (NPCs ، المعروفة أيضا باسم الخلايا الجذعية العصبية والذرية) كمرشح واعد للاستراتيجية العلاجية العصبية1. الشخصيات غير المتمايزة لديها قدرة التجديد الذاتي، متعددة الفعالية، والقدرة على الانتشار2،3. وقد ذكرت دراسة سابقة أن المصفوفة خارج الخلية والوسطاء الجزيئية تنظيم التمايز من المجلس الوطني للصحافه. عامل نمو البشرة (EGF) وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) تعزيز انتشار المجلس الوطني للصحافه، وبالتالي الحفاظ على الدولة غير المتمايزة4.

وقد ذكرت الدراسات السابقة أن التحفيز الكهربائي يمكن تنظيم الأنشطة الفسيولوجية الخلية مثل القسم5، الهجرة6،7،8، التمايز1،9،10، وموت الخلية11. تلعب المجالات الكهربائية (EFs) أدوارا حيوية في تطوير وتجديد تطوير الجهاز العصبي المركزي12و13و14. من 2009 إلى 2019، قام هذا المختبر بالتحقيق في الاستجابات الخلوية لتطبيق EF في النظام الدقيق1، 6،7،8،15،16،17. تم تصميم رقاقة متعددة القنوات وشفافة بصريا والكهربائية (MOE) لتكون مناسبة لتلطيخ immunofluorescence للتنظير المجهري الكونف البؤري. كانت الشريحة ذات شفافية بصرية عالية ومتانة جيدة وسمحت بإجراء ثلاث تجارب تحفيز مستقلة في وقت واحد والعديد من الحالات الملطخة بالمناعة في دراسة واحدة. النظام microfluidic مفيد في تبسيط الإعداد التجريبي العام ، وبالتالي ، فإن استهلاك الكاشف والعينة. تصف هذه الورقة تطور نظام زراعة الخلايا الدقيقة التي استخدمت لدراسة تمايز الخلايا على المدى الطويل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تصميم وتصنيع رقاقة MOE

  1. رسم أنماط لطبقات الميثاكريل البولي ميثيل الفردية (PMMA) والشريط على الوجهين باستخدام البرامج المناسبة(الشكل 1A، جدول المواد). قطع كل من أوراق PMMA والشريط على الوجهين مع CO2 آلة الليزر ناسخ (الشكل 1B).
    1. قم بتشغيل جهاز نسخ ليزر CO2 وتوصيله بجهاز كمبيوتر شخصي. افتح ملف النقش المصمم باستخدام البرنامج.
    2. ضع أوراق PMMA (275 مم × 400 مم) أو الشريط على الوجهين (210 مم × 297 مم) على منصة كاتب الليزر(الشكل 2A). ركز الليزر على سطح أوراق PMMA أو الشريط على الوجهين باستخدام أداة التركيز التلقائي.
    3. حدد كاتب الليزر كطابعة، ثم "طباعة" النمط باستخدام كاتب الليزر لبدء الاستئصال المباشر على ورقة PMMA أو الشريط على الوجهين والحصول على أنماط فردية على ورقة PMMA أو الشريط(الشكل 2B).
  2. إزالة الفيلم واقية من أوراق PMMA، وتنظيف السطح باستخدام غاز النيتروجين.
    ملاحظة: الرسم نمط PMMA والآلات المباشرة من ورقة PMMA تم تنفيذها وفقا لتقرير سابق17.
  3. للترابط معا طبقات متعددة من أوراق PMMA، كومة ثلاث قطع من أوراق PMMA 1 ملم (طبقات 1 و 2 و 3)، والسندات لهم تحت ضغط من 5 كجم / سم2 في عبودية الحرارية لمدة 30 دقيقة في 110 درجة مئوية لتشكيل تدفق / الكهربائية تنشيط قناة التجميع (الشكل 2C).
    ملاحظة: دفعات مختلفة من ورقة PMMA التي تم الحصول عليها تجاريا لها درجة حرارة انتقال الزجاج مختلفة قليلا (TG). درجة الحرارة الترابط الأمثل يحتاج إلى اختبار في 5 درجة مئوية زيادات قريبة من TG.
  4. الالتزام 12 قطعة من محولات لفتحات الفردية في طبقة 1 من التجمع رقاقة وزارة التربية والتعليم مع الغراء سيانواكريلات سريع المفعول.
    ملاحظة: يتم إجراء محولات من PMMA عن طريق حقن صب. الأسطح المسطحة في الأسفل هي للاتصال بشريحة MOE. محولات تحمل 1/4W-28 الخيط المسمار الإناث هي لربط المقابس البيضاء إصبع ضيق، موصلات أسفل شقة، أو محولات لوير. كن حذرا عند استخدام الغراء سيانواكريلات سريع المفعول. تجنب الرش في العينين.
  5. تطهير ركائز PMMA 1 مم (طبقات 1-3)، الشريط على الوجهين (طبقة 4)، و3 مم درجة بصرية PMMA (طبقة 5) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) لمدة 30 دقيقة قبل تجميع رقاقة (الشكل 1A).
  6. الالتزام ركائز PMMA 1 ملم (طبقات 1-3) على 3 مم درجة بصرية PMMA (طبقة 5) مع الشريط على الوجهين (طبقة 4) لإكمال التجميع PMMA (طبقات 1-5) (الشكل 1A).
  7. إعداد الزجاج غطاء نظيفة للتجميع على رقاقة.
    1. ملء تخفيف عشرة أضعاف من المنظفات في جرة تلطيخ (انظر جدول المواد)،وتنظيف الزجاج الغطاء في هذا المنظفات باستخدام منظف بالموجات فوق الصوتية لمدة 15 دقيقة.
    2. شطف جيدا جرة تلطيخ تحت مياه الصنبور الجارية لإزالة جميع آثار المنظفات.
    3. استمر في الشطف بالماء المقطر لإزالة جميع آثار مياه الصنبور، وكرر الخطوة 1.7.2 مرتين.
    4. جفف زجاج الغطاء النظيف عن طريق نفخه بغاز النيتروجين.
  8. تطهير التجمع PMMA (طبقات 1-5)، الشريط على الوجهين (طبقة 6)، والزجاج الغطاء (طبقة 7) باستخدام الأشعة فوق البنفسجية داخل خزانة السلامة البيولوجية لمدة 30 دقيقة قبل تجميع رقاقة(الشكل 1A).
  9. الالتزام الزجاج غطاء تنظيف (طبقة 7) إلى التجمع PMMA (طبقات 1-5) مع الشريط على الوجهين (طبقة 6) (الشكل 1A).
  10. احتضان رقاقة وزارة التربية والتعليم في غرفة فراغ بين عشية وضحاها; استخدام تجميع رقاقة MOE للإجراءات اللاحقة (الشكل 3).

2. طلاء بولي L-ليسين (PLL) على الركيزة في مناطق ثقافة الخلية

  1. إعداد أنبوب البوليتيترافلوروإيثيلين، موصل شقة القاع، موصل مخروط، محول مخروط لوير، أبيض الاصبع ضيق المكونات (وتسمى أيضا سدادة)، محول لوير، حقنة قفل لوير، والمطاط الأسود بونغ (الشكل 4A، جدول المواد). تعقيم جميع المكونات المذكورة أعلاه في الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  2. ختم فتحات محولات جسر أجار(الشكل 1A)مع المقابس إصبع ضيق أبيض. قم بتوصيل الموصل المسطح السفلي بتجميع شرائح MOE عبر محولات المدخل والمأخذ المتوسطة(الشكل 4B). قم بتوصيل محول مخروط Luer ب stopcocks ثلاثية الاتجاه.
  3. إضافة 2 مل من محلول PLL 0.01٪ باستخدام حقنة 3 مل التي تتصل ب stopcock 3-way من مدخل المتوسطة (الشكل 4B- Equation 1 ).
  4. توصيل حقنة فارغة 3 مل إلى stopcock 3-طريقة من منفذ المتوسطة (الشكل 4B- Equation 2 ).
  5. ملء مناطق ثقافة الخلية مع الحل PLL. ضخ يدويا حل الطلاء ذهابا وإيابا ببطء. أغلق الحطابين الثلاثيين لإغلاق الحل داخل مناطق الثقافة.
  6. احتضان رقاقة MOE عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها في حاضنة مليئة بجو ثاني أكسيد الكربونبنسبة 5٪.

3. إعداد شبكة جسر الملح

  1. بعد الخطوة 2.6، افتح اثنين من stopcocks 3-way وطرد الفقاعات في القنوات عن طريق ضخ يدويا حل الطلاء ذهابا وإيابا في القناة باستخدام الحقنتين.
  2. رسم 3 مل من المتوسطة كاملة (الخلايا الجذعية صيانة المتوسطة تتكون من Dulbecco تعديل النسر المتوسطة / هام خليط المواد الغذائية F-12 (DMEM/F12), 2٪ B-27 الملحق, 20 نانوغرام / مل EGF، و 20 نانوغرام / مل bFGF) في حقنة 3 مل الذي يربط إلى stopcock 3-way من مدخل المتوسطة (الشكل 4B- Equation 1 والشكل 4B- Equation 3 ).
  3. إضافة 3 مل من المتوسطة كاملة لتحل محل حل الطلاء في مناطق ثقافة الخلية. توصيل حقنة فارغة 5 مل إلى stopcock 3-way من منفذ متوسط (الشكل 4B- Equation 4 ).
  4. إعداد شبكة جسر الملح (الشكل 5).
    1. قطع بونغ المطاط الأسود لإنتاج فجوة، وإدراج الفضة (Ag) / كلوريد الفضة (AgCl) الأقطاب الكهربائية من خلال بونغ المطاط الأسود وإلى حقنة قفل لوير(الشكل 4A).
    2. استبدال المكونات إصبع أبيض مع محول لوير، وحقن 3٪ الآغاروز الساخن لملء محول لوير.
      ملاحظة: لإعداد الآغاروز الساخن، حل 3 غرام من مسحوق الآغاروز في 100 مل من المالحة العازلة بالفوسفات (PBS) وتعقيمها في الأوتوكلاف في 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    3. قم بتوصيل حقنة قفل Luer بمحول Luer. حقن 3٪ agarose الساخنة من خلال بونغ المطاط الأسود لملء حقنة قفل لوير باستخدام الحقنة مع إبرة. السماح 10 إلى 20 دقيقة لأغاروز لتهدئة وترسيخ.
      ملاحظة: من أجل زيادة سعة حجم agarose، يتم تركيب حقنة قفل Luer على محول Luer(الشكل 4 والشكل 5). ثم يتم إدخال الأقطاب الكهربائية الكبيرة في حقنة قفل Luer. القطب قادر على توفير التحفيز الكهربائي مستقرة للتجربة على المدى الطويل.

4. إعداد ال MNPCs

  1. ثقافة mNPCs1 في الوسط الكامل في قارورة ثقافة الخلية 25T في 37 درجة مئوية في حاضنة مليئة 5٪ CO2 الغلاف الجوي. زراعة الخلايا الفرعية كل 3-4 أيام، وإجراء جميع التجارب مع الخلايا التي خضعت 3-8 مقاطع من المصدر الأصلي.
  2. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي 15 مل، وتدور أسفل الأعصاب في 100 × غرام لمدة 5 دقائق. يستنشق supernatant ، وغسل الأعصاب مع برنامج تلفزيوني 1x دولبيكو (DPBS). تدور أسفل الأعصاب في 100 × غرام لمدة 5 دقائق.
  3. يستنشق DPBS 1x ومن ثم إعادة إنفاق الأعصاب في الوسط الكامل. تخلط جيدا وبلطف.
  4. إضافة 1 مل من تعليق العصبي باستخدام حقنة 1 مل الذي يربط إلى stopcock 3-طريقة للمنفذ (الشكل 4B- Equation 2 ).

5. إعداد نظام microfluidic لتحفيز نبض العاصمة (الشكل 6)

  1. قم بتثبيت رقاقة MOE ذات البذور الخلوية على سخان ITO الشفاف المثبت على مرحلة قابلة للبرمجة مزودة بمحرك X-Y-Z.
    ملاحظة: يتم التحكم في درجة حرارة سطح ITO بواسطة وحدة تحكم مشتقة متكاملة نسبيا ويتم الاحتفاظ بها عند 37 درجة مئوية. يتم تثبيت مزدوج حراري من نوع K بين الشريحة وسخان ITO لمراقبة درجة حرارة مناطق ثقافة الخلية داخل الشريحة. يتم تثبيت رقاقة MOE على مرحلة قابلة للبرمجة X-Y-Z الآلية ومناسبة للحصول التلقائي على صورة الفاصل الزمني في أقسام القناة الفردية. وقد وصفت تصنيع سخان ITO والإعداد لنظام التدفئة ثقافة الخلية سابقا18،19.
  2. غرس mNPCs عن طريق الضخ اليدوي في رقاقة MOE عبر منفذ متوسط. احتضان رقاقة MOE المصنفة بالخلايا على سخان ITO 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعة.
  3. بعد 4 ساعة، ضخ المتوسطة كاملة من خلال رقاقة MOE عبر مدخل المتوسطة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / ساعة باستخدام مضخة حقنة.
    ملاحظة: نمت والحفاظ على mNPCs في رقاقة إضافية 24 ساعة قبل التحفيز EF للسماح مرفق الخلية والنمو. يتم جمع السائل النفايات في حقنة فارغة 5 مل متصلة stopcock 3-الاتجاه للمنفذ، كما هو موضح في "النفايات" في الشكل 6A. يظهر تكوين نظام MOE microfluidic في الشكل 6. يوفر هذا النظام microfluidic إمدادات مستمرة من التغذية للخلايا. يتم ضخ المتوسطة الطازجة كاملة باستمرار في رقاقة وزارة التربية والتعليم للحفاظ على قيمة درجة الحموضة ثابت. لذلك، يمكن استزراع الخلايا خارج حاضنة CO2.
  4. استخدم الأسلاك الكهربائية لتوصيل جهاز EF متعدد الأجهزة بشريحة MOE عبر أقطاب Ag/AgCl الكهربائية على الشريحة. توصيل متعدد EF ومولد دالة إلى مكبر للصوت لإخراج نبضات DC الموجة المربعة مع حجم 300 mV/mm على تردد 100 هرتز في دورات واجب 50٪ (50٪ وقت على و 50٪ إجازة) (الشكل 6B).
    1. قم بتوصيل الأسلاك الكهربائية بمضاعف EF. توصيل الأسلاك الكهربائية إلى رقاقة MOE عبر أقطاب Ag / AgCl.
    2. قم بتوصيل جهاز EF متعدد الأجهزة بالمكبر باستخدام الأسلاك الكهربائية. قم بتوصيل مولد الوظيفة بالمكبر للصوت والمنظار الذبذب الرقمي.
      ملاحظة: يعد جهاز EF multixer دائرة تتضمن مقاومة غرفة الثقافة في الدائرة وتربط جميع الغرف الفردية في شبكة إلكترونية متوازية. كل غرفة من غرف الثقافة الثلاث متصلة كهربائيا بمقاوم متغير (Vr) ومقياس (يظهر على شكل μA في الشكل 6A)في المضاعف. يختلف التيار الكهربائي من خلال كل غرفة ثقافة من خلال التحكم في الواقع الافتراضي ، ويظهر التيار على مقياس الأمتر المقابل. تم حساب قوة المجال الكهربائي في كل منطقة ثقافة الخلية من قبل قانون أوم، I = σEA، حيث أنا التيار الكهربائي، σ (تعيين 1.38 S·m-1 لDMEM/F1220)هو الموصلية الكهربائية للوسط الثقافة، E هو المجال الكهربائي، و A هي المنطقة المقطعية من الغرفة الكهربائية. بالنسبة لبعد منطقة ثقافة الخلية الموضح في الشكل 1، فإن التيار الكهربائي هو ~ 87 mA و ~ 44 mA لنبض DC و DC عند دورة عمل 50٪ على التوالي.
  5. إخضاع ال MNPCs لنبضات DC مربعة بحجم 300 mV/mm عند تردد 100 هرتز ل 48h. ضخ باستمرار المتوسطة كاملة بمعدل 10 ميكرولتر / ساعة لتوفير التغذية الكافية للخلايا والحفاظ على قيمة درجة الحموضة ثابت في المتوسط.

6. اختبارات immunofluorescence من الشخصيات غير المناهمة بعد التحفيز DC نبضي

ملاحظة: في هذه الخطوة، يتم ضخ جميع الكاشفات عبر مدخل متوسط باستخدام مضخة حقنة.

  1. بعد 3, 7, أو 14 أيام في المختبر (DIV) زراعة بعد البذر1, غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 25 ميكرولتر / دقيقة لمدة 20 دقيقة.
  2. إصلاح الخلايا مع 4٪ بارافورمالديهايد (PFA). ضخ 4٪ PFA في رقاقة بمعدل تدفق 25 ميكرولتر / دقيقة لمدة 20 دقيقة لتحل محل برنامج تلفزيوني 1x. لاستبدال PFA 4٪، اغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 25 ميكرولتر / دقيقة لمدة 20 دقيقة.
  3. ضخ 0.1٪ تريتون X-100 في رقاقة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق ل permeabilize الخلايا. خفض معدل التدفق إلى 50 ميكرولتر / ساعة لمدة 30 دقيقة إضافية للرد مع الخلايا. لاستبدال 0.1٪ تريتون X-100، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق.
  4. منع الخلايا مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 1٪ ألبوم مصل البقر (BSA) للحد من ربط الأجسام المضادة غير محددة. ضخ 1٪ BSA في الشريحة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق. خفض معدل التدفق إلى 100 ميكرولتر / ساعة وضخ لمدة 1 ساعة.
  5. ضخ الأجسام المضادة لاحتواء المناعة المزدوجة في رقاقة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق، واحتضان رقاقة لمدة 18 ساعة في 4 درجة مئوية. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  6. ضخ الأجسام المضادة الثانوية اليكسا فلور المترافقة في رقاقة بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 6 دقائق. خفض معدل التدفق إلى 50 ميكرولتر / ساعة، وضخ الأجسام المضادة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  7. للتلطيخ النووي، قم بضخ Hoechst 33342 في الشريحة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر/دقيقة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني 1x بمعدل تدفق 50 ميكرولتر / دقيقة لمدة 15 دقيقة.
  8. بعد الالتهاز المناعي، لاحظ الخلايا باستخدام مجهر مضان كونفوكال.

7. تحليل الصور ومعالجة البيانات

  1. تحليل الصور الفلورية باستخدام البرمجيات مع المدمج في أدوات القياس (انظر جدول المواد).
  2. قارن النواة الملطخة المضادة للهويشت (العدد الإجمالي للخلايا) في مجموعات التحكم والعلاج، واحسب النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن كل علامة فينوتيبيبيك.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر التكوين التفصيلي لشريحة MOE في الشكل 1. توفر رقاقة microfluidic نهجا مفيدا لتقليل حجم الإعداد التجريبي وحجم العينة وحجم الكاشف. تم تصميم رقاقة MOE لإجراء ثلاث تجارب تحفيز EF مستقلة والعديد من حالات التثبيط المناعي في وقت واحد في دراسة واحدة(الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، فإن رقاقة MOE ، التي تتمتع بشفافية بصرية عالية مناسبة لفحوصات المجهر confocal. تم تصميم رقاقة MOE أيضا للتحقيق في آثار ظروف ثقافة الخلايا المختلفة (على سبيل المثال ، تحفيز EF متعددة ، العديد من الأدوية ، ركيزة طلاء مختلفة ، سلسلة متعددة من الخلايا) في وقت واحد في تجربة واحدة.

وتعرضت المركبات المنافرة للموجات المربعة من نبضات التيار (300 mV/mm بتردد 100 هرتز). تم إجراء تحفيز نبض DC لمدة 48 ساعة. كانت الخلايا المتمايزة ملطخة بالمناعة مع Tuj1 (الفئة الثالثة الخاصة بالخلايا العصبية β-tubulin) ، والبروتين الحمضي الرجفانى الدبقية (GFAP لتحديد الخلايا الفلكية) ، وعلامة oligodendrocyte O4. بعد علاج نبض DC ، أعربت ال MNPCs عن أعداد كبيرة من الخلايا العصبية (خلايا Tuj1+ ) في DIV 7. في DIV 3، كانت الخلايا الفلكية (خلايا GFAP+ ) موجودة عند مستويات أعلى نسبيا في مجموعات التحفيز منها في مجموعة التحكم (CTL). بالمقارنة مع مجموعة CTL، كانت خلايا أوليغوديندريوسيتي (O4+ الخلايا) أعلى بكثير في مجموعة التحفيز في DIV 7 و DIV 14(الشكل 7). تظهر هذه النتائج أن تحفيز نبض DC أدى إلى تمييز ال MNPCs إلى خلايا عصبية وخلايا أستراتية وخلايا أوليغودندروسيت في وقت واحد في وسط صيانة الخلايا الجذعية. وتشير هذه النتائج إلى أن نظام الموائع الدقيقة MOE مناسب لدراسة تمايز الخلايا على المدى الطويل عن طريق المجهر.

Figure 1
الشكل 1: التكوين التفصيلي لشريحة كهربائية شفافة بصريا متعددة القنوات. (A) عرض انفجرت من تجميع رقاقة وزارة التربية والتعليم. تتكون رقاقة MOE من أوراق PMMA (50 مم × 25 مم × 1 مم) وشريط مزدوج الوجه (50 مم × 25 مم × 0.07 مم) ومحولات (10 مم × 10 مم × 6 مم)) ، ورقة PMMA بصري الصف (50 ملم × 75 ملم × 3 ملم) ، شريط على الوجهين (24 ملم × 60 ملم × 0.07 ملم) ، وزجاج غطاء (24 ملم × 60 ملم). هناك ثلاث غرف ثقافة الخلية في رقاقة وزارة التربية والتعليم. رقاقة MOE لديها ثقوب ربط لمدخل المتوسطة / منفذ وجسور الملح أجار. تم استزراع الخلايا في منطقة زراعة الخلايا (العرض 3 مم × الطول 42 مم × الارتفاع 0.07 مم). تم تعديل الشكل 1A من تشانغ وآخرون. (ب) صورة لشريحة MOE التي تضم محولات ، أوراق PMMA ، شريط على الوجهين ، وزجاج تغطية. الاختصارات: MOE = الكهروماتيكاتيك متعدد القنوات الشفاف بصريا؛ PMMA = ميثاكريلات بولي ميثيل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: تم تصنيعوتجميع عمليات رقاقة MOE. (A) تم تصنيع الأنماط المصممة من أوراق PMMA أو الشريط على الوجهين باستخدام micromachining الليزر. (ب)تم قطع أوراق PMMA الفردية بواسطة كاتب ليزرCO2. (ج)تم ربط الطبقات المتعددة من أوراق PMMA النظيفة معا بواسطة رابط حراري. الاختصارات: MOE = الكهروماتيكاتيك متعدد القنوات الشفاف بصريا؛ PMMA = ميثاكريلات بولي ميثيل; CO2 = ثاني أكسيد الكربون. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: صورة لشريحة MOE. وقد تم تعديل هذا الرقم من تشانغوآخرون. اختصار: MOE = متعدد القنوات الكهربائية شفافة بصريا. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: اتصال متوسط وكهربائي لشريحة MOE. (A) صورة لمكونات شبكة التدفق المتوسط وشبكة EF في نظام MOE microfluidic ، بما في ذلك أنبوب PTFE ، موصل مسطح القاع ، موصل مخروط ، محول مخروط لوير ، قابس أبيض ضيق الإصبع ، محول Luer ، حقنة قفل Luer ، bung مطاطي أسود ، وأقطاب Ag / AgCl. (ب) صورة فوتوغرافية لتكوين شبكة التدفق المتوسط. الاختصارات: MOE = الكهروماتيكاتيك متعدد القنوات الشفاف بصريا؛ EF = المجال الكهربائي؛ PTFE = البوليتيترافلوروإيثيلين; Ag = الفضة; AgCl = كلوريد الفضة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5:صورة تظهر رقاقة MOE على المجهر. الاختصارات: MOE = الكهروماتيكاتيك متعدد القنوات الشفاف بصريا؛ Ag = الفضة; AgCl = كلوريد الفضة; ITO = أكسيد القصدير الاندونيوم. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6: التكوين والنظام المستخدم لتحفيز نبض العاصمة. (أ) تكوين النظام بأكمله لتحفيز نبض العاصمة. استخدمت المحاقن المتصلة بشريحة MOE للضخ المتوسط والنفايات efflux. تم توفير نبض DC في الشريحة من خلال إمدادات الطاقة التي أجريت من خلال أقطاب Ag / AgCl. تم تثبيت إعداد الجهاز على المرحلة الآلية X-Y-Z من مجهر مقلوب على النقيض من المراحل مجهز بكاميرا رقمية. (ب) صورة فوتوغرافية تظهر الإعداد على مقاعد البدلاء المختبر. الاختصارات: MOE = الكهروماتيكاتيك متعدد القنوات الشفاف بصريا؛ Ag = الفضة; AgCl = كلوريد الفضة; ITO = أكسيد القصدير الاندونيوم; EF = المجال الكهربائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 7
الشكل 7:تمييز خلايا mNPC في مجموعة التحكم (CTL) وفي مجموعة تحفيز نبض DC في DIV 3 و 7 و 14. النسبة المئوية للخلايا العصبية (خلايا Tuj1+ ) ، والخلايا الفلكية (GFAP + الخلايا) ، وoligodendrocytes (O4 + الخلايا) في (A-C) مجموعة CTL و (D-F) في مجموعة التحفيز (نبض العاصمة). وقد نشرت هذا الرقم من قبل تشانغوآخرون. الاختصارات: CTL: التحكم; DC = التيار المباشر; Tuj1 = فئة الخلايا العصبية الخاصة الثالث β-توبولين; GFAP = بروتين حمضي الرجفان الدبقية; O4 = oligodendrocyte علامة O4. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

أثناء تصنيع رقاقة MOE ، يتم إرفاق المحولات بالطبقة 1 من رقاقة MOE مع غراء سيانواكريلات سريع المفعول. يتم تطبيق الغراء على 4 زوايا من المحولات، ومن ثم يتم تطبيق الضغط بالتساوي على محولات. يجب تجنب كمية زائدة من الغراء لضمان البلمرة كاملة من الغراء. وعلاوة على ذلك، يتم احتضان تجميع رقاقة MOE المكتملة في غرفة فراغ. تساعد هذه الخطوة على إزالة الفقاعات بين طبقة PMMA والشريط على الوجهين وزجاج الغطاء.

ويستند اختيار مادة القطب على حقيقة أن أيونات الكلوريد ، الموجودة بوفرة في الوسط ، هي المنتجات المنحلة بالكهرباء التي تتدفق عبر منطقة ثقافة الخلية. خلال تجربة التحفيز EF، ظلت الحموضة حول الأقطاب الكهربائية ثابتة. تكوين أبسط باستخدام البلاتين (Pt) كمادة القطب الكهربائي يلهز الماء ويولد أيونات الهيدروجين (H+) والأيونات الهيدروكسيد (OH- )في القطب الإيجابي والقطب السلبي ، على التوالي ، مما يؤدي إلى تغييرات درجة الحموضة في منطقة الثقافة. تجنب استخدام أقطاب Pt يتحايل على مشكلة تغيرات الحموضة أثناء تجربة تحفيز EF.

الآغاروز الساخن وأغاروز الخالي من الفقاعات ضروريان أثناء إعداد شبكة جسر الملح. Agarose الساخنة لديها سيولة عالية ويمكن حقنها بسهولة في شبكة جسر الملح. قم بتوصيل حقنة قفل Luer بمحول Luer بعد حقن الآغروز الساخن بنسبة 3٪ في محول Luer. خلال هذه الخطوة، سيتم دفع agarose حتى في حقنة قفل لوير بحيث يمكن تحقيق اتصال شركة خالية من فقاعة من شبكة جسر الملح. فقاعات في جسور الملح تزيد من المقاومة الكهربائية، وبالتالي، لا يمكن الوصول إلى التيار الكهربائي المتوقع. بعد حقن agarose، من المهم الانتظار لgarose لتهدئة وترسيخ في درجة حرارة الغرفة لمدة 10-20 دقيقة لمنع تشكيل الحطام agarose الصلبة في منطقة ثقافة الخلية.

يتم وضع رقاقة MOE على سخان ITO الذي يتم تأمينه على مرحلة قابلة للبرمجة X-Y-Z مزودة بمحرك. تم بناء النظام بأكمله على مجهر مقلوب على النقيض من الطور مجهز بكاميرا رقمية لمراقبة تمايز الخلايا داخل مناطق ثقافة الخلية في الشريحة. من المريح مراقبة مورفولوجيا الخلية والحصول على الصور التلقائية الفاصلة زمنيا في نظام MOE microfluidic خارج الحاضنة. هذا النظام microfluidic ليس فقط يقصر الوقت التجريبي المطلوب، ولكن أيضا يزيد من دقة السيطرة على البيئة الدقيقة.

تنمو خلايا mNPC كب تعليق في الوسائط الثقافية. ومع ذلك ، فإن الشخصيات المناهمة التي تلتزم باللوحة المغلفة ب PLL في رقاقة MOE أمر بالغ الأهمية للتمايز. ويفضل الخلايا العصبية التي شكلتها 30-40 خلايا لبدء التمايز mNPC. فرط نمو ال MNPCs سيضعف بقاء الخلية أثناء عملية التمايز. وعلاوة على ذلك، بعد التحفيز DC نبضي، يمكن أن تتأثر المناعة تلطيخ التجريبية من معدل التدفق. وبالتالي، استخدم عدة معدلات تدفق لخطوات مختلفة لتجنب فصل الخلايا أثناء الغسيل.

في هذه الدراسة ، والحد من هذه التقنية هو أنه لا يمكن إعادة استخدام رقاقة وزارة التربية والتعليم بسبب صعوبة في التنظيف الشامل للرقاقة. ومع ذلك ، يمكن وضع رقاقة MOE تحت مجهر تباين المرحلة أو مجهر confocal المسح مباشرة. يضمن التصميم الضيق للمياه للنظام الدقيق المفلور المبلغ عنه عدم حدوث التبخر المؤقت / المتوسط ، مع الحفاظ على التركيز الدقيق للمخزن المؤقت / المتوسط والخصائص الكهربائية المقابلة. من خلال تقليل أحجام الكاشف ووقت التشغيل المقابل ، يوفر نظام MOE microfluidic نهجا فعالا لدراسة تمايز الخلايا.

وقد أظهرت دراسة سابقة أن EGF وbFGF تعزيز بقاء المجلس الوطني لنواب الشعب الصيني، والتوسع، والصيانة في الدولة غير المتمايزة4. في هذه الدراسة، تسببت نبضات DC في تمييز ال MNPCs في وسيط صيانة الخلايا الجذعية الذي يحتوي على EGF و bFGF. وقد ذكرت الدراسات السابقة أن EF يعزز التمايز من الشخصيات في الخلايا العصبية و / أو الخلايا الفلكية في وسط التمايز دون EGF وbFGF14,21,22. تظهر هذه النتائج أن ال MNPCs تمايزت في الخلايا العصبية والخلايا الفلكية وoligodendrocytes بعد تحفيز نبض العاصمة. كما أنها تشير إلى أن العلاج البسيط لنبض DC يمكن أن يتحكم في مصير الشخصيات غير المتشتة. مع مزيد من التحسين على وقت التحفيز، EF القوة، أو دورة الواجب، يمكن تطبيق نبضات العاصمة للتلاعب التمايز المجلس الوطني للصحافه ويمكن استخدامها لتطوير الاستراتيجيات العلاجية التي تستخدم NPCs لعلاج اضطرابات الجهاز العصبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون البروفيسور تانغ ك. تانغ، معهد العلوم الطبية الحيوية، أكاديميا سينيكا، على مساعدته في توفير الخلايا الجذعية العصبية للفأر والخلايا السلف (mNPCs). كما يشكر المؤلفان البروفيسور تانغ ك. تانغ والسيدة ينغ شان لي على مناقشتيهما القيمة بشأن التمييز بين الشخصيات غير الوطنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) BHT K2R20 Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube Protech Technology Enterprise Co., Ltd CT-15-PL-TW Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe TERUMO DVR-3413 3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5) CHI MEI Corporation ACRYPOLY PMMA Sheet Optical grade PMMA
3-way stopcock NIPRO NCN-3L Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe TERUMO DVR-3410 5 mL oral syringes, without needle
Adaptor Dong Zhong Co., Ltd. Customized PMMA adaptor
Agarose Sigma-Aldrich A9414 Agarose, low gelling temperature
Amplifier A.A. Lab Systems Ltd A-304 High voltage amplifier
AutoCAD software Autodesk Educational Version Drafting
B-27 supplement Gibco 12587-010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech AF-100-18B Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung TERUMO DVR-3413 From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich B4287 Blocking reagent 
Centrifuge HSIANGTAI CV2060 Centrifuge
CO2 laser scriber Laser Tools and Technics Corp.  ILS-II Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector IDEX Health & Science F-120X One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor IDEX Health & Science P-659 Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope Leica Microsystems TCS SP5 Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera OLYMPUS E-330 Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope Tektronix TDS2024 Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape 3M  PET 8018 Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 12400024 DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600010 DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer Asiatic Sky Co., Ltd. Customized Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue 3M  7004T Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector IDEX Health & Science P-206 Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator Agilent Technologies 33120A High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150117 Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) Abcam ab150086 Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
ImageJ software National Institutes of Health 1.48v Analyze the fluorescent images 
Indium–tin–oxide (ITO) glass Merck 300739 For ITO heater
Inverted phase contrast microscope OLYMPUS CKX41 For cell morphology observation
K-type thermocouple Tecpel TPK-02A Temperature thermocouples
Luer adapter IDEX Health & Science P618-01 Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe TERUMO DVR-3413 For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP eBioscience 14-9892 Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody R&D Systems MAB1326 Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS) Basic Life BL2651 Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL) SIGMA P4707 Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H MARIENFELD 107242 https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage Tanlian Inc Customized Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller Toho Electronics TTM-J4-R-AB Temperature controller 
PTFE tube Professional Plastics Inc. Taiwan Branch Outer diameter 1/16 Inches White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1 Abcam ab18207 Neuron marker
Syringe pump New Era Systems Inc NE-1000 NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent FRANKLAB TFD4 Cover glass cleaner
Thermal bonder Kuan-MIN Tech Co. Customized Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner LEO LEO-300S Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. DOV-30 Vacuum drying oven
White fingertight plug IDEX Health & Science P-316 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 170، الحقول الكهربائية، الجذعية العصبية وخلايا السلف، التمايز، ميثاكريلات البولي ميثيل، PMMA، نظام microfluidic
تمايز الخلايا السليفة العصبية الناجمة عن الحقل الكهربائي في الأجهزة الدقيقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. F., Chou, S. E., Cheng, J. … More

Chang, H. F., Chou, S. E., Cheng, J. Y. Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (170), e61917, doi:10.3791/61917 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter