Summary
In dieser Studie stellen wir ein Protokoll zur Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs) vor, das ausschließlich durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) in einem mikrofluidischen System induziert wird.
Abstract
Physiologische elektrische Felder (EF) spielen eine wichtige Rolle bei der Zellmigration, Differenzierung, Teilung und tod. Dieses Papier beschreibt ein mikrofluidisches Zellkultursystem, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie mittels Mikroskopie verwendet wurde. Das mikrofluidische System besteht aus folgenden Hauptkomponenten: einem optisch transparenten elektrotaktischen Chip, einer transparenten Indium-Zinnoxid-Heizung (ITO), einer Kulturmedienfüllpumpe, einer elektrischen Stromversorgung, einem Hochfrequenz-Leistungsverstärker, einem EF-Multiplexer, einer programmierbaren X-Y-Z-Motorbühne und einem invertierten Phasenkontrastmikroskop mit Digitalkamera. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Diese Arbeit beinhaltet die Differenzierung von neuronalen Stamm- und Vorläuferzellen (NPCs), die durch Gleichstrom-Pulsstimulation (DC) induziert werden. Im Stammzellerhaltungsmedium unterschieden sich die Maus-NPCs (mNPCs) nach der DC-Pulsstimulation in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass eine einfache DC-Pulsbehandlung das Schicksal von mNPCs steuern und zur Entwicklung therapeutischer Strategien für Erkrankungen des Nervensystems verwendet werden könnte. Das System kann für die Zellkultur in mehreren Kanälen, für die langfristige EF-Stimulation, für die zellmorphologische Beobachtung und für die automatische Zeitrafferbildaufnahme verwendet werden. Dieses mikrofluidische System verkürzt nicht nur die benötigte Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit der Kontrolle auf der Mikroumgebung.
Introduction
Neurale Vorläuferzellen (NPCs, auch bekannt als neuronale Stamm- und Vorläuferzellen) können ein vielversprechender Kandidat für neurodegenerative therapeutische Strategiesein 1. Die undifferenzierten NPCs haben Selbsterneuerungskapazität, Multipotenz und proliferative Fähigkeit2,3. Eine frühere Studie hat berichtet, dass die extrazelluläre Matrix und molekulare Mediatoren die Differenzierung von NPC regulieren. Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) und der grundlegende Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) fördern die NPC-Proliferation und behalten so den undifferenzierten Zustandbei 4.
Frühere Studien haben berichtet, dass elektrische Stimulation zellphysiologische Aktivitäten wie Abteilung5,Migration6,7,8, Differenzierung1,9,10und Zelltod11regulieren kann. Elektrische Felder (EFs) spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung und Regeneration der Entwicklung des zentralen Nervensystems12,13,14. Von 2009 bis 2019 hat dieses Labor zelluläre Reaktionen auf die Anwendung von EF im mikrofluidischen System1,6,7,8,15,16,17untersucht. Ein mehrkanalig, optisch transparenter, elektrotaktischer (MOE) Chip wurde entwickelt, um für die Immunfluoreszenzfärbung für die konfokale Mikroskopie geeignet zu sein. Der Chip hatte eine hohe optische Transparenz und eine gute Haltbarkeit und ermöglichte die gleichzeitige Durchführung von drei unabhängigen Stimulationsexperimenten und mehreren immunbefleckten Bedingungen in einer einzigen Studie. Das mikrofluidische System ist vorteilhaft bei der Vereinfachung des gesamten Versuchsaufbaus und damit des Reagenz- und Probenverbrauchs. Dieser Beitrag beschreibt die Entwicklung eines mikrofluidischen Zellkultursystems, das für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie verwendet wurde.
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Protocol
1. Design und Herstellung des MOE-Chips
- Zeichnen Sie Muster für einzelne Polymethylmethacrylatschichten (PMMA) und das doppelseitige Band mit entsprechender Software (Abbildung 1A, Materialtabelle). Schneiden Sie sowohl die PMMA-Platten als auch das doppelseitige Band mit einem CO 2-Lasermaschinenschreiber (Abbildung 1B).
- Schalten Sie den CO 2-Laserschreiber ein und schließen Sie ihn an einen PC an. Öffnen Sie die entworfene Musterdatei mit der Software.
- Stellen Sie die PMMA-Platten (275 mm x 400 mm) oder das doppelseitige Klebeband (210 mm x 297 mm) auf die Plattform des Laserschreibers(Abbildung 2A). Richten Sie den Laser mit dem Autofokus-Werkzeug auf die Oberfläche der PMMA-Platten oder das doppelseitige Band.
- Wählen Sie den Laserschreiber als Drucker aus, und "drucken" Sie dann das Muster mit dem Laserschreiber, um die direkte Ablation auf dem PMMA-Blatt oder doppelseitigen Band zu starten und individuelle Muster auf dem PMMA-Blatt oder -Band zu erhalten (Abbildung 2B).
- Entfernen Sie den Schutzfilm von den PMMA-Platten und reinigen Sie die Oberfläche mit Stickstoffgas.
ANMERKUNG: Die Zeichnung des PMMA-Musters und die direkte Bearbeitung des PMMA-Blatts wurden gemäß einem früheren Bericht17durchgeführt. - Zum Verkleben mehrerer Schichten von PMMA-Platten drei Stück von 1 mm PMMA-Platten (Schichten 1, 2 und 3) stapeln und unter einem Druck von 5 kg/cm2 in einem thermischen Bonder für 30 min bei 110 °C verkleben, um die Strömungs-/elektrische Stimulationskanalbaugruppe zu bilden (Abbildung 2C).
HINWEIS: Verschiedene Chargen von kommerziell erhaltenen PMMA-Platten haben eine leicht unterschiedliche Glasübergangstemperatur (Tg). Die optimale Klebetemperatur muss in 5 °C-Schritten in der Nähe des Tg getestet werden. - 12 Stück Adapter an den einzelnen Öffnungen in Schicht 1 der MOE-Chip-Baugruppe mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber kleben.
HINWEIS: Die Adapter werden aus PMMA durch Spritzgießen hergestellt. Die flachen Flächen an der Unterseite sind für den Anschluss an den MOE-Chip. Die Adapter mit 1/4W-28 Innengewinde sind für den Anschluss von weißen fingerdichten Steckern, flachen Bodenverbindern oder Luer-Adaptern. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie schnell wirkenden Cyanoacrylatkleber verwenden. Vermeiden Sie es, in die Augen zu spritzen. - Desinfizieren Sie die 1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3), das doppelseitige Band (Schicht 4) und das 3 mm optische PMMA (Schicht 5) mit ultravioletter (UV) Bestrahlung für 30 min vor der Montage des Chips (Abbildung 1A).
- Verkleben Sie die 1 mm PMMA-Substrate (Schichten 1-3) auf dem 3 mm optischen PMMA (Schicht 5) mit dem doppelseitigen Band (Schicht 4), um die PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5) abzuschließen (Abbildung 1A).
- Bereiten Sie das saubere Deckglas für die Montage auf dem Chip vor.
- Füllen Sie eine zehnfache Verdünnung des Reinigungsmittels in ein Färbeglas (siehe Materialtabelle), und reinigen Sie das Deckglas in diesem Reinigungsmittel mit einem Ultraschallreiniger für 15 min.
- Spülen Sie das Färbeglas unter fließendem Leitungswasser gründlich ab, um alle Spuren des Reinigungsmittels zu entfernen.
- Spülen Sie mit destilliertem Wasser weiter, um alle Spuren von Leitungswasser zu entfernen, und wiederholen Sie Schritt 1.7.2 zweimal.
- Trocknen Sie das gereinigte Deckglas, indem Sie es mit Stickstoffgas blasen.
- Desinfizieren Sie die PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5), das doppelseitige Band (Schicht 6) und das Deckglas (Schicht 7) mit UV-Bestrahlung in einem Biosicherheitsschrank für 30 min vor der Montage des Chips (Abbildung 1A).
- Das gereinigte Deckglas (Schicht 7) mit dem doppelseitigen Klebeband (Schicht 6)(Abbildung 1A)an der PMMA-Baugruppe (Schichten 1-5) aufkleben
- Inkubieren Sie den MOE-Chip über Nacht in einer Vakuumkammer; verwenden Sie die MOE-Chip-Baugruppe für nachfolgende Verfahren (Abbildung 3).
2. Beschichtung von Poly-L-Lysin (PLL) auf dem Substrat in den Zellkulturbereichen
- Vorbereiten des Polytetrafluorethylen-Rohrs, des Flachbodensteckers, des Kegelverbinders, des Kegel-Luer-Adapters, des weißen Finger-Tight-Plugs (auch Stopper genannt), des Luer-Adapters, der Luer-Sperrspritze und der schwarzen Gummi-Bung (Abbildung 4A, Materialtabelle). Sterilisieren Sie alle oben genannten Komponenten in einem Autoklaven bei 121 °C für 30 min.
- Versiegeln Sie die Öffnungen der Agarbrückenadapter (Abbildung 1A) mit den weißen fingerdichten Steckern. Schließen Sie den Flachbodenstecker über die mittleren Ein- und Auslassadapter an die MOE-Chipbaugruppe an (Abbildung 4B). Schließen Sie den Kegel-Luer-Adapter an die 3-Wege-Stoppcocks an.
- Fügen Sie 2 ml 0,01% PLL-Lösung mit einer 3 ml Spritze hinzu, die mit dem 3-Wege-Stopphahn des mittleren Einlasses verbunden ist (Abbildung 4B-
). - Schließen Sie eine leere 3 ml Spritze an den 3-Wege-Stopphahn des mittleren Auslasses an (Abbildung 4B-
). - Füllen Sie die Zellkulturbereiche mit der PLL-Lösung. Die Beschichtungslösung langsam hin und her pumpen. Schließen Sie die beiden 3-Wege-Stoppcocks, um die Lösung innerhalb der Kulturregionen zu versiegeln.
- Inkubieren Sie den MOE-Chip bei 37 °C über Nacht in einem Inkubator, der mit 5%CO2-Atmosphäre gefüllt ist.
).
).3. Vorbereitung des Salzbrückennetzes
- Öffnen Sie nach Schritt 2.6 die beiden 3-Wege-Stoppcocks und spülen Sie die Blasen in den Kanälen weg, indem Sie die Beschichtungslösung mit den beiden Spritzen manuell hin und her in den Kanal pumpen.
- Zeichnen Sie 3 ml komplettes Medium (Stammzellerhaltungsmedium bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium/Schinken-Nährstoffgemisch F-12 (DMEM/F12), 2% B-27-Ergänzung, 20 ng/mL EGF und 20 ng/mL bFGF) in eine 3 ml Spritze, die sich mit dem 3-Wege-Stopphahn des Mittleren Einlasses verbindet(Abbildung 4B- und Abbildung 4B-
). - Fügen Sie 3 ml komplettes Medium hinzu, um die Beschichtungslösung in den Zellkulturbereichen zu ersetzen. Schließen Sie eine leere 5 ml Spritze an den 3-Wege-Stopphahn des mittleren Auslasses an (Abbildung 4B-
). - Vorbereiten des Salzbrückennetzes (Abbildung 5).
- Schneiden Sie die schwarze Gummi-Bung, um einen Spalt zu produzieren, und legen Sie die Silber (Ag)/Silberchlorid (AgCl) Elektroden durch die schwarze Gummi-Bung und in die Luer-Sperrspritze(Abbildung 4A).
- Ersetzen Sie den weißen fingerdichten Stecker durch den Luer-Adapter, und injizieren Sie 3% heiße Agarose, um den Luer-Adapter zu füllen.
HINWEIS: Zur Herstellung der heißen Agarose 3 g Agarosepulver in 100 ml phosphatgepufferter Kochsaline (PBS) auflösen und in einem Autoklaven bei 121 °C für 30 min sterilisieren. - Schließen Sie die Luer-Verriegelungsspritze an den Luer-Adapter an. Injizieren Sie 3% heiße Agarose durch den schwarzen Gummi-Bung, um die Luer-Sperrspritze mit der Spritze mit Nadel zu füllen. 10 bis 20 Min. für die Agarose abkühlen und erstarren lassen.
HINWEIS: Um die Volumenkapazität der Agarose zu erhöhen, ist die Luer-Schlossspritze am Luer-Adapter montiert(Abbildung 4 und Abbildung 5). Anschließend werden die großen Elektroden in die Luer-Sperrspritze eingeführt. Die Elektrode ist in der Lage, eine stabile elektrische Stimulation für das Langzeitexperiment zu bieten.
).
).4. Vorbereitung von mNPCs
- Kultur die mNPCs1 im gesamten Medium in einem 25T Zellkulturkolben bei 37 °C in einem Inkubator mit 5%CO2-Atmosphäre gefüllt. Subkultur die Zellen alle 3-4 Tage, und führen Sie alle Experimente mit Zellen, die 3-8 Passagen aus der ursprünglichen Quelle durchlaufen haben.
- Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15 ml konisches Rohr und spinnen Sie die Neurosphären bei 100 × g für 5 min. Aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Neurosphären mit 1x Dulbecco s PBS (DPBS). Spin-down der Neurosphären bei 100 × g für 5 min.
- Aspirieren Sie die 1x DPBS und setzen Sie dann die Neurosphären im gesamten Medium wieder aus. Gründlich und sanft mischen.
- Fügen Sie 1 ml der Neurosphäresuspension mit einer 1 ml Spritze hinzu, die mit dem 3-Wege-Hahn des Auslasses verbunden ist (Abbildung 4B- ).
5. Einrichtung des mikrofluidischen Systems zur DC-Pulsstimulation (Abbildung 6)
- Installieren Sie den zellsäenden MOE-Chip auf der transparenten ITO-Heizung, die auf einer programmierbaren X-Y-Z motorisierten Bühne befestigt ist.
HINWEIS: Die ITO-Oberflächentemperatur wird von einem proportional-integral-derivative-controller gesteuert und bei 37 °C gehalten. Ein K-Thermoelement wird zwischen dem Chip und der ITO-Heizung eingeklemmt, um die Temperatur der Zellkulturbereiche innerhalb des Chips zu überwachen. Der MOE-Chip ist auf einer programmierbaren X-Y-Z motorisierten Bühne installiert und eignet sich für die automatische Zeitraffer-Bildaufnahme an einzelnen Kanalabschnitten. Die Herstellung der ITO-Heizung und der Aufbau der Zellkulturheizung wurden zuvor beschrieben18,19. - Infundieren Sie die mNPCs durch manuelles Pumpen in den MOE-Chip über den mittleren Auslass. Inkubieren Sie den zellsamen MOE-Chip auf dem 37 °C ITO-Heizer für 4 h.
- Nach 4 h das komplette Medium mit einer Spritzenpumpe über den mittleren Einlass mit einer Durchflussrate von 20 l/h durch den MOE-Chip pumpen.
HINWEIS: Die mNPCs werden im Chip für weitere 24 h vor der EF-Stimulation angebaut und gewartet, um Zellanhaftung und Wachstum zu ermöglichen. Die Abfallflüssigkeit wird in einer leeren 5 ml Spritze gesammelt, die mit dem 3-Wege-Hahn des Auslasses verbunden ist, der in Abbildung 6Aals "Abfall" dargestellt ist. Die MOE mikrofluidische Systemkonfiguration ist in Abbildung 6dargestellt. Dieses mikrofluidische System versorgt die Zellen kontinuierlich mit Nahrung. Das komplette frische Medium wird kontinuierlich in den MOE-Chip gepumpt, um einen konstanten pH-Wert zu halten. Daher können die Zellen außerhalb eines CO2-Inkubators kultiviert werden. - Verwenden Sie elektrische Drähte, um einen EF-Multiplexer über die Ag/AgCl-Elektroden auf dem Chip mit dem MOE-Chip zu verbinden. Schließen Sie einen EF-Multiplexer und einen Funktionsgenerator an einen Verstärker an, um rechteckige DC-Impulse mit einer Magnitude von 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz bei 50 % Betriebszyklen (50 % Time-on und 50% Time-off) auszugeben (Abbildung 6B).
- Schließen Sie die elektrischen Drähte an den EF-Multiplexer an. Schließen Sie die elektrischen Drähte über die Ag/AgCl-Elektroden an den MOE-Chip an.
- Schließen Sie den EF-Multiplexer über elektrische Drähte an den Verstärker an. Schließen Sie den Funktionsgenerator an den Verstärker und das digitale Oszilloskop an.
HINWEIS: Der EF-Multiplexer ist eine Schaltung, die die Impedanz der Kulturkammer in der Schaltung enthält und alle einzelnen Kammern in einem parallelen elektronischen Netzwerk verbindet. Jede der drei Kulturkammern ist seriell mit einem variablen Widerstand (Vr) und einem Amperemeter (in Abbildung 6Adargestellt) im Multiplexer elektrisch verbunden. Der elektrische Strom durch jede Kulturkammer wird durch Die Steuerung des Vr variiert, und der Strom wird auf dem entsprechenden Amperemeter angezeigt. Die elektrische Feldstärke in jeder Zellkulturregion wurde durch Das Ohm-Gesetz I= EA berechnet, wobei ich der elektrische Strom bin, σ (eingestellt auf 1,38 Sm-1 für DMEM/F1220)die elektrische Leitfähigkeit des Kulturmediums ist, E das elektrische Feld und A der Querschnittsbereich der elektrotaktischen Kammer. Für die in Abbildung 1dargestellte Dimension des Zellkulturbereichs beträgt der elektrische Strom 87 mA bzw. 44 mA für DC- und DC-Puls bei 50 % Betriebszyklus.
- Unterziehen Sie die mNPCs quadratischen DC-Impulsen mit einer Magnitude von 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz für 48h. Das gesamte Medium kontinuierlich mit einer Rate von 10 l/h pumpen, um die Zellen ausreichend mit Nahrung zu versorgen und einen konstanten pH-Wert im Medium aufrechtzuerhalten.
6. Immunfluoreszenz-Assays von mNPCs nach gepulsten DC-Stimulation
HINWEIS: In diesem Schritt wird das gesamte Reagenz über den mittleren Einlass mit einer Spritzenpumpe gepumpt.
- Nach 3, 7 oder 14 Tagen in vitro (DIV) Kultivierung nach der Aussaat1,waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min.
- Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd (PFA). Pumpen Sie 4% PFA in den Chip mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min, um die 1x PBS zu ersetzen. Um die 4% PFA zu ersetzen, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 25 l/min für 20 min.
- Pumpe 0,1% Triton X-100 in den Chip mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min, um die Zellen zu permeabilisieren. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 50 l/h, damit weitere 30 min mit den Zellen reagieren. Um den 0,1% Triton X-100 zu ersetzen, waschen Sie die Zellen mit 1x PBS bei einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min.
- Blockieren Sie die Zellen mit PBS, die 1% Rinderserumalbumin (BSA) enthalten, um die unspezifische Antikörperbindung zu reduzieren. Pumpe 1% BSA in den Chip mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 100 l/h und pumpen Sie 1 h.
- Die Antikörper zur doppelten Immunfärbung mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min in den Chip pumpen und den Chip für 18 h bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.
- Pumpen Sie die Alexa Fluor-konjugierten Sekundärantikörper mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 6 min in den Chip. Reduzieren Sie den Durchfluss auf 50 l/h, und pumpen Sie die Antikörper bei Raumtemperatur im Dunkeln 1 h. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.
- Für die Kernfärbung, pumpe Hoechst 33342 in den Chip mit einer Durchflussrate von 20 l/min für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Waschen Sie die Zellen mit 1x PBS mit einer Durchflussrate von 50 l/min für 15 min.
- Beobachten Sie die Zellen nach der Immunfärbung mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.
7. Bildanalyse und Datenverarbeitung
- Analysieren Sie die fluoreszierenden Bilder mit Software mit integrierten Messwerkzeugen (siehe Tabelle der Materialien).
- Vergleichen Sie die Hoechst-counterstainierten Kerne (Gesamtanzahl der Zellen) in den Kontroll- und Behandlungsgruppen, und berechnen Sie den Prozentsatz der Zellen, die jeden phänotypchenden Marker exemittieren.
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Representative Results
Die detaillierte Konfiguration des MOE-Chips ist in Abbildung 1dargestellt. Der mikrofluidische Chip bietet einen vorteilhaften Ansatz zur Reduzierung der Versuchsaufbaugröße, des Probenvolumens und des Reagenzvolumens. Der MOE-Chip wurde entwickelt, um drei unabhängige EF-Stimulationsexperimente und mehrere Immunflecken gleichzeitig in einer einzigen Studie durchzuführen (Abbildung 3). Darüber hinaus eignet sich der MOE-Chip mit hoher optischer Transparenz für konfokale Mikroskopieuntersuchungen. Der MOE-Chip wurde auch entwickelt, um die Auswirkungen verschiedener Zellkulturbedingungen (z. B. mehrfache EF-Stimulation, mehrere Medikamente, unterschiedliche Beschichtungssubstrate, mehrere Zellreihen) gleichzeitig in einem einzigen Experiment zu untersuchen.
Die mNPCs wurden quadratischen DC-Impulsen (Magnitude 300 mV/mm bei einer Frequenz von 100 Hz) ausgesetzt. Die DC-Pulsstimulation wurde für 48 h durchgeführt. Die differenzierten Zellen wurden mit Tuj1 (neuronspezifische Klasse III β-Tubulin), glialfibrillärem saurem Protein (GFAP zur Identifizierung von Astrozyten) und Oligodendrozytenmarker O4 immungefärbt. Nach der DC-Pulsbehandlung drückten die mNPCs eine signifikant hohe Anzahl von Neuronen (Tuj1+-Zellen) bei DIV 7 aus. Bei DIV 3 waren Astrozyten (GFAP+-Zellen) in den Stimulationsgruppen auf relativ höheren Ebenen vorhanden als in der Kontrollgruppe (CTL). Im Vergleich zur CTL-Gruppe waren Oligodendrozyten (O4+-Zellen) in der Stimulationsgruppe bei DIV 7 und DIV 14(Abbildung 7) signifikant höher. Diese Ergebnisse zeigen, dass die DC-Pulsstimulation dazu führte, dass mNPCs sich gleichzeitig in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten in Stammzellerhaltungsmedium enzieren. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das MOE-Mikrofluidsystem für eine Langzeit-Zelldifferenzierungsstudie mittels Mikroskopie geeignet ist.
Abbildung 1: Die detaillierte Konfiguration des optisch transparenten Elektrotaktik-Multikanal-Chips. (A) Explosionsansicht der MOE-Chip-Baugruppe. Der MOE-Chip besteht aus PMMA-Platten (50 mm x 25 mm x 1 mm), doppelseitigem Klebeband (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), Adaptern (10 mm x 10 mm x 6 mm), optischem PMMA-Blatt (50 mm x 75 mm x 3 mm), doppelseitigem Klebeband (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) und einem Abdeckglas (24 mm × 60 mm). Es gibt drei Zellkulturkammern im MOE-Chip. Der MOE-Chip verfügt über Verbindungslöcher für den mittleren Einlass/Auslass und die Agarsalzbrücken. Die Zellen wurden im Zellkulturbereich kultiviert (Breite 3 mm x Länge 42 mm x Höhe 0,07 mm). Abbildung 1A wurde von Chang et al.6geändert. (B) Foto des MOE-Chips mit Adaptern, PMMA-Platten, doppelseitigem Klebeband und Deckglas. Abkürzungen: MOE= mehrkanalig optisch transparente Elektrotaktik; PMMA = Polymethylmethacrylat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Die Herstellungs- und Montageprozesse des MOE-Chips. (A) Die entworfenen Muster der PMMA-Platten oder doppelseitigen Klebebandwurden mittels Laser-Mikrobearbeitung gefertigt. (B) Die einzelnen PMMA-Blätter wurden von einemCO2-Laserschreiber geschnitten. (C) Die mehrfachen Schichten der gereinigten PMMA-Platten wurden durch einen thermischen Bonder miteinander verbunden. Abkürzungen: MOE= mehrkanalig optisch transparente Elektrotaktik; PMMA = Polymethylmethacrylat; CO2 = Kohlendioxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3:Ein Foto des MOE-Chips. Diese Zahl wurde von Chang et al.6geändert. Abkürzung: MOE= mehrkanalig optisch transparente Elektrotaktik. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Mittlerer und elektrischer Anschluss an den MOE-Chip. (A) Foto der Komponenten für das Medium Flow Network und das EF-Netz im MOE-Mikrofluidsystem, einschließlich PTFE-Rohr, Flachbodenstecker, Kegelanschluss, Kegel-Luer-Adapter, weißer Finger-Tight-Plug, Luer-Adapter, Luer-Sperrspritze, schwarzer Gummi-Bung und der Ag/AgCl-Elektroden. (B) Foto der Konfiguration für das Medium Flow Netzwerk. Abkürzungen: MOE= mehrkanalig optisch transparente Elektrotaktik; EF = elektrisches Feld; PTFE = Polytetrafluorethylen; Ag = Silber; AgCl = Silberchlorid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5:Ein Foto, das den MOE-Chip auf einem Mikroskop zeigt. Abkürzungen: MOE= mehrkanalig optisch transparente Elektrotaktik; Ag = Silber; AgCl = Silberchlorid; ITO = Indium-Zinn-Oxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 6: Die Konfiguration und das für die DC-Pulsstimulation verwendete System. (A) Die Konfiguration des gesamten Systems für die DC-Pulsstimulation. Die mit dem MOE-Chip verbundenen Spritzen wurden für mittlere Infusion und Abfallabfluss verwendet. Der DC-Impuls im Chip wurde durch eine Stromversorgung durch die Ag/AgCl-Elektroden bereitgestellt. Das Geräte-Setup wurde auf der motorisierten X-Y-Z-Bühne eines invertierten Phasenkontrastmikroskops installiert, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist. (B) Ein Foto, das das Setup auf einer Laborbank zeigt. Abkürzungen: MOE= mehrkanalig optisch transparente Elektrotaktik; Ag = Silber; AgCl = Silberchlorid; ITO = Indium-Zinn-Oxid; EF = elektrisches Feld. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 7: Differenzierung der mNPC-Zellen in der Kontrollgruppe (CTL) und in der DC-Pulsstimulationsgruppe bei DIV 3, 7 und 14. Der Prozentsatz von Neuronen (Tuj1+-Zellen), Astrozyten (GFAP+-Zellen) und Oligodendrozyten (O4+-Zellen) in (A-C) der CTL-Gruppe und (D-F) in der Stimulationsgruppe (DC-Pulsen). Diese Zahl wurde von Chang et al.1veröffentlicht. Abkürzungen: CTL: Steuerung; DC = Gleichstrom; Tuj1 = neuronspezifische Klasse III β-Tubulin; GFAP = glial fibrilläres saures Protein; O4 = Oligodendrozytenmarker O4. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Bei der Herstellung des MOE-Chips werden die Adapter mit schnell wirkendem Cyanoacrylatkleber am Layer 1 des MOE-Chips befestigt. Der Kleber wird auf 4 Ecken der Adapter aufgetragen, und dann wird der Druck gleichmäßig über die Adapter aufgebracht. Überschüssige Klebstoffmenge muss vermieden werden, um eine vollständige Polymerisation des Klebers zu gewährleisten. Darüber hinaus wird die fertige MOE-Chip-Montage in einer Vakuumkammer inkubiert. Dieser Schritt hilft, die Blasen zwischen der PMMA-Schicht, dem doppelseitigen Klebeband und dem Deckglas zu entfernen.
Die Wahl des Elektrodenmaterials basiert auf der Tatsache, dass Chloridionen, die im Medium reichlich vorhanden sind, die elektrolytischen Produkte sind, die durch den Zellkulturbereich fließen. Während des EF-Stimulationsexperiments blieb der pH-Wert um die Elektroden konstant. Eine einfachere Konfiguration mit Platin (Pt) als Elektrodenmaterial elektrolyziert Wasser und erzeugt Wasserstoffionen (H+) und Hydroxidionen (OH-) an der positiven Elektrode bzw. der negativen Elektrode, was pH-Veränderungen im Kulturbereich induzieren. Durch die Vermeidung der Verwendung von Pt-Elektroden wird das Problem der pH-Änderungen während des EF-Stimulationsexperiments umgangen.
Die heiße Agarose und die blasenfreie Agrose sind bei der Vorbereitung des Salzbrückennetzes unerlässlich. Die heiße Agarose hat eine hohe Fließfähigkeit und kann leicht in das Salzbrückennetz injiziert werden. Schließen Sie die Luer-Verriegelungsspritze an den Luer-Adapter an, nachdem Sie die 3% heiße Agarose in den Luer-Adapter injiziert haben. In diesem Schritt wird die Agarose in die Luer-Schlossspritze geschoben, so dass eine blasenfreie feste Verbindung des Salzbrückennetzes erreicht werden kann. Blasen in den Salzbrücken erhöhen den elektrischen Widerstand und somit kann der erwartete elektrische Strom nicht erreicht werden. Nach der Agarose-Injektion ist es wichtig, darauf zu warten, dass die Agarose abkühlt und bei Raumtemperatur für 10-20 min erstarrt, um die Bildung von erstarrtem Agarose-Abfall in der Zellkulturregion zu verhindern.
Der MOE-Chip wird auf eine ITO-Heizung gelegt, die auf einer programmierbaren X-Y-Z motorisierten Bühne verriegelt ist. Das gesamte System basiert auf einem invertierten Phasenkontrastmikroskop, das mit einer Digitalkamera ausgestattet ist, um die Zelldifferenzierung innerhalb der Zellkulturbereiche im Chip zu überwachen. Es ist bequem, die Zellmorphologie und die Erfassung der automatischen Zeitrafferbilder im MOE-Mikrofluidsystem außerhalb eines Inkubators zu beobachten. Dieses mikrofluidische System verkürzt nicht nur die benötigte Versuchszeit, sondern erhöht auch die Genauigkeit der Kontrolle auf der Mikroumgebung.
Die mNPC-Zellen wachsen als Suspension in Kulturmedien. MNPCs, die an der PLL-beschichteten Platte im MOE-Chip haften, sind jedoch entscheidend für die Differenzierung. Neurosphären, die von 30-40 Zellen gebildet werden, werden bevorzugt für die Initiierung der mNPC-Differenzierung. Ein Überwuchern von mNPCs beeinträchtigt das Zellüberleben während des Differenzierungsprozesses. Darüber hinaus kann nach der gepulsten DC-Stimulation die Immunfluoreszenzfärbung experimentell durch die Durchflussrate beeinflusst werden. Verwenden Sie daher mehrere Durchflussraten für verschiedene Schritte, um das Lösen von Zellen während der Wäsche zu vermeiden.
In dieser Studie ist eine Einschränkung dieser Technik, dass der MOE-Chip nicht wiederverwendet werden kann, da es schwierig ist, den Chip gründlich zu reinigen. Der MOE-Chip kann jedoch direkt unter einem Phasenkontrastmikroskop oder einem Raster-Konfokalmikroskop platziert werden. Die wasserdichte Auslegung des gemeldeten mikrofluidischen Systems stellt sicher, dass keine Puffer-/Mittelverdampfung auftritt, wobei die genaue Konzentration des Puffers/Mediums und die entsprechenden elektrischen Eigenschaften erhalten bleiben. Durch die Reduzierung der Reagenzvolumina und der entsprechenden Betriebszeit bietet das moE-Mikrofluidsystem einen effizienten Ansatz zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Eine frühere Studie hat gezeigt, dass EGF und bFGF das Überleben, die Expansion und die Wartung von NPC im undifferenzierten Zustand fördern4. In dieser Studie induzierten die DC-Impulse die Differenzierung der mNPCs im Stammzellerhaltungsmedium, das EGF und bFGF enthielt. Frühere Studien haben berichtet, dass EF die Differenzierung von NPCs in Neuronen und/oder Astrozyten im Differenzierungsmedium ohne EGF und bFGF14,21,22fördert. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die mNPCs nach der DC-Pulsstimulation in Neuronen, Astrozyten und Oligodendrozyten differenzierten. Sie deuten auch darauf hin, dass eine einfache DC-Pulsbehandlung das Schicksal von NPCs steuern könnte. Mit weiterer Optimierung der Stimulationszeit, EF-Stärke oder des Belastungszyklus können DC-Pulse zur Manipulation der NPC-Differenzierung eingesetzt werden und können für die Entwicklung therapeutischer Strategien verwendet werden, die NPCs zur Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems einsetzen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Professor Tang K. Tang, Institut für Biomedizinische Wissenschaften, Academia Sinica, für seine Unterstützung bei der Bereitstellung von mausneuralen Stamm- und Vorläuferzellen (mNPCs). Die Autoren danken auch Professor Tang K. Tang und Frau Ying-Shan Lee für ihre wertvolle Diskussion über die Differenzierung von mNPCs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
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