Summary
במחקר זה, אנו מציגים פרוטוקול לבידול של גזע עצבי ותאי אב (NPCs) המושרה אך ורק על ידי גירוי דופק זרם ישיר (DC) במערכת מיקרופלואידית.
Abstract
שדות חשמליים פיזיולוגיים (EF) ממלאים תפקידים חיוניים בנדידת תאים, בידול, חלוקה ומוות. מאמר זה מתאר מערכת תרבית תאים מיקרופלואידית ששימשה למחקר התמיינות תאים ארוך טווח באמצעות מיקרוסקופיה. המערכת המיקרופלואידית מורכבת מהרכיבים העיקריים הבאים: שבב אלקטרו-טקטי שקוף אופטית, תנור תחמוצת אינדיום-פח (ITO) שקוף, משאבת מילוי מדיה תרבותית, ספק כוח חשמלי, מגבר הספק בתדר גבוה, מולטיפלקסר EF, שלב ממונע X-Y-Z מתוכנת ומיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוך המצויד במצלמה דיגיטלית. המערכת המיקרופלואידית מועילה לפישוט ההתקנה הניסיונית הכוללת, ובתורו, לצריכת ריאגנט ודגימה. עבודה זו כרוכה בהבחנה של גזע עצבי ותאי אב (NPCs) הנגרמת על ידי גירוי דופק זרם ישיר (DC). במדיום תחזוקת תאי גזע, העכבר NPCs (mNPCs) מובחן לנוירונים, אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים לאחר גירוי הדופק DC. התוצאות מראות כי טיפול דופק DC פשוט יכול לשלוט על גורלם של mNPCs והוא יכול לשמש לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עבור הפרעות במערכת העצבים. המערכת יכולה לשמש לתרבות תאים בערוצים מרובים, לגירוי EF לטווח ארוך, לתצפית מורפולוגית של תאים, ולרכישת תמונה אוטומטית בזמן לשגות. מערכת מיקרופלואידית זו לא רק מקצרת את זמן הניסוי הנדרש, אלא גם מגבירה את דיוק השליטה במיקרו-וירוס.
Introduction
תאי מבשר עצבי (NPCs, הידוע גם בשם גזע עצבי ותאי אב) יכול להיות כמועמד מבטיח עבור אסטרטגיה טיפולית ניוונית1. NPCs מובחנת יש יכולת חידוש עצמי, רב עוצמה, ויכולת התפשטות2,3. מחקר קודם דיווח כי מטריצה חוץ תאית ומתווכים מולקולריים לווסת את הבידול של NPC. גורם הגדילה האפידרמלי (EGF) וגורם הגדילה הבסיסי פיברובלסט (bFGF) לקדם התפשטות NPC, ובכך לשמור על מצב מובחן4.
מחקרים קודמים דיווחו כי גירוי חשמלי יכול לווסת פעילויות פיזיולוגיות של התא כגוןחטיבה 5,הגירה 6,7,8, בידול1,9,10, ומוותתאים 11. שדות חשמליים (EFs) ממלאים תפקידים חיוניים בפיתוח והתחדשות של התפתחות מערכת העצבים המרכזית12,13,14. משנת 2009 עד 2019, מעבדה זו חקרה תגובות סלולריות ליישום EF במערכת המיקרופלואידית1,6,7,8,15,16,17. שבב רב-ערוצי, שקוף אופטית ואלקטרו-טקטי (MOE) תוכנן כך שיתאימו לכתם כשל חיסוני למיקרוסקופיה קונפוקלית. השבב היה בעל שקיפות אופטית גבוהה ועמידות טובה ואיפשר התנהלות סימולטנית של שלושה ניסויי גירוי עצמאיים ומספר תנאים אימונו-מוכתמים במחקר אחד. המערכת המיקרופלואידית מועילה לפישוט ההתקנה הניסיונית הכוללת, ובתורו, לצריכת ריאגנט ודגימה. מאמר זה מתאר את התפתחותה של מערכת תרבית תאים מיקרופלואידית ששימשה למחקר דיפרנציאציה ארוך טווח של תאים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תכנון והפיה של שבב MOE
- צייר דוגמאות מילוי לשכבות polymethyl methacrylate (PMMA) בודדות ולסרט הדו-צדדי באמצעות התוכנה המתאימה (איור 1A, טבלת החומרים). חותכים הן את יריעות ה-PMMA והן את הקלטת הדו-צדדית באמצעות סופר מכונת לייזר CO2 (איור 1B).
- הפעל את סופר הלייזר CO2 וחבר אותו למחשב אישי. פתח את קובץ התבנית המעוצב באמצעות התוכנה.
- הנח את יריעות ה- PMMA (275 מ"מ x 400 מ"מ) או סרט דו-צדדי (210 מ"מ x 297 מ"מ) על פלטפורמת סופר הלייזר (איור 2A). מקד את הלייזר על פני השטח של יריעות PMMA או על הסרט הדו-צדדי באמצעות כלי המיקוד האוטומטי.
- בחר את סופר הלייזר כמדפסת ולאחר מכן "הדפס" את התבנית באמצעות סופר הלייזר כדי להפעיל את אבלציה ישירה על גיליון PMMA או קלטת דו-צדדית ולקבל דפוסים בודדים בגיליון PMMA או בקלטת (איור 2B).
- הסר את סרט המגן מגליונות PMMA, ולנקות את פני השטח באמצעות גז חנקן.
הערה: הציור של תבנית PMMA ועיבוד ישיר של גיליון PMMA בוצעו על פי דו"ח קודם17. - לחיבור שכבות מרובות של יריעות PMMA, ערמו שלוש חתיכות של יריעות PMMA של 1 מ"מ (שכבות 1, 2 ו-3), וקשרו אותן בלחץ של 5 ק"ג/ס"מ2 בשוד תרמי למשך 30 דקות ב-110 מעלות צלזיוס ליצירת הרכבה של ערוץ זרימה/גירוי חשמלי(איור 2C).
הערה: קבוצות שונות של גיליון PMMA שהושג מסחרית יש טמפרטורת מעבר זכוכית שונה במקצת (Tg). טמפרטורת מליטה אופטימלית צריך להיבדק במרווחים של 5 מעלות צלזיוס קרוב Tg. - הדבק 12 חתיכות של מתאמים לפתחים הבודדים בשכבה 1 של מכלול שבב MOE עם דבק ציאנואקרילאט מהיר.
הערה: המתאמים עשויים PMMA על ידי הזרקת דפוס. המשטחים השטוחים בתחתית מיועדים לחיבור לשבב MOE. המתאמים הנושאים חוט בורג נקבה של 1/4W-28 מיועדים לחיבור תקעים לבנים צמודים לאצבע, מחברים תחתונים שטוחים או מתאמי Luer. היזהר בעת שימוש בדבק ציאנואקרילאט מהיר. הימנע התזה לתוך העיניים. - חטאו את מצעי PMMA בגודל 1 מ"מ (שכבות 1-3), את הסרט הדו-צדדי (שכבה 4) ואת PMMA בעל הדרגה האופטית 3 מ"מ (שכבה 5) באמצעות הקרנה אולטרה סגולה (UV) למשך 30 דקות לפני הרכבת השבב (איור 1A).
- דבק במצעי PMMA בגודל 1 מ"מ (שכבות 1-3) ב- PMMA בעל הכיתה האופטית של 3 מ"מ (שכבה 5) עם הקלטת הדו-צדדית (שכבה 4) כדי להשלים את הרכבת PMMA (שכבות 1.5) (איור 1A).
- מכינים את זכוכית הכיסוי הנקי למכלול על השבב.
- מלאו דילול פי עשרה של חומר הניקוי בצנצנת מכתימה (ראו טבלת החומרים),ונקו את זכוכית הכיסוי בחומר ניקוי זה באמצעות מנקה קולי למשך 15 דקות.
- לשטוף ביסודיות את צנצנת הכתמים תחת מי ברז זורמים כדי להסיר את כל העקבות של חומר הניקוי.
- המשך לשטוף במים מזוקקים כדי להסיר את כל העקבות של מי ברז, ולחזור על שלב 1.7.2 פעמיים.
- יבש את זכוכית הכיסוי המנוקה על ידי ניפוחה בגז חנקן.
- לחטא את מכלול PMMA (שכבות 1-5), את הסרט הדו-צדדי (שכבה 6) ואת זכוכית הכיסוי (שכבה 7) באמצעות הקרנת UV בתוך ארון biosafety במשך 30 דקות לפני הרכבת השבב (איור 1A).
- הדבק את זכוכית הכיסוי המנוקה (שכבה 7) להרכבת PMMA (שכבות 1.5) עם הקלטת הדו-צדדית (שכבה 6) (איור 1A).
- דגירה שבב MOE בתא ואקום לילה; השתמש בהרכבת שבב MOE עבור ההליכים הבאים (איור 3).
2. ציפוי פולי-ל-ליצין (PLL) על המצע באזורי תרבות התא
- הכינו את שפופרת הפוליטרפלואורואתילן, מחבר שטוח-תחתון, מחבר חרוט, מתאם חרוט-לואר, תקע לבן צמוד לאצבע (המכונה גם פקק), מתאם לואר, מזרק מנעול לואר ובאנג גומי שחור(איור 4A, לוח חומרים). לעקר את כל הרכיבים לעיל במובלעת אוטומטית ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
- אטמו את פתחי מתאמי גשר אגר(איור 1A)באמצעות התקעים הלבנים הצמודים לאצבע. חבר את המחבר השטוח לתחתית למכלול שבבי MOE באמצעות מתאמי כניסת ושקעים בינוניים (איור 4B). חבר את מתאם החרוט-לואר לפסקי ה-3.
- הוסף 2 מ"ל של פתרון PLL של 0.01% באמצעות מזרק של 3 מ"ל שמתחבר לעצירה התלת-כיוונית של המפרצון הבינוני (איור 4B-
). - חבר מזרק ריק של 3 מ"ל לשקע התלת-כיווני(איור 4B
). - מלא את אזורי תרבות התאים בפתרון PLL. יש לשאוב ידנית את פתרון הציפוי קדימה ואחורה לאט. סגור את שני stopcocks 3-way כדי לאטום את הפתרון בתוך אזורי התרבות.
- דגירה שבב MOE ב 37 °C (60 °F) לילה באינקובטור מלא 5% CO2 אווירה.
).
).3. הכנת רשת גשר המלח
- לאחר שלב 2.6, פתחו את שני המזרקים התלת-כיווניים וסמקו את הבועות בתעלות על ידי שאיבת פתרון הציפוי באופן ידני הלוך ושוב בערוץ באמצעות שני המזרקים.
- לצייר 3 מ"ל של מדיום מלא (תא גזע תחזוקה בינונית המורכבת של Dulbecco של שונה הנשר בינוני / Ham של תערובת תזונה F-12 (DMEM / F12), 2% B-27 תוספת, EGF של 20 ng/mL ו- 20 ng/mL bFGF) למזרק של 3 מ"ל שמתחבר לעצירה התלת-כיוונית של הכניסה הבינונית (איור 4B- ואיור 4B-
). - הוסף 3 מ"ל של מדיום שלם כדי להחליף את פתרון הציפוי באזורי תרבות התא. חברו מזרק ריק של 5 מ"ל לשקע התלת-כיווני של השקע הבינוני (איור 4B-
). - הכינו את רשת גשר המלח (איור 5).
- חותכים את באנג הגומי השחור כדי לייצר רווח, ומכניסים את אלקטרודות הכסף (Ag)/כסף כלוריד (AgCl) דרך באנג הגומי השחור לתוך מזרק מנעול Luer(איור 4A).
- החליפו את התקע הלבן עם מתאם הלואר, והזריקו 3% אגרוז חם כדי למלא את מתאם הלואר.
הערה: להכנת agarose חם, להמיס 3 גרם של אבקת agarose ב 100 מ"ל של מלוחים אגירה פוספט (PBS) ו לעקר אוטוקלאב ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. - חבר את מזרק מנעול הלואר ומתאם הלואר. להזריק 3% חם agarose דרך באנג גומי שחור כדי למלא את מזרק מנעול לואר באמצעות המזרק עם מחט. אפשר 10 עד 20 דקות עבור agarose להתקרר ולחזק.
הערה: כדי להגדיל את קיבולת הנפח של האגרוז, מזרק מנעול הלואר מותקן על מתאם הלואר(איור 4 ואיור 5). לאחר מכן, האלקטרודות הגדולות מוחדרות למזרק מנעול הלואר. האלקטרודה מסוגלת לספק גירוי חשמלי יציב לניסוי ארוך הטווח.
).
).4. הכנת MNPCs
- תרבות mNPCs1 במדיום המלא בבקבוק תרבות תאים 25T ב 37 °C (69 °F) באינקובטור מלא 5% CO2 אווירה. תת-תרבות התאים כל 3-4 ימים, ולבצע את כל הניסויים עם תאים שעברו 3-8 קטעים מהמקור.
- להעביר את ההשעיה התא צינור חרוט 15 מ"ל, וספין למטה נוירוספרות ב 100 × גרם במשך 5 דקות. לשאוף את supernatant, ולשטוף את הנוירוספרות עם PBS של 1x Dulbecco (DPBS). ספין למטה נוירוספרות ב 100 × g במשך 5 דקות.
- לשאוף את 1x DPBS ולאחר מכן resuspend את הנוירוספרות במדיום המלא. מערבבים היטב ובעדינות.
- הוסיפו 1 מ"ל של ההשעיה הנוירוספרית באמצעות מזרק של 1 מ"ל שמתחבר לעצירה התלת-כיוונית של השקע(איור 4B- ).
5. הגדרת המערכת המיקרופלואידית לגירוי פולס DC (איור 6)
- התקן את שבב MOE בעל זרעי התאים על תנור ITO השקוף המהודק על שלב ממונע X-Y-Z הניתן לתכנות.
הערה: טמפרטורת פני השטח של ITO נשלטת על ידי בקר פרופורציונלי-אינטגרלי-נגזר ומתוחזקת בטמפרטורה של 37 °C (70 °F). תרמוקופול מסוג K מהודק בין השבב לתנור ITO כדי לפקח על הטמפרטורה של אזורי תרבות התא בתוך השבב. שבב MOE מותקן על שלב ממונע X-Y-Z לתכנות ומתאים לרכישת תמונה אוטומטית בזמן לשגות בקטעי ערוץ בודדים. הייצור של תנור ITO ואת ההתקנה של מערכת חימום תרבות התא תוארו בעבר18,19. - להחדיר את mNPCs על ידי שאיבה ידנית לתוך שבב MOE דרך השקע הבינוני. דגירה שבב MOE זרעי תא על 37 °C ITO תנור עבור 4 שעות.
- לאחר 4 שעות, לשאוב את המדיום המלא דרך שבב MOE דרך כניסת בינוני בקצב זרימה של 20 μL / h באמצעות משאבת מזרק.
הערה: mNPCs גדלים ומתוחזקים בשבב במשך 24 שעות נוספות לפני גירוי EF כדי לאפשר חיבור וצמיחה של התא. נוזל הפסולת נאסף במזרק ריק של 5 מ"ל המחובר לעצירה התלת-כיוונית של השקע, המוצגת כ"פסולת" באיור 6A. תצורת המערכת המיקרופלואידית של MOE מוצגת באיור 6. מערכת מיקרופלואידית זו מספקת אספקה רציפה של תזונה לתאים. המדיום הטרי המלא נשאב ללא הרף לתוך שבב MOE כדי לשמור על ערך pH קבוע. לכן, התאים יכולים להיות תרבית מחוץ לאינקובטור CO2. - השתמש בחוטי חשמל כדי לחבר מולטיפלקסר EF לשבב MOE באמצעות אלקטרודות Ag / AgCl על השבב. חבר מולטיפלקסר EF ומחולל פונקציות למגבר כדי ליצור פולסים DC של גל ריבועי בעוצמה של 300 mV/mm בתדר של 100 הרץ במחזורי חובה של 50% (50% פסק זמן ו-50% פסק זמן)(איור 6B).
- חבר את חוטי החשמל למולטיפלקסר EF. חבר את חוטי החשמל לשבב MOE באמצעות האלקטרודות Ag/AgCl.
- חבר את מולטיפלקסר EF למגבר באמצעות חוטי חשמל. חבר את מחולל הפונקציות למגבר ולאוסצילוסקופ הדיגיטלי.
הערה: מולטיפלקסר EF הוא מעגל הכולל את העכבה של תא התרבות במעגל ומחבר את כל התאים הבודדים ברשת אלקטרונית מקבילה. כל אחד משלושת תאי התרבות מחובר חשמלית בסידרה לנגד משתנה (Vr) ולאמטר (המוצג כ- μA באיור 6A)במוליך. הזרם החשמלי דרך כל תא תרבות משתנה על ידי שליטה Vr, ואת הזרם מוצג על ammeter המקביל. חוזק השדה החשמלי בכל אזור תרבות תאים חושב על ידי חוק אוהם, I = σEA, שבו אני הזרם החשמלי, σ (מוגדר כ- 1.38S·m-1 עבור DMEM / F1220) הוא המוליכות החשמלית של מדיום התרבות, E הוא השדה החשמלי, ו- A הוא האזור החתך של התא האלקטרו-טקי. עבור ממד אזור תרבות התא המוצג באיור 1, הזרם החשמלי הוא ~ 87 mA ו ~ 44 mA עבור DC ו- DC פולס ב 50% מחזור חובה, בהתאמה.
- הכפפ את ה- mNPCs לפולסים DC מרובעים בעוצמה של 300 mV/mm בתדר של 100 הרץ למשך 48 שעות. ברציפות לשאוב את המדיום המלא בקצב של 10 μL / h כדי לספק תזונה נאותה לתאים ולשמור על ערך pH קבוע באמצעי.
6. בדיקות אימונופלואורסצנטיות של mNPCs לאחר גירוי DC פעמו
הערה: בשלב זה, כל ריאגנט נשאב דרך כניסת בינונית באמצעות משאבת מזרק.
- לאחר 3, 7, או 14 ימים במבחנה (DIV) culturing לאחר זריעה1, לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 25 μL / min במשך 20 דקות.
- לתקן את התאים עם 4% paraformaldehyde (PFA). משאבה 4% PFA לתוך השבב בקצב זרימה של 25 μL / min במשך 20 דקות כדי להחליף את 1x PBS. כדי להחליף את 4% PFA, לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 25 μL / min במשך 20 דקות.
- משאבה 0.1% טריטון X-100 לתוך השבב בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות כדי לחלחל התאים. להפחית את קצב הזרימה ל 50 μL / h במשך 30 דקות נוספות כדי להגיב עם התאים. כדי להחליף את 0.1% טריטון X-100, לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות.
- חסום את התאים עם PBS המכיל 1% אלבומין סרום שור (BSA) כדי להפחית איגוד נוגדנים לא ספציפי. משאבה 1% BSA לתוך השבב בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות. להפחית את קצב הזרימה ל 100 μL / h ומשאבה במשך 1 שעה.
- לשאוב את הנוגדנים עבור immunostaining כפול לתוך השבב בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות, ולהדגיר את השבב במשך 18 שעות ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 15 דקות.
- לשאוב את הנוגדנים המשניים אלקסה פלואור מצומד לתוך השבב בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 6 דקות. להפחית את קצב הזרימה ל 50 μL / h, ולשאוב את הנוגדנים במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 15 דקות.
- עבור כתמים גרעיניים, משאבה Hoechst 33342 לתוך השבב בקצב זרימה של 20 μL / min במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשטוף את התאים עם 1x PBS בקצב זרימה של 50 μL / min במשך 15 דקות.
- לאחר immunostaining, להתבונן בתאים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal.
7. ניתוח תמונה ועיבוד נתונים
- נתח את התמונות הפלואורסצנטיות באמצעות תוכנה באמצעות כלי מדידה מובנים (ראה טבלת החומרים).
- השווה את הגרעינים המוכתמים על-ידי Hoechst (המספר הכולל של תאים) בקבוצות הבקרה והטיפול, וחשב את אחוז התאים המבטאים כל סמן פנוטיפי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התצורה המפורטת של שבב MOE מוצגת באיור 1. השבב המיקרופלואידי מספק גישה מועילה להפחתת גודל ההתקנה הניסיונית, נפח הדגימה ונפח ריאגנט. שבב MOE תוכנן לבצע שלושה ניסויי גירוי EF עצמאיים ומספר תנאים חיסוניים בו זמנית במחקר אחד (איור 3). בנוסף, שבב MOE, בעל שקיפות אופטית גבוהה, מתאים לבדיקות מיקרוסקופיות קונפוקל. שבב MOE נועד גם לחקור את ההשפעות של תנאים שונים של תרבות התא (למשל, גירוי EF מרובים, מספר תרופות, מצע ציפוי שונה, סדרות מרובות של תאים) בו זמנית בניסוי אחד.
ה- mNPCs נחשפו לפולסים DC של גלים מרובעים (בעוצמה של 300 mV/mm בתדר של 100 הרץ). גירוי הדופק DC נערך במשך 48 שעות. התאים המובחנים היו immunostained עם Tuj1 (נוירון ספציפי מחלקה III β-טובולין), חלבון חומצי פרפור גליה (GFAP לזיהוי אסטרוציטים), ו סמן oligodendrocyte O4. לאחר טיפול דופק DC, mNPCs הביע מספר גבוה באופן משמעותי של נוירונים (Tuj1 + תאים) ב DIV 7. ב- DIV 3, אסטרוציטים (תאי GFAP+ ) היו נוכחים ברמות גבוהות יחסית בקבוצות הגירוי מאשר בקבוצת הבקרה (CTL). בהשוואה לקבוצת CTL, אוליגודנדרוציטים (O4+ תאים) היו גבוהים משמעותית בקבוצת הגירוי ב- DIV 7 ו- DIV 14 (איור 7). תוצאות אלו מראות כי גירוי הדופק DC הביא mNPCs הבחנה לתוך נוירונים, אסטרוציטים, ו oligodendrocytes בו זמנית במדיום תחזוקת תאי גזע. תוצאות אלו מצביעות על כך שהמערכת המיקרופלואידית MOE מתאימה למחקר בידול תאים ארוך טווח על ידי מיקרוסקופיה.
איור 1: התצורה המפורטת של השבב האלקטרו-טקטי הרב-ערוצי השקוף אופטית. שבב MOE מורכב יריעות PMMA (50 מ"מ x 25 מ"מ x 1 מ"מ), סרט דו צדדי (50 מ"מ x 25 מ"מ x 0.07 מ"מ), מתאמים (10 מ"מ x 10 מ"מ x 6 מ"מ ), גיליון PMMA בדרגה אופטית (50 מ"מ x 75 מ"מ x 3 מ"מ), סרט הדבקה דו-צדדי (24 מ"מ x 60 מ"מ x 0.07 מ"מ) וזכוכית כיסוי (24 מ"מ × 60 מ"מ). ישנם שלושה תאי תרבות שבב MOE. שבב MOE כולל חורים מחברים עבור כניסת / שקע בינוני וגשרי מלח אגר. התאים היו תרבית באזור תרבות התא (רוחב 3 מ"מ x אורך 42 מ"מ x גובה 0.07 מ"מ). איור 1A שונה מצ'אנג ואח'6. (B)תצלום של שבב MOE הכולל מתאמים, גיליונות PMMA, סרט הדבקה דו-צדדי וזכוכית כיסוי. קיצורים: MOE= אלקטרוטאטיקה שקופה אופטית רב-ערוצית; PMMA = פולימתיל מתקרילט. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: תהליכי הייצור וההרכבה של שבב MOE. (A) הדפוסים המעוצבים של יריעות PMMA או סרט דו-צדדי היו מפוברקים באמצעות מיקרו-מכונות לייזר. (B)יריעות PMMA בודדות נחתכו על ידי סופר לייזר CO2. (ג)השכבות המרובות של יריעות PMMA שנוקו נקשרו יחד על ידי בונדר תרמי. קיצורים: MOE= אלקטרוטאטיקה שקופה אופטית רב-ערוצית; PMMA = פולימתיל מתאקרילאט; CO2 = פחמן דו חמצני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: תצלום של שבב MOE. נתון זה שונה מצ'אנג ואח '6. קיצור: MOE= אלקטרואקטיקה שקופה אופטית רב-ערוצית. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: חיבור בינוני וחשמלי לשבב MOE. (A) תצלום של הרכיבים עבור רשת הזרימה הבינונית ורשת ה- EF במערכת המיקרופלואידית MOE, כולל צינור PTFE, מחבר שטוח תחתון, מחבר חרוט, מתאם חרוט-לואר, תקע לבן הדוק לאצבע, מתאם לואר, מזרק מנעול לואר, באנג גומי שחור ואלקטרודות Ag/AgCl. (B) תצלום של התצורה עבור רשת הזרימה הבינונית. קיצורים: MOE= אלקטרוטאטיקה שקופה אופטית רב-ערוצית; EF = שדה חשמלי; PTFE = פוליטרהפלואורואתילן; Ag = כסף; AgCl = כסף כלוריד. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 5: תצלום המציג את שבב MOE במיקרוסקופ. קיצורים: MOE= אלקטרוטאטיקה שקופה אופטית רב-ערוצית; Ag = כסף; AgCl = כסף כלוריד; ITO = תחמוצת אינדיום-פח. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 6: התצורה והמערכת המשמשת לגירוי הדופק DC. (A) תצורת המערכת כולה לגירוי הדופק DC. המזרקים המחוברים לשבב MOE שימשו לעירוי בינוני ופלוט פסולת. פולס DC בשבב סופק על ידי ספק כוח שנערך באמצעות אלקטרודות Ag / AgCl. התקנת ההתקן הותקנה על הבמה הממונעת X-Y-Z של מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות פאזה המצויד במצלמה דיגיטלית. (B)תצלום המציג את ההתקנה על ספסל מעבדה. קיצורים: MOE= אלקטרוטאטיקה שקופה אופטית רב-ערוצית; Ag = כסף; AgCl = כסף כלוריד; ITO = תחמוצת אינדיום-פח; EF = שדה חשמלי. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 7: בידול של תאי mNPC בקבוצת הביקורת (CTL) ובקבוצת גירוי הדופק DC ב- DIV 3, 7 ו- 14. אחוז תאי הנוירון (תאי Tuj1+), האסטרוציטים (תאי GFAP+ ) והאוליגודנדרוציטים (O4+ תאים) ב- (A-C) קבוצת CTL ו -( D-F) בקבוצה גירוי (פולסים DC). נתון זה פורסם ע"י צ'אנג ואח '1. קיצורים: CTL: שליטה; DC = זרם ישיר; Tuj1 = נוירון ספציפי בכיתה III β-טובולין; GFAP = חלבון חומצי פרפור גליה; O4 = סמן אוליגודנדרוציטים O4. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במהלך הייצור של שבב MOE, המתאמים מחוברים לשכבה 1 של שבב MOE עם דבק ציאנואקרילאט מהיר. הדבק מוחל על 4 פינות של המתאמים, ולאחר מכן הלחץ מוחל באופן שווה על המתאמים. יש להימנע מכמות עודפת של דבק כדי להבטיח פולמור מלא של הדבק. יתר על כן, הרכבת שבב MOE הושלמה הוא דגירה בתא ואקום. שלב זה מסייע בהסרת הבועות בין שכבת PMMA, הסרט הדו-צדדי וזכוכית הכיסוי.
הבחירה בחומר האלקטרודה מבוססת על העובדה כי יוני כלוריד, הנמצאים בשפע במדיום, הם המוצרים האלקטרוליטיים הזורמים באזור תרבות התא. במהלך ניסוי גירוי EF, ה- pH סביב האלקטרודות נשאר קבוע. תצורה פשוטה יותר באמצעות פלטינה (Pt) כמו אלקטרוליזה חומר אלקטרודה מים ומייצר יוני מימן (H+) ויונים הידרוקסידיים (OH-) על האלקטרודה החיובית ואת האלקטרודה השלילית, בהתאמה, גרימת שינויי pH באזור התרבות. הימנעות משימוש באלקטרודות Pt עוקפת את הבעיה של שינויי pH במהלך ניסוי גירוי EF.
agarose חם ו agarose ללא בועה חיוניים במהלך הכנת רשת גשר המלח. agarose חם יש נזילות גבוהה ניתן להזריק בקלות לתוך רשת גשר המלח. חבר את מזרק מנעול Luer לאמת Luer לאחר הזרקת 3% חם agarose לתוך מתאם לואר. במהלך שלב זה, agarose יהיה דחף למעלה לתוך מזרק מנעול לואר, כך חיבור המשרד ללא בועה של רשת גשר המלח ניתן להשיג. בועות בגשרי המלח מגבירות את ההתנגדות החשמלית ולכן לא ניתן להגיע לזרם החשמלי הצפוי. לאחר הזרקת agarose, חשוב לחכות agarose להתקרר ולהתמצק בטמפרטורת החדר במשך 10-20 דקות כדי למנוע היווצרות של פסולת agarose מוצק באזור תרבות התא.
שבב MOE ממוקם על תנור ITO הנעול על שלב ממונע X-Y-Z לתכנות. המערכת כולה בנויה על מיקרוסקופ הפוך עם ניגודיות פאזה המצויד במצלמה דיגיטלית לניטור התמיינות התאים באזורי תרבות התאים בשבב. נוח להתבונן במורפולוגיה של התאים וברכישת התמונות האוטומטיות של זמן לשגות במערכת המיקרופלואידית MOE מחוץ לאינקובטור. מערכת מיקרופלואידית זו לא רק מקצרת את זמן הניסוי הנדרש, אלא גם מגבירה את דיוק השליטה במיקרו-וירוס.
תאי mNPC גדלים כהשעיה במדיית תרבות. עם זאת, mNPCs הדבקים בלוח מצופה PLL בשבב MOE הם קריטיים לבידול. נוירוספרות שנוצרו על ידי 30-40 תאים עדיפים על ייזום בידול mNPC. גרימת יתר של mNPCs תפגע בהישרדות התאים במהלך תהליך הבידול. יתר על כן, לאחר גירוי DC פעמו, הניסיון מכתים immunofluorescence יכול להיות מושפע על ידי קצב הזרימה. לפיכך, השתמש במספר קצבי זרימה עבור שלבים שונים כדי למנוע ניתוק תאים במהלך הכביסה.
במחקר זה, מגבלה של טכניקה זו היא כי שבב MOE לא ניתן לעשות שימוש חוזר בגלל הקושי בניקוי יסודי של השבב. עם זאת, שבב MOE יכול להיות ממוקם תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ קונפוקל סריקה ישירות. התכנון ההדוק למים של המערכת המיקרופלואידית המדווחת מבטיח כי אידוי חיץ/בינוני לא יתרחש, תוך שמירה על ריכוז מדויק של החיץ/המדיום והתכונות החשמליות המתאימות. על ידי הפחתת נפחי ריאגנט וזמן הפעולה המתאים, המערכת המיקרופלואידית MOE מספקת גישה יעילה לחקר בידול תאים.
מחקר קודם הראה כי EGF ו bFGF לקדם הישרדות NPC, הרחבה, ותחזוקה במצב מובחן4. במחקר זה, פולסים DC המושרה הבידול של mNPCs במדיום תחזוקת תאי גזע שהכיל EGF ו bFGF. מחקרים קודמים דיווחו כי EF מקדם בידול של NPCs לתוך נוירונים ו / או אסטרוציטים במדיום בידול ללא EGF ו bFGF14,21,22. תוצאות אלה מראות כי mNPCs הבדילו נוירונים, אסטרוציטים, ואוליגודנדרוציטים לאחר גירוי הדופק DC. הם גם מציעים כי טיפול דופק DC פשוט יכול לשלוט על גורלם של NPCs. עם אופטימיזציה נוספת על זמן הגירוי, כוח EF, או מחזור החובה, פולסים DC עשוי להיות מיושם כדי לתפעל בידול NPC וניתן להשתמש בהם לפיתוח אסטרטגיות טיפוליות המעסיקות NPCs לטיפול בהפרעות במערכת העצבים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מודים לפרופסור טאנג ק. טאנג, המכון למדעים ביו-רפואיים, אקדמיה סיניקה, על עזרתו במתן גזע עצבי עכבר ותאי אב (mNPCs). המחברים מודים גם לפרופסור טאנג ק. טאנג ולגברת יינג-שאן לי, על הדיון החשוב שלהם על הבידול של MNPCs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
