Summary
En este estudio, presentamos un protocolo para la diferenciación de células madre neurales y progenitoras (NPC) inducidas únicamente por estimulación del pulso de corriente directa (DC) en un sistema microfluídico.
Abstract
Los campos eléctricos fisiológicos (EF) desempeñan un papel vital en la migración celular, la diferenciación, la división y la muerte. Este artículo describe un sistema de cultivo celular microfluídico que se utilizó para un estudio de diferenciación celular a largo plazo utilizando microscopía. El sistema microfluídico consta de los siguientes componentes principales: un chip electrotáctico ópticamente transparente, un calentador transparente de óxido de indio-estaño (ITO), una bomba de llenado de medios de cultivo, una fuente de alimentación eléctrica, un amplificador de potencia de alta frecuencia, un multiplexor EF, una etapa motorizada X-Y-Z programable y un microscopio de contraste de fase invertido equipado con una cámara digital. El sistema microfluídico es beneficioso para simplificar la configuración experimental general y, a su vez, el reactivo y el consumo de muestras. Este trabajo implica la diferenciación de células madre neurales y progenitoras (NPC) inducidas por estimulación del pulso de corriente directa (CC). En el medio de mantenimiento de células madre, los PNJ del ratón (MNPC) se diferenciaron en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos después de la estimulación del pulso de CC. Los resultados sugieren que el tratamiento simple del pulso de CC podría controlar el destino de los MNPC y podría utilizarse para desarrollar estrategias terapéuticas para los trastornos del sistema nervioso. El sistema se puede utilizar para el cultivo celular en múltiples canales, para la estimulación ef a largo plazo, para la observación morfológica celular y para la adquisición automática de imágenes de lapso de tiempo. Este sistema microfluídico no sólo acorta el tiempo experimental requerido, sino que también aumenta la precisión del control en el microambiente.
Introduction
Las células precursoras neuronales (NPCs, también conocidas como células madre neurales y progenitoras) pueden ser como un candidato prometedor para la estrategia terapéutica neurodegenerativa1. Los PNJ indiferenciados tienen capacidad de autorretración, multipotencia y capacidad proliferativa2,3. Un estudio anterior ha informado de que la matriz extracelular y los mediadores moleculares regulan la diferenciación de NPC. El factor de crecimiento epidérmico (FEAG) y el factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) promueven la proliferación de NPC, manteniendo así el estado indiferenciado4.
Estudios previos han informado que la estimulación eléctrica puede regular las actividades fisiológicas celulares como la división5,la migración6,7,8,la diferenciación1,9,10,y la muerte celular11. Los campos eléctricos (EF) desempeñan un papel vital en el desarrollo y regeneración del desarrollo del sistema nervioso central12,13,14. De 2009 a 2019, este laboratorio ha investigado las respuestas celulares a la aplicación de EF en el sistema microfluídico1,6,7,8,15,16,17. Un chip multicanal, ópticamente transparente y electrotáctico (MOE) fue diseñado para ser adecuado para la tinción de inmunofluorescencia para microscopía confocal. El chip tenía alta transparencia óptica y buena durabilidad y permitió la realización simultánea de tres experimentos de estimulación independientes y varias condiciones inmunodeprimadas en un solo estudio. El sistema microfluídico es beneficioso para simplificar la configuración experimental general y, a su vez, el reactivo y el consumo de muestras. Este artículo describe el desarrollo de un sistema de cultivo celular microfluídico que se utilizó para un estudio de diferenciación celular a largo plazo.
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Protocol
1. Diseño y fabricación del chip MOE
- Dibuje patrones para capas individuales de metacrilato de polimetilo (PMMA) y la cinta de doble cara utilizando el software adecuado (Figura 1A,Tabla de Materiales). Corte las hojas de PMMA y la cinta de doble cara con un escribar de máquina láser CO2 (Figura 1B).
- Encienda el escribar láser CO2 y conéctelo a un ordenador personal. Abra el archivo de patrón diseñado utilizando el software.
- Coloque las láminas PMMA (275 mm x 400 mm) o cinta de doble cara (210 mm x 297 mm) en la plataforma del escribar láser (Figura 2A). Centre el láser en la superficie de las hojas de PMMA o en la cinta de doble cara mediante la herramienta de enfoque automático.
- Seleccione el escribar láser como impresora y, a continuación, "imprima" el patrón utilizando el escribar láser para iniciar la ablación directa en la hoja PMMA o cinta a doble cara y obtener patrones individuales en la hoja o cinta PMMA (Figura 2B).
- Retire la película protectora de las láminas de PMMA y limpie la superficie con gas nitrógeno.
NOTA: El dibujo del patrón PMMA y el mecanizado directo de la hoja PMMA se realizaron de acuerdo con un informe anterior17. - Para unir varias capas de láminas de PMMA, apile tres piezas de láminas de PMMA de 1 mm (capas 1, 2 y 3) y úselos bajo una presión de 5 kg/cm2 en una unión térmica durante 30 minutos a 110 °C para formar el conjunto del canal de flujo/estimulación eléctrica (Figura 2C).
NOTA: Diferentes lotes de lámina de PMMA obtenida comercialmente tienen una temperatura de transición de vidrio ligeramente diferente (Tg). La temperatura óptima de unión debe probarse a incrementos de 5 °C cerca del Tg. - Adherir 12 piezas de adaptadores a las aberturas individuales en la capa 1 del conjunto de chip MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida.
NOTA: Los adaptadores están hechos de PMMA mediante moldeo por inyección. Las superficies planas en la parte inferior son para conectarse al chip MOE. Los adaptadores que llevan rosca de tornillo hembra de 1/4W-28 son para conectar tapones blancos ajustados a los dedos, conectores de fondo plano o adaptadores Luer. Tenga cuidado al usar pegamento de cianoacrilato de acción rápida. Evite salpicar en los ojos. - Desinfectar los sustratos PMMA de 1 mm (Capas 1-3), la cinta de doble cara (Capa 4) y el PMMA de grado óptico de 3 mm (Capa 5) utilizando irradiación ultravioleta (UV) durante 30 minutos antes de montar el chip (Figura 1A).
- Adherido a los sustratos PMMA de 1 mm (Capas 1-3) en el PMMA de grado óptico de 3 mm (Capa 5) con la cinta de doble cara (Capa 4) para completar el ensamblaje de PMMA (Capas 1-5) (Figura 1A).
- Prepare el vaso de cubierta limpio para el conjunto en el chip.
- Llene diez veces la dilución del detergente en un frasco de manchas (ver la Tabla de Materiales),y limpie el vidrio de la cubierta de este detergente usando un limpiador ultrasónico durante 15 minutos.
- Enjuague bien el frasco de manchas debajo del agua corriente del grifo para eliminar todos los rastros del detergente.
- Continúe enjuagando con agua destilada para eliminar todos los rastros de agua del grifo y repita el paso 1.7.2 dos veces.
- Seque el vaso de la cubierta limpia soplando con gas nitrógeno.
- Desinfectar el ensamblaje de PMMA (Capas 1-5), la cinta de doble cara (Capa 6) y el vidrio de la cubierta (Capa 7) usando irradiación UV dentro de un armario de bioseguridad durante 30 minutos antes de montar el chip (Figura 1A).
- Adhiera el vidrio de la cubierta limpia (Capa 7) al ensamblaje pmma (capas 1-5) con la cinta de doble cara (Capa 6) (Figura 1A).
- Incubar el chip MOE en una cámara de vacío durante la noche; utilizar el conjunto de chip MOE para procedimientos posteriores (Figura 3).
2. Recubrimiento de poli-L-lisina (PLL) en el sustrato en las regiones de cultivo celular
- Prepare el tubo de politetrafluoroetileno, el conector de fondo plano, el conector del cono, el adaptador cono-luer, el tapón blanco con los dedos apretados (también llamado tapón), el adaptador Luer, la jeringa de bloqueo Luer y el bung de goma negro(Figura 4A,Tabla de Materiales). Esterilizar todos los componentes anteriores en un autoclave a 121 °C durante 30 min.
- Selle las aberturas de los adaptadores de puente de agar(Figura 1A)con los tapones blancos ajustados a los dedos. Conecte el conector de fondo plano al conjunto de viruta MOE a través de los adaptadores de entrada y salida medianas(Figura 4B). Conecte el adaptador cono-luer a los stopcocks de 3 vías.
- Añadir 2 ml de solución PLL del 0,01% utilizando una jeringa de 3 ml que se conecta al stopcock de 3 vías de la entrada mediana (Figura 4B-
). - Conecte una jeringa vacía de 3 ml al tapón de 3 vías de la toma de corriente media (Figura 4B-
). - Rellene las regiones de cultivo de celda con la solución PLL. Bombee manualmente la solución de recubrimiento de un lado a otro lentamente. Cierre los dos stopcocks de 3 vías para sellar la solución dentro de las regiones de cultivo.
- Incubar el chip MOE a 37 °C durante la noche en una incubadora llena de 5% de CO2 atmósfera.
).
).3. Preparación de la red de puentes salados
- Después del paso 2.6, abra los dos stopcocks de 3 vías y tire las burbujas en los canales bombeando manualmente la solución de recubrimiento de ida y vuelta en el canal usando las dos jeringas.
- Dibuje 3 ml de medio completo (medio de mantenimiento de células madre que consiste en la mezcla nutritiva del águila modificada de Dulbecco F-12 (DMEM/F12), suplemento B-27 del 2%, 20 ng/mL EGF, y 20 ng/mL bFGF) en una jeringa de 3 ml que conecta con el stopcock de 3 vías de la entrada mediana (Figura 4B- y Figura 4B-
). - Añadir 3 ml de medio completo para reemplazar la solución de recubrimiento en las regiones de cultivo celular. Conecte una jeringa vacía de 5 ml al tapón de 3 vías de la toma de corriente media (Figura 4B-
). - Preparar la red de puentes salados (Figura 5).
- Corte el bung de goma negra para producir un hueco, e inserte los electrodos de cloruro de plata (Ag)/plata (AgCl) a través del bung de goma negra y en la jeringa de bloqueo Luer(Figura 4A).
- Reemplace el tapón de la dedo blanca por el adaptador Luer e inyecte un 3% de agarose caliente para llenar el adaptador Luer.
NOTA: Para la preparación de la agarose caliente, disolver 3 g de polvo de agarose en 100 ml de solución salina amortiguada por fosfato (PBS) y esterilizar en un autoclave a 121 °C durante 30 min. - Conecte la jeringa de bloqueo Luer al adaptador Luer. Inyectar 3% de agarose caliente a través de la boquete de goma negra para llenar la jeringa de bloqueo Luer usando la jeringa con aguja. Deje que de 10 a 20 minutos para que la agarose se enfríe y se solidifique.
NOTA: Con el fin de aumentar la capacidad de volumen de la agarose, la jeringa de bloqueo Luer se monta en el adaptador Luer (Figura 4 y Figura 5). A continuación, los electrodos grandes se insertan en la jeringa de bloqueo luer. El electrodo es capaz de proporcionar una estimulación eléctrica estable para el experimento a largo plazo.
).
).4. Preparación de mNC
- Cultea los mNPC1 en el medio completo en un matraz de cultivo celular 25T a 37 °C en una incubadora llena de 5% de CO2 atmósfera. Subculen las células cada 3-4 días, y realizan todos los experimentos con células que han sido sometidas a 3-8 pasajes de la fuente original.
- Transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml y gire las neuroesferas a 100 × g durante 5 minutos. Aspirar el sobrenadante, y lavar las neuroesferas con 1x PBS de Dulbecco (DPBS). Gire hacia abajo las neuroesferas a 100 × g durante 5 minutos.
- Aspirar el 1x DPBS y luego resuspend las neuroesferas en el medio completo. Mezcle bien y suavemente.
- Añadir 1 ml de la suspensión de la neurosfera utilizando una jeringa de 1 ml que se conecta al stopcock de 3 vías de la salida (Figura 4B- ).
5. Configuración del sistema microfluídico para estimulación del pulso CC (Figura 6)
- Instale el chip MOE de semillas de celda en el calentador ITO transparente que se fija en una etapa motorizada X-Y-Z programable.
NOTA: La temperatura superficial ITO se controla mediante un controlador proporcional-integral-derivado y se mantiene a 37 °C. Un termopar tipo K se sujeta entre el chip y el calentador ITO para monitorear la temperatura de las regiones de cultivo celular dentro del chip. El chip MOE está instalado en una etapa motorizada X-Y-Z programable y es adecuado para la adquisición automática de imágenes de lapso de tiempo en secciones de canales individuales. La fabricación del calentador ITO y la configuración del sistema de calefacción de cultivo celular se han descrito previamente18,19. - Infunda los mNPC bombeando manualmente al chip MOE a través de la toma de corriente media. Incubar el chip MOE de semillas celulares en el calentador ITO de 37 °C durante 4 h.
- Después de 4 h, bombear el medio completo a través del chip MOE a través de la entrada media a un caudal de 20 μL/h utilizando una bomba de jeringa.
NOTA: Los mNPC se cultivan y mantienen en el chip durante 24 h adicionales antes de la estimulación ef para permitir el apego y el crecimiento de la célula. El líquido residual se recoge en una jeringa vacía de 5 ml conectada al tapón de 3 vías de la salida, que se muestra como "residuos" en la Figura 6A. La configuración del sistema microfluídico MOE se muestra en la Figura 6. Este sistema microfluídico proporciona un suministro continuo de nutrición a las células. El medio fresco completo se bombea continuamente en el chip MOE para mantener un valor de pH constante. Por lo tanto, las células se pueden cultivar fuera de una incubadora de CO2. - Utilice cables eléctricos para conectar un multiplexador EF al chip MOE a través de los electrodos Ag/AgCl del chip. Conecte un multiplexador EF y un generador de funciones a un amplificador para emitir pulsos de CC de onda cuadrada con una magnitud de 300 mV/mm a una frecuencia de 100 Hz a un 50% de ciclos de trabajo (50% de tiempo encendido y 50% de tiempo de apagado) (Figura 6B).
- Conecte los cables eléctricos al multiplexador EF. Conecte los cables eléctricos al chip MOE a través de los electrodos Ag/AgCl.
- Conecte el multiplexador EF al amplificador mediante cables eléctricos. Conecte el generador de funciones al amplificador y al osciloscopio digital.
NOTA: El multiplexador EF es un circuito que incluye la impedancia de la cámara de cultivo en el circuito y conecta todas las cámaras individuales en una red electrónica paralela. Cada una de las tres cámaras de cultivo está conectada eléctricamente en serie a una resistencia variable (Vr) y un ammeter (que se muestra como μA en la Figura 6A)en el multiplexor. La corriente eléctrica a través de cada cámara de cultivo es variada mediante el control de la Vr, y la corriente se muestra en el ammeter correspondiente. La fuerza de campo eléctrico en cada región de cultivo celular fue calculada por la Ley de Ohm, I= σEA, donde yo es la corriente eléctrica, σ (establecida como 1.38 S·m-1 para DMEM/F1220)es la conductividad eléctrica del medio de cultivo, E es el campo eléctrico, y A es el área transversal de la cámara electrotáctica. Para la dimensión de región de cultivo celular que se muestra en la Figura 1,la corriente eléctrica es ~87 mA y ~44 mA para el pulso DC y DC al 50% del ciclo de trabajo, respectivamente.
- Someta los mNPC a pulsos de CC cuadrados con una magnitud de 300 mV/mm a la frecuencia de 100 Hz durante 48h. Bombee continuamente el medio completo a una velocidad de 10 μL/h para suministrar una nutrición adecuada a las células y mantener un valor constante de pH en el medio.
6. Ensayos de inmunofluorescencia de mNPC después de la estimulación de CC pulsada
NOTA: En este paso, todo reactivo se bombea a través de la entrada mediana utilizando una bomba de jeringa.
- Después de 3, 7 o 14 días de cultivo in vitro (DIV) después de la siembra1,lave las células con 1x PBS a un caudal de 25 μL/min durante 20 minutos.
- Fijar las células con 4% paraformaldehído (PFA). Bombee 4% PFA en el chip a un caudal de 25 μL/min durante 20 minutos para reemplazar el PBS 1x. Para reemplazar el PFA del 4%, lave las celdas con 1x PBS a un caudal de 25 μL/min durante 20 min.
- Bomba 0.1% Tritón X-100 en el chip a un caudal de 50 μL/min durante 6 minutos para permeabilizar las células. Reduzca el caudal a 50 μL/h durante 30 minutos adicionales para reaccionar con las células. Para reemplazar el Tritón X-100 del 0,1%, lave las células con 1x PBS a un caudal de 50 μL/min durante 6 min.
- Bloquee las células con PBS que contenga albúmina sérica bovina (BSA) al 1% para reducir la unión de anticuerpos no específicos. Bombee 1% BSA en el chip a un caudal de 50 μL/min durante 6 min. Reduzca el caudal a 100 μL/h y bombee durante 1 h.
- Bombea los anticuerpos para una doble inmunodetención en el chip a un caudal de 50 μL/min durante 6 min, e incuba el chip durante 18 h a 4 °C. Lave las células con 1x PBS a un caudal de 50 μL/min durante 15 min.
- Bombea los anticuerpos secundarios conjugados con Fluor Alexa en el chip a un caudal de 50 μL/min durante 6 min. Reduzca el caudal a 50 μL/h y bombee los anticuerpos durante 1 h a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave las células con 1x PBS a un caudal de 50 μL/min durante 15 min.
- Para la tinción nuclear, bombee Hoechst 33342 en el chip a un caudal de 20 μL/min durante 10 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Lave las células con 1x PBS a un caudal de 50 μL/min durante 15 min.
- Después de la inmunodetención, observe las células utilizando un microscopio de fluorescencia confocal.
7. Análisis de imágenes y procesamiento de datos
- Analice las imágenes fluorescentes utilizando software con herramientas de medición integradas (consulte la Tabla de materiales).
- Compare los núcleos manchados de contador Hoechst (número total de células) en los grupos de control y tratamiento, y calcule el porcentaje de células que expresan cada marcador fenotípico.
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Representative Results
La configuración detallada del chip MOE se muestra en el cuadro 1. El chip microfluídico proporciona un enfoque beneficioso para reducir el tamaño de configuración experimental, el volumen de la muestra y el volumen de reactivos. El chip MOE fue diseñado para realizar tres experimentos independientes de estimulación ef y varias condiciones de inmunodetención simultáneamente en un solo estudio (Figura 3). Además, el chip MOE, que tiene una alta transparencia óptica, es adecuado para exámenes de microscopía confocal. El chip MOE también está diseñado para investigar los efectos de diferentes condiciones de cultivo celular (por ejemplo, estimulación de EF múltiple, varios fármacos, sustrato de recubrimiento diferente, varias series de células) simultáneamente en un solo experimento.
Los mNC estaban expuestos a pulsos de CC de onda cuadrada (magnitud 300 mV/mm a una frecuencia de 100 Hz). La estimulación del pulso de CC se llevó a cabo durante 48 h. Las células diferenciadas fueron inmunodeprimidas con Tuj1 (β-tubulina de clase III específica de la neurona), proteína ácida fibrilarina glial (GFAP para identificar astrocitos) y marcador de oligodendrocitoSO4. Después del tratamiento del pulso de CC, los MNPC expresaron un número significativamente alto de neuronas (células Tuj1+) en DIV 7. En DIV 3, los astrocitos (células GFAP+) estaban presentes en niveles relativamente más altos en los grupos de estimulación que en el grupo de control (CTL). En comparación con el grupo CTL, los oligodendrocitos (células O4+) fueron significativamente más altos en el grupo de estimulación en DIV 7 y DIV 14 (Figura 7). Estos resultados muestran que la estimulación del pulso de CC dio lugar a mNPC que se diferencian en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos simultáneamente en el medio de mantenimiento de células madre. Estos resultados sugieren que el sistema microfluídico MOE es adecuado para un estudio de diferenciación celular a largo plazo por microscopía.
Figura 1: La configuración detallada del chip electrotáctico ópticamente transparente multicanal. (A) Vista explosionada del conjunto de chips MOE. El chip MOE consta de láminas PMMA (50 mm x 25 mm x 1 mm), cinta de doble cara (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptadores (10 mm x 10 mm x 6 mm), lámina PMMA de grado óptico (50 mm x 75 mm x 3 mm), cinta de doble cara (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) y un cristal de cubierta (24 mm × 60 mm). Hay tres cámaras de cultivo celular en el chip MOE. El chip MOE tiene orificios de conexión para la entrada/salida mediana y los puentes de sal del agar. Las células se cultivaban en la región de cultivo celular (ancho 3 mm x longitud 42 mm x altura 0,07 mm). La Figura 1A ha sido modificada de Chang et al.6. (B) Fotografía del chip MOE que comprende adaptadores, láminas de PMMA, cinta a doble cara y vidrio de cubierta. Abreviaturas: MOE= electrotáctica ópticamente transparente multicanal; PMMA = metacrilato de polimetilo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Los procesos de fabricación y montaje del chip MOE. (A) Los patrones diseñados de las láminas PMMA o cinta de doble cara fueron fabricados con micromechining láser. (B) Las hojas individuales de PMMA fueron cortadas por un escriban láser de CO2. (C) Las múltiples capas de las láminas de PMMA limpiadas fueron unidas juntas por un bonder térmico. Abreviaturas: MOE= electrotáctica ópticamente transparente multicanal; PMMA = metacrilato de polimetilo; CO2 = dióxido de carbono. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Una fotografía del chip MOE. Esta cifra ha sido modificada de Chang et al.6. Abreviatura: MOE= electrotáctica ópticamente transparente multicanal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Conexión media y eléctrica al chip MOE. (A) Fotografía de los componentes de la red de flujo medio y la red EF en el sistema microfluídico MOE, incluyendo el tubo PTFE, conector de fondo plano, conector de cono, adaptador cono-luer, enchufe blanco ajustado a los dedos, adaptador Luer, jeringa de bloqueo Luer, boina de goma negra y los electrodos Ag/AgCl. (B) Fotografía de la configuración de la red de flujo medio. Abreviaturas: MOE= electrotáctica ópticamente transparente multicanal; EF = campo eléctrico; PTFE = politetrafluoroetileno; Ag = plata; AgCl = cloruro de plata. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Una fotografía que muestra el chip MOE en un microscopio. Abreviaturas: MOE= electrotáctica ópticamente transparente multicanal; Ag = plata; AgCl = cloruro de plata; ITO = indium-tin-oxide. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: La configuración y el sistema utilizado para la estimulación del pulso CC. (A) La configuración de todo el sistema para la estimulación del pulso CC. Las jeringas conectadas al chip MOE se utilizaron para la perfusión media y el eflujo residual. El pulso de CC en el chip fue proporcionado por una fuente de alimentación realizada a través de los electrodos Ag/AgCl. La configuración del dispositivo se instaló en la etapa motorizada X-Y-Z de un microscopio de contraste de fase invertido equipado con una cámara digital. B) Una fotografía que muestra la configuración en un banco de laboratorio. Abreviaturas: MOE= electrotáctica ópticamente transparente multicanal; Ag = plata; AgCl = cloruro de plata; ITO = indium-tin-oxide; EF = campo eléctrico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Diferenciación de las células mNPC en el grupo de control (CTL) y en el grupo de estimulación del pulso CC en DIV 3, 7 y 14. El porcentaje de neuronas (células Tuj1+), astrocitos (células GFAP+) y oligodendrocitos (células O4+) en (A-C) el grupo CTL y (D-F) en el grupo de estimulación (pulsos DC). Esta cifra ha sido publicada por Chang et al.1. Abreviaturas: CTL: control; DC = corriente directa; Tuj1 = β-tubulina de clase III específica de la neurona; GFAP = proteína ácida fibrilarárica glial; O4 = marcador de oligodendrocitoS4. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Durante la fabricación del chip MOE, los adaptadores se unen a la Capa 1 del chip MOE con pegamento de cianoacrilato de acción rápida. El pegamento se aplica a 4 esquinas de los adaptadores, y luego la presión se aplica uniformemente sobre los adaptadores. Se debe evitar el exceso de pegamento para garantizar la polimerización completa del pegamento. Además, el conjunto de chips MOE completado se incuba en una cámara de vacío. Este paso ayuda a eliminar las burbujas entre la capa PMMA, la cinta de doble cara y el cristal de la cubierta.
La elección del material de electrodo se basa en el hecho de que los iones de cloruro, que están abundantemente presentes en el medio, son los productos electrolíticos que fluyen a través de la región del cultivo celular. Durante el experimento de estimulación ef, el pH alrededor de los electrodos se mantuvo constante. Una configuración más simple usando platino (Pt) como material de electrodo electrolice el agua y genera iones de hidrógeno (H+) e iones de hidróxido (OH-) en el electrodo positivo y el electrodo negativo, respectivamente, induciendo cambios de pH en la región de cultivo. Evitar el uso de electrodos Pt elude el problema de los cambios de pH durante el experimento de estimulación ef.
La agarose caliente y la agarose sin burbujas son esenciales durante la preparación de la red de puentes de sal. La agarose caliente tiene alta fluidez y se puede inyectar fácilmente en la red de puentes de sal. Conecte la jeringa de bloqueo Luer al adaptador Luer después de inyectar el 3% de agarose caliente en el adaptador Luer. Durante este paso, la agarose será empujada hacia arriba en la jeringa de bloqueo Luer para que se pueda lograr una conexión firme libre de burbujas de la red de puentes de sal. Las burbujas en los puentes de sal aumentan la resistencia eléctrica y, por lo tanto, no se puede alcanzar la corriente eléctrica prevista. Después de la inyección de agarose, es importante esperar a que la agarose se enfríe y se solidifique a temperatura ambiente durante 10-20 minutos para evitar la formación de desechos de agarose solidificados en la región del cultivo celular.
El chip MOE se coloca en un calentador ITO que está bloqueado en una etapa motorizada X-Y-Z programable. Todo el sistema está construido sobre un microscopio de contraste de fase invertido equipado con una cámara digital para monitorear la diferenciación celular dentro de las regiones de cultivo celular en el chip. Es conveniente observar la morfología celular y la adquisición de las imágenes automáticas de lapso de tiempo en el sistema microfluídico MOE fuera de una incubadora. Este sistema microfluídico no sólo acorta el tiempo experimental requerido, sino que también aumenta la precisión del control en el microambiente.
Las células mNPC crecen como una suspensión en los medios de cultivo. Sin embargo, los mNC que se adhieren a la placa recubierta de PLL en el chip MOE son críticos para la diferenciación. Neuroesferas formadas por 30-40 células son preferidas para iniciar la diferenciación mNPC. El crecimiento excesivo de mNPC afectará la supervivencia celular durante el proceso de diferenciación. Además, después de la estimulación de CC pulsada, la tinción de inmunofluorescencia experimental puede verse afectada por el caudal. Por lo tanto, utilice varios caudales para diferentes pasos para evitar separar las células durante el lavado.
En este estudio, una limitación de esta técnica es que el chip MOE no puede ser reutilizado debido a la dificultad en la limpieza exhaustiva del chip. Sin embargo, el chip MOE se puede colocar bajo un microscopio de contraste de fase o un microscopio confocal de barrido directamente. El diseño hermético del sistema microfluídico notificado garantiza que no se produzca una evaporación tampón/media, manteniendo la concentración precisa del buffer/medio y las propiedades eléctricas correspondientes. Al reducir los volúmenes de reactivos y el tiempo de operación correspondiente, el sistema microfluídico MOE proporciona un enfoque eficiente para estudiar la diferenciación celular.
Un estudio anterior ha demostrado que el FEAG y bFGF promueven la supervivencia, expansión y mantenimiento del NPC en el estado indiferenciado4. En este estudio, los pulsos de CC indujeron la diferenciación de los MNPCs en el medio de mantenimiento de células madre que contenía EGF y bFGF. Estudios anteriores han informado de que EF promueve la diferenciación de npcs en neuronas y/o astrocitos en medio de diferenciación sin EGF y bFGF14,21,22. Estos resultados muestran que los MNPC se diferenciaron en neuronas, astrocitos y oligodendrocitos después de la estimulación del pulso de CC. También sugieren que un tratamiento simple con pulso de CC podría controlar el destino de los PNJ. Con una mayor optimización en el tiempo de estimulación, la fuerza de EF o el ciclo de trabajo, los pulsos de CC se pueden aplicar para manipular la diferenciación de NPC y se pueden utilizar para el desarrollo de estrategias terapéuticas que emplean PNJ para tratar trastornos del sistema nervioso.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen al profesor Tang K. Tang, del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Academia Sinica, su ayuda para proporcionar células progenitoras y madre neural del ratón (MNPCs). Los autores también agradecen al Profesor Tang K. Tang y a la Sra. Ying-Shan Lee, su valioso debate sobre la diferenciación de los MNPC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
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