Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Elektrisk-felt-induceret neurale prækursor celle differentiering i mikrofluidiske enheder

Published: April 14, 2021 doi: 10.3791/61917
Automatic Translation
1, 1, 1,2,3,4
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

Summary

I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol for differentiering af neurale stamceller og stamceller (NPC'ere), der udelukkende er fremkaldt af jævnstrøms (DC) pulsstimulation i et mikrofluidisk system.

Abstract

Fysiologiske elektriske felter (EF) spiller afgørende roller i cellemigration, differentiering, division og død. Dette papir beskriver et mikrofluidisk cellekultursystem, der blev brugt til en langsigtet celledifferentieringsundersøgelse ved hjælp af mikroskopi. Det mikrofluidiske system består af følgende hovedkomponenter: en optisk gennemsigtig elektrotaktisk chip, en gennemsigtig indium-tin-oxid (ITO) varmelegeme, en kultur mediefyldningspumpe, en elektrisk strømforsyning, en højfrekvent effektforstærker, en EF-multiplexer, en programmerbar X-Y-Z motoriseret fase og et omvendt fasekontrastmikroskop udstyret med et digitalt kamera. Det mikrofluidiske system er gavnligt med hensyn til at forenkle den overordnede eksperimentelle opsætning og til gengæld reagens- og prøveforbruget. Dette arbejde indebærer differentiering af neurale stamceller og stamceller (NPC'er) induceret af jævnstrøm (DC) pulsstimulation. I stamcellevedligeholdelsesmediet differentierede musens NPC'er (mNPC'er) sig til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter efter DC-pulsstimulationen. Resultaterne tyder på, at simpel DC puls behandling kunne kontrollere skæbnen for MNPC'er og kan bruges til at udvikle terapeutiske strategier for nervesystemet lidelser. Systemet kan bruges til cellekultur i flere kanaler, til langsigtet EF-stimulering, til cellemorfologiske observationer og til automatisk time-lapse billedopsamling. Dette mikrofluidiske system forkorter ikke kun den krævede forsøgstid, men øger også nøjagtigheden af kontrollen med mikromiljøet.

Introduction

Neurale prækursorceller (NPC'ere, også kendt som neurale stamceller og stamceller) kan være som en lovende kandidat til neurodegenerativ terapeutisk strategi1. De udifferentierede NPC'ere har selvfornyelseskapacitet , multistyrke og proliferativ evne2,3. En tidligere undersøgelse har rapporteret, at den ekstracellulære matrix og molekylære mæglere regulere differentiering af NPC. Den epidermale vækstfaktor (EGF) og den grundlæggende fibroblastvækstfaktor (bFGF) fremmer NPC-spredning og opretholder dermed den udifferentierede tilstand4.

Tidligere undersøgelser har rapporteret, at elektrisk stimulation kan regulere cellefysiologiske aktiviteter som division5, migration6,7,8, differentiering1,9,10og celledød11. Elektriske felter (EFs) spiller afgørende roller i udviklingen og regenerering af centralnervesystemet udvikling12,13,14. Fra 2009 til 2019 har dette laboratorium undersøgt cellulære reaktioner på anvendelsen af EF i det mikrofluidiske system1,6, 7,8,15,16,17. En multikanal, optisk gennemsigtig, elektrotaktisk (MOE) chip er designet til at være egnet til immunfluorescens farvning til konfokal mikroskopi. Chippen havde høj optisk gennemsigtighed og god holdbarhed og tillod samtidig udførelse af tre uafhængige stimulationseksperimenter og flere immunostained betingelser i en enkelt undersøgelse. Det mikrofluidiske system er gavnligt med hensyn til at forenkle den overordnede eksperimentelle opsætning og til gengæld reagens- og prøveforbruget. Dette papir beskriver udviklingen af et mikrofluidisk cellekultursystem, der blev brugt til en langsigtet celledifferentieringsundersøgelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Design og fremstilling af MOE-chippen

  1. Tegn mønstre for individuelle polymethylmethanlag (PMMA) og dobbeltsidet tape ved hjælp af passende software (Figur 1A, Materialetabel). Klip både PMMA-arkene og det dobbeltsidede bånd med en CO 2-lasermaskineskribent (Figur 1B).
    1. Tænd for CO2 laserskriveren, og tilslut den til en personlig computer. Åbn den designede mønsterfil ved hjælp af softwaren.
    2. Pmma-arkene (275 mm x 400 mm) eller dobbeltsidet tape (210 mm x 297 mm) anbringes på laserskriverens platform (Figur 2A). Fokuser laseren på overfladen af PMMA-arkene eller det dobbeltsidede bånd ved hjælp af værktøjet til automatisk fokusering.
    3. Vælg laserskriveren som printer, og "udskriv" derefter mønsteret ved hjælp af laserskriveren for at starte den direkte ablation på PMMA-arket eller dobbeltsidet tape og få individuelle mønstre på PMMA-arket eller -båndet (Figur 2B).
  2. Fjern beskyttelsesfilmen fra PMMA-arkene, og rengør overfladen ved hjælp af nitrogengas.
    BEMÆRK: Tegningen af PMMA-mønsteret og den direkte bearbejdning af PMMA-arket blev udført i henhold til en tidligere rapport17.
  3. Til sammenbinding af flere lag PMMA-ark skal du stable tre stykker 1 mm PMMA-ark (lag 1, 2 og 3) og binde dem under et tryk på 5 kg/cm2 i en termisk binding i 30 minutter ved 110 °C for at danne flow/elektrisk stimulationskanalsamling(Figur 2C).
    BEMÆRK: Forskellige partier af kommercielt fremstillede PMMA-plader har en lidt anden glasovergangstemperatur (Tg). Den optimale bindingstemperatur skal testes ved trin på 5 °C tæt på Tg.
  4. Hold 12 stykker adaptere til de enkelte åbninger i lag 1 af MOE-spånsamlingen med hurtigtvirkende cyanoacrylatlim.
    BEMÆRK: Adapterne er lavet af PMMA ved sprøjtestøbning. De flade overflader i bunden er til tilslutning til MOE-chippen. Adapterne med 1/4W-28 kvindelige skruetråd er beregnet til tilslutning af hvide fingertætte stik, flade bundstik eller Luer-adaptere. Vær forsigtig, når du bruger hurtigtvirkende cyanoacrylatlim. Undgå at sprøjte ind i øjnene.
  5. Desinficere 1 mm PMMA-substraterne (Lag 1-3), det dobbeltsidede bånd (Lag 4) og den 3 mm optiske pmma-kvalitet (lag 5) ved hjælp af ultraviolet (UV) bestråling i 30 minutter, før chippen samles (Figur 1A).
  6. Vedhæft 1 mm PMMA-underlagene (Lag 1-3) på den 3 mm optiske pmma-kvalitet (lag 5) med det dobbeltsidede bånd (lag 4) for at fuldføre PMMA-samlingen (Lag 1-5) (Figur 1A).
  7. Forbered det rene dækglas til samlingen på chippen.
    1. Fyld en ti gange fortynding af vaskemidlet i en farvningskrukke (se materialebordet), og rengør dækglasset i dette vaskemiddel ved hjælp af en ultralydsrenser i 15 minutter.
    2. Skyl pletglasset grundigt under rindende postevand for at fjerne alle spor af vaskemidlet.
    3. Fortsæt skylning med destilleret vand for at fjerne alle spor af postevand, og gentag trin 1.7.2 to gange.
    4. Tør det rensede dækglas ved at blæse det med nitrogengas.
  8. Desinficere PMMA-samlingen (Lag 1-5), det dobbeltsidede bånd (Lag 6) og dækglasset (Lag 7) ved hjælp af UV-bestråling inde i et biosikkerhedsskab i 30 minutter, før chippen samles (Figur 1A).
  9. Hold det rensede dækglas (Lag 7) fast på PMMA-samlingen (Lag 1-5) med det dobbeltsidede bånd (Lag 6) (Figur 1A).
  10. Inkubat MOE-chippen i et vakuumkammer natten over; brug MOE-chipsamlingen til efterfølgende procedurer (figur 3).

2. Belægning af poly-L-lysin (PLL) på substratet i cellekulturregionerne

  1. Forbered polytetrafluorethylenrøret, fladbundet stik, keglestik, kegle-Luer-adapter, hvidt fingertæt stik (også kaldet prop), Luer-adapter, Luer-låsesprøjte og sort gummibung (Figur 4A, Materialetabel). Alle ovennævnte komponenter steriliseres i en autoklave ved 121 °C i 30 min.
  2. Forsegl åbningerne af agarbroens adaptere (Figur 1A) med de hvide fingertætte stik. Tilslut det flade stik til MOE-chipsamlingen via mediumindløbs- og udløbsadapterne (Figur 4B). Tilslut kegle-Luer-adapteren til 3-vejs stophaner.
  3. Der tilsættes 2 ml pll-opløsning på 0,01 % ved hjælp af en 3 ml sprøjte, der tilsluttes mediumindløbets 3-vejs stophane (Figur 4B- Equation 1 ).
  4. Tilslut en tom 3 mL sprøjte til 3-vejs stophane af medium stikkontakten(Figur 4B- Equation 2 ).
  5. Fyld cellekulturregionerne med PLL-løsningen. Pump belægningsopløsningen manuelt langsomt frem og tilbage. Luk de to 3-vejs stophaner for at forsegle opløsningen inde i kulturregionerne.
  6. Moe-chippen inkuberes ved 37 °C natten over i en inkubator fyldt med 5% CO2-atmosfære.

3. Forberedelse af saltbronettet

  1. Efter trin 2.6 skal du åbne de to 3-vejs stophaner og skylle boblerne væk i kanalerne ved manuelt at pumpe belægningsopløsningen frem og tilbage i kanalen ved hjælp af de to sprøjter.
  2. Tegne 3 mL komplet medium (stamcellevedligeholdelsesmedium bestående af Dulbeccos modificerede Eagle's medium/Skinkes næringsstofblanding F-12 (DMEM/F12), 2% B-27 supplement, 20 ng/mL EGF og 20 ng/mL bFGF) i en 3 mL sprøjte, der forbinder til 3-vejs stophane af medium indløbet (Figur 4B- Equation 1 og Figur 4B- Equation 3 ).
  3. Tilsæt 3 ml komplet medium for at erstatte belægningsopløsningen i cellekulturområderne. Tilslut en tom 5 mL sprøjte til 3-vejs stophane af medium stikkontakten(Figur 4B- Equation 4 ).
  4. Forbered saltbronettet (figur 5).
    1. Skær den sorte gummi bung at producere et hul, og indsætte sølv (Ag) / sølvchlorid (AgCl) elektroder gennem den sorte gummi bung og ind i Luer lås sprøjte (Figur 4A).
    2. Udskift det hvide fingertight stik med Luer-adapteren, og injicere 3% varm agarose for at fylde Luer-adapteren.
      BEMÆRK: Til fremstilling af varm agarose opløses 3 g agarosepulver i 100 mL fosfatbufferet saltvand (PBS) og steriliseres i en autoklave ved 121 °C i 30 min.
    3. Tilslut Luer-låsesprøjten til Luer-adapteren. Injicere 3% varm agarose gennem den sorte gummi bung at fylde Luer lås sprøjten ved hjælp af sprøjten med nål. Lad 10 til 20 minutter for agarose at køle ned og størkne.
      BEMÆRK: For at øge agaroses volumenkapacitet monteres Luer-låsesprøjten på Luer-adapteren(figur 4 og figur 5). Derefter indsættes de store elektroder i Luer-låsesprøjten. Elektroden er i stand til at give en stabil elektrisk stimulation til det langsigtede eksperiment.

4. Forberedelse af de ikke-kinesiske lande

  1. MNPC'erne1 dyrkes i hele mediet i en 25T-cellekulturkolbe ved 37 °C i en inkubator fyldt med 5% CO2-atmosfære. Subkultur cellerne hver 3-4 dage, og udføre alle eksperimenter med celler, der har gennemgået 3-8 passager fra den oprindelige kilde.
  2. Overfør celleaffjedringen til et 15 mL konisk rør, og spin-down neurosfærerne ved 100 × g i 5 min. Aspirere supernatant, og vask neurosfærerne med 1x Dulbecco's PBS (DPBS). Spin-down neurosfærerne på 100 × g i 5 min.
  3. Aspirere 1x DPBS og derefter genbruge neurosfærerne i det komplette medium. Bland grundigt og forsigtigt.
  4. Tilsæt 1 mL af neurosfærens affjedring ved hjælp af en 1 mL sprøjte, der forbinder til 3-vejs stophane af stikkontakten(Figur 4B- Equation 2 ).

5. Opsætning af det mikrofluidiske system til stimulering af domænecontrollerimpuls (figur 6)

  1. Installer den celleseedede MOE-chip på den gennemsigtige ITO-varmelegeme, der er fastgjort på en programmerbar X-Y-Z motoriseret scene.
    BEMÆRK: ITO's overfladetemperatur styres af en proportional integral-afledt controller og holdes ved 37 °C. En K-type termoelement er fastspændt mellem chippen og ITO varmelegeme til at overvåge temperaturen i cellekulturen regioner i chippen. MOE-chippen er installeret på et programmerbart X-Y-Z motoriseret stadie og er velegnet til automatisk time-lapse billedopsamling ved individuelle kanalsektioner. Fremstillingen af ITO varmelegeme og opsætningen af cellekulturens varmesystem er blevet beskrevet tidligere18,19.
  2. Tilfør de mNPC'er ved manuelt at pumpe ind i MOE-chippen via mediumudgangen. Den celleseedede MOE-chip inkuberes på ITO-varmeapparatet på 37 °C i 4 timer.
  3. Efter 4 timer pumpes hele mediet gennem MOE-chippen via mediumindløbet med en strømningshastighed på 20 μL/h ved hjælp af en sprøjtepumpe.
    BEMÆRK: De mNPC'er dyrkes og vedligeholdes i chippen i yderligere 24 timer før EF-stimulering for at tillade celletilbehør og vækst. Affaldsvæsken opsamles i en tom 5 mL sprøjte, der er forbundet med stikkontaktens 3-vejs stophane, vist som "affald" i figur 6A. Moe-mikrofluidisk systemkonfiguration er vist i figur 6. Dette mikrofluidiske system giver en kontinuerlig forsyning af ernæring til cellerne. Det komplette friske medium pumpes kontinuerligt ind i MOE-chippen for at opretholde en konstant pH-værdi. Derfor kan cellerne dyrkes uden for en CO 2-inkubator.
  4. Brug elektriske ledninger til at tilslutte en EF multiplexer til MOE-chippen via Ag/AgCl-elektroderne på chippen. Tilslut en EF multiplexer og en funktionsgenerator til en forstærker til output firkantede DC-impulser med en hastighed på 300 mV/mm med en frekvens på 100 Hz ved 50% arbejdscyklus (50% time-on og 50% time-off)(Figur 6B).
    1. Tilslut de elektriske ledninger til EF multiplexeren. Tilslut de elektriske ledninger til MOE-chippen via Ag/AgCl elektroderne.
    2. Tilslut EF-multiplexeren til forstærkeren ved hjælp af elektriske ledninger. Tilslut funktionsgeneratoren til forstærkeren og det digitale oscilloskop.
      BEMÆRK: EF multiplexeren er et kredsløb, der omfatter dyrkningskammerets impedans i kredsløbet og forbinder alle individuelle kamre i et parallelt elektronisk netværk. Hvert af de tre kulturkamre er elektrisk forbundet med en variabel modstand (Vr) og et ammeter (vist som μA i figur 6A)i multiplexeren. Den elektriske strøm gennem hvert kulturkammer varieres ved at styre vr'en, og strømmen vises på det tilsvarende ammeter. Den elektriske feltstyrke i hver cellekulturregion blev beregnet ved Ohms lov, I= σEA, hvor jeg er den elektriske strøm, σ (indstillet til 1,38 S·m-1 for DMEM/F1220) er kulturmediets elektriske ledningsevne, E er det elektriske felt, og A er det tværsnitsareal i det elektrotaktiske kammer. For cellekulturregionsdimensionen vist i figur 1er den elektriske strøm ~87 mA og ~44 mA for henholdsvis DC- og DC-puls ved henholdsvis 50% arbejdscyklus.
  5. Omemne mNPC'erne til firkantede DC-impulser med en størrelse på 300 mV/mm ved frekvensen 100 Hz i 48 timer. Pump hele mediet kontinuerligt med en hastighed på 10 μL/h for at levere tilstrækkelig ernæring til cellerne og for at opretholde en konstant pH-værdi i mediet.

6. Immunfluorescensanalyser af mNPC'er efter pulserende DC-stimulering

BEMÆRK: I dette trin pumpes alt reagens via det mellemstore indløb ved hjælp af en sprøjtepumpe.

  1. Efter 3, 7 eller 14 dages in vitro (DIV) dyrkning efter såning1vaskes cellerne med 1x PBS med en strømningshastighed på 25 μL/min. i 20 min.
  2. Ret cellerne med 4% paraformaldehyd (PFA). Pump 4% PFA ind i chippen med en strømningshastighed på 25 μL/min i 20 minutter for at erstatte 1x PBS. For at erstatte 4% PFA vaskes cellerne med 1x PBS med en strømningshastighed på 25 μL/min. i 20 min.
  3. Pump 0,1% Triton X-100 ind i chippen med en strømningshastighed på 50 μL/min i 6 min. for at gennemtrænge cellerne. Reducere strømningshastigheden til 50 μL/h i yderligere 30 minutter for at reagere med cellerne. For at erstatte 0,1% Triton X-100 vaskes cellerne med 1x PBS med en strømningshastighed på 50 μL/min i 6 min.
  4. Bloker cellerne med PBS, der indeholder 1% bovin serum albumin (BSA) for at reducere uspecifik antistofbinding. Pump 1% BSA ind i chippen med en strømningshastighed på 50 μL/min. i 6 min. Strømningshastigheden reduceres til 100 μL/h og pumpes i 1 time.
  5. Antistofferne pumpes til dobbelt immunfarvning ind i chippen med en strømningshastighed på 50 μL/min. i 6 min. og inkuber chippen i 18 timer ved 4 °C. Cellerne vaskes med 1x PBS med en strømningshastighed på 50 μL/min. i 15 min.
  6. Pump Alexa Fluorkonjugerede sekundære antistoffer ind i chippen med en strømningshastighed på 50 μL/min i 6 min. Strømningshastigheden reduceres til 50 μL/h, og antistofferne pumpes i 1 time ved stuetemperatur i mørke. Cellerne vaskes med 1x PBS med en strømningshastighed på 50 μL/min. i 15 min.
  7. Til nuklear farvning pumpes Hoechst 33342 ind i chippen med en strømningshastighed på 20 μL/min. i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke. Cellerne vaskes med 1x PBS med en strømningshastighed på 50 μL/min. i 15 min.
  8. Efter immunostaining observeres cellerne ved hjælp af et konfokalt fluorescensmikroskop.

7. Billedanalyse og databehandling

  1. Analyser fluorescerende billeder ved hjælp af software med indbyggede måleværktøjer (se materialeoversigten).
  2. Sammenlign hoechst-tællerens indgroede kerner (det samlede antal celler) i kontrol- og behandlingsgrupperne, og beregn procentdelen af celler, der udtrykker hver fænotypisk markør.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den detaljerede konfiguration af MOE-chippen er vist i figur 1. Den mikrofluidiske chip giver en gavnlig tilgang til at reducere den eksperimentelle opsætningsstørrelse, prøvevolumen og reagensvolumen. MOE-chippen er designet til at udføre tre uafhængige EF-stimulationseksperimenter og flere immundæmpende tilstande samtidigt i en enkelt undersøgelse (Figur 3). Derudover er MOE-chippen, som har en høj optisk gennemsigtighed, velegnet til konfokale mikroskopiundersøgelser. MOE-chippen er også designet til at undersøge virkningerne af forskellige cellekulturforhold (f.eks. flere EF-stimulering, flere lægemidler, forskelligt belægningssubstrat, flere celleserier) samtidigt i et enkelt eksperiment.

MNPC'erne blev udsat for firkantede DC-impulser (størrelsesorden 300 mV/mm med en frekvens på 100 Hz). DC pulsstimulation blev udført i 48 timer. De differentierede celler blev immunostained med Tuj1 (neuron-specifikke klasse III β-tubulin), glia fibrillary sure protein (GFAP at identificere astrocytter), og oligodendrocyt markør O4. Efter DC-pulsbehandlingen udtrykte mNPC'erne betydeligt et stort antal neuroner (Tuj1+ celler) ved DIV 7. Ved DIV 3 var astrocytter (GFAP+-celler) til stede på relativt højere niveauer i stimuleringsgrupperne end i kontrolgruppen (CTL). Sammenlignet med CTL-gruppen var oligodendrocytter (O4+ celler) betydeligt højere i stimuleringsgruppen ved DIV 7 og DIV 14 (Figur 7). Disse resultater viser, at DC puls stimulation resulterede i MNPCs differentiere i neuroner, astrocytter, og oligodendrocytter samtidig i stamceller vedligeholdelse medium. Disse resultater tyder på, at MOE mikrofluidic system er egnet til en langsigtet celle differentiering undersøgelse ved mikroskopi.

Figure 1
Figur 1: Den detaljerede konfiguration af multikanalen optisk gennemsigtig elektrotaktisk chip. MOE-chippen består af PMMA-plader (50 mm x 25 mm x 1 mm), dobbeltsidet tape (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptere (10 mm x 10 mm x 6 mm ), pmma-ark af optisk kvalitet (50 mm x 75 mm x 3 mm), dobbeltsidet tape (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) og et dækglas (24 mm × 60 mm). Der er tre cellekulturkamre i MOE-chippen. MOE-chippen har forbindelseshuller til mediumindløb/udløb og agarsaltbroerne. Cellerne blev dyrket i cellekulturområdet (bredde 3 mm x længde 42 mm x højde 0,07 mm). Figur 1A er blevet ændret fra Chang et al.6. (B) Fotografi af MOE-chippen bestående af adaptere, PMMA-plader, dobbeltsidet tape og dækglas. Forkortelser: MOE= multikanal optisk gennemsigtig elektrotaktisk; PMMA = polymethylmethanthacrylat. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Fremstillings- og samlingsprocesserne for MOE-chippen ( A) De designede mønstre i PMMA-arkene eller dobbeltsidet tape blev fremstillet ved hjælp af lasermikromaskin. (B) De enkelte PMMA-plader blev skåret af en CO2 laserskriver. (C) De mange lag af de rensede PMMA-plader blev bundet sammen af en termisk bindingsmand. Forkortelser: MOE= multikanal optisk gennemsigtig elektrotaktisk; PMMA = polymethylmethanthacrylat; CO2 = kuldioxid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Et fotografi af MOE-chippen. Dette tal er blevet ændret fra Chang et al.6. Forkortelse: MOE= multikanal optisk gennemsigtig elektrotaktisk. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Mellem- og elektrisk forbindelse til MOE-chippen ( A) Foto af komponenterne til det mellemstore flownetværk og EF-netværket i MOE-mikrofluidic-systemet, herunder PTFE-røret, fladt bundstik, keglestik, kegle-Luer-adapter, hvidt fingertæt stik, Luer-adapter, Luer-låsesprøjte, sort gummibung og Ag/AgCl-elektroderne. (B) Fotografi af konfigurationen for det mellemstore flow netværk. Forkortelser: MOE= multikanal optisk gennemsigtig elektrotaktisk; EF = elektrisk felt; PTFE = polytetrafluorethylen; Ag = sølv; AgCl = sølvchlorid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Et fotografi, der viser MOE-chippen på et mikroskop. Forkortelser: MOE= multikanal optisk gennemsigtig elektrotaktisk; Ag = sølv; AgCl = sølvchlorid; ITO = indium-tin-oxid. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Konfigurationen og systemet, der anvendes til DC-pulsstimulationen. Sprøjterne, der var forbundet med MOE-chippen, blev brugt til medium infusion og affaldssens. DC-pulsen i chippen blev leveret af en strømforsyning, der blev udført gennem Ag/AgCl-elektroderne. Enheden setup blev installeret på X-Y-Z motoriseret fase af en omvendt fase-kontrast mikroskop udstyret med et digitalt kamera. (B)Et fotografi, der viser opsætningen på en laboratoriebænk. Forkortelser: MOE= multikanal optisk gennemsigtig elektrotaktisk; Ag = sølv; AgCl = sølvchlorid; ITO = indium-tin-oxid; EF = elektrisk felt. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: Differentiering af mNPC-cellerne i kontrolgruppen (CTL) og i DC-pulsstimulationsgruppen ved DIV 3, 7 og 14. Procentdelen af neuron (Tuj1+ celler), astrocytter (GFAP+ celler) og oligodendrocytter (O4+ celler) i (A-C) CTL-gruppen og (D-F) i stimulationsgruppen (DC pulser). Dette tal er blevet offentliggjort af Chang et al.1. Forkortelser: CTL: kontrol; DC = jævnstrøm; Tuj1 = neuronspecifik klasse III β tubulin; GFAP = glial fibrillary acidic protein; O4 = oligodendrocyt markør O4. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Under fremstillingen af MOE-chippen fastgøres adapterne til MOE-chippens lag 1 med hurtigtvirkende cyanoacrylatlim. Limen påføres 4 hjørner af adapterne, og derefter påføres trykket jævnt over adapterne. Overskydende mængde lim skal undgås for at sikre fuldstændig polymerisering af limen. Desuden inkuberes den færdige MOE-chipsamling i et vakuumkammer. Dette trin hjælper med at fjerne boblerne mellem PMMA-laget, det dobbeltsidede bånd og dækglasset.

Valget af elektrodematerialet er baseret på det faktum, at chloridioner, som er rigeligt til stede i mediet, er de elektrolytiske produkter, der strømmer gennem cellekulturregionen. Under EF-stimuleringseksperimentet forblev pH-vinduet omkring elektroderne konstant. En enklere konfiguration ved hjælp af platin (Pt) som elektrodematerialet elektrolyserer vand og genererer hydrogenioner (H+) og hydroxidioner (OH-) ved henholdsvis den positive elektrode og den negative elektrode, hvilket fremkalder pH-ændringer i kulturregionen. Undgå brug af Pt elektroder omgår problemet med pH-ændringer under EF stimulation eksperiment.

Den varme agarose og boblefri agarose er afgørende under forberedelsen af saltbronetværket. Den varme agarose har høj fluiditet og kan let injiceres i saltbronetværket. Tilslut Luer-låsesprøjten til Luer-adapteren efter at have injiceret den 3% varme agarose i Luer-adapteren. I løbet af dette trin vil agarose blive skubbet op i Luer-låsesprøjten, så der kan opnås en boblefri fast forbindelse til saltbronetværket. Bobler i saltbroerne øger den elektriske modstand, og derfor kan den forventede elektriske strøm ikke nås. Efter agaroseinjektionen er det vigtigt at vente på, at agarosen køler ned og størkner ved stuetemperatur i 10-20 minutter for at forhindre dannelsen af størknet agaroseaffald i cellekulturområdet.

MOE-chippen er placeret på en ITO-varmelegeme, der er låst på en programmerbar X-Y-Z motoriseret scene. Hele systemet er bygget på et omvendt fasekontrastmikroskop udstyret med et digitalt kamera til at overvåge celledifferentiering inden for cellekulturregionerne i chippen. Det er praktisk at observere cellemorfologien og erhvervelsen af de automatiske time-lapse-billeder i MOE mikrofluidic-systemet uden for en inkubator. Dette mikrofluidiske system forkorter ikke kun den krævede forsøgstid, men øger også nøjagtigheden af kontrollen med mikromiljøet.

MNPC-cellerne vokser som en suspension i kulturmedier. Men, mNPC'er, der klæber til PLL-belagt plade i MOE-chippen, er afgørende for differentiering. Neurosfærer dannet af 30-40 celler foretrækkes til at indlede mNPC differentiering. Overvækst af mNPC'er vil forringe celleoverlevelsen under differentieringsprocessen. Efter den pulserende DC-stimulering kan immunfluorescenspletteringsforsøget desuden påvirkes af strømningshastigheden. Brug derfor flere strømningshastigheder til forskellige trin for at undgå at løsne celler under vask.

I denne undersøgelse er en begrænsning af denne teknik, at MOE-chippen ikke kan genbruges på grund af vanskeligheden ved grundig rengøring af chippen. MOE-chippen kan dog placeres direkte under et fasekontrastmikroskop eller et scanningskonfokaltmikroskop. Det rapporterede mikrofluidiske systems vandtætte design sikrer, at buffer/medium fordampning ikke sker, idet den nøjagtige koncentration af bufferen/mediet og de tilsvarende elektriske egenskaber opretholdes. Ved at reducere reagensmængderne og den tilsvarende driftstid giver DET mikrofluidiske SYSTEM MOE en effektiv metode til at studere celledifferentiering.

En tidligere undersøgelse har vist, at EGF og bFGF fremmer NPC overlevelse, ekspansion og vedligeholdelse i udifferentieret tilstand4. I denne undersøgelse fremkaldte DC-pulserne differentieringen af de mNPC'er i stamcellevedligeholdelsesmediet, der indeholdt EGF og bFGF. Tidligere undersøgelser har rapporteret , at EF fremmer differentiering af NPC'er i neuroner og/eller astrocytter i differentieringsmedium uden EGF og bFGF14,21,22. Disse resultater viser, at mNPC'erne differentieret i neuroner, astrocytter, og oligodendrocytter efter DC puls stimulation. De foreslår også, at simpel DC puls behandling kunne kontrollere skæbneN for NPC'ere. Med yderligere optimering på stimuleringstid, EF-styrke eller arbejdscyklus kan DC-impulser anvendes til at manipulere NPC-differentiering og kan bruges til udvikling af terapeutiske strategier, der anvender NPC'ere til behandling af nervesystemforstyrrelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker professor Tang K. Tang, Institut for Biomedicinske Videnskaber, Academia Sinica, for hans hjælp til at give mus neurale stamceller og stamceller (mNPC'er). Forfatterne takker også professor Tang K. Tang og Ms Ying-Shan Lee, for deres værdifulde diskussion om differentiering af MNPC'er.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) BHT K2R20 Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
15 mL plastic tube Protech Technology Enterprise Co., Ltd CT-15-PL-TW Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized
3 mL syringe TERUMO DVR-3413 3 mL oral syringes, without needle
3 mm optical grade PMMA (Layer 5) CHI MEI Corporation ACRYPOLY PMMA Sheet Optical grade PMMA
3-way stopcock NIPRO NCN-3L Sterile disposable 3-way stopcock
5 mL syringe TERUMO DVR-3410 5 mL oral syringes, without needle
Adaptor Dong Zhong Co., Ltd. Customized PMMA adaptor
Agarose Sigma-Aldrich A9414 Agarose, low gelling temperature
Amplifier A.A. Lab Systems Ltd A-304 High voltage amplifier
AutoCAD software Autodesk Educational Version Drafting
B-27 supplement Gibco 12587-010 B-27 supplement (50x), minus vitamin A
Basic fibroblast growth factor (bFGF)  Peprotech AF-100-18B Also called recombinant human FGF-basic
Black rubber bung TERUMO DVR-3413 From 3 mL oral syringes, without needle
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich B4287 Blocking reagent 
Centrifuge HSIANGTAI CV2060 Centrifuge
CO2 laser scriber Laser Tools and Technics Corp.  ILS-II Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm
Cone connector IDEX Health & Science F-120X One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural
Cone-Luer adaptor IDEX Health & Science P-659 Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK
Confocal fluorescence microscope Leica Microsystems TCS SP5 Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Digital camera OLYMPUS E-330 Automatic time-lapse image acquisition
Digital oscilloscope Tektronix TDS2024 Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency.
Double-sided tape 3M  PET 8018 Purchased from http://en.thd.com.tw/
Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) Gibco 12400024 DMEM/F-12, powder, HEPES
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) Gibco 21600010 DPBS, powder, no calcium, no magnesium
EF multiplexer Asiatic Sky Co., Ltd. Customized Monitor and control the electric current in individual channels
Epidermal growth factor (EGF) Peprotech AF-100-15 Also called recombinant human EGF
Fast-acting cyanoacrylate glue 3M  7004T Strength instant adhesive (liquid)
Flat bottom connector IDEX Health & Science P-206 Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue
Function generator Agilent Technologies 33120A High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability
Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) Abcam ab150117 Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed
Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) Abcam ab150086 Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed
Hoechst 33342 Invitrogen H3570 Nuclear staining
ImageJ software National Institutes of Health 1.48v Analyze the fluorescent images 
Indium–tin–oxide (ITO) glass Merck 300739 For ITO heater
Inverted phase contrast microscope OLYMPUS CKX41 For cell morphology observation
K-type thermocouple Tecpel TPK-02A Temperature thermocouples
Luer adapter IDEX Health & Science P618-01 Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene
Luer lock syringe TERUMO DVR-3413 For agar salt bridges
Mouse anti-GFAP eBioscience 14-9892 Astrocytes marker
Oligodendrocyte  marker  O4  antibody R&D Systems MAB1326 Oligodendrocytes marker
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 Fixing agent
Phosphate buffered saline (PBS) Basic Life BL2651 Washing solution
Poly-L-Lysine (PLL) SIGMA P4707 Coating solution
Precision cover glasses thickness No. 1.5H MARIENFELD 107242 https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Programmable X-Y-Z motorised stage Tanlian Inc Customized Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportional–integral–derivative (PID) controller Toho Electronics TTM-J4-R-AB Temperature controller 
PTFE tube Professional Plastics Inc. Taiwan Branch Outer diameter 1/16 Inches White translucent PTFE tubing
Rabbit anti-Tuj1 Abcam ab18207 Neuron marker
Syringe pump New Era Systems Inc NE-1000 NE-1000 programmable single syringe pump
TFD4 detergent FRANKLAB TFD4 Cover glass cleaner
Thermal bonder Kuan-MIN Tech Co. Customized Purchased from http://kmtco.com.tw/
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Permeabilized solution
Ultrasonic cleaner LEO LEO-300S Ultrasonic steri-cleaner
Vacuum chamber DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. DOV-30 Vacuum drying oven
White fingertight plug IDEX Health & Science P-316 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
  2. Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
  4. Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
  5. Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
  6. Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
  7. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
  8. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
  9. Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
  10. Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
  11. Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
  12. Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
  13. Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
  14. Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
  15. Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
  16. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
  17. Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
  18. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
  19. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
  20. Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
  21. AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
  22. Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).

Tags

Bioengineering Problem 170 Elektriske felter neurale stamceller og stamceller differentiering polymethyl methacrylat PMMA mikrofluidic system
Elektrisk-felt-induceret neurale prækursor celle differentiering i mikrofluidiske enheder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. F., Chou, S. E., Cheng, J. … More

Chang, H. F., Chou, S. E., Cheng, J. Y. Electric-Field-Induced Neural Precursor Cell Differentiation in Microfluidic Devices. J. Vis. Exp. (170), e61917, doi:10.3791/61917 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter