Summary
I denna studie presenterar vi ett protokoll för differentiering av neurala stam- och stamceller (NPCs) som enbart induceras av likströmspulsstimulering (DC) i ett mikrofluidiskt system.
Abstract
Fysiologiska elektriska fält (EF) spelar viktiga roller i cellmigration, differentiering, uppdelning och död. Detta dokument beskriver ett mikrofluidiskt cellkultursystem som användes för en långsiktig cell differentiering studie med hjälp av mikroskopi. Det mikrofluidiska systemet består av följande huvudkomponenter: ett optiskt transparent elektrotaktiskt chip, en transparent INDIUM-tennoxidvärmare (ITO), en odlingsmediefyllningspump, en elektrisk strömförsörjning, en högfrekvent effektförstärkare, en EF-multiplexer, ett programmerbart X-Y-Z-motoriserat steg och ett inverterat faskontrastmikroskop utrustat med en digitalkamera. Det mikrofluidiska systemet är fördelaktigt för att förenkla den övergripande experimentella installationen och i sin tur reagens- och provförbrukningen. Detta arbete innebär differentiering av neurala stam- och stamceller (NPC) inducerad av likströmspulsstimulering ( DC). I stamcellsunderhållsmediet differentierade musen NPC (mNPC) i nervceller, astrocyter och oligodendrocyter efter DC-pulsstimuleringen. Resultaten tyder på att enkel DC puls behandling kan kontrollera ödet för mNPCs och kan användas för att utveckla terapeutiska strategier för nervsystemet störningar. Systemet kan användas för cellkultur i flera kanaler, för långsiktig EF-stimulering, för cellmorfologisk observation och för automatisk tidsfördröjning av bildförvärv. Detta mikrofluidiska system förkortar inte bara den experimentella tid som krävs, utan ökar också noggrannheten i kontrollen av mikromiljön.
Introduction
Neurala prekursorceller (NPC, även känd som neurala stam- och stamceller) kan vara som en lovande kandidat för neurodegenerativ terapeutisk strategi1. De odifferentierade npc:erna har självförnyelsekapacitet, multipotens och proliferativförmåga 2,3. En tidigare studie har rapporterat att den extracellulära matrisen och molekylära medlare reglerar differentiering av NPC. Epidermal tillväxtfaktor (EGF) och grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF) främja NPC spridning, därmed upprätthålla det odifferentierade tillståndet4.
Tidigare studier har rapporterat att elektrisk stimulering kan reglera cellfysiologiska aktiviteter som division5,migration6,7,8, differentiering1,9,10och celldöd11. Elektriska fält (EFs) spelar viktiga roller i utvecklingen och förnyelsen av centrala nervsystemet utveckling12,13,14. Från 2009 till 2019 har detta laboratorium undersökt cellulära svar på tillämpningen av EF i det mikrofluidiska systemet1,6,7,8,15,16,17. Ett flerkanaligt, optiskt transparent, elektrotaktiskt (MOE) chip utformades för att vara lämpligt för immunofluorescensfärgning för konfokal mikroskopi. Chippet hade hög optisk transparens och god hållbarhet och tillät samtidig genomförande av tre oberoende stimuleringsexperiment och flera immunstained villkor i en enda studie. Det mikrofluidiska systemet är fördelaktigt för att förenkla den övergripande experimentella installationen och i sin tur reagens- och provförbrukningen. Detta dokument beskriver utvecklingen av ett mikrofluidiskt cellkultursystem som användes för en långsiktig cell differentieringsstudie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Design och tillverkning av MOE-chippet
- Rita mönster för enskilda pmma-skikt (polymetylmetakryl) och det dubbelsidiga bandet med lämplig programvara (figur 1A, Materialförteckning). Skär både PMMA-arken och det dubbelsidiga bandet med en CO2 lasermaskinskrivare (Figur 1B).
- Slå på CO2 laserskrivaren och anslut den till en persondator. Öppna den designade mönsterfilen med hjälp av programvaran.
- Placera PMMA-arken (275 mm x 400 mm) eller dubbelsidig tejp (210 mm x 297 mm) på laserskrivarens plattform (figur 2A). Fokusera lasern på ytan av PMMA-arken eller det dubbelsidiga tejpen med hjälp av autofokusverktyget.
- Välj laserskrivaren som skrivare och "skriv sedan ut" mönstret med laserskrivaren för att starta den direkta ablationen på PMMA-arket eller dubbelsidig tejp och få individuella mönster på PMMA-arket eller tejpen (figur 2B).
- Ta bort skyddsfilmen från PMMA-arken och rengör ytan med hjälp av kvävegas.
OBS: Ritningen av PMMA-mönstret och direkt bearbetning av PMMA-arket utfördes enligt en tidigare rapport17. - För bindning av flera lager PMMA-ark, stapla tre stycken 1 mm PMMA-ark (lager 1, 2 och 3) och bind dem under ett tryck av 5 kg/cm2 i en termisk bonder i 30 min vid 110 °C för att bilda flödes-/elektrisk stimuleringskanalenhet (Figur 2C).
OBS: Olika partier av kommersiellt erhållna PMMA-ark har något annorlunda glasövergångstemperatur (Tg). Den optimala bindningstemperaturen måste testas vid steg om 5 °C nära Tg. - Fäst 12 adaptrar på de enskilda öppningarna i lager 1 av MOE-spånenheten med snabbverkande cyanoakrylatlim.
OBS: Adaptrar är gjorda av PMMA genom formsprutning. De plana ytorna längst ner är för anslutning till MOE-chippet. Adaptrar med 1/4W-28 honskruvgänga är till för anslutning av vita fingertäta pluggar, platta bottenkontakter eller Luer-adaptrar. Var försiktig när du använder snabbverkande cyanoakrylatlim. Undvik att plaska i ögonen. - Desinficera 1 mm PMMA-substrat (lager 1-3), dubbelhäftande tejp (lager 4) och 3 mm pmma av optisk kvalitet (lager 5) med ultraviolett (UV) bestrålning i 30 minuter innan chipet monteras (figur 1A).
- Fäst 1 mm PMMA-substrat (lager 1-3) på 3 mm pmma av optisk kvalitet (lager 5) med dubbelhäftande tejp (lager 4) för att slutföra PMMA-enheten (lager 1-5) (figur 1A).
- Förbered det rena täckglaset för monteringen på chippet.
- Fyll en tiofaldig utspädning av tvättmedlet i en färgburk (se materialtabellen)och rengör täckglaset i detta tvättmedel med hjälp av en ultraljudsrengöringsmedel i 15 minuter.
- Skölj färgburken noggrant under rinnande kranvatten för att ta bort alla spår av tvättmedlet.
- Fortsätt sköljning med destillerat vatten för att ta bort alla spår av kranvatten och upprepa steg 1.7.2 två gånger.
- Torka det rengjorda täckglaset genom att blåsa det med kvävegas.
- Desinficera PMMA-enheten (lager 1-5), dubbelsidig tejp (skikt 6) och täckglaset (skikt 7) med UV-bestrålning inuti ett biosäkerhetsskåp i 30 minuter innan chippet monteras (figur 1A).
- Fäst det rengjorda täckglaset (lager 7) på PMMA-enheten (lager 1-5) med dubbelhäftande tejp (skikt 6) (figur 1A).
- Inkubera MOE-chippet i en vakuumkammare över natten; använd MOE-spånenheten för efterföljande förfaranden(figur 3).
2. Beläggning av poly-L-lysin (PLL) på substratet i cellkulturregionerna
- Förbered polytetrafluoretylenröret, den platta nederkantskontakten, konkontakten, kon-luer-adaptern, den vita fingertäta kontakten (även kallad propp), lueradapter, luerlåsspruta och svart gummibung(figur 4A, materialförteckning). Sterilisera alla ovanstående komponenter i en autoklav vid 121 °C i 30 min.
- Täta öppningarna på agarbroadaptrar (Figur 1A) med de vita fingertäta pluggarna. Anslut den platta nederkantskontakten till MOE-spånenheten via de medelstora inlopps- och utloppsadaptrarna(bild 4B). Anslut kon-Luer-adaptern till 3-vägskranarna.
- Tillsätt 2 ml 0,01 % PLL-lösning med en 3 ml spruta som ansluts till den 3-vägs kranen på mellaninloppet (Figur 4B-
). - Anslut en tom 3 ml spruta till den 3-vägs kranen på det medelstora uttaget (Bild 4B-
). - Fyll cellkulturområdena med PLL-lösningen. Pumpa beläggningslösningen manuellt fram och tillbaka långsamt. Stäng de två 3-vägskranarna för att försegla lösningen inom kulturregionerna.
- Inkubera MOE-chipet vid 37 °C över natten i en inkubator fylld med 5 % CO2-atmosfär.
).
).3. Förberedelse av saltbronätet
- Efter steg 2.6 öppnar du de två 3-vägskranarna och spolar bort bubblorna i kanalerna genom att manuellt pumpa beläggningslösningen fram och tillbaka i kanalen med hjälp av de två sprutorna.
- Rita 3 ml komplett medium (stamcellsunderhållsmedium bestående av Dulbeccos modifierade Eagle's medium/Hams näringsblandning F-12 (DMEM/F12), 2% B-27 tillägg, 20 ng/mL EGF och 20 ng/mL bFGF) i en 3 ml spruta som ansluter till den 3-vägs kranen på mediuminloppet (figur 4B- och figur 4B-
). - Tillsätt 3 ml komplett medium för att ersätta beläggningslösningen i cellkulturregionerna. Anslut en tom 5 ml spruta till den 3-vägs kranen på det medelstora uttaget (Bild 4B-
). - Förbered saltbryggan (figur 5).
- Skär det svarta gummit bung för att skapa en lucka och för in silver (Ag)/silverklorid (AgCl) elektroder genom det svarta gummit bung och in i Luer låssprutan (Figur 4A).
- Sätt tillbaka den vita fingertäta kontakten med Luer-adaptern och injicera 3 % varm agarosa för att fylla Luer-adaptern.
OBS: För beredning av den heta agarosen, lös upp 3 g agarospulver i 100 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sterilisera i en autoklav vid 121 °C i 30 min. - Anslut Luer-låssprutan till Luer-adaptern. Injicera 3% varm agarosa genom det svarta gummit bung för att fylla Luer låssprutan med sprutan med nål. Låt 10 till 20 minuter för agarosen svalna och stelna.
OBS: För att öka agarosens volymkapacitet monteras Luerlåssprutan på Luer-adaptern (figur 4 och figur 5). Sedan sätts de stora elektroderna in i Luer-låssprutan. Elektroden kan ge en stabil elektrisk stimulering för det långsiktiga experimentet.
).
).4. Förberedelse av mNPC:er
- KulturmNPC:erna 1 i hela mediet i en 25T cellkulturkolv vid 37 °C i en inkubator fylld med 5% CO2 atmosfär. Subkultur cellerna var 3-4 dagar och utför alla experiment med celler som har genomgått 3-8 passager från den ursprungliga källan.
- Överför cellupphängningen till ett 15 ml koniskt rör och snurra ner neurosfärerna vid 100 × g i 5 minuter. Aspirera supernaten och tvätta neurosfärerna med 1x Dulbeccos PBS (DPBS). Snurra ner neurosfärerna vid 100 × g i 5 min.
- Aspirera 1x DPBS och återanvänd sedan neurosfärerna i hela mediet. Blanda noggrant och försiktigt.
- Tillsätt 1 ml av neurosfärens suspension med en 1 ml spruta som ansluts till utloppets 3-vägskran (Figur 4B- ).
5. Inställning av det mikrofluidiska systemet för dc-pulsstimulering (figur 6)
- Montera det cellfröade MOE-chippet på den genomskinliga ITO-värmaren som är fastsatt på en programmerbar X-Y-Z motoriserad scen.
OBS: ITO-yttemperaturen styrs av en proportionell-integrerad derivatstyrenhet och bibehålls vid 37 °C. Ett termoelement av K-typ spänns fast mellan chipet och ITO-värmaren för att övervaka temperaturen i cellkulturregionerna i chippet. MOE-chippet är installerat på ett programmerbart X-Y-Z-motoriserat stadium och är lämpligt för automatisk timelapse-bildförvärv vid enskilda kanalsektioner. Tillverkningen av ITO-värmaren och installationen av cellkulturvärmesystemet har beskrivits tidigare18,19. - Ingjut mNPC:erna genom manuell pumpning i MOE-chippet via det medelstora uttaget. Inkubera det cellfröade MOE-chippet på ITO-värmaren på 37 °C i 4 timmar.
- Pumpa det kompletta mediet genom MOE-chippet via medelinloppet efter 4 timmar med en flödeshastighet på 20 μL/h med hjälp av en sprutpump.
OBS: MNPC:erna odlas och underhålls i chipet i ytterligare 24 timmar före EF-stimulering för att möjliggöra cellfäste och tillväxt. Avfallsvätskan samlas i en tom 5 ml spruta som är ansluten till utloppets 3-vägskran, som visas som "avfall" i figur 6A. Moe-konfigurationen av mikrofluidsystemet visas i figur 6. Detta mikrofluidiska system ger en kontinuerlig näringstillförsel till cellerna. Det kompletta färska mediet pumpas kontinuerligt in i MOE-chippet för att bibehålla ett konstant pH-värde. Därför kan cellerna odlas utanför en CO2-inkubator. - Använd elektriska ledningar för att ansluta en EF multiplexer till MOE-chipet via Ag/AgCl-elektroderna på chippet. Anslut en EF-multiplexer och en funktionsgenerator till en förstärkare för att mata ut fyrvågspulser med en magnitud på 300 mV/mm med en frekvens av 100 Hz vid 50 % arbetscykler (50 % time-on och 50 % ledighet) (figur 6B).
- Anslut de elektriska kablarna till EF-multiplexern. Anslut de elektriska kablarna till MOE-chippet via Ag/AgCl-elektroderna.
- Anslut EF multiplexer till förstärkaren med hjälp av elektriska ledningar. Anslut funktionsgeneratorn till förstärkaren och det digitala oscilloskopet.
OBS: EF multiplexer är en krets som inkluderar kulmens impedans i kretsen och ansluter alla enskilda kammare i ett parallellt elektroniskt nätverk. Var och en av de tre odlingskamrarna är elektriskt ansluten i seriell till ett variabelt motstånd (Vr) och en ammeter (visas som μA i figur 6A)i multiplexern. Den elektriska strömmen genom varje kulturkammare varieras genom att styra Vr, och strömmen visas på motsvarande ammeter. Den elektriska fältstyrkan i varje cellkulturregion beräknades enligt Ohms lag, I= σEA, där jag är den elektriska strömmen, σ (inställd som 1,38 S·m-1 för DMEM/F1220) är kulturmediets elektriska ledningsförmåga, E är det elektriska fältet och A är det tvärsnittsmässiga området i den elektrotaktiska kammaren. För cellkulturregiondimensionen som visas i figur 1är den elektriska strömmen ~87 mA respektive ~44 mA för DC- och DC-puls vid 50 % arbetscykel.
- Utsätter mNPC:erna för kvadratiska DC-pulser med en magnitud på 300 mV/mm med frekvensen 100 Hz i 48 timmar. Pumpa kontinuerligt hela mediet med en hastighet av 10 μL/h för att leverera tillräcklig näring till cellerna och för att upprätthålla ett konstant pH-värde i mediet.
6. Immunofluorescensanalyser av mNPC efter pulsad DC-stimulering
OBS: I detta steg pumpas allt reagens via mediuminloppet med hjälp av en sprutpump.
- Efter 3, 7 eller 14 dagars in vitro-odling (DIV) efter sådd1, tvätta cellerna med 1x PBS med en flödeshastighet på 25 μL/min i 20 min.
- Fixera cellerna med 4% paraformaldehyd (PFA). Pumpa in 4 % PFA i chippet med en flödeshastighet på 25 μL/min i 20 minuter för att ersätta 1x PBS. För att ersätta 4% PFA, tvätta cellerna med 1x PBS med en flödeshastighet på 25 μL/min i 20 min.
- Pumpa in 0,1% Triton X-100 i chipet med en flödeshastighet på 50 μL/min i 6 min för att permeabilisera cellerna. Sänk flödeshastigheten till 50 μL/h i ytterligare 30 minuter för att reagera med cellerna. För att ersätta 0,1% Triton X-100, tvätta cellerna med 1x PBS med en flödeshastighet på 50 μL/min i 6 min.
- Blockera cellerna med PBS som innehåller 1% bovint serumalbumin (BSA) för att minska ospecificerad antikroppsbindning. Pumpa in 1% BSA i chipet med en flödeshastighet på 50 μL/min i 6 min. Sänk flödeshastigheten till 100 μL/h och pumpa i 1 timme.
- Pumpa antikropparna för dubbel immunstaining i chipet med en flödeshastighet på 50 μL/min i 6 min och inkubera chipet i 18 timmar vid 4 °C. Tvätta cellerna med 1x PBS med en flödeshastighet på 50 μL/min i 15 min.
- Pumpa in alexafluorkonjugerade sekundära antikroppar i chipet med en flödeshastighet på 50 μL/min i 6 minuter. Minska flödeshastigheten till 50 μL/h och pumpa antikropparna i 1 timme vid rumstemperatur i mörker. Tvätta cellerna med 1x PBS med en flödeshastighet på 50 μL/min i 15 min.
- För kärnfärgning, pumpa Hoechst 33342 i chipet med en flödeshastighet på 20 μL/min i 10 min vid rumstemperatur i mörker. Tvätta cellerna med 1x PBS med en flödeshastighet på 50 μL/min i 15 min.
- Efter immunostaining, observera cellerna med hjälp av ett konfokalt fluorescensmikroskop.
7. Bildanalys och databehandling
- Analysera fluorescerande bilder med hjälp av programvara med inbyggda mätverktyg (se materialförteckningen).
- Jämför Hoechst-counterstained atomkärnor (totalt antal celler) i kontroll- och behandlingsgrupperna och beräkna procentandelen celler som uttrycker varje fenotypisk markör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den detaljerade konfigurationen av MOE-chippet visas i figur 1. Det mikrofluidiska chippet ger ett fördelaktigt tillvägagångssätt för att minska den experimentella installationsstorleken, provvolymen och reagensvolymen. MOE-chippet utformades för att utföra tre oberoende EF-stimuleringsexperiment och flera immunostaining-tillstånd samtidigt i en enda studie (figur 3). Dessutom är MOE-chipet, som har en hög optisk transparens, lämpligt för konfokala mikroskopiundersökningar. MOE-chippet är också utformat för att undersöka effekterna av olika cellkulturförhållanden (t.ex. multipel EF-stimulering, flera läkemedel, olika beläggningssubstrat, flera serier av celler) samtidigt i ett enda experiment.
MNPC:erna utsattes för kvadratvågspulser (magnitud 300 mV/mm med en frekvens av 100 Hz). DC puls stimulering genomfördes för 48 h. De differentierade cellerna var immunostained med Tuj1 (neuron-specifika klass III β-tubulin), stödjeceller fibrillary sura protein (GFAP att identifiera astrocyter) och oligodendrocyte markör O4. Efter DC pulsbehandling uttryckte mNPC: erna betydligt högt antal nervceller (Tuj1 + celler) vid DIV 7. Vid DIV 3 fanns astrocyter (GFAP+ celler) på relativt högre nivåer i stimuleringsgrupperna än i kontrollgruppen (CTL). Jämfört med CTL- gruppen var oligodendrocyter (O4+ celler) signifikant högre i stimuleringsgruppen vid DIV 7 och DIV 14 (figur 7). Dessa resultat visar att DC puls stimulering resulterade i mNPCs differentiering till nervceller, astrocyter och oligodendrocyter samtidigt i stamcell underhåll medium. Dessa resultat tyder på att MOE mikrofluidic systemet är lämplig för en långsiktig cell differentiering studie av mikroskopi.
Figur 1:Den detaljerade konfigurationen av flerkanaligt optiskt transparent elektrotaktiskt chip. (A) Sprängskiss av MOE-spånenheten. MOE-chippet består av PMMA-ark (50 mm x 25 mm x 1 mm), dubbelsidig tejp (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptrar (10 mm x 10 mm x 6 mm), PMMA-ark av optisk kvalitet (50 mm x 75 mm x 3 mm), dubbelsidig tejp (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) och ett täckglas (24 mm × 60 mm). Det finns tre cellkulturkammare i MOE-chippet. MOE-chippet har anslutningshål för det medelstora inloppet/utloppet och agarsaltbroarna. Cellerna odlades i cellkulturområdet (bredd 3 mm x längd 42 mm x höjd 0,07 mm). Figur 1A har ändrats från Chang et al.6. B)Fotografi av MOE-chipet bestående av adaptrar, PMMA-ark, dubbelsidig tejp och täckglas. Förkortningar: MOE= flerkanaligt transparent elektrotaktisk; PMMA = polymethylmetylmetakrylat. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 2:Tillverkningen och monteringsprocesserna för MOE-chippet. ( A )Dekonstruerade mönstren på PMMA-arken eller dubbelsidig tejp tillverkades med lasermikromachining. B)De enskilda PMMA-arken skars av en CO2 laserskrivare. C)De flera lagren av de rengjorda PMMA-arken var bundna av en termisk bonder. Förkortningar: MOE= flerkanaligt transparent elektrotaktisk; PMMA = polymethylmetylmetakrylat; CO2 = koldioxid. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 3:Ett fotografi av MOE-chippet. Denna siffra har ändrats från Chang et al.6. Förkortning: MOE= flerkanaligt optiskt transparent elektrotaktisk. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 4:Medelhög och elektrisk anslutning till MOE-chippet. (A) Fotografi av komponenterna för mellanflödesnätet och EF-nätverket i MOE-mikrofluidsystemet, inklusive PTFE-röret, platt-bottenkontakt, konkontakt, kon-Luer-adapter, vit fingertät kontakt, Luer-adapter, Luer-låsspruta, svart gummibung och Ag/AgCl-elektroderna. B)Fotografi av konfigurationen för mellanflödesnätet. Förkortningar: MOE= flerkanaligt transparent elektrotaktisk; EF = elektriskt fält; PTFE = polytetrafluoreten; Ag = silver; AgCl = silverklorid. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 5:Ett fotografi som visar MOE-chippet på ett mikroskop. Förkortningar: MOE= flerkanaligt transparent elektrotaktisk; Ag = silver; AgCl = silverklorid; ITO = indium-tenn-oxid. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Bild 6:Konfigurationen och systemet som används för dc-pulsstimuleringen. Sprutorna som var anslutna till MOE-chipet användes för medium infusion och spillflöde. Dc-pulsen i chipet tillhandahölls av en strömförsörjning som utfördes genom Ag/AgCl-elektroderna. Enhetsinstallationen installerades på det motoriserade X-Y-Z-stadiet i ett inverterat faskontrastmikroskop utrustat med en digitalkamera. B)Ett fotografi som visar inställningarna på en laboratoriebänk. Förkortningar: MOE= flerkanaligt transparent elektrotaktisk; Ag = silver; AgCl = silverklorid; ITO = indium-tennoxid; EF = elektriskt fält. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Figur 7:Differentiering av mNPC-cellerna i kontrollgruppen (CTL) och i DC-pulsstimuleringsgruppen vid DIV 3, 7 och 14. Procentandelen neuron (Tuj1+ celler), astrocyter (GFAP+ celler) och oligodendrocyter (O4 + celler) i (A-C)CTL-gruppenoch (D-F) i stimuleringsgruppen (DC-pulser). Denna siffra har publicerats av Chang et al.1. Förkortningar: CTL: kontroll; DC = likström; Tuj1 = neuronspecifik klass III-β-tubulin; GFAP = glial fibrillary surt protein; O4 = oligodendrocyt markör O4. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under tillverkningen av MOE-chipet fästs adaptrarna på MOE-chipets skikt 1 med snabbverkande cyanoakrylatlim. Limet appliceras på adaptrars 4 hörn och sedan appliceras trycket jämnt över adaptrar. Överskott av lim måste undvikas för att säkerställa fullständig polymerisering av limet. Dessutom inkuberas den färdiga MOE-spånenheten i en vakuumkammare. Det här steget hjälper till att ta bort bubblorna mellan PMMA-skiktet, den dubbelsidiga tejpen och täckglaset.
Valet av elektrodmaterialet baseras på det faktum att kloridjoner, som finns rikligt i mediet, är de elektrolytiska produkterna som strömmar genom cellkulturområdet. Under EF-stimuleringsexperimentet förblev pH runt elektroderna konstant. En enklare konfiguration med platina (Pt) som elektrodmaterial elektrolyserar vatten och genererar vätejoner (H+) och hydroxidjoner (OH-) vid den positiva elektroden respektive den negativa elektroden, vilket inducerar pH-förändringar i kulturregionen. Undvika användning av Pt elektroder kringgår problemet med pH förändringar under EF stimulering experiment.
Den heta agarosen och bubbelfria agarosen är viktiga under beredningen av saltbronätet. Den heta agarosen har hög fluiditet och kan enkelt injiceras i saltbronätet. Anslut Luer-låssprutan till Luer-adaptern efter att ha injicerat den 3% heta agarosen i Luer-adaptern. Under detta steg kommer agarosen att skjutas upp i Luer-låssprutan så att en bubbelfri fast anslutning av saltbronätet kan uppnås. Bubblor i saltbroarna ökar det elektriska motståndet och därför kan den förväntade elektriska strömmen inte nås. Efter agarosinjektionen är det viktigt att vänta på att agarosen kyls ner och stelna vid rumstemperatur i 10-20 min för att förhindra bildandet av stelnat agarosaskräp i cellkulturområdet.
MOE-chippet placeras på en ITO-värmare som är låst på en programmerbar X-Y-Z motoriserad scen. Hela systemet är byggt på ett inverterat faskontrastmikroskop utrustat med en digitalkamera för att övervaka celldilyssering inom cellkulturregionerna i chippet. Det är bekvämt att observera cellmorfologin och förvärvet av de automatiska timelapse-bilderna i MOE-mikrofluidsystemet utanför en inkubator. Detta mikrofluidiska system förkortar inte bara den experimentella tid som krävs, utan ökar också noggrannheten i kontrollen av mikromiljön.
MNPC-cellerna växer som en suspension i kulturmedia. MNPC:er som följer den PLL-belagda plattan i MOE-chippet är dock avgörande för differentiering. Neurosfärer som bildas av 30-40 celler föredras för att initiera mNPC differentiering. Överväxt av mNPC:er kommer att försämra cellöverlevnaden under differentieringsprocessen. Dessutom, efter pulsade DC stimulering, immunofluorescens färgning experimentell kan påverkas av flödeshastigheten. Använd därför flera flödeshastigheter för olika steg för att undvika att ta bort celler under tvätten.
I denna studie är en begränsning av denna teknik att MOE-chipet inte kan återanvändas på grund av svårigheten att grundlig rengöring av chipet. MOE-chippet kan dock placeras under ett faskontrastmikroskop eller ett scanningkonfokalt mikroskop direkt. Den vattentäta utformningen av det rapporterade mikrofluidiska systemet säkerställer att buffert/medium avdunstning inte uppstår, vilket bibehåller den exakta koncentrationen av bufferten/mediet och motsvarande elektriska egenskaper. Genom att minska reagensvolymerna och motsvarande driftstid ger MOE-mikrofluidiska systemet ett effektivt tillvägagångssätt för att studera celldiversiering.
En tidigare studie har visat att EGF och bFGF främjar NPC överlevnad, expansion och underhåll i det odifferentierade tillståndet4. I denna studie inducerade DC-pulserna differentiering av mNPC i stamcellsunderhållsmediet som innehöll EGF och bFGF. Tidigare studier har rapporterat att EF främjar differentiering av npc till nervceller och/eller astrocyter i differentieringsmedium utan EGF och bFGF14,21,22. Dessa resultat visar att mNPC differentierade i nervceller, astrocyter och oligodendrocyter efter DC puls stimulering. De föreslår också att enkel DC puls behandling kan kontrollera ödet för NPCs. Med ytterligare optimering av stimuleringstiden, EF-styrkan eller arbetscykeln kan DC-pulser appliceras för att manipulera NPC-differentiering och kan användas för utveckling av terapeutiska strategier som använder NPC för att behandla nervsystemets störningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar professor Tang K. Tang, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, för hans hjälp med att tillhandahålla musneurala stam- och stamceller (mNPCs). Författarna tackar också professor Tang K. Tang och Ms. Ying-Shan Lee, för deras värdefulla diskussion om differentiering av mNPCs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
