Summary
Bu çalışmada, sadece mikroakışkan bir sistemde doğrudan akım (DC) darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral kök ve progenitör hücrelerin (NPC' ler) farklılaşması için bir protokol sunuyoruz.
Abstract
Fizyolojik elektrik alanları (EF) hücre göçü, farklılaşma, bölünme ve ölümde hayati roller oynar. Bu makalede, mikroskopi kullanılarak uzun süreli hücre farklılaşması çalışması için kullanılan mikroakışkan hücre kültürü sistemi açıklanmaktadır. Mikroakışkan sistem aşağıdaki ana bileşenlerden oluşur: optik olarak şeffaf bir elektrotaktik çip, şeffaf bir indiyum-kalay-oksit (ITO) ısıtıcı, bir kültür medya dolum pompası, bir elektrik güç kaynağı, yüksek frekanslı bir güç amplifikatörü, bir EF çoklayıcı, programlanabilir bir X-Y-Z motorlu aşama ve dijital kamera ile donatılmış ters faz kontrastlı mikroskop. Mikroakışkan sistem, genel deneysel kurulumu ve buna karşılık reaktif ve numune tüketimini basitleştirmede faydalıdır. Bu çalışma, doğru akım (DC) darbe stimülasyonu ile indüklenen nöral kök ve progenitör hücrelerin (NPC' ler) farklılaştırılmasını içerir. Kök hücre bakım ortamında, fare NPC'leri (mNPC'ler) DC darbe stimülasyonundan sonra nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaştı. Sonuçlar, basit DC nabız tedavisinin mNPC'lerin kaderini kontrol edebileceğini ve sinir sistemi bozuklukları için terapötik stratejiler geliştirmek için kullanılabileceğini göstermektedir. Sistem, birden fazla kanalda hücre kültürü, uzun süreli EF stimülasyonu, hücre morfolojik gözlemi ve otomatik zaman atlamalı görüntü alımı için kullanılabilir. Bu mikroakışkan sistem sadece gerekli deneysel süreyi kısaltmakla kalmaz, aynı zamanda mikroçevrim üzerindeki kontrol doğruluğunu da arttırır.
Introduction
Nöral öncül hücreler (NPC'ler, nöral kök ve progenitör hücreler olarak da bilinir) nörodejeneratif terapötik strateji için umut verici bir aday olabilir1. Farklılaşmamış NPC'ler kendi kendini yenileme kapasitesine, çoklu güçlülüğe ve proliferatif yete sahip2,3. Daha önceki bir çalışmada hücre dışı matris ve moleküler arabulucuların NPC'nin farklılaşmasını düzenlediği bildirilmiştir. Epidermal büyüme faktörü (EGF) ve temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) NPC çoğalmasını teşvik eder, böylece farklılaşmamış durumu korur4.
Önceki çalışmalar, elektriksel stimülasyonun bölüm 5 , göç 6 , 7,8, farklılaşma1,9,10ve hücreölümü11gibi hücre fizyolojik faaliyetlerini düzenleyebileceğini bildirmiştir. Elektrik alanları (EF'ler) merkezi sinir sistemi gelişiminin geliştirilmesinde ve yenilenmesinde hayati roller oynar12,13,14. 2009'dan 2019'a kadar bu laboratuvar, EF'nin mikroakışkan sistem 1 ,6 , 7 ,8,15,16,17'dekiuygulamasına verilen hücresel yanıtları araştırmıştır. Çok kanallı, optik olarak şeffaf, elektroaktik (MOE) çip, konfokal mikroskopi için immünofluoresans boyamaya uygun olacak şekilde tasarlanmıştır. Çip yüksek optik şeffaflığa ve iyi dayanıklılığa sahipti ve tek bir çalışmada üç bağımsız stimülasyon deneyinin ve birkaç immünostained koşulun aynı anda yapılmasına izin verdi. Mikroakışkan sistem, genel deneysel kurulumu ve buna karşılık reaktif ve numune tüketimini basitleştirmede faydalıdır. Bu makalede, uzun süreli hücre farklılaşması çalışması için kullanılan mikroakışkan hücre kültürü sisteminin gelişimi açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. MOE çipinin tasarımı ve imalatı
- Tek tek polimetil methakril (PMMA) katmanları ve çift taraflı bant için uygun yazılımı kullanarak desenlerçizin(Şekil 1A, Malzeme Tablosu ). Hem PMMA levhalarını hem de çift taraflı bandı CO2 lazer makine katibi (Şekil 1B)ile kesin.
- CO2 lazer katipini aç ve kişisel bir bilgisayara bağla. Yazılımı kullanarak tasarlanmış desen dosyasını açın.
- PMMA levhaları (275 mm x 400 mm) veya çift taraflı bandı (210 mm x 297 mm) lazer katibinin platformuna yerleştirin (Şekil 2A). Otomatik odaklama aracını kullanarak lazeri PMMA levhalarının yüzeyine veya çift taraflı teybe odaklayın.
- Yazıcı olarak lazer katibi seçin ve ardından PMMA sayfasında veya çift taraflı bantta doğrudan ablasyonu başlatmak ve PMMA sayfasında veya bantta tek tek desenler elde etmek için lazer katibi kullanarak deseni "yazdırın"(Şekil 2B).
- Koruyucu filmi PMMA levhalarından çıkarın ve yüzeyi azot gazı kullanarak temizleyin.
NOT: PMMA deseninin çizimi ve PMMA levhasının doğrudan işlenmesi önceki bir rapora göregerçeklenmiştir 17. - Pmma levhaların birden fazla katmanını bir araya getirmek için, 1 mm PMMA levhadan üç parça (Katman 1, 2 ve 3) istifleyin ve akış / elektrik stimülasyon kanalı montajını oluşturmak için110 ° C'de 30 dakika boyunca bir termal bonderde 5 kg / cm 2 basınç altında yapıştırın ( Şekil2C).
NOT: Ticari olarak elde edilen farklı PMMA levha partileri biraz farklı cam geçiş sıcaklığına (Tg) sahiptir. Optimum yapıştırma sıcaklığının Tg'ye yakın 5 °C artışlarla test edilmesi gerekir. - Hızlı etkili siyanoakrilat tutkal ile MOE çip tertibatının Katman 1'deki bireysel açıklıklara 12 parça adaptör yapıştırın.
NOT: Adaptörler enjeksiyon kalıplama ile PMMA'dan yapılmıştır. Alttaki düz yüzeyler MOE çipine bağlanmak içindir. 1/4W-28 dişi vidalı diş taşıyan adaptörler, beyaz parmakla sıkı fişleri, düz alt konektörleri veya Luer adaptörlerini bağlamak içindir. Hızlı etkili siyanoakrilat tutkal kullanırken dikkatli olun. Gözlere sıçramaktan kaçının. - Çipi monte etmeden önce 30 dakika boyunca ultraviyole (UV) ışınlama kullanarak 1 mm PMMA yüzeylerini (Katman 1-3), çift taraflı bandı (Katman 4) ve 3 mm optik sınıf PMMA'yı (Katman 5) dezenfekte edersiniz (Şekil 1A).
- PMMA montajını (Katmanlar 1-5)(Şekil 1A)tamamlamak için 3 mm optik sınıf PMMA'daki (Katman 1-3) 1 mm PMMA substratlarını (Katman 5) çift taraflı bantla (Katman 4) yapıştırın.
- Talaş üzerindeki montaj için temiz kapak camını hazırlayın.
- Deterjanın on kat seyreltilmesini bir boyama kavanozuna doldurun (Malzeme Masası'nabakın) ve bu deterjandaki kapak camını ultrasonik bir temizleyici kullanarak 15 dakika boyunca temizleyin.
- Deterjanın tüm izlerini gidermek için boyama kavanozunu akan musluk suyunun altında iyice durulayın.
- Musluk suyunun tüm izlerini gidermek için damıtılmış suyla durulama işlemine devam edin ve 1.7.2 adımını iki kez tekrarlayın.
- Temizlenen kapak camını azot gazı ile üfleyerek kurutun.
- PMMA tertibatını (Katmanlar 1-5), çift taraflı bandı (Katman 6) ve kapak camını (Katman 7) çipi monte etmeden önce 30 dakika boyunca bir biyogüvenlik kabini içinde UV ışınlamasını kullanarak dezenfekte etmeyin(Şekil 1A).
- Temizlenen kapak camını (Katman 7) çift taraflı bantla (Katman 6) (Şekil 1A) PMMA tertibatine (Katman1-5)yapıştırın.
- MOE çipini bir gecede bir vakum odasında kuluçkaya yatırın; sonraki prosedürler için MOE çip montajını kullanın (Şekil 3).
2. Hücre kültürü bölgelerindeki substrat üzerindeki poli-L-lizin (PLL) kaplama
- Politetrafloroetilen tüp, düz-alt konektör, koni konektörü, koni-Luer adaptörü, beyaz parmak sıkı fiş (stoper olarak da adlandırılır), Luer adaptörü, Luer kilit şırıngını ve siyah kauçuk bung'u hazırlayın (Şekil 4A, Malzeme Masası). Yukarıdaki tüm bileşenleri 121 °C'de bir otoklavda 30 dakika sterilize edin.
- Agar köprüsü adaptörlerinin açıklıklarını (Şekil 1A) beyaz parmak sıkı fişlerle kapatın. Düz tabanlı konektörü orta giriş ve çıkış adaptörleri(Şekil 4B)aracılığıyla MOE talaş tertibatine bağlayın. Koni-Luer adaptörini 3 yönlü stopcock'lara bağlayın.
- Orta girişin 3 yönlü stopcock'una bağlanan 3 mL şırıngır kullanarak 2 mL% 0.01 PLL çözeltisi ekleyin (Şekil 4B-
). - Orta çıkışın 3 yönlü stopcock'una boş bir 3 mL şırıngır bağlayın (Şekil 4B-
). - Hücre kültürü bölgelerini PLL çözümüyle doldurun. Kaplama solüsyonunu yavaşça ileri geri manuel olarak pompalar. Çözeltiyi kültür bölgelerine kapatmak için iki 3 yönlü stopcock'u kapatın.
- MOE çipini %5 CO2 atmosferi ile dolu bir inkübatörde bir gecede 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
).
).3. Tuz köprüsü ağının hazırlanması
- 2.6. adımı takiben, iki şırınnayı kullanarak kaplama solüsyonunu kanala ileri geri manuel olarak pompalayarak iki 3 yönlü stopcock'u açın ve kanallardaki kabarcıkları yıkayın.
- 3 mL komple ortam çizin (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta/Ham besin karışımı F-12 (DMEM/F12), %2 B-27 takviyesinden oluşan kök hücre bakım ortamı, 20 ng/mL EGF ve 20 ng/mL bFGF), orta girişin 3 yönlü stopcock'una bağlanan 3 mL şırınna (Şekil 4B- ve Şekil 4B-
). - Hücre kültürü bölgelerindeki kaplama çözeltisini değiştirmek için 3 mL tam orta ekleyin. Orta çıkışın 3 yönlü stopcock'una boş bir 5 mL şırıngır bağlayın (Şekil 4B-
). - Tuz köprüsü ağını hazırlayın (Şekil 5).
- Bir boşluk oluşturmak için siyah kauçuk bung'u kesin ve gümüş (Ag)/gümüş klorür (AgCl) elektrotlarını siyah kauçuk bung'dan geçirip Luer kilit şırıngına yerleştirin (Şekil 4A).
- Beyaz parmak ucu fişini Luer adaptörü ile değiştirin ve Luer adaptörünü doldurmak için% 3 sıcak agarose enjekte edin.
NOT: Sıcak agazozun hazırlanması için, 3 g agarose tozunun 100 mL fosfat tamponlu salin (PBS) içinde çözün ve 121 °C'de bir otoklavda 30 dakika sterilize edin. - Luer kilit şırındını Luer adaptörüne bağlayın. Şırıngayı iğneyle kullanarak Luer kilit şırıngasını doldurmak için siyah kauçuk bung'dan% 3 sıcak agarose enjekte edin. Agarose'un soğuması ve katılaşması için 10 ila 20 dakika bekleyin.
NOT: Agarose'un hacim kapasitesini artırmak için, Luer kilit şırıngası Luer adaptörüne monte edilir (Şekil 4 ve Şekil 5). Daha sonra, büyük elektrotlar Luer kilit şırındıcına yerleştirilir. Elektrot, uzun süreli deney için istikrarlı bir elektriksel uyarım sağlayabilir.
).
).4. MNPC'lerin Hazırlanması
- MNPC'leri1'i% 5 CO 2 atmosferi ile dolu bir inkübatörde 37 ° C'de25T hücre kültürü şişesinde tam ortamda kültür edin. Hücreleri her 3-4 günde bir alt kültüre alın ve orijinal kaynaktan 3-8 geçiş geçirmiş hücrelerle tüm deneyleri yapın.
- Hücre süspansiyonu 15 mL konik bir tüpe aktarın ve nörosferleri 5 dakika boyunca 100 × g'da aşağı çevirin. Süpernatantı aspire edin ve nörosferleri 1x Dulbecco PBS (DPBS) ile yıkayın. Nörosferleri 5 dakika boyunca 100 × g'da aşağı çevirin.
- 1x DPBS'yi aspire edin ve ardından nörosferleri tam ortamda yeniden diriltin. İyice ve nazikçe karıştırın.
- Çıkışın 3 yönlü stopcock'una bağlanan 1 mL şırıngır kullanarak nörosfer süspansiyonunun 1 mL'lik kısmını ekleyin (Şekil 4B- ).
5. DC darbe stimülasyonu için mikroakışkan sistemin kurulumu (Şekil 6)
- Hücre tohumlu MOE çipini programlanabilir bir X-Y-Z motorlu sahneye tutturulmuş şeffaf ITO ısıtıcıya takın.
NOT: ITO yüzey sıcaklığı orantılı-integral türev kontrolör tarafından kontrol edilir ve 37 °C'de tutulur. Çip içindeki hücre kültürü bölgelerinin sıcaklığını izlemek için çip ve ITO ısıtıcısı arasına K tipi bir termokuple kenetlenir. MOE çipi programlanabilir bir X-Y-Z motorlu sahneye monte edilir ve tek tek kanal bölümlerinde otomatik zaman atlamalı görüntü alımı için uygundur. ITO ısıtıcının imalatı ve hücre kültürü ısıtma sisteminin kurulumu daha önceaçıklanmıştır 18,19. - MNPC'leri, orta çıkış üzerinden MOE çipine manuel pompalayarak demleyin. Hücre tohumlu MOE çipini 37 °C ITO ısıtıcıda 4 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
- 4 saat sonra, bir şırıng pompası kullanarak 20 μL/ s akış hızında orta giriş yoluyla MOE çipi aracılığıyla tam ortamı pompalayın.
NOT: MNPC'ler, hücre bağlanmasına ve büyümesine izin vermek için EF stimülasyonundan önce 24 saat daha çipte yetiştirilir ve korunur. Atık sıvı, Şekil 6A'da"atık" olarak gösterilen çıkışın 3 yönlü stopcock'una bağlı boş bir 5 mL şırınna içinde toplanır. MOE mikroakışkan sistem yapılandırması Şekil 6'da gösterilmiştir. Bu mikroakışkan sistem hücrelere sürekli beslenme sağlar. Tam taze ortam, sabit bir pH değerini korumak için sürekli olarak MOE çipine pompalanır. Bu nedenle, hücreler bir CO2 inkübatörü dışında kültürlenebilir. - Çip üzerindeki Ag/AgCl elektrotları aracılığıyla MOE çipine bir EF çoklayıcı bağlamak için elektrik kablolarını kullanın. %50 görev döngüsünde (%50 zaman açık ve %50 zaman kaybetme) 100 Hz frekansta 300 mV/mm şiddetinde kare dalga DC darbeleri çıkarmak için bir EF çoklayıcı ve bir fonksiyon üreteciyi amplifikatöre bağlayın(Şekil 6B).
- Elektrik kablolarını EF çoklayıcıya bağlayın. Elektrik kablolarını Ag/AgCl elektrotları aracılığıyla MOE çipine bağlayın.
- EF çoklayıcıyı elektrik tellerini kullanarak amplifikatöre bağlayın. Fonksiyon jeneratörünü amplifikatöre ve dijital osiloskopa bağlayın.
NOT: EF çoklayıcı, devredeki kültür odasının empedansını içeren ve tüm bireysel odaları paralel bir elektronik ağa bağlayan bir devredir. Üç kültür odasının her biri, çoklayıcıdaki değişken bir direnç (Vr) ve bir ammetreye (Şekil 6A'da μAolarak gösterilir) seri olarak bağlanır. Her kültür odasındaki elektrik akımı Vr'ı kontrol ederek değişir ve akım ilgili ammetrede gösterilir. Her hücre kültürü bölgesindeki elektrik alanı gücü Ohm Yasası, I= φEA, elektrik akımı olduğum, σ (DMEM/ F12 20 için1.38 S·m-1olarak ayarlanır) kültür ortamının elektrik iletkenliği, E elektrik alanı ve A elektrottik odanın kesit alanıdır. Şekil 1'degösterilen hücre kültürü bölge boyutu için, elektrik akımı sırasıyla %50 görev döngüsünde DC ve DC darbesi için ~87 mA ve ~44 mA'dır.
- MNPC'leri 48 saat boyunca 100 Hz frekansta 300 mV/mm büyüklüğünde kare DC darbelere tabi edin. Hücrelere yeterli beslenmeyi sağlamak ve ortamda sabit bir pH değerini korumak için tam ortamı 10 μL/s hızında sürekli pompalayın.
6. Darbeli DC stimülasyonundan sonra mNPC'lerin immünofluoresans tahlilleri
NOT: Bu adımda, tüm reaktifler bir şırınna pompası kullanılarak orta giriş yoluyla pompalanır.
- Tohumlamadan sonra 3, 7 veya 14 gün in vitro (DIV) kültlemeden sonra1, hücreleri 25 μL / dk akış hızında 1x PBS ile 20 dakika yıkayın.
- Hücreleri %4 paraformaldehit (PFA) ile sabitle. 1x PBS'yi değiştirmek için 20 dakika boyunca 25 μL/dk akış hızında çipe %4 PFA pompala. % 4 PFA'yı değiştirmek için, hücreleri 20 dakika boyunca 25 μL / dk akış hızında 1x PBS ile yıkayın.
- Hücrelerin dengesini sağlamak için 6 dakika boyunca 50 μL/dk akış hızında çipe %0,1 Triton X-100 pompala. Hücrelere tepki vermek için 30 dakika daha akış hızını 50 μL/s'ye düşürün. % 0,1 Triton X-100'ü değiştirmek için, hücreleri 6 dakika boyunca 50 μL / dk akış hızında 1x PBS ile yıkayın.
- Spesifik olmayan antikor bağlanmasını azaltmak için % 1 sığır serum albümini (BSA) içeren PBS ile hücreleri engelleyin. Çipe 6 dakika boyunca 50 μL/dk debide %1 BSA pompala. Debiyi 100 μL/s'ye düşürün ve 1 saat pompaya düşürün.
- Çift immünostaining için antikorları 6 dakika boyunca 50 μL/ dk akış hızında çipe pompala ve çipi 4 °C'de 18 saat kuluçkaya yatır. Hücreleri 1x PBS ile 50 μL/dk akış hızında 15 dakika boyunca yıkayın.
- Alexa Fluor konjuge ikincil antikorları 6 dakika boyunca 50 μL/dk akış hızında çipe pompala. Akış hızını 50 μL/s'ye düşürün ve antikorları karanlıkta oda sıcaklığında 1 saat pompalayın. Hücreleri 1x PBS ile 50 μL/dk akış hızında 15 dakika boyunca yıkayın.
- Nükleer boyama için Hoechst 33342'yi karanlıkta oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 20 μL/dk akış hızında talaşın içine pompalayın. Hücreleri 1x PBS ile 50 μL/dk akış hızında 15 dakika boyunca yıkayın.
- İmmünasyondan sonra, konfokal floresan mikroskop kullanarak hücreleri gözlemleyin.
7. Görüntü analizi ve veri işleme
- Floresan görüntüleri yerleşik ölçüm araçlarıyla yazılım kullanarak analiz edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
- Kontrol ve tedavi gruplarındaki Hoechst-counterstained çekirdeklerini (toplam hücre sayısı) karşılaştırın ve her fenotipik işaretçiyi ifade eden hücrelerin yüzdesini hesaplayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
MOE çipinin ayrıntılı yapılandırması Şekil 1'de gösterilmiştir. Mikroakışkan çip, deneysel kurulum boyutunu, numune hacmini ve reaktif hacmini azaltmak için yararlı bir yaklaşım sağlar. MOE çipi, tek bir çalışmada aynı anda üç bağımsız EF stimülasyon deneyi ve birkaç immünostaining koşulu gerçekleştirmek için tasarlanmıştır (Şekil 3). Ek olarak, yüksek optik şeffaflığa sahip MOE çipi konfokal mikroskopi incelemeleri için uygundur. MOE çipi ayrıca tek bir deneyde aynı anda farklı hücre kültürü koşullarının (örneğin, çoklu EF stimülasyonu, birkaç ilaç, farklı kaplama substratı, birden fazla hücre serisi) etkilerini araştırmak için tasarlanmıştır.
MNPC'ler kare dalga DC darbelerine maruz kaldı (100 Hz frekansta 300 mV/mm büyüklüğünde). DC darbe stimülasyonu 48 saat boyunca yapıldı. Farklılaştırılmış hücreler Tuj1 (nörona özgü sınıf III β-tubulin), glial fibril asidik protein (astrositleri tanımlamak için GFAP) ve oligodendrosit belirteci O4 ile immünosit edildi. DC nabız tedavisinden sonra, mNPC'ler DIV 7'de önemli sayıda nöron (Tuj1+ hücresi) ifade etti. DIV 3'te astrositler (GFAP+ hücreleri) stimülasyon gruplarında kontrol (CTL) grubuna göre nispeten daha yüksek seviyelerde mevcuttu. CTL grubu ile karşılaştırıldığında, Oligodendrositler (O4+ hücreleri) DIV 7 ve DIV 14'teki stimülasyon grubunda anlamlı olarak daha yüksekti (Şekil 7). Bu sonuçlar, DC darbe stimülasyonunun mNPC'lerin kök hücre bakım ortamında aynı anda nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaşmasına neden olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, MOE mikroakışkan sisteminin mikroskopi ile uzun süreli hücre farklılaşması çalışması için uygun olduğunu göstermektedir.
Şekil 1: Çok kanallı optik olarak şeffaf elektroaktik çipin ayrıntılı konfigürasyonu. (A) MOE çip tertibatının patlatılmış görünümü. MOE çipi PMMA levhalar (50 mm x 25 mm x 1 mm), çift taraflı bant (50 mm x 25 mm x 0,07 mm), adaptörlerden (10 mm x 10 mm x 6 mm) oluşur ), optik sınıf PMMA levha (50 mm x 75 mm x 3 mm), çift taraflı bant (24 mm x 60 mm x 0,07 mm) ve kapak camı (24 mm × 60 mm). MOE çipinde üç hücre kültürü odası var. MOE çipi, orta giriş/çıkış ve agar tuz köprüleri için bağlantı delikleri vardır. Hücreler hücre kültürü bölgesinde kültürlendi (genişlik 3 mm x uzunluk 42 mm x yükseklik 0,07 mm). Şekil 1A, Chang ve ark.6'dan değiştirilmiştir. (B) Adaptörler, PMMA levhalar, çift taraflı bant ve kapak camdan oluşan MOE çipinin fotoğrafı. Kısaltmalar: MOE= çok kanallı optik şeffaf elektrotaktik; PMMA = polimetil methakrilat. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: MOE çipinin imalat ve montaj işlemleri. (A) PMMA levhalarının veya çift taraflı bandın tasarlanmış desenleri lazer mikromakine kullanılarak imal edilmiştir. (B) Bireysel PMMA levhaları CO2 lazer katipleyici ile kesilmiştir. (C) Temizlenen PMMA levhaların birden fazla katmanı bir termal bonder tarafından birbirine bağlanmıştır. Kısaltmalar: MOE= çok kanallı optik şeffaf elektrotaktik; PMMA = polimetil methakrilat; CO2 = karbondioksit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: MOE çipinin fotoğrafı. Bu rakam Chang ve ark.6'dan değiştirilmiştir. Kısaltma: MOE= çok kanallı optik şeffaf elektrotaktik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: MOE çipine orta ve elektrik bağlantısı. (A) PTFE tüpü, düz tabanlı konektör, koni konektörü, koni-Luer adaptörü, beyaz parmak sıkı fiş, Luer adaptörü, Luer kilit şırıngası, siyah kauçuk bung ve Ag/AgCl elektrotları dahil olmak üzere MOE mikroakışkan sistemindeki orta akış ağı ve EF ağı bileşenlerinin fotoğrafı. (B) Orta akış ağı için yapılandırmanın fotoğrafı. Kısaltmalar: MOE= çok kanallı optik şeffaf elektrotaktik; EF = elektrik alanı; PTFE = politetrafloroetilen; Ag = gümüş; AgCl = gümüş klorür. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Moe çipini mikroskopta gösteren bir fotoğraf. Kısaltmalar: MOE= çok kanallı optik şeffaf elektrotaktik; Ag = gümüş; AgCl = gümüş klorür; ITO = indiyum-kalay-oksit. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: DC darbe stimülasyonu için kullanılan konfigürasyon ve sistem. (A) DC darbe stimülasyonu için tüm sistemin konfigürasyonu. MOE çipine bağlı şırınnalar orta infüzyon ve atık efflux için kullanılmıştır. Çipteki DC darbesi Ag/AgCl elektrotları aracılığıyla yürütülen bir güç kaynağı ile sağlandı. Cihaz kurulumu, dijital kamera ile donatılmış ters faz kontrastlı mikroskobun X-Y-Z motorlu aşamasına kuruldu. (B) Laboratuvar tezgahındaki kurulumu gösteren bir fotoğraf. Kısaltmalar: MOE= çok kanallı optik şeffaf elektrotaktik; Ag = gümüş; AgCl = gümüş klorür; ITO = indiyum-kalay-oksit; EF = elektrik alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Kontrol grubundaki (CTL) ve DC darbe stimülasyon grubundaki mNPC hücrelerinin DIV 3, 7 ve 14'te farklılaşması. Nöron (Tuj1+ hücreleri), astrositler (GFAP+ hücreleri) ve oligodendrositlerin (O4+ hücreleri) CTL grubundaki(A-C)ve (D-F) stimülasyon (DC darbeleri) grubundaki yüzdesi. Bu rakam Chang ve ark.1tarafından yayınlanmıştır. Kısaltmalar: CTL: control; DC = doğru akım; Tuj1 = nörona özgü sınıf III β-tubulin; GFAP = glial fibril asidik protein; O4 = oligodendrosit işaretleyici O4. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MOE çipinin imalatı sırasında, adaptörler hızlı etkili siyanoakrilat tutkal ile MOE çipinin Katman 1'ine bağlanır. Tutkal adaptörlerin 4 köşesine uygulanır ve daha sonra adaptörlerin üzerine eşit basınç uygulanır. Tutkalın tam polimerizasyonunu sağlamak için fazla miktarda tutkaldan kaçınılmalıdır. Ayrıca, tamamlanan MOE talaş montajı bir vakum odasında inkübe edilir. Bu adım PMMA katmanı, çift taraflı bant ve kapak camı arasındaki kabarcıkların giderilmesine yardımcı olur.
Elektrot malzemesinin seçimi, ortamda bol miktarda bulunan klorür iyonlarının hücre kültürü bölgesinden akan elektrolitik ürünler olduğu gerçeğine dayanmaktadır. EF stimülasyon deneyi sırasında elektrotların etrafındaki pH sabit kaldı. Elektrot malzemesi olarak platin (Pt) kullanılarak daha basit bir konfigürasyon suyu elektrolasyona sokarak pozitif elektrot ve negatif elektrotta hidrojen iyonları (H+) ve hidroksit iyonları (OH-) üretir ve kültür bölgesinde pH değişikliklerine neden olur. Pt elektrotlarının kullanımından kaçınmak, EF stimülasyon deneyi sırasında pH değişiklikleri sorununu atlatır.
Sıcak agarose ve kabarcıksız agarose, tuz köprüsü ağının hazırlanması sırasında gereklidir. Sıcak agarose yüksek akışkanlığa sahiptir ve tuz köprüsü ağına kolayca enjekte edilebilir. Luer kilit şırıngasını Luer adaptörüne %3 sıcak agaz enjekte ettikten sonra Luer adaptörüne bağlayın. Bu adım sırasında, agarose Luer kilit şırıngasına itilecek, böylece tuz köprüsü ağının kabarcıksız bir sıkı bağlantısı elde edilebilir. Tuz köprülerindeki kabarcıklar elektrik direncini arttırır ve bu nedenle beklenen elektrik akımına ulaşılamaz. Agarose enjeksiyonundan sonra, hücre kültürü bölgesinde katılaşmış agarose kalıntılarının oluşumunu önlemek için agarose'un oda sıcaklığında 10-20 dakika soğumasını ve katılaşmasını beklemek önemlidir.
MOE çipi, programlanabilir bir X-Y-Z motorlu sahneye kilitlenmiş bir ITO ısıtıcıya yerleştirilir. Tüm sistem, çipteki hücre kültürü bölgelerindeki hücre farklılaşmasını izlemek için dijital kamera ile donatılmış ters faz kontrastlı bir mikroskop üzerine inşa edilir. Bir inkübatör dışında MOE mikroakışkan sisteminde hücre morfolojisini ve otomatik zaman atlamalı görüntülerin edinimini gözlemlemek uygundur. Bu mikroakışkan sistem sadece gerekli deneysel süreyi kısaltmakla kalmaz, aynı zamanda mikroçevrim üzerindeki kontrol doğruluğunu da arttırır.
mNPC hücreleri kültür medyasında bir süspansiyon olarak büyür. Bununla birlikte, MOE çipinde PLL kaplı plakaya yapışmış mNPC'ler farklılaşma için kritik öneme sahiptir. MNPC farklılaşması başlatmak için 30-40 hücrenin oluşturduğu nörosferler tercih edilir. MNPC'lerin aşırı büyümesi, farklılaşma sürecinde hücre sağkalımını bozacaktır. Ayrıca, darbeli DC stimülasyonundan sonra, immünoresans boyama deneysel akış hızından etkilenebilir. Bu nedenle, yıkama sırasında hücrelerin ayrışmasını önlemek için farklı adımlar için birkaç akış hızları kullanın.
Bu çalışmada, bu tekniğin bir sınırlaması, çipin kapsamlı temizliğindeki zorluk nedeniyle MOE çipinin yeniden kullanılamamasıdır. Bununla birlikte, MOE çipi doğrudan bir faz kontrast mikroskobu veya tarama konfokal mikroskobun altına yerlenebilir. Bildirilen mikroakışkan sistemin su geçirmez tasarımı, tampon/orta buharlaşmanın gerçekleşmemesini sağlayarak tamponun/ortamın doğru konsantrasyonunu ve ilgili elektriksel özellikleri korur. Moe mikroakışkan sistemi, reaktif hacimlerini ve buna karşılık gelen çalışma süresini azaltarak hücre farklılaşması için etkili bir yaklaşım sağlar.
Önceki bir çalışma, EGF ve bFGF'nin farklılaşmamış durumda NPC hayatta kalma, genişleme ve bakımı teşvik ettiğini göstermiştir4. Bu çalışmada DC darbeleri EGF ve bFGF içeren kök hücre bakım ortamındaki mNPC'lerin farklılaşmasına neden oldu. Önceki çalışmalar, EF'nin EGF ve bFGF14,21,22olmadan farklılaşma ortamında NPC'lerin nöronlara ve / veya astrositlere farklılaştırılmasını teşvik ettiğinibildirmiştir. Bu sonuçlar, mNPC'lerin DC darbe stimülasyonundan sonra nöronlara, astrositlere ve oligodendrositlere farklılaştırıldığını göstermektedir. Ayrıca basit DC darbe tedavisinin NPC'lerin kaderini kontrol edebileceğini öne sürüyorlar. Stimülasyon süresi, EF gücü veya görev döngüsü üzerinde daha fazla optimizasyon ile, DC darbeleri NPC farklılaşmasını manipüle etmek için uygulanabilir ve sinir sistemi bozukluklarını tedavi etmek için NPC'leri kullanan terapötik stratejilerin geliştirilmesi için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Yazarlar, Fare sinir sapı ve progenitör hücrelerin (mNPC' ler) sağlanmasındaki yardımı için Academia Sinica Biyomedikal Bilimler Enstitüsü'nden Profesör Tang K. Tang'a teşekkür ediyor. Yazarlar ayrıca Profesör Tang K. Tang ve Bayan Ying-Shan Lee'ye MNPC'lerin farklılaşması konusundaki değerli tartışmaları için teşekkür ediyor.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mm PMMA substrates (Layers 1-3) | BHT | K2R20 | Polymethyl methacrylate (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html |
| 15 mL plastic tube | Protech Technology Enterprise Co., Ltd | CT-15-PL-TW | Conical bottomed tube with cap, assembled, presterilized |
| 3 mL syringe | TERUMO | DVR-3413 | 3 mL oral syringes, without needle |
| 3 mm optical grade PMMA (Layer 5) | CHI MEI Corporation | ACRYPOLY PMMA Sheet | Optical grade PMMA |
| 3-way stopcock | NIPRO | NCN-3L | Sterile disposable 3-way stopcock |
| 5 mL syringe | TERUMO | DVR-3410 | 5 mL oral syringes, without needle |
| Adaptor | Dong Zhong Co., Ltd. | Customized | PMMA adaptor |
| Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 | Agarose, low gelling temperature |
| Amplifier | A.A. Lab Systems Ltd | A-304 | High voltage amplifier |
| AutoCAD software | Autodesk | Educational Version | Drafting |
| B-27 supplement | Gibco | 12587-010 | B-27 supplement (50x), minus vitamin A |
| Basic fibroblast growth factor (bFGF) | Peprotech | AF-100-18B | Also called recombinant human FGF-basic |
| Black rubber bung | TERUMO | DVR-3413 | From 3 mL oral syringes, without needle |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | B4287 | Blocking reagent |
| Centrifuge | HSIANGTAI | CV2060 | Centrifuge |
| CO2 laser scriber | Laser Tools and Technics Corp. | ILS-II | Purchased from http://www.lttcorp.com/index.htm |
| Cone connector | IDEX Health & Science | F-120X | One-piece fingertight 10-32 coned, for 1/16" OD natural |
| Cone-Luer adaptor | IDEX Health & Science | P-659 | Luer Adapter 10-32 Female to Female Luer, PEEK |
| Confocal fluorescence microscope | Leica Microsystems | TCS SP5 | Leica TCS SP5 user manual, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf |
| Digital camera | OLYMPUS | E-330 | Automatic time-lapse image acquisition |
| Digital oscilloscope | Tektronix | TDS2024 | Measure voltage or current signals over time in an electronic circuit or component to display amplitude and frequency. |
| Double-sided tape | 3M | PET 8018 | Purchased from http://en.thd.com.tw/ |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium/Ham's nutrient mixture F-12 (DMEM/F12) | Gibco | 12400024 | DMEM/F-12, powder, HEPES |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Gibco | 21600010 | DPBS, powder, no calcium, no magnesium |
| EF multiplexer | Asiatic Sky Co., Ltd. | Customized | Monitor and control the electric current in individual channels |
| Epidermal growth factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | Also called recombinant human EGF |
| Fast-acting cyanoacrylate glue | 3M | 7004T | Strength instant adhesive (liquid) |
| Flat bottom connector | IDEX Health & Science | P-206 | Flangeless male nut Delrin, 1/4-28 flat-bottom, for 1/16" OD blue |
| Function generator | Agilent Technologies | 33120A | High-performance 15 MHz synthesized function generator with built-in arbitrary waveform capability |
| Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) | Abcam | ab150117 | Goat anti-mouse IgG H&L (Alexa Fluor 488) preadsorbed |
| Goat anti-rabbit IgG H&L (Alexa Fluor 555) | Abcam | ab150086 | Goat polyclonal secondary antibody to rabbit IgG - H&L (Alexa Fluor 555), preadsorbed |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining |
| ImageJ software | National Institutes of Health | 1.48v | Analyze the fluorescent images |
| Indium–tin–oxide (ITO) glass | Merck | 300739 | For ITO heater |
| Inverted phase contrast microscope | OLYMPUS | CKX41 | For cell morphology observation |
| K-type thermocouple | Tecpel | TPK-02A | Temperature thermocouples |
| Luer adapter | IDEX Health & Science | P618-01 | Luer adapter female Luer to 1/4-28 male polypropylene |
| Luer lock syringe | TERUMO | DVR-3413 | For agar salt bridges |
| Mouse anti-GFAP | eBioscience | 14-9892 | Astrocytes marker |
| Oligodendrocyte marker O4 antibody | R&D Systems | MAB1326 | Oligodendrocytes marker |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | Fixing agent |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Basic Life | BL2651 | Washing solution |
| Poly-L-Lysine (PLL) | SIGMA | P4707 | Coating solution |
| Precision cover glasses thickness No. 1.5H | MARIENFELD | 107242 | https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html |
| Programmable X-Y-Z motorised stage | Tanlian Inc | Customized | Purchased from http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm |
| Proportional–integral–derivative (PID) controller | Toho Electronics | TTM-J4-R-AB | Temperature controller |
| PTFE tube | Professional Plastics Inc. Taiwan Branch | Outer diameter 1/16 Inches | White translucent PTFE tubing |
| Rabbit anti-Tuj1 | Abcam | ab18207 | Neuron marker |
| Syringe pump | New Era Systems Inc | NE-1000 | NE-1000 programmable single syringe pump |
| TFD4 detergent | FRANKLAB | TFD4 | Cover glass cleaner |
| Thermal bonder | Kuan-MIN Tech Co. | Customized | Purchased from http://kmtco.com.tw/ |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Permeabilized solution |
| Ultrasonic cleaner | LEO | LEO-300S | Ultrasonic steri-cleaner |
| Vacuum chamber | DENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd. | DOV-30 | Vacuum drying oven |
| White fingertight plug | IDEX Health & Science | P-316 | 1/4-28 Flat-Bottom, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html |
References
- Chang, H. F., Lee, Y. S., Tang, T. K., Cheng, J. Y. Pulsed DC electric field-induced differentiation of cortical neural precursor cells. PLoS One. 11 (6), e0158133 (2016).
- Li, S., Li, H., Wang, Z. Orientation of spiral ganglion neurite extension in electrical fields of charge-balanced biphasic pulses and direct current in vitro. Hearing research. 267 (1-2), 111-118 (2010).
- Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
- Kim, Y. H., et al. Differential regulation of proliferation and differentiation in neural precursor cells by the Jak pathway. Stem Cells. 28 (10), 1816-1828 (2010).
- Cunha, F., Rajnicek, A. M., McCaig, C. D. Electrical stimulation directs migration, enhances and orients cell division and upregulates the chemokine receptors CXCR4 and CXCR2 in endothelial cells. Journal of Vascular Research. 56 (1), 39-53 (2019).
- Chang, H. F., Cheng, H. T., Chen, H. Y., Yeung, W. K., Cheng, J. Y. Doxycycline inhibits electric field-induced migration of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells. Scientific Reports. 9 (1), 8094 (2019).
- Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6 (3), 34116 (2012).
- Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosensors and Bioelectronics. 24 (12), 3510-3516 (2009).
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. American Chemical Society Chemical Neuroscience. 10 (1), 348-357 (2019).
- Guo, W., et al. Self-powered electrical stimulation for enhancing neural differentiation of mesenchymal stem cells on graphene-poly(3,4-ethylenedioxythiophene) hybrid microfibers. American Chemical Society Nano. 10 (5), 5086-5095 (2016).
- Manabe, M., Mie, M., Yanagida, Y., Aizawa, M., Kobatake, E. Combined effect of electrical stimulation and cisplatin in HeLa cell death. Biotechnology and Bioengineering. 86 (6), 661-666 (2004).
- Liu, M., et al. Protective effect of moderate exogenous electric field stimulation on activating netrin-1/DCC expression against mechanical stretch-induced injury in spinal cord neurons. Neurotoxicity Research. 34 (2), 285-294 (2018).
- Haan, N., Song, B. Therapeutic application of electric fields in the injured nervous system. Advances in Wound Care. 3 (2), 156-165 (2014).
- Ariza, C. A., et al. The influence of electric fields on hippocampal neural progenitor cells. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (4), 585-600 (2010).
- Huang, C. W., et al. Gene expression of human lung cancer cell line CL1-5 in response to a direct current electric field. PLoS One. 6 (10), e25928 (2011).
- Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6 (1), 14102-14114 (2012).
- Hou, H. S., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis studies of lung cancer cells using a multichannel dual-electric-field microfluidic chip. Journal of Visualized Experiments. 106, e53340 (2015).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Hsu, W. C., Jhang, J. H., Young, T. H. ITO patterning by a low power Q-switched green laser and its use in the fabrication of a transparent flow meter. Journal of Micromechanics and Microengineering. 17 (11), 2316-2323 (2007).
- Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2 (2), 24105 (2008).
- Fuhr, G., Shirley, S. G. Cell handling and characterization using micron and submicron electrode arrays: state of the art and perspectives of semiconductor microtools. Journal of Micromechanics and Microengineering. 5 (2), 77-85 (1995).
- AChang, K. A., et al. Biphasic electrical currents stimulation promotes both proliferation and differentiation of fetal neural stem cells. PLoS One. 6 (4), e18738 (2011).
- Lim, J. H., McCullen, S. D., Piedrahita, J. A., Loboa, E. G., Olby, N. J. Alternating current electric fields of varying frequencies: effects on proliferation and differentiation of porcine neural progenitor cells. Cell Reprogram. 15 (5), 405-412 (2013).
