Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

استكمال نشاط الربط بواسطة Galectin-3 - U1 SnRNP مجمع على الخرز

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

تصف هذه المقالة الإجراءات التجريبية ل(أ) استنفاد U1 snRNP من المستخلصات النووية، مع ما يصاحب ذلك من فقدان نشاط الربط؛ (ب) استنفاد اليورانيوم 1 من اليورانيوم المستنفد لليورانيوم من المستخلصات النووية، مع ما يصاحب ذلك من فقدان نشاط الربط؛ (ب) استنفاد اليورانيوم من اليورانيوم 1 من اليورانيوم المستنفد للأوزون؛ (ج) استنفاد اليورانيوم من اليورانيوم غير النووي. و (ب) إعادة تشكيل نشاط الربط في استخراج U1 المنضب بواسطة الجسيمات galectin-3 - U1 SnRNP ملزمة بالخرز يقترن بشكل متناقض مع الأجسام المضادة المضادة للجاليكتين-3.

Abstract

وتشير التجارب الكلاسيكية لإعادة تشكيل الاستنفاد إلى أن الجيليكتين -3 عامل مطلوب للربط في المستخلصات النووية. يتم تناول آلية دمج galectin-3 في مسار الربط في هذه الورقة. الترسيب من المستخلصات النووية خلايا هيلا على 12٪ -32٪ التدرجات الجلسرين تسفر عن كسور المخصب في الجسيمات الذاتية ~ 10S التي تحتوي على galectin-3 و U1 snRNP. ونصف الآن بروتوكولا لاستنفاد المستخلصات النووية من U1 snRNP مع ما يصاحب ذلك من فقدان نشاط الربط. يمكن إعادة تشكيل نشاط الربط في استخراج U1 المستنفدة من قبل الجسيمات galectin-3 - U1 SnRNP المحاصرين على حبات الآغاروز بشكل مشترك مع الأجسام المضادة المضادة للجاليكتين-3. وتشير النتائج إلى أن galectin-3 - U1 snRNP - مجمع ما قبل ميرنا الترنيري هو مجمع E وظيفي يؤدي إلى وسيطة ومنتجات رد فعل الربط وأن galectin-3 يدخل مسار الربط من خلال ارتباطه مع U1 snRNP. قد ينطبق مخطط استخدام التعقيدات التي يتم اختيارها من ناحية التقارب أو المناعة على الخرز لإعادة تشكيل نشاط الربط في المستخلصات المستنفدة لعامل ربط محدد بشكل عام على أنظمة أخرى.

Introduction

إنتاج معظم RNAS رسول eukaryotic (mRNAs) ينطوي على إزالة introns وربط exons في عملية نووية يطلق عليها اسم ما قبل مرنا الربط1. نوعين من مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي (RNPs) توجيه معالجة الحمض النووي الريبي قبل رسول في ميرنا ناضجة عبر مجمعات الطحال. يتم تشكيل فئة واحدة ، RNPs ما قبل الرسول الوليدة ، نسخا مشتركة من خلال ربط بروتينات RNP النووية غير المتجانسة وغيرها من البروتينات الملزمة للجيش الملكي النيبالي ، بما في ذلك بعض أفراد عائلة SR ، مما ينتج مجمعات hnRNP2. ويرتبط من الدرجة الثانية، RNPs النووية الصغيرة الغنية uracil (U snRNPs مع U1، U2، U4، U5، وU6 snRNAs) مع U محددة والبروتينات الأساسية3،4. تتفاعل UnRNPs بطريقة مرتبة مع مناطق محددة من RNPs ما قبل الرسول في مسار إعادة عرض ديناميكي حيث يتم استئصال السترونز وربط exons لإنتاج mRNPs5 ناضجة. ويشارك العديد من البروتينات النووية الإضافية في أحداث المعالجة هذه6.

Galectin-1 (Gal1) و galectin-3 (Gal3) هما بروتينان مطلوبان في مسار الربط كما هو موضح في دراسات إعادة تشكيل الاستنفاد7،8. إزالة كل من galectins من الربط المستخلصات النووية المختصة (NE) يلغي التجميع الربط ونشاط الربط في خطوة مبكرة. إضافة أي galectin إلى مثل هذه NE المنضب بشكل مضاعف يستعيد كلا النشاطين. Gal1 و Gal3 هي مكونات اللصقات النشطة كما يتضح من السبق المناعي المحدد لمرنا ما قبل، وسيطة الربط، ورنا ناضجة من قبل antiserum محددة إما Gal1 أو Gal39. الأهم من ذلك، Gal3 المنتسبين مع SnRNA U الذاتية التي تحتوي على جزيئات في NE خارج مسار الربط كما هو مبين من خلال هطول الأمطار من snRNPs من قبل antisera10 المضادة Gal3. وأخيرا، إسكات Gal3 في خلايا هيلا يغير أنماط الربط من الجينات العديدة11.

في NE قبل احتضان لتفكيك اللصقات مسبقة الشكل12، تم العثور على snRNPs في مجمعات متعددة الرسوب في تدرجات الجلسرين من 7S إلى أكبر من 60S. على الرغم من أن الكسر التدرج الجلسرين هو تقنية شائعة لعزل المجمعات والمكونات الطحال (انظر المراجع13,14,15 على سبيل المثال), لقد قمنا بتوسيع هذه الطريقة عن طريق توصيف كسور محددة باستخدام الأجسام المضادة المناعية. وsnRNP الرسوب في 10S يحتوي فقط U1 snRNA جنبا إلى جنب مع Gal3. إن التكسير المناعي للكسر 10S مع antisera محدد ل Gal3 أو U1 snRNP يشارك في التعجيل بكل من U1 و Gal3 مما يشير إلى أن بعض الجسيمات الأحادية U1 snRNP لا بد أن تكون Gal310. كما U1 snRNP هو أول مجمع يربط إلى ما قبل mRNP في التجميع spliceosomal1،5، تمثل هذه الخطوة موقع دخول محتمل لGal3 في مسار الربط. على هذا الأساس، أظهرنا أن 10S Gal3-U1 snRNP أحادية الجسيمات ملزمة المضادة Gal3 التي تحتوي على الخرز استعادة نشاط الربط إلى U1 snRNP استنفدت NE، وإنشاء هذا المجمع كآلية واحدة التي يتم تجنيد Gal3 في المسار الربط16. وهذا يتناقض مع محاولات عزل اللصقات في مراحل محددة في رد فعل الربط وفهرسة العوامل المرتبطة بها17,18. وفي مثل هذه الدراسات، يتم التأكد من وجود عوامل معينة في وقت ما ولكن ليس الآلية التي تم تحميلها بها.

كنا قد وصفنا بالتفصيل في إعداد NE، وركيزة الربط، وتجميع خليط رد فعل الربط، وتحليل المنتجات في توثيقنا لدور galectins في الربط قبل ميرنا19. ونصف الآن الإجراءات التجريبية لتجزئ المستخلصات النووية للحصول على جزء مثري في مجمع Gal3 - U1 snRNP ولانتقاء المناعة للمجمع الأخير لإعادة تشكيل نشاط الربط في مستخلص نووي مستنفد U1.

Figure 1
الشكل 1: مخطط تخطيطي يوضح استكمال نشاط الربط في استخراج نووي مستنزف من U1 snRNP بواسطة مجمع Gal3-U1 snRNP على الخرز. (A) NE في العازل C (NE(C)) يتم احتضانه بخرز البروتين A-Sepharose مقترنا بشكل متناقض مع حبات SnRNP المضادة U1 (حبات αU1). يتم استنفاد الكسر غير منضم من U1 snRNP (U1ΔNE). (ب) يتم تجزئة NE في المخزن المؤقت D (NE(D)) على تدرج جلسيرول 12٪-32٪ عن طريق الطرد المركزي الفائق. يتم الجمع بين الكسور المقابلة لمنطقة 10S (الكسور 3-5) وخلطها مع الخرز المقترن بشكل مشترك مع الأجسام المضادة المضادة ل Gal3 (حبات αGal3). المواد ملزمة الخرز يحتوي على Gal3-U1 snRNP أحادية الحزبية. (ج) يتم خلط مجمع Gal3-U1 snRNP من الجزء (B) مع U1ΔNE من الجزء (A) في مقايسة الربط باستخدام ركيزة MINX قبل ميرنا المسماة 32P ويتم تحليل وسيطة ومنتجات تفاعل الربط بواسطة الكتروفلوريس الهلامي والتصوير الإشعاعي التلقائي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ملاحظات حول الإجراءات العامة

  1. تأكد من أن جميع المواد الكيميائية (المكونات العازلة، والإنزيمات، وما إلى ذلك) يتم الاحتفاظ بها خالية من الريبونوكليز (RNase). عزل جميع زجاجات الكاشف المشتراة تجاريا من الاستخدام العام للمختبر. ارتداء قفازات لجميع خطوات الإجراء التجريبي. استخدم فقط الأواني الزجاجية والأواني التي تم خبزها (انظر الخطوة 1.2 أدناه) والحلول التي تم علاجها مسبقا (انظر الخطوة 1.3 أدناه).
  2. خبز جميع الأواني الزجاجية (الأكواب، القوارير، زجاجات، ماصة، الخ) لمدة لا تقل عن 4 ساعة في 177 درجة مئوية. التفاف الأواني الأخرى (ملعقة، اثارة القضبان، الخ) في رقائق الألومنيوم قبل الخبز في ظل نفس الظروف.
  3. إعداد حل 0.1٪ (vol/vol) من ديثيليبيروكربونات (DEPC) في الماء المقطر المزدوج (ddH2O). باستخدام شريط اثارة المغناطيسي، واثارة هذا الحل بين عشية وضحاها ومن ثم الأوتوكلاف. استخدم H2O المعالج من DEPC لإجراء كافة الحلول التي تحتوي على Tris; ثم، تصفية تعقيم باستخدام فلتر فراغ أعلى زجاجة. استخدام ddH2O العادية لإعداد جميع الحلول الأخرى (دون تريس)؛ ثم، علاج مع DEPC (0.1٪، فول / فول) وautclave.
    ملاحظة: يتم سرد المخازن المؤقتة المستخدمة في المجموعة التالية من الإجراءات التجريبية أبجديا في الجدول 1.
اسم المخزن المؤقت تكوين
المخزن المؤقت بورات 0.2 م بورات الصوديوم، pH 9
المخزن المؤقت C 20 mM HEPES, pH 7.9, 25٪ (vol/vol) جلسيرول, 0.42 M NaCl, 1.5 مللي متر ملغCl2, 0.2 مللي متر EDTA, 0.5 m M فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد (PMSF), 0.5 مللي متر ديثيوثريتول (DTT)
المخزن المؤقت D 10 م م HEPES، pH 7.9، 20٪ (vol/vol) جلسيرول، 0.1 M KCl، 0.2 m M EDTA، 0.5 mM PMSF، 0.5 mM DTT
60٪ مد 60٪ المخزن المؤقت D و 40٪ H2O
الإيثانولامين 0.2 مي الإيثانولامين، pH 8
عازل ربط HEPES 20 mM HEPES, pH 7.9
HEPES غسل العازلة 20 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 M NaCl
مخزن تحميل الحمض النووي الريبي المؤقت 90٪ فورماميد، 20 mM EDTA، pH 8، 0.05٪ (ث / v) بروموفينول الأزرق
المخزن المؤقت SDS-PAGE 25 mM تريس، 169 مل سليسين، 0.1٪ كبريتات دودسيل الصوديوم (SDS)، pH 8.8
المخزن المؤقت لعينة SDS 62.5 mM تريس، سه 6.8، 2٪ SDS، 10٪ الجلسرين، 5٪ 2-ميركابتوثانول، 0.1٪ (ث / v) بروموفينول الأزرق
TBE العازلة لالمواد الهلامية الجيش الملكي النيبالي 89 mM Tris، 89 mM حمض البوريك، 2.5 mM EDTA، درجة الحموضة 8.3
TE المخزن المؤقت 10 mM تريس، pH 8، 1 mM EDTA
نقل المخزن المؤقت 25 mM تريس، 1.92 M الجليسين، 20٪ الميثانول، pH 8.3
T-TBS المخزن المؤقت 10 mM تريس، 0.5 M NaCl، 0.05٪ توين 20، pH 7.5
مخزن TX المؤقت للغسيل 0.05٪ تريتون X-100 (تكساس) في 60٪D

الجدول 1: اسم المخازن المؤقتة وتكوينها

2. إعداد NE المنضب من U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. إعداد الخرز المضادة U1 لاستبداد المناعة
    1. قبل تضخم 50 ملغ البروتين A-Sepharose CL-4B الخرز في H2O DEPC المعالجة الزائدة لإنتاج ما يقرب من 200 ميكرولتر من الخرز منتفخة ومن ثم غسل في العازلة غسل HEPES.
    2. لهذا الغسيل وجميع يغسل اللاحقة، بيليه الخرز عن طريق الطرد المركزي (1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق) وإزالة غسل غير منضم باستخدام micropipettor وتجاهل.
    3. مزيج 150 ميكرولتر من الخرز المغسول مع 150 ميكرولتر من مصل المناعة الذاتية البشرية محددة لU1 snRNP (حجم الأجسام المضادة لحجم الخرز في نسبة 1:1).
    4. ضبط، على أساس الحجم الإجمالي (~ 300 ميكرولتر من الخطوة 2.1.3 أعلاه)، الخليط إلى 20 م م HEPES، الرقم الحموضة 7.9، المقابلة لشروط العازلة ربط HEPES؛ احتضان هذا الخليط مع هزاز مستمر في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة.
    5. غسل الخرز ملزمة مع الأجسام المضادة مع 1 مل من المخزن المؤقت بورات (0.2 M بورات الصوديوم، pH 9) وإعادة الإنفاق في 1 مل من نفس المخزن المؤقت بورات.
    6. للزوجين بشكل متناقض الأجسام المضادة ملزمة حبات البروتين A-Sepharose، إضافة dimethylpimelimidate إلى تركيز النهائي من 20 mM واحتضان في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لمدة 60 دقيقة.
    7. غسل الخرز مع 1 مل من المخزن المؤقت البورات.
    8. لمنع أي كاشف ربط متقاطع غير منقح، أضف 1 مل من 0.2 M الإيثانولامين (درجة الحموضة 8) واحتضن في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لمدة 60 دقيقة.
    9. غسل الخرز المقترن بالأجسام المضادة ، الذي تم تعيينه فيما بعد كعرز مضاد U1 ، مرتين مع 0.5 مل من مخزن غسيل TX المؤقت (0.05٪ Triton X-100 في 60٪ D).
  2. استنفاد U1 snRNP من NE (انظر الشكل 1A)
    ملاحظة: تم تطوير الإجراء لإعداد NE من خلايا هيلا في البداية من قبل Dignam et al.20. لقد وصفنا المواد والأساليب التفصيلية لإعداد NE لإجراء عمليات الفحص الربط19 (انظر الخطوتين 2.1 و 3.1 من هذا المرجع). NE، كما أعدت في البداية في المخزن المؤقت C وسيتم تعيينها فيما بعد NE (C). NE(C) dialyzed ضد وequilibrated مع المخزن المؤقت D سيتم تعيين NE(D).
    1. احتضان 200 ميكرولتر من NE (C) مع 100 ميكرولتر من الخرز المضاد U1 من الخطوة 2.1.9 أعلاه.
    2. إضافة 5 ميكرولتر من RNasin إلى الخليط.
    3. تدوير رأس microtube فوق الذيل في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. بيليه الخليط عن طريق الطرد المركزي (1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق) وجمع المواد غير منضمة (U1ΔNE) باستخدام حقنة هاملتون.
    5. Dialyze الحجم الكامل ل U1ΔNE، جنبا إلى جنب مع aquot 50 ميكرولتر منفصلة من NE (C) غير كامل الأصلي)، في مقصورات منفصلة من microdialyzer، مع اثارة، لمدة 75 دقيقة ضد 60٪ D باستخدام غشاء غسيل الكلى مع 8 K قطع الوزن الجزيئي.
    6. مباشرة بعد غسيل الكلى، تقسيم هذه الاستعدادات (U1ΔNE و NE في 60٪ D) إلى 20 ميكرولتر aliquots. ثم المفاجئة تجميد في حمام الثلج الجاف / الإيثانول وتخزينها في -80 درجة مئوية.
  3. تحليل الحمض النووي الريبي ومحتوى البروتين من U1ΔNE والمواد ملزمة على الخرز المضادة U1
    1. بعد إزالة المواد غير المنضمة (U1ΔNE) (الخطوة 2.2.4) ، اغسل المادة المرتبطة بالخرز المضاد U1 بإضافة 0.5 مل من مخزن غسيل TX المؤقت. بيليه الخليط عن طريق الطرد المركزي (1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق) وإزالة supernatant باستخدام micropipettor وتجاهل.
    2. كرر خطوات الغسيل 2.3.1 مرتين.
    3. إزالة المواد ملزمة الخرز المضادة U1 بإضافة 100 ميكرولتر من 2x SDS عينة العازلة إلى 100 ميكرولتر من الخرز واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    4. بيليه الخليط عن طريق الطرد المركزي (1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق)؛ إزالة supernatant بواسطة حقنة هاملتون، وتجميد المفاجئة في حمام الثلج الجاف / الإيثانول. يخزن عند -80 درجة مئوية.
    5. قارن NE غير كامل NE depleted (U1ΔNE) والمواد المرتبطة بالخرز (إزالتها من الخرز بواسطة المخزن المؤقت عينة SDS كما هو موضح في الخطوتين 2.3.3 و 2.3.4 أعلاه). اتبع الخطوات 2.3.6-2.3.8 لتحليل الحمض النووي الريبي أو الخطوات 2.3.9-2.3.10 لتحليل البروتين.
    6. لكل عينة، استخراج الحمض النووي الريبي مع 200 ميكرولتر من الفينول-الكلوروفورم (50:50، v/v)؛ ثم استخراج مرة أخرى مع 180 ميكرولتر من الكحول الكلوروفورم isoamyl (25:1، v/v). بعد الاستخراج، إضافة 300 ميكرولتر من الإيثانول الباردة 200 واقية، عكس لخلط، وتخزين الحمض النووي الريبي عجلت بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
    7. طرد مركزي من الحمض النووي الريبي المعجل بالإيثانول (12000 × غرام لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية). غسل الكريات مع 150 ميكرولتر من الإيثانول الباردة 70٪. جهاز الطرد المركزي مرة أخرى (12000 × غرام) عند 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. إزالة supernatant باستخدام micropipettor وتجفيف الكريات في سرعة فاك لمدة 10-15 دقيقة دون حرارة.
    8. Resuspend بيليه الحمض النووي الريبي المجفف في 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل العازلة، دوامة بلطف، والحرارة إلى 75-85 درجة مئوية لمدة 90 ثانية، ومن ثم احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة. فصل SnRNAs بواسطة هلام electrophoresis (2 ساعة في 16 mA) من خلال 13٪ البولي أكريلاميد - 8.3 M اليوريا الهلامية ومن ثم وصمة عار إما مع بروميد الإيثيديوم أو تخضع للنشاف الشمالية10،16.
    9. تحميل عينات البروتين، في المخزن المؤقت عينة SDS من الخطوة 2.3.5، على 12.5٪ المواد الهلامية البولي أكريلاميد والكهربائية في 200 V لحوالي 45-50 دقيقة في SDS-PAGE (الصوديوم دودسيل كبريتات البولي أكريلاميد هلام الكهربائي) العازلة.
    10. نقل البروتينات المنفصلة إلى غشاء النيتروسليلوز في 400 mA لمدة 2 ساعة في المخزن المؤقت للنقل. بعد نقل، منع الغشاء عن طريق احتضان بين عشية وضحاها في T-TBS تحتوي على 10٪ الحليب الجاف غير الدهني. ثم، immunoblot الغشاء للكشف عن بروتينات محددة8،21.

3. الكسر المناعي للكسور 10S من التدرجات الجلسرين بواسطة المضادة Gal3

  1. إعداد الخرز المضادة للجال3 لاستبداد المناعة
    ملاحظة: اشتقاق وتوصيف antisera متعدد النسيلة أرنب ضد Gal3 للأرنب # 2421 والأرنب # 4910 وقد وصفت سابقا.
    1. استخدام مصل ما قبلمون من أرنب # 49 والسيطرة.
    2. لإعداد الخرز المضادة Gal3 اتبع الإجراء الموصوف سابقا لإعداد الخرز المضادة U1 (الخطوة 2.1)، باستثناء أن المقابلة للخطوة 2.1.3، ونسبة antiserum (على سبيل المثال، المضادة Gal3، # 49) إلى الخرز هو 3:1.
    3. قبل الاستخدام مباشرة، اغسل الخرز المقترن بالأجسام المضادة، الذي تم تعيينه فيما بعد كخرزات مضادة ل Gal3، مرتين مع 0.5 مل من مخزن غسيل TX المؤقت. إزالة supernatant، أولا مع micropipettor للحصول على معظم السائل ومن ثم مع حقنة هاملتون للحصول على السائل من الخرز. اطرح.
  2. مناعة الكسور التدرج الجلسرين بواسطة المضادة Gal3 (انظر الشكل 1B)
    1. كسر NE (D) على مدى 12٪-32٪ التدرج الجلسرين10. الجمع بين وخلط الكسور التدرج الجلسرين 3 و 4 و 5 (مرقم من أعلى التدرج)، والتي هي بالقرب من منطقة 10S من التدرج.
    2. إعداد عينتين، كل مع 150 ميكرولتر aliquot من الكسور التدرج مجتمعة 3-5 (الخطوة 3.2.1)، ومكان في 50 ميكروغرام من الخرز المضادة Gal3.
    3. بالتوازي، قم بإعداد عينتين لكل منهما 150 ميكرولتر من الكسر 1 (تحتوي على Gal3 غير معقدة مع U1 snRNP10؛ الخطوة 3.2.1) ووضعها في 50 ميكرولتر من الخرز المضاد ل Gal3.
    4. كعنصر تحكم، ضع 150 ميكرولتر من 60٪ D في ميكروتوب آخر من حبات مضادة ل Gal3 50 ميكرولتر.
    5. مزيج بلطف عن طريق النقر على الأنبوب، ثم تدوير microtube الرأس أكثر من الذيل في 4°C لمدة 1 ساعة.
    6. بيليه الخليط عن طريق الطرد المركزي لطيف (1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق).
    7. إزالة supernatant (المواد غير منضم) باستخدام حقنة هاملتون. لا تغسل الخرز واستخدامها على الفور لإضافة ردود الفعل الربط (القسم 4.2).
  3. تحليل الحمض النووي الريبي ومحتوى البروتين في المواد غير المقيدة والملزمة من هطول الأمطار المضادة Gal3 من كسور الانحدار 10S
    1. لتحليل مكونات المواد المقيدة وغير المقيدة من هطول الأمطار المضادة Gal3 من كسور الانحدار 10S، وجمع المواد غير منضم (supernatant بعد الخطوة 3.2.6)، ونقل إلى microtube جديدة، وتجميد في -20 درجة مئوية.
    2. غسل الخرز عجلت من الخطوة 3.2.6 (تحتوي على مواد ملزمة المضادة Gal3) عن طريق إضافة 0.5 مل من TX غسل العازلة.
    3. بيليه الخليط عن طريق الطرد المركزي لطيف (1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق)؛ إزالة supernatant باستخدام micropipettor وتجاهل. كرر خطوات الغسيل مرتين أكثر.
    4. إضافة 50 ميكرولتر من 2X SDS عينة المخزن المؤقت إلى الخرز غسلها والكريات المضادة Gal3.
    5. اخلطي الخرز برفق واحتضنيه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. بيليه الخليط عن طريق الطرد المركزي لطيف (1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق) ، وجمع supernatant من قبل حقنة هاملتون وتخزينها في microtube الطازجة في -20 درجة مئوية.
    7. قارن المواد غير المنضمة (القسم 3.3.1) والمادة المقيدة (الخطوة 3.3.6) من هطول الأمطار المضادة ل Gal3 من حيث الحمض النووي الريبي ومكونات البروتين، وذلك باستخدام الإجراءات على النحو المبين في الخطوات 2.3.6. إلى 2.3.10، على التوالي.

4. تجميع رد فعل الربط وتحليل المنتجات

  1. إعداد الركيزة الربط
    ملاحظة: الركيزة ما قبل مرنا، MINX المعينة، يحتوي على تسلسلين exon وتسلسل واحد intron من Adenovirus22. تسلسل الحمض النووي MINX في البلازميد تحت سيطرة T3، T7، أو SP6 الحمض النووي الريبي بوليمراز المروجين. المواد والأساليب التفصيلية لتدوين الحمض النووي MINX plasmid مع endonuclease تقييد BamHI، النسخ من قبل SP6 RNA بوليمراز في وجود α-32P [GTP] وتنقية MINX المسمى 32P لإجراء فحوصات الربط موصوفة سابقا19 (انظر الخطوتين 2.2 و 3.2 من تلك الإشارة).
    1. تخزين MINX تسمية إشعاعية كمعجل الإيثانول في -20 درجة مئوية; استخدام الركيزة الربط المسمى في غضون 4-6 أسابيع بعد النسخ.
    2. قبل الاستخدام مباشرة، عجلت أجهزة الطرد المركزي الإيثانول MINX 32P المسمى في 12،000 × ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية. إزالة supernatant مع micropipettor وتجاهل.
    3. أضف 150 ميكرولتر من الإيثانول والطرد المركزي بنسبة 70٪ عند 12,000 × غرام لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل supernatant وتجفيف بيليه في سرعة فاك مع عدم وجود حرارة لمدة 15 دقيقة.
    4. إعادة ترطيب بيليه في 50 ميكرولتر من المياه DEPC. بقعة 2 ميكرولتر على كل من اثنين من مرشحات GF / C؛ تزج المرشحات في الباردة 5٪ حمض ثلاثي الكلور (TCA) لمدة 10 دقيقة. شطف مع TCA الباردة 5٪، تليها الإيثانول واقية من 180 على قارورة فراغ. الهواء الجاف المرشحات وتخضع لعد التلألؤ في 4 مل من السلامة حل.
    5. تمييع MINX 32P المسمى في 60٪ D إلى 104 cpm/μL لإجراء فحص الربط.
  2. تجميع رد الفعل الربط (انظر الشكل 1C)
    1. تجميع، على الجليد، وردود الفعل الربط في حجم إجمالي قدره 24 ميكرولتر (8 ميكرولتر U1ΔNE (من الخطوة 2.2.6)، 3.5 مللي متر ملغCl2، 1.5 mM ATP، 20 mm الكرياتين فوسفات، 0.5 mM DTT، 20 وحدة RNasin، 4 ميكرولتر 32P المسمى MINX الربط الركيزة (104 cpm/μL)، 60٪ D) وإضافة إلى كل أنبوب من الخرز من القسم 3.2.7. تجميع مجموعة متطابقة من ردود الفعل الربط في حجم إجمالي قدره 24 ميكرولتر ولكن من دون U1ΔNE وإضافة إلى كل أنبوب من الخرز من الخطوة 3.2.7.
    2. إعداد رد فعل الربط التحكم في حجم إجمالي 12 ميكرولتر (4 ميكرولتر NE(D)، 3.5 mM MgCl2، 1.5 mM ATP، 20 mm الكرياتين فوسفات، 0.5 mM DTT، 20 وحدة RNasin، 2 ميكرولتر 32P المسمى MINX الربط الركيزة (104 cpm/μL)، 60٪ D).
    3. اخلط الأنابيب برفق عن طريق النقر وتدوير نهاية الذيل عند 30 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة. بيليه الخليط عن طريق الطرد المركزي لطيف في 1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق.
    4. وقف رد الفعل وelute البروتينات قبالة الخرز عن طريق إضافة 24 ميكرولتر من 2x SDS عينة العازلة إلى الأنابيب التي تحتوي على الخرز، و 12 ميكروغرام من 2x SDS عينة عازلة إلى أنبوب التحكم التي تحتوي على NE ولكن لا الخرز. سخني الأنابيب عند 100 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
    5. طرد مركزي أنابيب بلطف في 1000 س غ في دوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10-15 ق.
    6. نقل النتوازات (elutions) إلى الأنابيب الدقيقة الطازجة: حوالي 48 ميكرولتر من أنابيب الخرز و 24 ميكرولتر من أنبوب التحكم NE.
    7. إضافة بروتيناز K (20 ملغم / مل) لهضم وslubilize البروتينات: إضافة 5 ميكرولتر إلى 48 ميكرولتر elution من الخرز وإضافة 2.5 ميكرولتر إلى التحكم 24 ميكرولتر NE.
    8. احتضان الأنابيب في 37 درجة مئوية لمدة 40 دقيقة.
    9. طرد مركزي بلطف الأنابيب في 1000 × ز في الدوار دلو يتأرجح في 4 درجة مئوية لمدة 10 ق.
    10. تمييع الخرز مع 39.5 ميكرولتر TE و 10 ميكرولتر 3 M خلات الصوديوم. تمييع التحكم NE مع 63.5 μL TE و 10 ميكرولتر 3 M خلات الصوديوم.
    11. استخراج وتحليل الحمض النووي الريبي على النحو المبين أدناه (القسم 4.3).
  3. تحليل منتجات رد فعل الربط
    1. استخراج الرناس في كل عينة مع الفينول-الكلوروفورم، تليها الكحول الكلوروفورم-إيزاميل. يعجل RNAs مع الإيثانول، الطرد المركزي، وغسل الكريات، وإزالة supernatant وتجفيف الكريات بعد نفس الإجراء كما هو موضح في الخطوتين 2.3.6 و 2.3.7.
    2. Resuspend بيليه الحمض النووي الريبي المجفف في 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي تحميل العازلة، دوامة بلطف، والحرارة إلى 75-85 درجة مئوية لمدة 90 ثانية، ومن ثم احتضان على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    3. إعداد 20 مل من محلول يحتوي على 13٪ من البولي أكريلاميد (بيساكريلاميد: أكريلاميد، 1.9:50 [wt/wt]) في 8.3 M يوريا؛ يلقي المواد الهلامية 15 سم في الطول باستخدام هذا الحل.
    4. مرة واحدة يلقي هلام، electrophorese ذلك (دون أي عينات تحميل) في 400 V لمدة 20 دقيقة باستخدام TBE كعازل تشغيل. بعد هذه الخطوة، اغسل الآبار باستخدام المخزن المؤقت تشغيل TBE.
    5. تحميل عينات الجيش الملكي النيبالي، في مخزن تحميل الحمض النووي الريبي العازلة، وكهربائي مع TBE تشغيل العازلة في 400 V لمدة 3.5 إلى 4 ساعة. بعد الكهروفورسيس، قم بإزالة اليوريا عن طريق غمر وتدوير الجل في الماء المقطر لمدة 10 دقائق.
    6. فراغ الجافة هلام على ورقة تصفية 3 M، أولا لمدة 2 ساعة 15 دقيقة في 80 درجة مئوية ومن ثم لمدة 30 دقيقة دون حرارة لتبريد ببطء. إخضاع الجل المجفف للتصوير الإشعاعي التلقائي على الفيلم للكشف عن مواقع هجرة المكونات المشعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NE المنضب من U1 snRNP (U1ΔNE من القسم 2.2.6) و Gal3 - U1 snRNP المجمعات من منطقة 10S من الجلسرين التدرج المناعي التي يتحرر منها المضادة Gal3 (الخطوة 3.2.7) كانت مختلطة في رد فعل الربط. يحتوي خليط التفاعل هذا على U1 snRNA (الشكل 2A ، حارة 3) ، وكذلك البروتين U1 محددة ، U1 - 70K (الشكل 2B ، حارة 3). وكما هو متوقع، عجلت مكافحة Gal3 Gal3 (الشكل 2B، حارة 3). لم يتم العثور على هذه المكونات (U1 snRNA، U1-70K البروتين، وGal3) في هطول الأمطار قبل المناعة (PI) السيطرة (الشكل 2A، الشكل 2B، حارة 2). بالمقارنة مع NE غير المنضب التي نفذت كعنصر تحكم إيجابي (الشكل 2C، حارة 1)، U1ΔNE لم تظهر نشاط الربط (الشكل 2C، حارة 2). يمكن إعادة تشكيل نشاط الربط في U1ΔNE بواسطة Gal3 - U1 snRNP المرتبط بالخرز (الشكل 2C ، الممر 6). تم العثور على كل من منتجات رد فعل الربط ، exons ligated والمقتطعة intron lariat (أبرزها السهام على اليمين) ، فضلا عن وسيطة ، exon 1 وlariat exon 2. كانت مكونات الكسور 3-5 حاسمة في استعادة الربط إلى U1ΔNE. عندما تم استبدال الكسور 3-5 بحاجز وحده (60٪ D) في التكفير المناعي ، لا يمكن ملاحظة أي نشاط الربط على الاختلاط مع U1ΔNE (الشكل 2C ، حارة 2) ، مما يشير إلى أن الخرز المضادة Gal3 لم تكن مسؤولة عن استعادة نشاط الربط في هذا الأخير. أكثر إقناعا، عندما تم استبدال الكسور 3-5 من قبل كسر 1 في إجراء المناعة ثم تضاف إلى U1ΔNE، لم يتم العثور على وسيطة أو منتجات رد فعل الربط (الشكل 2C، حارة 4). وقد وثقت التحليلات السابقة أن Gal3 في كسر 1 يمثل بروتين Gal3 الحرة، وليس بالاشتراك مع أي مجمع RNP10 والنشاف الشمالي من المواد المناعية من الكسر 1 فشلت في الكشف عن أي SnRNA16 U1. وأخيرا، لم تظهر الكسور المناعية من الكسر1 والكسور 3-5 نشاط الربط عند فحصها في غياب U1ΔNE (الشكل 2C، الممران 3 و 5، على التوالي).

Figure 2
الشكل 2: النتائج التمثيلية للتكوينات الحمض النووي الريبي والبوليبتيد من التعجيل المضادة Gal3 من منطقة 10S من الانحدار الجلسرين وقدرته على إعادة تشكيل الربط في استخراج النووية المنضب من U1 snRNP (U1ΔNE). (أ) تحليل النشاف الشمالي من U1 snRNA ملزمة الخرز إلى جانب مصل ما قبل المناعة (PI; حارة 2) أو إلى الخرز إلى جانب المضادة Gal3 (αGal3; حارة 3). يمثل Lane 1 20٪ من كمية الكسور المتدرجة المجمعة من الجليسيرول التي تتعرض لفرط المناعة. يمثل كل من الممر 2 والممر 3 25٪ من المواد المقيدة التي يتم استدراجها من الخرز المعني. (ب) تحليل النشاف الغربي للبوليبتيدات المرتبطة بالخرز إلى جانب مصل ما قبل المناعة (حارة 2) أو المضادة Gal3 (حارة 3). يتم الإشارة إلى هويات البروتين على اليمين. يمثل Lane 1 20٪ من كمية الكسور المتدرجة المجمعة من الجليسيرول التي تتعرض لفرط المناعة. يمثل كل من الممر 2 والممر 3 75٪ من المواد المقيدة التي تم استدراجها من الخرز المعني. (ج) تحليل القدرة على استعادة نشاط الربط إلى U1ΔNE بواسطة الجسيمات المناعية المضادة ل Gal3 (αGal3) من كسر تدرج الجلسرين 1 (الأب 1)، والكسور 3-5 (الأب 3-5)، أو 60٪ المخزن المؤقت D (60٪ D). يشير + أو - علامة فوق الخط الصلب الجريء إلى وجود أو غياب كل من هذه الرواسب في خليط التفاعل الربط. يشير + أو - التوقيع أسفل الخط الصلب ذو الغامق إلى وجود U1ΔNE أو غيابه (أو NE في المخزن المؤقت D). Lane 1: 4 ميكرولتر NE في مقايسة ربط 12 ميكرولتر، خضع 100٪ منها لتحليل الجل. بالنسبة للممرات 2-6 ، كان الحجم الإجمالي لمقاايسة الربط 24 ميكرولتر ، خضع 50٪ منها لتحليل الجل. حارة 2: 8 μL U1ΔNE بالإضافة إلى الخرز من هطول الأمطار من 60٪ D. لين 3: الخرز من هطول الأمطار من Fr 1. حارة 4: 8 μL U1ΔNE بالإضافة إلى الخرز من هطول الأمطار من Fr 1. حارة 5: الخرز من هطول الأمطار من الأب 3-5. حارة 6: 8 μL U1ΔNE بالإضافة إلى الخرز من هطول الأمطار من Fr 3-5. يشار إلى مواقع هجرة ركيزة ما قبل مرنا، وسيطة، والمنتجات (intron lariat و exons ligated، التي أبرزتها السهام) على اليمين. 10- والبيانات الواردة في الفريق جيم مستمدة من التجربة نفسها كما هو مبين في الفريق ألف والشكل 2 من هاوديك وآخرون.16. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم الحصول على النتائج المبينة في الشكل 2 مع مكافحة Gal3 (# 49). ويمكن ملاحظة نفس النتائج مع آخر المضادة Gal3 (# 24) ولكن المصل قبل المناعية من أرنب # 49 فشلت في إعادة تشكيل الربط في U1ΔNE بعد الحضانة مع كسور 3-516. كل هذه النتائج تشير بقوة إلى أن ركيزة ما قبل ميرنا يمكن أن ترتبط بجسيمات 10S Gal3 - U1 snRNP التي شلت حركتها على الخرز وأن المجمع الترني يعمل في مسار الربط.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يقدم هذا التقرير التفاصيل التجريبية التي توثق مجمع Gal3 - U1 snRNP المحاصرين على الخرز المغلف المضاد ل Gal3 يمكن أن يرتبط بركيزة ما قبل مرنا ويمكن لهذا المجمع الترني استعادة نشاط الربط إلى NE. Gal3 المستنفدة ل U1 SnRNP هو عضو واحد في عائلة من البروتينات المعزولة في الأصل على أساس نشاطها الخاص بالكربوهيدرات galactose . قدمت دراسات الفلورة المناعية المبكرة والتدريب دون الخلوي التلميح الأولي لارتباط Gal3 بمكونات من آلات الربط: الكولوكاليشن في البقع النووية مع البوليبتيدات الأساسية Sm من snRNPs وserine- وarinine الغنية (ريال) عائلة من عوامل التوابل24,25 والترسب على تدرجات كبريتات السيزيوم في كثافة (1.3-1.35 غرام /مل) مطابقة لتلك التي من hnRNP وsnRNP24 . وأظهرت التجارب اللاحقة لإعادة تشكيل الاستنفاد، بدورها، أن Gal3 (بالإضافة إلى عضو آخر من عائلة جاليكتين، galectin-1 (Gal1)) مطلوب، ولكن زائد عن الحاجة، عوامل في المقايسات الخالية من الخلايا الربط7،8.

عندما يتم تقسيم NE على تدرج الجلسرين، فإن الكسر المناعي للكسور المتدرجة مع المضادة ل Gal3 أسفر عن مجمعات متميزة بنسب متفاوتة من الحمض النووي الريبي المختلفة والبروتينات المرتبطة بها، مما يشير إلى أن Gal3 يرتبط مع snRNPs متعددة في غياب الركيزة الربط قبل مرنا10. على وجه الخصوص، يتم تجميع Gal3 و U1 snRNP في أحادية الجسيمات التي ترسيب إلى منطقة ~ 10S من التدرج (كسور 3-5 من 12٪ -32٪ التدرج الجلسرين). منذ ربط U1 snRNP لموقع 5'-الربط من قبل مرنا يمثل الخطوة الأولى في التجميع spliceosome5،26، كان من الممكن أن Gal3 قد تحصل على الدخول في مسار الربط عن طريق ارتباطها مع U1 snRNP. ويدعم هذه الفكرة ملاحظة أن Gal3 ، كجزء من مجمع 10S Gal3-U1 snRNP ، يمكن العثور عليه لربطه بركيزة ما قبل مرنا ولكن ليس مع السيطرة الجيش الملكي النيبالي تفتقر إلى مواقع الربط ، مما يشير إلى 5'-الربط موقع الاعتراف U1 snRNP كان شرطا أساسيا في تجميعها في لصق. وعلاوة على ذلك، فإن المعالجة المسبقة للكسور التي تحتوي على جسيم Gal3-U1 snRNP مع نواة ميكروكوكال ألغت تحميل Gal3 على ما قبل مرنا10. السؤال الرئيسي، إذن، هو ما إذا كان هذا المجمع الترني المبكر، الذي يتكون من Gal3 و U1 snRNP وما قبل مرنا، يمثل مجمعا وظيفيا E ملتزما بمسار الربط أو مجمع H مسدود لا يمكنه دخول مسار الربط5,26. تناولنا هذا السؤال عن طريق اختبار ما إذا كان Gal3 - U1 snRNP يمكن إعادة تشكيل نشاط الربط في NE استنفدت من U1 snRNP مع فقدان المصاحبة للقدرة على الربط (U1ΔNE). نتائج تجاربنا، التي يتم تفصيل بروتوكولها في هذه المقالة، تشير إلى أن Gal3 - U1 snRNP يربط إلى ركيزة ما قبل مرنا لتشكيل مجمع E وظيفية وأن مطلوب U1 snRNP لدمج Gal3 في مسار الربط16.

11- وينبغي ملاحظة خطوتين حاسمتين في إطار البروتوكول التجريبي الموصوف. أولا، الخطوة 3.2.7 تدعو إلى إزالة المواد غير المنضمة الفائقة بعد هطول الأمطار المضادة Gal3 من كسور الجلسرين. يتطلب الإزالة الكاملة للسائل من حبات الآغاروز الحبيبية إدخال طرف الإبرة لحقنة هاملتون في الجزء السفلي من الخرز. هذا يحتاج إلى أن يتم بعناية بحيث الخرز لا تسد إبرة حقنة أو تضيع عن طريق التمسك الإبرة كما يتم سحب هذا الأخير من الأنبوب. ثانيا، من المهم أن يتم استخدام الخرز الكريات لتجميع ردود الفعل الربط مع تأخير أقل قدر ممكن. وكان تنسيق هاتين الخطوتين حاسما لنجاح الإجراء. في هذا الصدد، تجدر الإشارة أيضا إلى أننا قد تحسنت مؤخرا انتعاش مجمعات Gal3-U1 snRNP في جزء بيليه عن طريق استبدال البروتين A-Sepharose CL-4B الخرز مع البروتين A-المغناطيسي نانوية في اقتران التكافؤ من الأجسام المضادة للجال3 إلى الخرز.

الاستنتاج الرئيسي مستمد من التجارب التي U1ΔNE، خالية من نشاط الربط، ويكمل من قبل 10S Gal3 - U1 snRNP الجسيمات المناعية التي تنتجها الخرز المستمدة بشكل متناقض مع الأجسام المضادة المضادة المضادة Gal3. على الرغم من وجود دليل واضح على إزالة الإنترون ، إلا أن كفاءة الانضمام إلى exon كانت أقل من تلك التي لوحظت في رد الفعل الذي أجري في غياب الخرز (قارن الممر 6 مقابل الممر 1 في الشكل 2C). في مقايسات الربط الخالية من الخلايا ، يتم تحويل ما يقرب من 30٪ من النشاط الإشعاعي في ركيزة ما قبل الحمض النووي الريبي إلى exons مربطة. ويمكن أن يعزى هذا النقص في ربط ال exon إلى: (أ) بعض الكمية الأقل من الأمثل من عنصر حاسم، إما في U1ΔNE (الشكل 1A) أو في مجمع Gal3 - U1 snRNP (الشكل 1B)؛ (ب) أو في 1993- 1 في 1000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 أو (ب) بعض القيود الهيكلية (على سبيل المثال، صعوبة في الخضوع لتغيير تشكيلي) من Gal3 - U1 snRNP شلت على الخرز المضادة Gal3 خلال رد فعل الربط (الشكل 1C).

وأبلغ محققون آخرون عن استخدام الانتقاء المناعي للمرحلة الصلبة لاعتراض مجمعات محددة وتوثيق النشاط الحفاز أو بعض التقدم المنظم للهياكل اللصقية. على سبيل المثال، أظهر تشيو وآخرون إضافة عامل الربط الخميرة Cwc25 يمكن مطاردة الركيزة قبل ميرنا على الجبائر المجمعة الأجسام المضادة المحاصرين في رد الفعل الحفاز الأول، مما أسفر عن وسيطة، exon 1 وlariat-exon227. في نفس نظام الخميرة، استخدم كريشنان وآخرون بروتين A-tag لشل الحركة، عن طريق biotinylated-IgG، منقى مجمع Bact spliceosome إلى الخرز المغناطيسي المغلفة بالستريبتافيدين في دراسة بيوفيزيائية لإعادة عرض ما قبل ميرنا (المسافة بين موقع 5'-الربط ونقطة الفرع) قبل الخطوة الأولى الربط28. مقالنا الحالي يمتد هذه الدراسات السابقة من حيث استكمال كلا الخطوتين من رد فعل الربط، وبالتالي، قد تحمل أهمية ذات طبيعة تقنية: يمكن تطبيق هذه المجموعة نفسها من الإجراءات على أي عدد من عوامل الربط الأخرى التي ترتبط مع snRNPs لدراسة متى وكيف يتم تحميل هذه العوامل على مجمعات الربط. القدرة على رصد تشكيل المنتج مرنا من رد فعل الربط يشكل دليلا قويا على أن هذه اللصقات تجميعها هي وظيفية في الواقع. قد يعزز هذا فهمنا لكيفية تشكل اللصقات ، حيث أن التقارير السابقة التي تستخدم النهج البروتيوميكية17 كتالوج فقط وجود بعض العوامل في مجمع معين بدلا من كيفية تحميل العوامل على المجمع.

وهناك قيود واضحة على التطبيق العام لهذه الإجراءات على البروتينات الأخرى أو snRNPs لتقييم دورها في الربط هو توافر الأجسام المضادة محددة موجهة ضد عامل معين من شأنها أن تعجل بكفاءة المعقدة المرتبطة بها. على سبيل المثال، antisera متعدد النسيلة المضادة Gal3 من عدد من الأرانب (على سبيل المثال، # 24، # 49) مناعة مجمع Gal3-U1 snRNP من استخراج النووية أو كسور الجلسرين 3-5 (U1 snRNA و U1 70K البروتين المشتركة مع مستضد cognate، Gal3). وعلى النقيض من ذلك، فشل جسمان مضادان أحاديا النسيلة متاحان تجاريا موجهان ضد غال3 وماك-2 وNCL-GAL3 في تحقيق نفس النتائج. تم تعيين epitopes من ماك-2 وNCL-GAL3 إلى المجال الأميني الطرفية من polypeptide29 Gal3 وأنه من الممكن أن epitopes كل منهما لا يمكن الوصول إليها في مجمع Gal3-U1 snRNP. وعلاوة على ذلك، قد لا يكون العامل المقيد بالأجسام المضادة (مثل Gal3) والمجمع المرتبط به (مثل U1 snRNP) قادرا على تكوين تفاعلات إضافية مع ما قبل الحمض النووي الريبي أو المكونات الأخرى للربط. قد يكون هذا بسبب التداخل المادي من قبل الأجسام المضادة أو من خلال المصفوفة التي يقترن بها الجسم المضاد بشكل مشترك. ولذلك، ينبغي تقييم كل نظام من الأنظمة ذات الاهتمام على أساس كل حالة على حدة. على الرغم من هذه القيود ، ومع ذلك ، يبدو أن مخطط استخدام التعقيدات تقارب - أو المناعية المختارة على الخرز لإعادة تشكيل نشاط الربط في مقتطفات استنفدت من عامل الربط محددة قد تكون قابلة للتطبيق عموما على النظم الأخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

Acknowledgments

وقد تم دعم هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم منحة MCB-0092919 وجامعة ولاية ميشيغان منحة البحوث الداخلية 09-CDFP-2001 (إلى RJP) والمعاهد الوطنية للصحة منحة جنرال موتورز-38740 وميشيغان AgBioResearch مشروع MICL02455 (إلى JLW).

كانت ركيزة MINX قبل مرنا المستخدمة في المقايسات الربط هدية لطيفة من الدكتور سوزان بيرغيت (كلية بايلور للطب، هيوستن، تكساس، الولايات المتحدة الأمريكية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 166، الربط قبل مرنا، الربط، فحص الربط الخالي من الخلايا، تجزئة التدرج الجلسرين، U1 SnRNP المعقدة، galectins
استكمال نشاط الربط بواسطة Galectin-3 - U1 SnRNP مجمع على الخرز
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voss, P. G., Haudek, K. C.,… More

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter