Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Komplementering av splitsningsaktivitet av ett Galectin-3 - U1 snRNP-komplex på pärlor

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

Denna artikel beskriver de experimentella förfarandena för a) utarmning av U1 snRNP från kärnextrakt, med samtidig förlust av splitsning aktivitet; och b) rekonstitution av splitsning aktivitet i U1-utarmat extrakt av galectin-3 - U1 snRNP partiklar bundna till pärlor kovalent i kombination med anti-galectin-3 antikroppar.

Abstract

Klassiska utarmning-rekonstitution experiment visar att galectin-3 är en obligatorisk splitsning faktor i kärnämne extrakt. Mekanismen för införlivande av galectin-3 i skarvningsvägen behandlas i detta dokument. Sedimentering av HeLa-cellskärnextrakt på 12-32% glycerol gradienter ger fraktioner berikade i en endogen ~ 10S partikel som innehåller galectin-3 och U1 snRNP. Vi beskriver nu ett protokoll för att tömma kärnämne extrakt av U1 snRNP med samtidig förlust av splitsning verksamhet. Splitsning aktivitet i U1-utarmat extrakt kan rekonstitueras av galectin-3 - U1 snRNP partikel fångas på agarose pärlor kovalent i kombination med anti-galectin-3 antikroppar. Resultaten indikerar att galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternary komplex är ett funktionellt E-komplex som leder till intermediärer och produkter av splitsningsreaktionen och att galectin-3 går in i skarvningsvägen genom sin associering med U1 snRNP. Systemet för användning av komplex affinitet- eller immunvalt på pärlor för rekonstituerande splitsning aktivitet i extrakt uttömda av en specifik splitsningsfaktor kan vara allmänt tillämpliga på andra system.

Introduction

Produktion av mest eukaryotic budbärareRNA (mRNAs) innebär borttagning av introner och ligation av exons i en kärn- processaa som benämns pre-mRNA-skarvning1. Två klasser av RNA-proteinkomplex (RNPs) styr bearbetningen av pre-messenger RNA till mogna mRNA via spliceosomal komplex. En klass, gryende pre-messenger RNPs, bildas co-transcriptionally genom bindning av heterogena nukleära RNP-proteiner och andra RNA-bindande proteiner, inklusive vissa medlemmar av SR-familjen, vilket ger hnRNP-komplex2. Den andra klassen, uracil-rika små nukleära RNPs (U snRNPs med U1, U2, U4, U5 och U6 snRNAs) är associerad med U-specifika och kärnproteiner3,4. U snRNPs interagerar på ett ordnat sätt med specifika regioner av pre-messenger RNPs i en dynamisk ombyggnadsväg som introner är strukna och exons är ligated för att producera mogna MRNPs5. Många ytterligare nukleära proteiner deltar i dessa bearbetningsevenemang6.

Galectin-1 (Gal1) och galectin-3 (Gal3) är två proteiner som krävs faktorer i skarvningsvägen som framgår av utarmnings-rekonstitutionsstudier7,8. Avlägsnande av båda galectins från skarvning kompetent kärnämne extrakt (NE) avskaffar skareosome montering och splitsning verksamhet i ett tidigt steg. Tillägg av antingen galectin till ett så dubbelt utarmat NE återställer båda aktiviteterna. Gal1 och Gal3 är komponenter i aktiva splitseomer, vilket framgår av specifik immunprecipitation av pre-mRNA, skarvning av intermediärer och mogna mRNA med antiserumspecifikt för antingen Gal1 eller Gal39. Viktigt är att Gal3 associerar med endogent U snRNA som innehåller partiklar i NE utanför skarvningsvägen som framgår av utfällning av snRNPs av anti-Gal3 antisera10. Slutligen, ljuddämpning av Gal3 i HeLa celler förändrar skarvning mönster av många gener11.

I NE pre-incubated för att demontera förformade spliteosomer12, snRNPs finns i flera komplex sedimentering i glycerol gradienter från 7S till mer än 60S. Även om glycerol gradient fraktionering är en vanlig teknik för isolering av spliceosomal komplex och komponenter (se referenser13,14,15 till exempel), har vi utvidgat denna metod genom att karakterisera specifika fraktioner med hjälp av antikroppar immunprecipitations. En snRNP sedimentering vid 10S innehåller endast U1 snRNA tillsammans med Gal3. Immunoprecipitation av 10S-fraktionen med antisera specifik för Gal3 eller U1 snRNP co-fäller ut både U1 och Gal3 som indikerar att några av U1 snRNP-monopartiklarna är bundna till Gal310. Eftersom U1 snRNP är det första komplexet som binder till pre-mRNP i spliteosomal sammansättning1,5, representerar detta steg en potentiell ingångsplats för Gal3 i skarvningsvägen. På denna grund visade vi att 10S Gal3-U1 snRNP monopartiklar bundna till anti-Gal3 som innehåller pärlor återställde splitsning aktivitet till en U1 snRNP utarmade NE, upprätta detta komplex som en mekanism genom vilken Gal3 rekryteras till den spliteosomala vägen16. Detta står i kontrast till försök att isolera splitsosomer i specifika stadier i skarvningsreaktionen och katalogisering av de associerade faktorerna17,18. I sådana studier fastställs förekomsten av vissa faktorer vid någon tidpunkt men inte den mekanism genom vilken de laddades.

Vi hade tidigare beskrivit i detalj beredningen av NE, skarvning substratet, monteringen av skarvning reaktion blandning och analys av produkter i vår dokumentation av galectins roll i pre-mRNA splitsning19. Vi beskriver nu de experimentella förfarandena för fraktionering av kärnextrakt för att erhålla en bråkdel berikad i Gal3 - U1 snRNP komplex och för immuno-urval av det senare komplexet att rekonstituerande splitsning verksamhet i en U1-utarmade kärnämne extrakt.

Figure 1
Figur 1: Schematiskt diagram som illustrerar komplementering av skarvningsaktivitet i kärnextrakt som uttömts av U1 snRNP av ett Gal3-U1 snRNP-komplex på pärlor. Den obundna fraktionen är uttömd av U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE i buffert D (NE(D)) är fraktionerad över en 12-32% glycerol gradient genom ultracentrifugation. Fraktioner som motsvarar 10S-regionen (fraktioner 3-5) kombineras och blandas med pärlor kovalent i kombination med anti-Gal3-antikroppar (αGal3 pärlor). Materialet som är bundet till pärlorna innehåller en Gal3-U1 snRNP monopartikel. C) Gal3-U1 snRNP-komplexet från del B blandas med U1ΔNE från del A i en skarvningsanalys med 32P-märkt MINX pre-mRNA-substrat och intermediärerna och produkterna i skarvningsreaktionen analyseras med gelelektrofores och autoradiografi. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Anmärkningar om allmänna förfaranden

  1. Se till att alla kemikalier (buffertkomponenter, enzymer osv.) hålls fria från ribonukleas (RNase). Sequester alla kommersiellt köpta reagensflaskor från allmän labbanvändning. Använd handskar för alla steg i det experimentella förfarandet. Använd endast glas och redskap som har bakats (se steg 1.2 nedan) och lösningar som har förbehandlats (se steg 1.3 nedan).
  2. Grädda allt glas (bägare, flaskor, flaskor, pipetter osv.) i minst 4 timmar vid 177 °C. Linda in andra redskap (spatlar, omrörstänger etc.) i aluminiumfolie innan du bakar under samma förhållanden.
  3. Förbered en 0,1% (vol/vol) lösning av diethylpyrokarbonat (DEPC) i dubbeldestillerat vatten (ddH2O). Använd en magnetisk omrörningsstång, rör om denna lösning över natten och sedan autoklav. Använd denna DEPC-behandlade H2O för att göra alla lösningar som innehåller Tris; filtrera sedan sterilisera med hjälp av ett flaskfilter. Använd vanlig ddH2O för att förbereda alla andra lösningar (utan Tris); behandla sedan med DEPC (0,1%, vol/vol) och autoklav.
    Obs: De buffertar som används i följande uppsättning experimentella procedurer anges i alfabetisk ordning i tabell 1.
Buffertens namn Sammansättning
Boratbuffert 0,2 M natriumborat, pH 9
Buffert C 20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) glycerol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM dithiothreitol (DTT)
Buffert D 10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) glycerol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT
60%D 60% Buffert D och 40% H2O
Etanolamin 0,2 M etanolamin, pH 8
HEPES-bindningsbuffert 20 mM HEPES, pH 7,9
HEPES tvättbuffert 20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
RNA-laddningsbuffert 90% formamid, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (w/v) bromofenol blå
SDS-PAGE-buffert 25 mM Tris, 169 mM glycin, 0,1% natrium dodecylsulfat (SDS), pH 8,8
SDS-exempelbuffert 62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0,1% (w/v) bromofenol blå
TBE-buffert för RNA-geler 89 mM Tris, 89 mM borsyra, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
TE-buffert 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Överföringsbuffert 25 mM Tris, 1,92 M glycin, 20% metanol, pH 8,3
T-TBS-buffert 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Interpol 20, pH 7,5
TX tvättbuffert 0.05% Triton X-100 (TX) i 60%D

Tabell 1: Buffertarnas namn och sammansättning

2. Beredning av NE uttömt av U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Beredning av anti-U1 pärlor för immunoadsorption
    1. Försvallande 50 mg Protein A-Sepharose CL-4B pärlor i överskott DEPC-behandlade H2O för att producera cirka 200 μL svullna pärlor och sedan tvätta i HEPES tvättbuffert.
    2. För denna tvätt och alla efterföljande tvättar, pellet pärlorna genom centrifugering (1000 x g i en svängande hinkrotor vid 4 °C i 10-15 s) och ta bort den obundna tvätten med en mikropipettor och kassera.
    3. Blanda 150 μL tvättade pärlor med 150 μL humant autoimmunt serum specifikt för U1 snRNP (volym av antikroppar mot volymen av pärlor i ett förhållande av 1:1).
    4. Justera blandningen till 20 mM HEPES, pH 7,9, motsvarande villkoren för HEPES-bindningsbuffert på grundval av den totala volymen (~300 μL från steg 2.1.3 ovan), inkubera denna blandning med kontinuerlig gungning vid rumstemperatur i 60 min.
    5. Tvätta pärlor bundna med antikroppar med 1 ml boratbuffert (0,2 M natriumborrat, pH 9) och återsuspend i 1 ml av samma boratbuffert.
    6. För att kovalent koppla antikroppen bunden till protein A-Sepharose pärlor, tillsätt dimetylpimelimidate till en slutlig koncentration av 20 mM och inkubera vid rumstemperatur med gungning i 60 min.
    7. Tvätta pärlorna med 1 ml boratbuffert.
    8. För att blockera oreagerat korslänkande reagens, tillsätt 1 ml 0,2 M etanolamin (pH 8) och inkubera vid rumstemperatur med gungning i 60 minuter.
    9. Tvätta de antikroppskopplade pärlorna, nedan betecknade som anti-U1-pärlor, två gånger med 0,5 ml TX tvättbuffert (0, 05% Triton X-100 i 60% D).
  2. Utarmning av U1 snRNP från NE (se figur 1A)
    OBS: Förfarandet för att förbereda NE från HeLa celler utvecklades ursprungligen av Dignam et al.20. Vi har beskrivit material och detaljerade metoder för beredning av NE för skarvningsanalyser19 (se steg 2.1 och 3.1 i den referensen). NE, som ursprungligen bereddes, finns i buffert C och kommer därefter att betecknas som NE(C). NE(C) som är dialyserade mot och ekvilibrerade med buffert D kommer att betecknas som NE(D).
    1. Inkubera 200 μL NE(C) med 100 μL anti-U1-pärlor från steg 2.1.9 ovan.
    2. Tillsätt 5 μL RNasin till blandningen.
    3. Rotera mikrorörets huvud-över-svans vid 4 °C i 1 h.
    4. Pellet blandningen genom centrifugering (1 000 x g i en svängande hinkrotor vid 4 °C i 10-15 s) och samla upp det obundna materialet (U1ΔNE) med en Hamilton-spruta.
    5. Dialysera hela volymen av U1ΔNE, tillsammans med en separat 50 μL alikvot av den ursprungliga icke-uttömda NE(C), i separata fack i en mikrodialysator, med omrörning, i 75 min mot 60% D med hjälp av ett dialysmembran med 8 K molekylviktsavstängning.
    6. Omedelbart efter dialys, dela dessa preparat (U1ΔNE och NE i 60% D) i 20 μL alikvoter; snap frys sedan i ett torrt is/ etanolbad och förvara vid -80 °C.
  3. Analys av RNA- och proteinhalten i U1ΔNE och material som är bundet på anti-U1-pärlor
    1. Efter avlägsnandet av det obundna materialet (U1ΔNE) (steg 2.2.4), tvätta materialet som är bundet till anti-U1-pärlorna genom att tillsätta 0,5 ml TX tvättbuffert. Pellet blandningen genom centrifugering (1 000 x g i en svängande hinkrotor vid 4 °C i 10-15 s) och ta bort supernatanten med hjälp av en mikropipettor och kassera.
    2. Upprepa tvättstegen 2.3.1 två gånger.
    3. Ta bort materialet som är bundet till anti-U1-pärlorna genom att tillsätta 100 μL 2x SDS-provbuffert till 100 μL av pärlorna och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur.
    4. Pellet blandningen genom centrifugering (1 000 x g i en svängande hinkrotor vid 4 °C i 10-15 s); ta bort supernatanten med Hamilton spruta och snap frys i ett torrt is / etanolbad. Förvara vid -80 °C.
    5. Jämför det icke-uttömda ne,det utarmade ne(U1ΔNE) och det material som är bundet till pärlorna (borttaget från pärlorna genom SDS-provbuffert enligt beskrivningen i steg 2.3.3 och 2.3.4 ovan). Följ steg 2.3.6-2.3.8 för RNA-analys eller steg 2.3.9-2.3.10 för proteinanalys.
    6. För varje prov, extrahera RNA med 200 μL fenolkloroform (50:50, v/v); extrahera sedan igen med 180 μL kloroform-isoamylalkohol (25:1, v/v). Efter extraktion tillsätt 300 μL kall 200-säker etanol, invertera för att blanda, och förvara det utfällda RNA över natten vid -20 °C.
    7. Centrifugera etanolutfällda RNA (12 000 x g i 10 min vid 4 °C). Tvätta pelletsen med 150 μL kall 70% etanol. Centrifugera igen (12 000 x g) vid 4 °C i 15 min. Ta bort supernatanten med en mikropipettor och torka pelletsen i en hastighetsvac i 10-15 min utan värme.
    8. Resuspend den torkade RNA-pelleten i 10 μL RNA-lastbuffert, virvel försiktigt, värm till 75-85 °C i 90 s och inkubera sedan på is i 2 min. Separera snRNAs med gelelektrofores (2 h vid 16 mA) genom 13% polyakrylamid - 8,3 M urea geler och sedan antingen fläcka med etidiumbromid eller föremål för norra blotting10,16.
    9. Ladda proteinproverna i SDS-provbuffert från steg 2.3.5 på 12,5% polyakrylamidgeler och elektrofores vid 200 V i cirka 45-50 min i SDS-PAGE (natrium dodecylsulfatpokrylamidgelelektrofores).
    10. Överför de separerade proteinerna till nitrocellulosamembranet vid 400 mA i 2 timmar i överföringsbuffert. Blockera membranet efter överföring genom att inkubera över natten i T-TBS som innehåller 10% fettfri torrmjölk. Sedan immunobloda membranet för att avslöja specifika proteiner8,21.

3. Immunoprecipitation av 10S-fraktioner av glycerolgradienter av anti-Gal3

  1. Beredning av anti-Gal3 pärlor för immunoadsorption
    OBS: Härledning och karakterisering av kanin polyklonal antisera mot Gal3 för kanin #2421 och för kanin #4910 har beskrivits tidigare.
    1. Använd preimmune serum från kanin #49 som kontroll.
    2. För beredning av anti-Gal3 pärlor följ förfarandet som tidigare beskrivits för beredning av anti-U1 pärlor (steg 2.1), med undantag för att motsvarande steg 2.1.3, förhållandet mellan antiserum (t.ex. anti-Gal3, #49) till pärlor är 3:1.
    3. Strax före användning, tvätta de antikroppskopplade pärlor, nedan betecknade som anti-Gal3 pärlor, två gånger med 0,5 ml TX tvättbuffert. Ta bort supernatanten, först med en mikropipettor för att få ut det mesta av vätskan och sedan med en Hamilton-spruta för att få vätskan ur pärlorna; kasta bort.
  2. Immunoprecipitaton av glycerol gradient fraktioner av anti-Gal3 (se figur 1B)
    1. Fraktionera NE(D) över en 12%-32% glycerol gradient10. Kombinera och blanda glycerolgradientfraktionerna 3, 4 och 5 (numrerade från toppen av övertoningen), som ligger nära övertoningens 10S-region.
    2. Förbered två prover, var och en med 150 μL alikvot av kombinerade gradientfraktioner 3-5 (steg 3.2.1), och placera i 50 μL anti-Gal3 pärlor.
    3. Förbered samtidigt två prover med 150 μL fraktion 1 (innehållande Gal3 som inte är komplext med U1 snRNP10; steg 3.2.1) och placera i 50 μL anti-Gal3-pärlor.
    4. Placera 150 μL 60% D i ett annat mikrorör med 50 μL anti-Gal3-pärlor.
    5. Blanda försiktigt genom att knacka på röret och rotera sedan mikroröret huvud-över-svans vid 4 °C i 1 h.
    6. Pellet blandningen genom skonsam centrifugering (1 000 x g i en svängande skopa rotor vid 4 °C i 10-15 s).
    7. Ta bort supernatanten (obundet material) med en Hamilton-spruta. Tvätta inte pärlorna och använd omedelbart för tillsats av skarvningsreaktionerna (avsnitt 4.2).
  3. Analys av RNA- och proteinhalten i det obundna och bundna materialet från anti-Gal3-utfällningen av 10S gradientfraktioner
    1. För analys av komponenter i det bundna och obundna materialet från anti-Gal3-utfällning av 10S gradientfraktioner, samla in det obundna materialet (supernatant efter steg 3.2.6), överför till ett nytt mikrorör och frys vid -20 °C.
    2. Tvätta de utfällda pärlorna från steg 3.2.6 (innehållande material som är bundet till anti-Gal3) genom att tillsätta 0,5 ml TX tvättbuffert.
    3. Pellet blandningen genom skonsam centrifugering (1 000 x g i en svängande skopa rotor vid 4 °C för 10-15 s); ta bort supernatanten med en mikropipettor och kassera. Upprepa tvättstegen två gånger till.
    4. Tillsätt 50 μL 2X SDS-provbuffert till de tvättade och pelleterade anti-Gal3-pärlorna.
    5. Blanda pärlorna försiktigt och inkubera i 10 min vid rumstemperatur.
    6. Pellet blandningen genom skonsam centrifugering (1 000 x g i en svängande hinkrotor vid 4 °C i 10-15 s), samla supernatanten med Hamilton spruta och förvara i en ny mikrorör vid -20 °C.
    7. Jämför det obundna materialet (avsnitt 3.3.1) och det bundna materialet (steg 3.3.6) i anti-Gal3-utfällningen i termer av RNA och proteinkomponenter, med hjälp av procedurer enligt beskrivningen i steg 2.3.6. till 2.3.10.

4. Montering av skarvningsreaktion och analys av produkter

  1. Beredning av skarvningssubstratet
    OBS: Pre-mRNA-substratet, betecknat MINX, innehåller två exonsekvenser och en intronsekvens från Adenovirus22. MINX DNA-sekvensen i plasmiden kontrolleras av T3-, T7- eller SP6 RNA-polymeraspromotors. Materialen och detaljerade metoder för linjärisering av MINX-plasmid-DNA med BamHI-begränsningen endonukleas, transkription av SP6 RNA-polymeras i närvaro av α-32P[GTP] och rening av 32P-märkt MINX för skarvningsanalyser beskrivs tidigare19 (se steg 2.2 och 3.2 i den referensen).
    1. Förvara den radiomärkta MINX som etanolutfällning vid -20 °C; använd det märkta skarvningssubstratet inom 4-6 veckor efter transkription.
    2. Strax före användning, centrifugera etanolen fälld 32P-märkt MINX vid 12 000 x g i 10 min vid 4 °C; ta bort supernatanten med en mikropipettor och kassera.
    3. Tillsätt 150 μL 70 % etanol och centrifug vid 12 000 x g i 15 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten och torka pelleten i hastighetsvac utan värme i 15 min.
    4. Återfukta pelleten i 50 μL DEPC-vatten. Punkt 2 μL på vart och ett av två GF/C-filter. sänk ner filtren i kall 5% trikloreättiksyra (TCA) i 10 min. Skölj med kallt 5% TCA, följt av 180-säker etanol på en vakuumkolv. Lufttorka filtren och föremål för scintillationsräkning i 4 ml Safety-Solve.
    5. Späd 32P-märkt MINX i 60% D till 104 cpm/μL för skarvningsanalysen.
  2. Montering av skarvningsreaktionen (se figur 1C)
    1. Montera, på is, skarvningsreaktioner i en total volym av 24 μL (8 μL U1ΔNE (från steg 2.2.6), 3.5 mM MgCl2, 1.5 mM ATP, 20 mM kreatinfosfat, 0.5 mM DTT, 20 enheter RNasin, 4 μL 32P-märkt MINX-skarvningssubstrat (0,5 mM DTT, 20 enheter RNasin, 4 μL 32P-märkt MINX-skarvningssubstrat(0,5 mM DTT, 20 enheter RNasin, 4 μL 32P-märkt MINX-skarvningssubstrat(0,5 mM DTT, 20 enheter RNasin, 4 μL 32P-märkt MINX-skarvningssubstrat Montera en identisk uppsättning skarvningsreaktioner i en total volym på 24 μL men utan U1ΔNE och lägg till varje rör av pärlor från steg 3.2.7.
    2. Förbered en kontrollskarvningsreaktion i en total volym på 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM kreatinfosfat, 0,5 mM DTT, 20 enheter RNasin, 2 μL 32P-märkt MINX-skarvningssubstrat (104 cpm/μL), 60% D).
    3. Blanda rören försiktigt genom att knacka och rotera end-over-tail vid 30°C i 90 min. Pellet blandningen genom skonsam centrifugering vid 1 000 x g i en svängande skopa rotor vid 4 °C för 10-15 s.
    4. Stoppa reaktionen och elute proteinerna från pärlorna genom att tillsätta 24 μL 2x SDS provbuffert till rören som innehåller pärlor, och 12 μL 2x SDS provbuffert till kontrollröret som innehåller NE men inga pärlor. Värm rören vid 100 °C i 7 min.
    5. Centrifugera rören försiktigt vid 1 000 x g i en svängande skoparotorn vid 4 °C i 10-15 s.
    6. Överför supernatanterna (elutions) till färska mikrorör: cirka 48 μL från pärlrören och 24 μL från NE-kontrollröret.
    7. Tillsätt Proteinas K (20 mg/ml) för att smälta och solubilisera proteinerna: tillsätt 5 μL till 48 μL-elutionen från pärlor och tillsätt 2,5 μL till 24 μL NE-kontrollen.
    8. Inkubera rören vid 37°C i 40 min.
    9. Centrifugera rören försiktigt vid 1 000 x g i en svängande hinkrotor vid 4 °C i 10 s.
    10. Späd bead elutions med 39,5 μL TE och 10 μL 3 M natriumacetat. Späd ne-kontrollen med 63,5 μL TE och 10 μL 3 M natriumacetat.
    11. Extrahera och analysera RNA enligt beskrivningen nedan (avsnitt 4.3).
  3. Analys av produkter av skarvningsreaktionen
    1. Extrahera RNAs i varje prov med fenolkloroform, följt av kloroform-isoamylalkohol; fäll ut RNAs med etanol, centrifugera, tvätta pelletsen, avlägsna supernatanten och torka pelletsen enligt samma förfarande som beskrivs i steg 2.3.6 och 2.3.7.
    2. Resuspend den torkade RNA-pelleten i 10 μL RNA-lastbuffert, virvel försiktigt, värm till 75-85 °C i 90 s och inkubera sedan på is i 2 min.
    3. Förbered 20 ml av en lösning som innehåller 13% polyakrylamid (bisakrylamid: akrylamid, 1.9:50 [wt/wt]) i 8,3 M urea; gjutna geler 15 cm långa med denna lösning.
    4. När gelén är gjuten, elektroforera den (utan några prover laddade) vid 400 V i 20 minuter med TBE som löpbuffert. Tvätta brunnarna efter detta steg med TBE-buffert.
    5. Ladda RNA-proverna, i RNA-laddningsbufferten, och elektrofores med TBE-buffert vid 400 V i 3,5 till 4 timmar. Efter elektrofores, ta bort urea genom att nedsänka och rotera gelén i destillerat vatten i 10 min.
    6. Dammsug gelén på 3 M filterpapper, först i 2 h 15 min vid 80 °C och sedan i 30 minuter utan värme för att långsamt kyla den. Utsätt den torkade gelen för autoradiografi på film för att upptäcka de radioaktiva komponenternas migrationspositioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NE utarmat av U1 snRNP (U1ΔNE från avsnitt 2.2.6) och Gal3 - U1 snRNP komplex från regionen 10S i glycerol gradient immunoprecipitated av anti-Gal3 (steg 3.2.7) blandades i en skarvning reaktion. Denna reaktionsblandning innehöll U1 snRNA (figur 2A, körfält 3), liksom det U1-specifika proteinet, U1-70K (figur 2B, körfält 3). Som förväntat fällde anti-Gal3 Gal3 (figur 2B, körfält 3). Dessa komponenter (U1 snRNA, U1-70K protein och Gal3) hittades inte i pre-immun (PI) kontroll nederbörd (figur 2A, figur 2B, körfält 2). Jämfört med ett icke utarmat NE som utfördes som en positiv kontroll (figur 2C, körfält 1) uppvisade U1ΔNE inte splitsningsaktivitet (figur 2C, körfält 2). Splitsningsaktiviteten i U1ΔNE skulle kunna rekonstrueras av det pärlbundna Gal3 - U1 snRNP-komplexet (figur 2C, körfält 6). Båda produkterna av skarvning reaktionen, ligated exons och strukits intron lariat (markeras av pilar till höger), liksom intermediärer, exon 1 och lariat exon 2, hittades. Komponenterna i fraktioner 3-5 var kritiska för att återställa skarvning till U1ΔNE. När fraktioner 3-5 ersattes av buffert ensam (60% D) i immunprecipitation, kunde ingen splitsning aktivitet observeras vid blandning med U1ΔNE (figur 2C, lane 2), vilket tyder på att anti-Gal3 pärlor inte var ansvariga för återställande av splitsning verksamhet i den senare. Mer övertygande, när fraktioner 3-5 ersattes av fraktion 1 i immunprecipitation förfarandet och sedan läggas till U1ΔNE, hittades inga intermediärer eller produkter av skarvning reaktionen (figur 2C, körfält 4). Tidigare analys hade dokumenterat att Gal3 i fraktion 1 representerade fritt Gal3 protein, inte i samband med någon RNP komplex10 och norra blotting av materialet immunoprecipitated från fraktion 1 misslyckades med att avslöja någon U1 snRNA16. Slutligen uppvisade immunoprecipitates från fraktion1 och fraktionerna 3-5 inte skarvningsaktivitet när de analyseras i avsaknad av U1ΔNE (figur 2C, körfält 3 respektive 5).

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat av RNA- och polypeptidsammansättningen i anti-Gal3-utfällningen av 10S-regionen i glycerolgradienten och dess förmåga att rekonstituera splitsa i kärnextrakt utarmat av U1 snRNP (U1ΔNE). A) Nordlig blottinganalys av U1 snRNA som är bunden till pärlor i kombination med preimmunt serum (PI; lane 2) eller till pärlor i kombination med anti-Gal3 (αGal3; lane 3). Lane 1 representerar 20% av mängden kombinerade glycerol gradient fraktioner utsätts för immunoprecipitation. Körfält 2 och körfält 3 utgör vardera 25% av det bundna materialet som eliseras från respektive pärlor. B) Västerländsk blottinganalys av polypeptider bundna till pärlor i kombination med pre-immun serum (lane 2) eller anti-Gal3 (körfält 3). Proteinidentiteter anges till höger. Lane 1 representerar 20% av mängden kombinerade glycerol gradient fraktioner utsätts för immunoprecipitation. Körfält 2 och körfält 3 utgör vardera 75% av det bundna materialet som eliseras från respektive pärlor. (C) Analys av förmågan att återställa skarvningsaktiviteten till U1ΔNE genom anti-Gal3 (αGal3) immunprecipitater av glycerol gradientfraktion 1 (Fr 1), fraktioner 3-5 (Fr 3-5) eller 60% buffert D (60% D). + eller - tecknet ovanför den fetstilta fasta linjen indikerar närvaron eller frånvaron av var och en av dessa fällningar i skarvningsreaktionsblandningen. Tecknet + eller - under den fetdragna heldragna linjen anger förekomsten eller frånvaron av U1ΔNE (eller NE i buffert D). Bana 1: 4 μL NE i en 12 μL splitsningsanalys, varav 100% utsattes för gelanalys. För körfält 2-6 var den totala volymen av skarvningsanalysen 24 μL, varav 50% utsattes för gelanalys. Lane 2: 8 μL U1ΔNE plus pärlor från nederbörd på 60% D. Lane 3: pärlor från nederbörd av Fr 1. Lane 4: 8 μL U1ΔNE plus pärlor från nederbörd av Fr 1. Lane 5: pärlor från nederbörd av Fr 3-5. Lane 6: 8 μL U1ΔNE plus pärlor från nederbörd av Fr 3-5. Positionerna för migrering av pre-mRNA-substratet, intermediärerna och produkterna (intron lariat och ligated exons, markerade med pilar) anges till höger. Uppgifterna i panel C härleds från samma experiment som visas i panel A, figur 2 i Haudek et al.16. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Resultaten i figur 2 erhölls med anti-Gal3 (#49). Samma resultat kunde observeras med en annan anti-Gal3 (#24) men pre-immun serum från kanin #49 misslyckades med att rekonstituera splitsa i U1ΔNE efter inkubation med fraktioner 3-516. Alla dessa resultat tyder starkt på att pre-mRNA substrat kan binda till 10S Gal3 - U1 snRNP partikel immobiliserad på pärlor och att ternary komplexet är funktionellt i skarvningsvägen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denna rapport ger de experimentella detaljerna som dokumenterar ett Gal3 - U1 snRNP-komplex fångat på anti-Gal3-belagda pärlor kan binda till pre-mRNA-substrat och detta ternarykomplex kan återställa splitsningsaktiviteten till en U1 snRNP-utarmad NE. Gal3 är en medlem av en familj av proteiner som ursprungligen isolerades på grundval av dess galaktosspecifika kolhydratbindningsaktivitet23 . Tidiga immunofluorescens- och subcellulära fraktioneringsstudier gav den första antydan till en associering av Gal3 med komponenter i skarvningsmaskineriet: colocalization i nukleära fläckar med Sm core polypeptider av snRNPs och den serin- och argininrika (SR) familjen av spicingfaktorer24,25 och sedimentering på cesiumsulfatgradienter vid en densitet (1,3-1,35 g/ mL) som matchar de . Efterföljande utarmnings-rekonstitution experiment, i sin tur, visade Gal3 (liksom en annan medlem av galectin familjen, galectin-1 (Gal1)) krävdes, men överflödiga, faktorer i cell-free splitsning analyser7,8.

När NE är fraktionerad över en glycerol gradient, immunprecipitation av gradient fraktioner med anti-Gal3 gav distinkta komplex med varierande förhållanden av olika snRNAs och associerade proteiner, vilket tyder på att Gal3 är associerad med flera snRNPs i avsaknad av pre-mRNA splitsar substrat10. I synnerhet monteras Gal3 och U1 snRNP i en monopartikel som sedimenteras till ~10S-regionen i gradienten (fraktioner 3-5 av en 12%-32% glycerol gradient). Eftersom bindningen av U1 snRNP till 5:s skarvplats för pre-mRNA representerar det första steget i spliteosommontering5,26, var det möjligt att Gal3 kan få tillträde till splitsningsvägen via dess associering med U1 snRNP. Detta begrepp stöds av observationen att Gal3, som en del av 10S Gal3-U1 snRNP-komplexet, kunde hittas för att associera med ett pre-mRNA-substrat men inte med kontroll RNA som saknar skarvplatser, vilket tyder på 5:s skarvplatsigenkänning av U1 snRNP var en nyckelkrav i dess montering till en spliteosome. Dessutom avskaffade förbehandlingen av fraktionerna som innehåller Gal3-U1 snRNP-partikeln med mikrokokvalosen lastningen av Gal3 på pre-mRNA10. Nyckelfrågan är då om detta tidiga ternarykomplex, bestående av Gal3, U1 snRNP och pre-mRNA, representerar ett funktionellt E-komplex som är engagerat i skarvningsvägen eller ett dött H-komplex som inte kan komma in i skarvningsvägen5,26. Vi tog itu med denna fråga genom att testa om Gal3 - U1 snRNP kan rekonstruera splitsning aktivitet i NE utarmat av U1 snRNP med samtidig förlust av splitsning kapacitet (U1ΔNE). Resultaten av våra experiment, vars protokoll beskrivs i den nuvarande artikeln, indikerar att Gal3 - U1 snRNP binder till pre-mRNA substrat för att bilda ett funktionellt E-komplex och att U1 snRNP krävs för att införliva Gal3 i skarvningsvägen16.

Två kritiska steg inom det beskrivna experimentella protokollet måste noteras. Först kräver steg 3.2.7 avlägsnande av supernatant obundet material efter anti-Gal3 nederbörd av glycerol fraktioner. Fullständig borttagning av vätskan från de pelleterade agarospärlor kräver att Hamilton-sprutans nålspets sätts in i botten av pärlorna. Detta måste göras noggrant så att pärlorna inte täpper till sprutnålen eller går vilse genom att hålla fast vid nålen när den senare dras ut ur röret. För det andra är det viktigt att de pelleterade pärlorna används för montering av skarvningsreaktionerna med så liten fördröjning som möjligt. Samordningen av dessa två steg var avgörande för att förfarandet skulle lyckas. I detta sammanhang bör det också noteras att vi nyligen har förbättrat återhämtningen av Gal3-U1 snRNP-komplex i pelletfraktionen genom att ersätta protein A-Sepharose CL-4B pärlor med protein A-magnetiska nanopartiklar i den kovalenta kopplingen av anti-Gal3 antikroppen till pärlor.

Den viktigaste slutsatsen härrör från experiment där U1ΔNE, utan splitsning aktivitet, kompletteras av 10S Gal3 - U1 snRNP partikel immunoprecipitated av pärlor kovalent derivatized med anti-Gal3 antikroppar. Även om det fanns tydliga bevis för intron borttagning, var effektiviteten av exon sammanfogning mindre än den som observerats i reaktionen som utfördes i avsaknad av pärlor (jämför körfält 6 kontra körfält 1 i figur 2C). I våra cellfria skarvningsanalyser omvandlas cirka 30% av radioaktiviteten i pre-mRNA-substratet vanligtvis till ligerade exoner. Denna brist i exon ligatur kan bero på a) en mindre än optimal mängd av en kritisk komponent, antingen i U1ΔNE (figur 1A) eller i Gal3- U1 snRNP-komplexet (figur 1B); eller b) vissa strukturella begränsningar (t.ex. svårigheter att genomgå en konformationsförändring) av Gal3- U1 snRNP immobiliserade på anti-Gal3 pärlor under skarvningsreaktionen (figur 1C).

Andra utredare har rapporterat användning av immunval i solid fas för att fånga specifika komplex och dokumentera katalytisk aktivitet eller någon ordnad progression av spliteosomstrukturer. Visade till exempel tillsats av jästskarvningsfaktorn Cwc25 kan jaga pre-mRNA-substratet på en antikroppsfångad monterad spliceosome i den första katalytiska reaktionen, vilket ger intermediärerna, exon 1 och lariat-exon227. I samma jästsystem använde Krishnan et al. en Protein A-tagg för att immobilisera, via biotinylated-IgG, renat Bact-skarvkomplex till streptavidinbelagda magnetiska pärlor i en biofysisk studie av förm-mRNA-ombyggnad (avstånd mellan 5:s skarvplats och grenpunkt) före det första skarvningssteget28. Vår nuvarande artikel utvidgar dessa tidigare studier när det gäller att slutföra båda stegen i skarvningsreaktionen och kan därför ha betydelse av teknisk natur: samma uppsättning förfaranden kan tillämpas på ett antal andra splitsningsfaktorer som associeras med snRNPs för att undersöka när och hur dessa faktorer laddas på spliteosomala komplex. Förmågan att övervaka mRNA-produktbildning från splitsningsreaktionen utgör starka bevis för att dessa monterade splitseosomer verkligen är funktionella. Detta kan främja vår förståelse av hur spliteosomer bildas, eftersom tidigare rapporter med proteomiska metoder17 bara katalogiserar förekomsten av vissa faktorer i ett visst komplex snarare än hur faktorerna kan ha laddats på komplexet.

En tydlig begränsning av dessa förfarandens allmänna tillämplighet på andra proteiner eller snRNPs för att utvärdera deras roll i splitsning är tillgången till en specifik antikropp riktad mot den särskilda faktor som effektivt kommer att fälla ut dess associerade komplex. Till exempel immunpreciperade polyklonala anti-Gal3 antisera från ett antal kaniner (t.ex. #24, #49) immunprecipiterade Gal3-U1 snRNP-komplexet från kärnextrakt eller glycerolfraktioner 3-5 (U1 snRNA och U1 70K-protein som fälls ut tillsammans med cognateantigenet Gal3). Däremot gav två kommersiellt tillgängliga monoklonala antikroppar riktade mot Gal3, Mac-2 och NCL-GAL3 inte samma resultat. Epitoperna av Mac-2 och NCL-GAL3 har mappats till aminoterminaldomänen för Gal3 polypeptid29 och det är möjligt att deras respektive epitoper inte är tillgängliga i Gal3-U1 snRNP-komplexet. Dessutom kan en antikroppsbunden faktor (t.ex. Gal3) och dess associerade komplex (t.ex. U1 snRNP) inte längre bilda ytterligare interaktioner med pre-mRNA eller andra splitseomala komponenter. Detta kan bero på fysisk interferens av antikroppen eller av matrisen som antikroppen är kovalent kopplad till. Därför måste varje intressesystem utvärderas från fall till fall. Trots dessa begränsningar verkar det dock som om systemet för användning av komplex affinitet- eller immunvalt på pärlor till rekonstituerande splitsning aktivitet i extrakt utarmade av en specifik skarvningsfaktor kan vara allmänt tillämpliga på andra system.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete har stöttats av National Science Foundation Grant MCB-0092919 och Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (till RJP) och av National Institutes of Health Grant GM-38740 och Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (till JLW).

MINX pre-mRNA-substrat som användes i skarvningsanalyserna var en snäll gåva från Dr. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Tags

Biokemi nummer 166 pre-mRNA-skarvning splitseosom cellfri skarvningsanalys glycerol gradientfraktionering U1 snRNP-komplex galectiner
Komplementering av splitsningsaktivitet av ett Galectin-3 - U1 snRNP-komplex på pärlor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voss, P. G., Haudek, K. C.,… More

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter