Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Komplementering av skjøteaktivitet av et Galectin-3 - U1 snRNP-kompleks på perler

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

Denne artikkelen beskriver de eksperimentelle prosedyrene for (a) uttømming av U1 snRNP fra kjernefysiske ekstrakter, med samtidig tap av skjøteaktivitet; og (b) rekonstituering av skjøteaktivitet i U1-utarmet ekstrakt ved galectin-3 - U1 snRNP partikler bundet til perler kovalent kombinert med anti-galectin-3 antistoffer.

Abstract

Klassiske uttømmingsrekonstitueringsforsøk indikerer at galectin-3 er en nødvendig skjøtefaktor i atomekstrakter. Mekanismen for inkorporering av galectin-3 i skjøtebanen er adressert i dette papiret. Sedimentering av HeLa celle kjernefysiske ekstrakter på 12%-32% glyserol gradienter gir fraksjoner beriket i en endogen ~ 10S partikkel som inneholder galectin-3 og U1 snRNP. Vi beskriver nå en protokoll for å tømme kjernefysiske ekstrakter av U1 snRNP med samtidig tap av skjøteaktivitet. Skjøteaktivitet i U1-utarmet ekstrakt kan rekonstitueres av galectin-3 - U1 snRNP partikkel fanget på agarose perler kovalent kombinert med anti-galectin-3 antistoffer. Resultatene indikerer at galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternary komplekset er et funksjonelt E-kompleks som fører til mellomprodukter og produkter av skjøtereaksjonen, og at galectin-3 kommer inn i skjøteveien gjennom sin tilknytning til U1 snRNP. Ordningen med å bruke kompleks affinitet- eller immuno-valgt på perler for å rekonstituere skjøteaktivitet i ekstrakter utarmet av en bestemt skjøtefaktor kan generelt gjelde for andre systemer.

Introduction

Produksjon av de fleste eukaryote budbringere RNAer (mRNAer) innebærer fjerning av introner og ligasjon av eksoner i en kjernefysisk prosess kalt pre-mRNA skjøting1. To klasser av RNA-proteinkomplekser (RNPer) styrer behandlingen av pre-messenger RNA til moden mRNA via spleiseosomale komplekser. En klasse, nascent pre-messenger RNPs, dannes co-transkripsjonelt ved binding av heterogene kjernefysiske RNP-proteiner og andre RNA-bindende proteiner, inkludert noen medlemmer av SR-familien, noe som gir hnRNP-komplekser2. Den andre klassen, uracil-rike små kjernefysiske RNPer (U snRNPer med U1, U2, U4, U5 og U6 snRNAs) er forbundet med U-spesifikke og kjerneproteiner3,4. De amerikanske snRNPene samhandler på en ordnet måte med spesifikke regioner av pre-messenger RNPer i en dynamisk ombyggingsvei som introner utskilles og exons er ligated å produsere modne mRNPs5. Mange andre kjerneproteiner deltar i disse behandlingshendelsene6.

Galectin-1 (Gal1) og galectin-3 (Gal3) er to proteiner som er nødvendige faktorer i skjøteveien som vist ved uttømming-rekonstitueringsstudier7,8. Fjerning av begge galectins fra skjøting kompetente kjernefysiske ekstrakter (NE) avskaffer skjøteosom montering og skjøting aktivitet på et tidlig trinn. Tillegg av begge galectin til en slik dobbelt utarmet NE gjenoppretter begge aktivitetene. Gal1 og Gal3 er komponenter av aktive skjøteosomer som det fremgår av spesifikk immunoprecipitation av pre-mRNA, skjøting mellomprodukter, og moden mRNA ved antiserum spesifikk for enten Gal1 eller Gal39. Viktigst, Gal3 forbinder med endogene U snRNA inneholder partikler i NE utenfor skjøteveien som vist ved nedbør av snRNPs av anti-Gal3 antisera10. Til slutt endrer silencing av Gal3 i HeLa-celler skjøtemønstre av mange gener11.

I NE pre-inkubert for å demontere preformede skjøteosomer12, snRNPs finnes i flere komplekser sedimentering i glyserol gradienter fra 7S til større enn 60S. Selv om glyserol gradient fraksjonering er en vanlig teknikk for isolering av spleiseosomale komplekser og komponenter (se referanser13,14,15 for eksempel), har vi utvidet denne metoden ved å karakterisere spesifikke fraksjoner ved hjelp av antistoff immunoprecipitations. En snRNP sedimentering ved 10S inneholder bare U1 snRNA sammen med Gal3. Immunoprecipitation av 10S fraksjonen med antisera spesifikk for Gal3 eller U1 snRNP co-utfelling både U1 og Gal3 indikerer noen av U1 snRNP monopartikler er bundet til Gal310. Siden U1 snRNP er det første komplekset som binder seg til pre-mRNP i spleiseosomal montering1,5, representerer dette trinnet et potensielt inngangssted for Gal3 inn i skjøtebanen. På dette grunnlaget viste vi at 10S Gal3-U1 snRNP monopartikler bundet til anti-Gal3 som inneholder perler restaurert skjøteaktivitet til en U1 snRNP utarmet NE, og etablerer dette komplekset som en mekanisme som Gal3 rekrutteres til den spleiseosomale banen16. Dette står i kontrast til forsøk på å isolere skjøteosomer på bestemte stadier i skjøtereaksjonen og katalogisere de tilhørende faktorene17,18. I slike studier er tilstedeværelsen av visse faktorer på et tidspunkt fastslått, men ikke mekanismen de ble lastet på.

Vi hadde tidligere beskrevet i detalj utarbeidelsen av NE, skjøteunderlaget, monteringen av skjøtereaksjonsblandingen og analysen av produkter i vår dokumentasjon av galektinenes rolle i pre-mRNA skjøting19. Vi beskriver nå de eksperimentelle prosedyrene for fraksjonering av atomekstrakter for å oppnå en brøkdel beriket i Gal3 - U1 snRNP-kompleks og for immunvalg av sistnevnte kompleks for å rekonstituere skjøteaktivitet i et U1-utarmet atomekstrakt.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk diagram som illustrerer komplementering av skjøteaktivitet i kjernefysisk ekstrakt utarmet av U1 snRNP av et Gal3-U1 snRNP-kompleks på perler. (A) NE i Buffer C (NE(C)) inkuberes med Protein A-Sepharose perler kovalent kombinert med anti-U1 snRNP (αU1 perler). Den ubundne brøkdelen er utarmet av U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE i buffer D (NE(D)) er fraksjonert over en 12%-32% glyserol gradient ved ultracentrifugation. Fraksjoner som tilsvarer 10S-regionen (brøker 3-5) kombineres og blandes med perler kovalent kombinert med anti-Gal3 antistoffer (αGal3 perler). Materialet bundet til perlene inneholder en Gal3-U1 snRNP monopartikkel. (C) Gal3-U1 snRNP-komplekset fra part (B) blandes med U1ΔNE fra del (A) i en skjøteanalyse ved hjelp av 32P-merket MINX pre-mRNA-substrat og mellomprodukter og produkter av skjøtereaksjonen analyseres ved gelelektroforese og autoradiografi. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Merknader om generelle prosedyrer

  1. Forsikre deg om at alle kjemikalier (bufferkomponenter, enzymer, etc.) holdes fri for ribonuklease (RNase). Sequester alle kommersielt kjøpte reagensflasker fra generell lab bruk. Bruk hansker for alle trinn i den eksperimentelle prosedyren. Bruk kun glass og redskaper som er bakt (se trinn 1.2 nedenfor) og løsninger som er forhåndsbehandlet (se trinn 1.3 nedenfor).
  2. Stek alt glass (beger, kolber, flasker, pipetter, etc.) i minst 4 timer ved 177 °C. Pakk inn andre redskaper (spateler, rørestenger, etc.) i aluminiumsfolie før du baker under samme forhold.
  3. Forbered en 0,1% (vol / vol) løsning av dietylpyrokarbonat (DEPC) i dobbeltdestillert vann (ddH2O). Bruk en magnetisk rørestang, rør denne løsningen over natten og autoklaver deretter. Bruk denne DEPC-behandlede H2O til å lage alle løsninger som inneholder Tris; Deretter filtreres steriliseres ved hjelp av et flasketopvakuumfilter. Bruk vanlig ddH2O for å forberede alle andre løsninger (uten Tris); Behandle deretter med DEPC (0,1 %, vol/vol) og autoklav.
    MERK: Bufferne som brukes i følgende sett med eksperimentelle prosedyrer, er oppført alfabetisk i tabell 1.
Navn på buffer Komposisjon
Borate buffer 0,2 M natriumskjeder, pH 9
Buffer C 20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) glyserol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM dithiothreitol (DTT)
Buffer D 10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) glyserol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT
60%D Buffer D med 60 % og 40 % H2O
Etanolamin 0,2 M etanamin, pH 8
HEPES-bindingsbuffer 20 mM HEPES, pH 7,9
HEPES vaskebuffer 20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
RNA-lastebuffer 90% formamid, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (m/ v) bromofenol blå
SDS-PAGE-buffer 25 mM Tris, 169 mM glycin, 0,1% natriumdedylsulfat (SDS), pH 8,8
SDS-eksempelbuffer 62,5 mM tris, pH 6,8, 2 % SDS, 10 % glyserol, 5 % 2–mercaptoetanol, 0,1 % (m/v) bromofenolblå
TBE buffer for RNA geler 89 mM Tris, 89 mM borsyre, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
TE-buffer 10 mM tris, pH 8, 1 mM EDTA
Overføringsbuffer 25 mM Tris, 1,92 M glycin, 20 % metanol, pH 8,3
T-TBS-buffer 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5
TX vaskebuffer 0,05 % Triton X-100 (TX) i 60 %D

Tabell 1: Navn og sammensetning av buffere

2. Fremstilling av NE utarmet av U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Fremstilling av anti-U1 perler for immunoadsorpsjon
    1. Pre-swell 50 mg Protein A-Sepharose CL-4B perler i overflødig DEPC-behandlet H2O for å produsere ca 200 μL hovne perler og deretter vaske i HEPES vaskebuffer.
    2. For denne vasken og alle etterfølgende vasker, pellet perlene ved sentrifugering (1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s) og fjern den ubundne vasken ved hjelp av en mikropipettor og kast den.
    3. Bland 150 μL vaskede perler med 150 μL human autoimmun serum som er spesifikk for U1 snRNP (volum antistoff mot volum perler i forholdet 1:1).
    4. Juster, på grunnlag av det totale volumet på (~ 300 μL fra trinn 2.1.3 ovenfor), blandingen til 20 mM HEPES, pH 7.9, som tilsvarer forholdene til HEPES bindingsbuffer; inkuber denne blandingen med kontinuerlig gynging ved romtemperatur i 60 min.
    5. Vask perlene bundet med antistoffer med 1 ml boratbuffer (0,2 M natriumskjeder, pH 9) og resuspend i 1 ml av samme boratbuffer.
    6. For å kovalent parre antistoffet bundet til Protein A-Sepharose perler, legg dimethylpimelimidate til en endelig konsentrasjon på 20 mM og inkuber ved romtemperatur med gynging i 60 min.
    7. Vask perlene med 1 ml boratbuffer.
    8. For å blokkere eventuelle ikke-acted krysskoblingsreagens, tilsett 1 ml 0,2 M etanolamin (pH 8) og inkuber ved romtemperatur med gynging i 60 minutter.
    9. Vask de antistoff-koblede perlene, heretter utpekt som anti-U1 perler, to ganger med 0,5 ml TX vaskebuffer (0,05% Triton X-100 i 60% D).
  2. Uttømming av U1 snRNP fra NE (se figur 1A)
    MERK: Prosedyren for å forberede NE fra HeLa-celler ble opprinnelig utviklet av Dignam et al.20. Vi har beskrevet materialene og detaljerte metoder for utarbeidelse av NE for skjøting av analyser19 (se trinn 2.1 og 3.1 i denne referansen). NE, som opprinnelig utarbeidet er i buffer C og vil heretter bli utpekt som NE (C). NE(C) som ringes mot og likevektes med buffer D, angis som NE(D).
    1. Inkuber 200 μL NE(C) med 100 μL anti-U1 perler fra trinn 2.1.9 ovenfor.
    2. Tilsett 5 μL RNasin til blandingen.
    3. Roter mikrorørets hode-over-hale ved 4 °C i 1 time.
    4. Pellet blandingen ved sentrifugering (1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s) og samle det ubundne materialet (U1ΔNE) ved hjelp av en Hamilton-sprøyte.
    5. Dialyze hele volumet av U1ΔNE, sammen med en separat 50 μL aliquot av den opprinnelige ikke-pleted NE (C), i separate rom i en mikrodialyser, med omrøring, i 75 min mot 60% D ved hjelp av en dialysemembran med 8 K molekylvekt cutoff.
    6. Umiddelbart etter dialyse, del disse preparatene (U1ΔNE og NE i 60% D) i 20 μL aliquots; Deretter kan du fryse i et tørt is-/etanolbad og oppbevare det ved -80 °C.
  3. Analyse av RNA og proteininnholdet i U1ΔNE og materiale bundet på anti-U1 perler
    1. Etter fjerning av det ubundne materialet (U1ΔNE) (trinn 2.2.4), vask materialet bundet til anti-U1 perler ved å legge til 0,5 ml TX vaskebuffer. Pellet blandingen ved sentrifugering (1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s) og fjern supernatanten ved hjelp av en mikropipettor og kast den.
    2. Gjenta vasketrinnene 2.3.1 to ganger.
    3. Fjern materialet som er bundet til anti-U1 perler ved å legge til 100 μL 2x SDS prøvebuffer til 100 μL perler og inkubere i 10 minutter ved romtemperatur.
    4. Pellet blandingen ved sentrifugering (1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s); fjern supernatanten med Hamilton-sprøyten, og trykk på frys i et tørt is-/etanolbad. Oppbevars ved -80 °C.
    5. Sammenlign den ikke-justerte NE, den utarmede NE (U1ΔNE) og materialet som er bundet til perlene (fjernet fra perlene av SDS-prøvebuffer som beskrevet i trinn 2.3.3 og 2.3.4 ovenfor). Følg trinn 2.3.6-2.3.8 for RNA-analyse eller trinn 2.3.9-2.3.10 for proteinanalyse.
    6. For hver prøve, trekk ut RNA med 200 μL fenol-kloroform (50:50, v / v); trekk deretter ut igjen med 180 μL kloroform-isoamylalkohol (25:1, v/v). Etter ekstraksjon, tilsett 300 μL kaldt 200-bevis etanol, inverter for å blande, og lagre den utfelte RNA over natten ved -20 °C.
    7. Sentrifuger den etanolutfellede RNA (12 000 x g i 10 min ved 4 °C). Vask pelletsene med 150 μL kaldt 70% etanol. Sentrifuge igjen (12.000 x g) ved 4 °C i 15 min. Fjern supernatanten ved hjelp av en mikropipettor og tørk pelletsene i en hastighetsvac i 10-15 min uten varme.
    8. Resuspend den tørkede RNA pellet i 10 μL RNA lastebuffer, forsiktig virvel, varme til 75-85 °C i 90 s, og deretter inkubere på is i 2 min. Skill snRNAene ved gelelektroforese (2 t ved 16 mA) gjennom 13% polyakrylamid - 8,3 M urea geler og deretter enten flekk med ethidiumbromid eller utsatt for nordlig blotting10,16.
    9. Last proteinprøvene, i SDS-prøvebuffer fra trinn 2.3.5, på 12,5% polyakrylamidgeler og elektrofore ved 200 V i ca. 45-50 min i SDS-PAGE (natrium dodecylsulfatpolyakrylamidgelelektroforese) buffer.
    10. Overfør de separerte proteinene til nitrocellulosemembranen ved 400 mA i 2 timer i overføringsbuffer. Etter overføring, blokker membranen ved å inkubere over natten i T-TBS som inneholder 10% ikke-fett tørr melk. Deretter immunoblot membranen for å avsløre spesifikke proteiner8,21.

3. Immunoprecipitation av 10S brøkdeler av glyserol gradienter ved anti-Gal3

  1. Fremstilling av anti-Gal3 perler for immunoadsorpsjon
    MERK: Avledning og karakterisering av kaninpolyklonal antisera mot Gal3 for kanin #2421 og for kanin #4910 er beskrevet tidligere.
    1. Bruk preimmun serum fra kanin #49 som kontroll.
    2. For fremstilling av anti-Gal3 perler følg prosedyren som tidligere er beskrevet for fremstilling av anti-U1 perler (trinn 2.1), med unntak av at tilsvarende trinn 2.1.3, forholdet mellom antiserum (f.eks. anti-Gal3, # 49) til perler er 3:1.
    3. Rett før bruk, vask de antistoff-koblede perlene, heretter utpekt som anti-Gal3 perler, to ganger med 0,5 ml TX vaskebuffer. Fjern supernatanten, først med en mikropipettor for å få det meste av væsken ut og deretter med en Hamilton-sprøyte for å få væsken ut av perlene; kassere.
  2. Immunoprecipitaton av glyserolgradientfraksjoner med anti-Gal3 (se figur 1B)
    1. Fraksjoner NE(D) over en 12%-32% glyserol gradient10. Kombiner og bland glyserolgraderingsfraksjoner 3, 4 og 5 (nummerert fra toppen av graderingen), som er nær 10S-området i gradienten.
    2. Forbered to prøver, hver med 150 μL aliquot av kombinerte gradientfraksjoner 3-5 (trinn 3.2.1), og plasser i 50 μL anti-Gal3 perler.
    3. Parallelt, forberede to prøver hver med 150 μL av brøkdel 1 (inneholder Gal3 ikke i kompleks med U1 snRNP10; trinn 3.2.1) og plasser i 50 μL anti-Gal3 perler.
    4. Som en kontroll, plasser 150 μL 60% D i et annet mikrorør på 50 μL anti-Gal3 perler.
    5. Bland forsiktig ved å trykke på røret, og roter deretter mikrotubens hode-over-hale ved 4 °C i 1 time.
    6. Pellet blandingen ved skånsom sentrifugering (1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s).
    7. Fjern supernatanten (ubundet materiale) ved hjelp av en Hamilton-sprøyte. Ikke vask perlene og bruk dem umiddelbart for tilsetning av skjøtereaksjonene (pkt. 4.2).
  3. Analyse av RNA og proteininnhold i det ubundne og bundne materialet fra anti-Gal3-utfellingen av 10S gradientfraksjoner
    1. For analyse av komponenter i det bundne og ubundne materialet fra anti-Gal3-utfelling av 10S gradientfraksjoner, samle det ubundne materialet (supernatant etter trinn 3.2.6), overfør til et friskt mikrorør og frys ved -20 °C.
    2. Vask de utfelte perlene fra trinn 3.2.6 (som inneholder materiale bundet til anti-Gal3) ved å tilsette 0,5 ml TX-vaskebuffer.
    3. Pellet blandingen ved skånsom sentrifugering (1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s); fjern supernatanten ved hjelp av en mikropipettor og kast den. Gjenta vasketrinnene to ganger til.
    4. Tilsett 50 μL 2X SDS prøvebuffer til de vaskede og pelleterte anti-Gal3 perlene.
    5. Bland perlene forsiktig og inkuber i 10 min ved romtemperatur.
    6. Pellet blandingen ved skånsom sentrifugering (1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s), samle supernatanten ved Hamilton-sprøyten og oppbevar den i et nytt mikrorør ved -20 °C.
    7. Sammenlign det ubundne materialet (avsnitt 3.3.1) og det bundne materialet (trinn 3.3.6) i anti-Gal3-utfellingen når det gjelder RNA- og proteinkomponenter, ved hjelp av prosedyrer som beskrevet i trinn 2.3.6. til henholdsvis 2,3,10.

4. Montering av skjøtereaksjon og analyse av produkter

  1. Forberedelse av skjøtesubstratet
    MERK: Pre-mRNA-substratet, kalt MINX, inneholder to eksonsekvenser og en intronsekvens fra Adenovirus22. MINX DNA-sekvensen i plasmidet er under kontroll av T3-, T7- eller SP6 RNA-polymerasepromotorer. Materialene og detaljerte metoder for linearisering av MINX-plasmid-DNA med BamHI-begrensning endonuklease, transkripsjon av SP6 RNA-polymerase i nærvær av α-32P[GTP] og rensing av 32P-merket MINX for skjøteanalyser er beskrevet tidligere19 (se trinn 2.2 og 3.2 av denne referansen).
    1. Oppbevar den radiomerkede MINX som et etanolfelle ved -20 °C; bruk det merkede skjøteunderlaget innen 4-6 uker etter transkripsjon.
    2. Like før bruk, sentrifugere etanol utfelt 32P-merket MINX ved 12,000 x g i 10 min ved 4 °C; fjern supernatanten med en mikropipettor og kast den.
    3. Tilsett 150 μL 70% etanol og sentrifuge ved 12 000 x g i 15 min ved 4 °C. Kast supernatanten og tørk pelletsen i hastighetsvac uten varme i 15 min.
    4. Rehydrer pelletsen i 50 μL DEPC-vann. Spot 2 μL på hvert av to GF/C-filtre; senk filtrene ned i kald 5% trichloroacetic acid (TCA) i 10 min. Skyll med kaldt 5% TCA, etterfulgt av 180-bevis etanol på en vakuumflaske. Lufttørk filtrene og underlagt scintillasjonstelling i 4 ml Safety-Solve.
    5. Fortynn MINX med 32P-etikett i 60 % D til 104 cpm/μL for skjøteanalysen.
  2. Montering av skjøtereaksjonen (se figur 1C)
    1. Monter, på is, skjøtereaksjoner i et totalt volum på 24 μL (8 μL U1ΔNE (fra trinn 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM kreatinfosfat, 0,5 mM DTT, 20 enheter RNasin, 4 μL 32P-merket MINX skjøteunderlag (104 cpm/μL), 60% D) og legg til hvert rør perler fra pkt. 3.2.7. Monter et identisk sett med skjøtereaksjoner i et totalt volum på 24 μL, men uten U1ΔNE og legg til hvert rør perler fra trinn 3.2.7.
    2. Forbered en kontrollspleisereaksjon i et totalt volum på 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM kreatinfosfat, 0,5 mM DTT, 20 enheter RNasin, 2 μL 32P-merket MINX skjøteunderlag (104 cpm/μL), 60% D).
    3. Bland rørene forsiktig ved å tappe og rotere ende-over-hale ved 30°C i 90 min. Pellet blandingen ved skånsom sentrifugering ved 1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s.
    4. Stopp reaksjonen og unngå proteinene av perlene ved å tilsette 24 μL 2x SDS prøvebuffer til rørene som inneholder perler, og 12 μL 2x SDS prøvebuffer til kontrollrøret som inneholder NE, men ingen perler. Varm rørene ved 100 °C i 7 minutter.
    5. Sentrifuger rørene forsiktig ved 1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10-15 s.
    6. Overfør supernatantene (elutionene) til friske mikrorør: ca. 48 μL fra perlerørene og 24 μL fra NE-kontrollrøret.
    7. Tilsett Proteinase K (20 mg/ml) for å fordøye og løse proteinene: Tilsett 5 μL til 48 μL elution fra perler og tilsett 2,5 μL til 24 μL NE-kontrollen.
    8. Inkuber rørene ved 37 °C i 40 minutter.
    9. Sentrifuger forsiktig rørene ved 1000 x g i en svingende bøtterotor ved 4 °C i 10 s.
    10. Fortynn perle-elutionene med 39,5 μL TE og 10 μL 3 M natriumacetat. Fortynn NE-kontrollen med 63,5 μL TE og 10 μL 3 M natriumacetat.
    11. Trekk ut og analyser RNA som beskrevet nedenfor (pkt. 4.3).
  3. Analyse av produkter av skjøtereaksjonen
    1. Trekk ut RNAene i hver prøve med fenol-kloroform, etterfulgt av kloroform-isoamylalkohol; utfelling av RNAene med etanol, sentrifugering, vask pelletsene, fjern supernatanten og tørk pelletsene ved å følge samme prosedyre som beskrevet i trinn 2.3.6 og 2.3.7.
    2. Resuspend den tørkede RNA pellet i 10 μL RNA lastebuffer, forsiktig virvel, varme til 75-85 °C i 90 s, og deretter inkubere på is i 2 min.
    3. Forbered 20 ml av en oppløsning som inneholder 13% polyakrylamid (bisacrylamid:akrylamid, 1,9:50 [wt/wt]) i 8,3 M urea; støpte geler 15 cm i lengde ved hjelp av denne løsningen.
    4. Når gelen er støpt, elektroforese den (uten noen prøver lastet) ved 400 V i 20 minutter ved hjelp av TBE som løpebuffer. Etter dette trinnet, vask brønnene med TBE løpebuffer.
    5. Last inn RNA-prøvene, i RNA-lastebuffer og elektroforese med TBE-buffer ved 400 V i 3,5 til 4 timer. Etter elektroforese, fjern urea ved å nedsenke og rotere gelen i destillert vann i 10 min.
    6. Støvsug gelen på 3 M filterpapir, først i 2 t 15 min ved 80 °C og deretter i 30 minutter uten varme for å avkjøle den sakte. Underkast den tørkede gelen til autoradiografi på film for å oppdage posisjonene til migrasjon av de radioaktive komponentene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NE utarmet av U1 snRNP (U1ΔNE fra seksjon 2.2.6) og Gal3 - U1 snRNP komplekser fra 10S-regionen av glyserol gradient immunoprecipitated av anti-Gal3 (trinn 3.2.7) ble blandet i en skjøtereaksjon. Denne reaksjonsblandingen inneholdt U1 snRNA (figur 2A, bane 3), samt U1-spesifikt protein, U1-70K (figur 2B, bane 3). Som forventet utløste anti-Gal3 Gal3 (figur 2B, bane 3). Disse komponentene (U1 snRNA, U1-70K protein og Gal3) ble ikke funnet i pre-immune (PI) kontrollutfelling (figur 2A, figur 2B, bane 2). Sammenlignet med en ikke-utarmet NE utført som en positiv kontroll (figur 2C, kjørefelt 1), viste U1ΔNE ikke skjøteaktivitet (figur 2C, kjørefelt 2). Skjøteaktivitet i U1ΔNE kan rekonstitueres av det perlebundne Gal3 - U1 snRNP-komplekset (figur 2C, bane 6). Begge produktene av skjøtereaksjonen, ligaterte eksoner og utskilt intron lariat (fremhevet av piler til høyre), samt mellomprodukter, exon 1 og lariat exon 2, ble funnet. Komponentene i brøkdeler 3-5 var avgjørende for å gjenopprette skjøting til U1ΔNE. Når fraksjoner 3-5 ble erstattet av buffer alene (60% D) i immunoprecipitation, kunne det ikke observeres skjøteaktivitet ved blanding med U1ΔNE (figur 2C, bane 2), noe som indikerer at anti-Gal3-perlene ikke var ansvarlige for restaurering av skjøteaktivitet i sistnevnte. Mer overbevisende, når fraksjoner 3-5 ble erstattet av brøkdel 1 i immunoprecipitation prosedyren og deretter lagt til U1ΔNE, ble det ikke funnet mellomprodukter eller produkter av skjøtereaksjonen (figur 2C, bane 4). Tidligere analyse hadde dokumentert at Gal3 i brøkdel 1 representerte fritt Gal3-protein, ikke i forbindelse med noe RNP-kompleks10 og nordlig blotting av materialet immunoprecipitated fra brøkdel 1 klarte ikke å avsløre noen U1 snRNA16. Til slutt viste immunoprecipitates fra brøkdel1 og fraksjoner 3-5 ikke skjøteaktivitet når de ble analysert i fravær av U1ΔNE (henholdsvis figur 2C, bane 3 og 5).

Figure 2
Figur 2: Representative resultater av RNA- og polypeptidsammensetningene i anti-Gal3-bunnfallet i 10S-regionen i glyserolgradienten og dens evne til å rekonstituere skjøting i kjernefysisk ekstrakt utarmet av U1 snRNP (U1ΔNE). (A) Northern blotting analyse av U1 snRNA bundet til perler kombinert med pre-immun serum (PI; lane 2) eller til perler kombinert med anti-Gal3 (αGal3; lane 3). Bane 1 representerer 20% av mengden kombinerte glyserol gradient fraksjoner utsatt for immunoprecipitation. Lane 2 og lane 3 representerer hver 25% av det bundne materialet som er utrømt fra de respektive perlene. (B) Vestlig blotting analyse av polypeptider bundet til perler kombinert med pre-immun serum (lane 2) eller anti-Gal3 (lane 3). Proteinidentiteter er angitt til høyre. Bane 1 representerer 20% av mengden kombinerte glyserol gradient fraksjoner utsatt for immunoprecipitation. Lane 2 og lane 3 representerer hver 75% av det bundne materialet som er utrømt fra de respektive perlene. (C) Analyse av evnen til å gjenopprette skjøteaktivitet til U1ΔNE ved anti-Gal3 (αGal3) immunoprecipitates av glyserol gradient brøkdel 1 (Fr 1), brøker 3-5 (Fr 3-5), eller 60% Buffer D (60% D). + eller - tegnet over den dristige faste linjen indikerer tilstedeværelsen eller fraværet av hver av disse utfellingene i skjøtereaksjonsblandingen. Tegnet + eller - under den fete heltrukket linjen angir tilstedeværelsen eller fraværet av U1ΔNE (eller NE i buffer D). Bane 1: 4 μL NE i en 12 μL skjøteanalyse, hvorav 100% ble utsatt for gelanalyse. For baner 2-6 var det totale volumet av skjøteanalysen 24 μL, hvorav 50% ble utsatt for gelanalyse. Lane 2: 8 μL U1ΔNE pluss perler fra nedbør på 60% D. Lane 3: perler fra nedbør av Fr 1. Lane 4: 8 μL U1ΔNE pluss perler fra nedbør av Fr 1. Lane 5: perler fra nedbør av Fr 3-5. Lane 6: 8 μL U1ΔNE pluss perler fra nedbør av Fr 3-5. Posisjonene til migrasjon av pre-mRNA-substratet, mellomproduktene og produktene (intron lariat og ligated exons, uthevet av piler) er angitt til høyre. Dataene i panel C er avledet fra samme eksperiment som vist i panel A, figur 2 av Haudek et al.16. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Resultatene vist i figur 2 ble oppnådd med anti-Gal3 (#49). De samme resultatene kunne observeres med en annen anti-Gal3 (#24), men pre-immunserum fra kanin #49 klarte ikke å rekonstituere skjøting i U1ΔNE etter inkubasjon med fraksjoner 3-516. Alle disse resultatene antyder sterkt at pre-mRNA-substratet kan binde seg til 10S Gal3 - U1 snRNP-partikkel immobilisert på perler og at det ternære komplekset er funksjonelt i skjøtebanen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne rapporten gir de eksperimentelle detaljene som dokumenterer et Gal3 - U1 snRNP-kompleks fanget på anti-Gal3-belagte perler kan binde seg til pre-mRNA-substrat, og dette ternære komplekset kan gjenopprette skjøteaktivitet til en U1 snRNP-utarmet NE. Gal3 er et medlem av en familie av proteiner som opprinnelig var isolert på grunnlag av sin galaktosespesifikke karbohydratbindingsaktivitet23 . Tidlig immunfluorescens og subcellulære fraksjoneringsstudier ga det første hintet om en assosiasjon av Gal3 med komponenter i skjøtemaskineriet: colokalisering i kjernefysiske flekker med Sm-kjernepolypeptider av snRNPer og de serin- og argininrike (SR) familie av spicing faktorer24,25 og sedimentering på cesium sulfat gradienter med en tetthet (1,3-1,35 g /ml) samsvarer med de av hnRNP og snRNP24 . Påfølgende uttømming-rekonstitueringseksperimenter viste i sin tur Gal3 (så vel som et annet medlem av galectin-familien, galectin-1 (Gal1)) var nødvendig, men overflødige, faktorer i cellefrie skjøteanalyser7,8.

Når NE er fraksjonert over en glyserol gradient, immunoprecipitation av gradient brøker med anti-Gal3 ga tydelige komplekser med varierende forhold av ulike snRNAer og tilhørende proteiner, noe som tyder på at Gal3 er forbundet med flere snRNPs i fravær av pre-mRNA skjøte substrat10. Spesielt er Gal3 og U1 snRNP samlet i en monopartikkel som sedimenterer til ~10S-regionen av gradienten (fraksjoner 3-5 av en 12%-32% glyserol gradient). Siden bindingen av U1 snRNP til 5'-spleisestedet til pre-mRNA representerer det første trinnet i skjøteosom assembly5,26, var det mulig at Gal3 kan få adgang til skjøteveien via sin tilknytning til U1 snRNP. Denne forestillingen støttes av observasjonen om at Gal3, som en del av 10S Gal3-U1 snRNP-komplekset, kunne bli funnet å assosiere med et pre-mRNA-substrat, men ikke med kontroll RNA mangler skjøteplasser, noe som tyder på at 5'spleisestedgjenkjenning av U1 snRNP var en nøkkel nødvendig i sin montering i et skjøteosome. Videre avskaffet forbehandling av fraksjonene som inneholder Gal3-U1 snRNP-partikkelen med mikrokokkkjernen, lastingen av Gal3 på pre-mRNA10. Det viktigste spørsmålet er da om dette tidlige ternære komplekset, bestående av Gal3, U1 snRNP og pre-mRNA, representerer et funksjonelt E-kompleks forpliktet til skjøtebanen eller et blindveis H-kompleks som ikke kan komme inn i skjøteveien5,26. Vi tok opp dette spørsmålet ved å teste om Gal3 - U1 snRNP kan rekonstituere skjøteaktivitet i NE utarmet av U1 snRNP med samtidig tap av skjøteevne (U1ΔNE). Resultatene av våre eksperimenter, hvis protokoll er beskrevet i den nåværende artikkelen, indikerer at Gal3 - U1 snRNP binder seg til pre-mRNA-substrat for å danne et funksjonelt E-kompleks, og at U1 snRNP er nødvendig for å innlemme Gal3 i skjøteveien16.

To kritiske trinn innenfor den beskrevne eksperimentelle protokollen må noterres. Først krever trinn 3.2.7 fjerning av det supernatante ubundne materialet etter anti-Gal3-nedbør av glyserolfraksjonene. Fullstendig fjerning av væsken fra de pelleterte agaroseperlene krever at nålespissen på Hamilton-sprøyten settes inn i bunnen av perlene. Dette må gjøres nøye slik at perlene ikke tetter opp sprøytenålen eller går seg vill ved å feste seg til nålen når sistnevnte trekkes ut av røret. For det andre er det viktig at de pelleterte perlene brukes til montering av skjøtereaksjonene med så liten forsinkelse som mulig. Koordineringen av disse to trinnene var avgjørende for at prosedyren skulle lykkes. I denne forbindelse bør det også bemerkes at vi nylig har forbedret utvinningen av Gal3-U1 snRNP-komplekser i pelletsfraksjonen ved å erstatte Protein A-Sepharose CL-4B perler med Protein A-magnetiske nanopartikler i kovalentkoblingen av anti-Gal3-antistoffet mot perler.

Hovedkonklusjonen er avledet fra eksperimenter der U1ΔNE, blottet for skjøteaktivitet, suppleres med 10S Gal3 - U1 snRNP partikkelimmunoprecipitated av perler kovalent avledet med anti-Gal3 antistoffer. Selv om det var klare tegn på intronfjerning, var effektiviteten av exon sammenføyning mindre enn det som ble observert i reaksjonen utført i fravær av perler (sammenlign kjørefelt 6 mot kjørefelt 1 i figur 2C). I våre cellefrie skjøteanalyser omdannes omtrent 30 % av radioaktiviteten i pre-mRNA-substratet vanligvis til ligaterte eksoner. Denne mangelen på exon ligation kan skyldes: (a) en mindre enn optimal mengde av en kritisk komponent, enten i U1ΔNE (figur 1A) eller i Gal3 - U1 snRNP-komplekset (figur 1B); eller (b) noen strukturelle begrensninger (f.eks. vanskeligheter med å gjennomgå en konformasjonsendring) av Gal3 - U1 snRNP immobilisert på anti-Gal3 perler under skjøtereaksjonen (figur 1C).

Andre etterforskere har rapportert bruk av solid fase immuno-seleksjon for å fange spesifikke komplekser og dokumentere katalytisk aktivitet eller noen bestilt progresjon av skjøteosome strukturer. For eksempel viste Chiu et al. tilsetning av gjærspleiefaktoren Cwc25 kan jage pre-mRNA-substratet på et antistoff-fanget montert skjøteosom i den første katalytiske reaksjonen, noe som gir mellomprodukter, exon 1 og lariat-exon227. I samme gjærsystem brukte Krishnan et al. en Protein A-tag for å immobilisere, via biotinylert-IgG, renset Bact skjøteosomkompleks til streptavidinbelagte magnetiske perler i en biofysisk studie av pre-mRNA-ombygging (avstand mellom 5'-spleisestedet og grenpunktet) før det første skjøtetrinnet28. Vår nåværende artikkel utvider disse tidligere studiene når det gjelder å fullføre begge trinnene i skjøtereaksjonen, og kan derfor ha betydning av teknisk karakter: De samme prosedyrene kan brukes på en rekke andre skjøtefaktorer som forbinder med snRNPer for å undersøke når og hvordan disse faktorene lastes på skjøteosomale komplekser. Evnen til å overvåke mRNA-produktdannelse fra skjøtereaksjonen utgjør et sterkt bevis på at disse monterte skjøteosomene faktisk er funksjonelle. Dette kan ytterligere vår forståelse av hvordan skjøteosomer dannes, da tidligere rapporter som bruker proteomiske tilnærminger17 bare katalogiserer tilstedeværelsen av noen faktorer i et gitt kompleks i stedet for hvordan faktorene kan ha blitt lastet på komplekset.

En klar begrensning av den generelle anvendbarheten av disse prosedyrene til andre proteiner eller snRNPer for å evaluere deres rolle i skjøting er tilgjengeligheten av et bestemt antistoff rettet mot den spesielle faktoren som effektivt vil utfelle det tilknyttede komplekset. For eksempel, polyklonal anti-Gal3 antisera fra en rekke kaniner (f.eks. #24, #49) immunoprecipitated Gal3-U1 snRNP kompleks fra kjernefysisk ekstrakt eller glyserolfraksjoner 3-5 (U1 snRNA og U1 70K protein co-utfelt med cognate antigen, Gal3). I motsetning til dette klarte ikke to kommersielt tilgjengelige monoklonale antistoffer rettet mot Gal3, Mac-2 og NCL-GAL3 å gi de samme resultatene. Epitopene til Mac-2 og NCL-GAL3 er kartlagt til aminoterminaldomenet til Gal3 polypeptid29, og det er mulig at deres respektive epitoper ikke er tilgjengelige i Gal3-U1 snRNP-komplekset. Videre kan det hende at en antistoffbundet faktor (f.eks. Gal3) og det tilhørende komplekset (f.eks. U1 snRNP) ikke lenger kan danne ytterligere interaksjoner med pre-mRNA eller andre skjøteosomale komponenter. Dette kan skyldes fysisk interferens av antistoffet eller av matrisen som antistoffet er kovalent koblet til. Derfor må hvert interessesystem evalueres fra sak til sak. Til tross for disse begrensningene ser det imidlertid ut til at ordningen med å bruke kompleks affinitet- eller immunovalgt på perler for å rekonstituere skjøteaktivitet i ekstrakter utarmet av en bestemt skjøtefaktor generelt kan være aktuelt for andre systemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet har blitt støttet av National Science Foundation Grant MCB-0092919 og Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (til RJP) og av National Institutes of Health Grant GM-38740 og Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (til JLW).

MINX pre-mRNA-substratet som ble brukt i skjøteanalysene var en snill gave fra Dr. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Tags

Biokjemi Utgave 166 pre-mRNA skjøting skjøteosom cellefri skjøteanalyse glyserol gradient fraksjonering U1 snRNP kompleks galectins
Komplementering av skjøteaktivitet av et Galectin-3 - U1 snRNP-kompleks på perler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voss, P. G., Haudek, K. C.,… More

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter