Summary
この記事では、(a)核抽出物からのU1 snRNPの枯渇に関する実験的手順について説明し、それに伴うスプライシング活性の喪失について説明します。(b)ガレクチン-3-U1 snRNP粒子に結合したU1枯渇エキスにおけるスプライシング活性の再構成を抗ガレクチン-3抗体と共有結合した。
Abstract
従来の枯渇再構成実験は、ガレクチン-3が核抽出物に必要なスプライシング因子であることを示している。この論文では、ガレクチン-3をスプライシング経路に組み込むメカニズムについて説明する。12%~32%のグリセロール勾配に対するHeLa細胞核抽出物の沈積は、ガレクチン-3およびU1 snRNPを含む内因性〜10S粒子に富んだ分画を生み出す。我々は、スプライシング活性の伴う損失を伴うU1 snRNPの核抽出物を枯渇させるプロトコルを記述する。U1枯渇した抽出物におけるスプライシング活性は、アガロースビーズに閉じ込められたガレクチン-3-U1 snRNP粒子と抗ガレクチン-3抗体と共価的に結合することによって再構成することができる。結果は、ガレクチン-3- U1 snRNP - mRNA前三元複合体がスプライシング反応の中間体および産物につながる機能的E複合体であり、ガレクチン-3がU1 snRNPとの関連を通じてスプライシング経路に入ることを示している。特定のスプライシング因子の枯渇した抽出物におけるスプライシング活性を再構成するためにビーズ上で親和性または免疫選択された複合体を使用するスキームは、一般的に他のシステムに適用され得る。
Introduction
ほとんどの真核メッセンジャーRNA(mRNA)の生産は、プレmRNAスプライシング1と呼ばれる核プロセスにおけるイントロンの除去およびエキソンの結紮を伴う。RNA-タンパク質複合体(RRP)の2つのクラスは、プロミセソーム複合体を介して成熟mRNAにメッセンジャー前RNAの処理を指示します。1つのクラス、新生プレメッセンジャーRnPsは、異種核RNPタンパク質および他のRNA結合タンパク質の結合によって共同転写されて形成され、SRファミリーの一部のメンバーを含む、hnRNP complexes2を生じる。第2級はウラシルが豊富な小型核RnPs(U1、U2、U4、U5、およびU6 snRNAを有するU snRNPs)がU特異的およびコアタンパク質3,4に関連している。U snRNPsは、イントロンが切除され、エキソンが合わせて成熟したmRNPs5を生成するように、動的改造経路でメッセンジャー前のRnPsの特定の領域と秩序ある方法で相互作用する。これらの処理イベントには、多くの追加核タンパク質が関与する6。
ガレクチン-1(Gal1)およびガレクチン-3(Gal3)は、枯渇再構成研究で示されるように、スプライシング経路に必要な因子である2つのタンパク質である7,8。有能な核抽出物(NE)のスプライシングから両方のガレクチンを除去することは、初期の段階でスプライセソームアセンブリとスプライシング活性を廃止する。このような二重に枯渇したNEにガレクチンを加えて、両方の活動を復元します。Gal1およびGal3は、前mRNAの特異的免疫沈降法、中間体のスプライシング、およびGal1またはGal39のいずれかに対する抗血清による成熟mRNAによって証明される活性スプライセソームの成分である。重要なことに、Gal3は、抗Gal3抗sera10によるsnRNPsの沈殿によって示されるように、NEの外側のスプライシング経路に粒子を含む内因性U snRNAと関連する。最後に、HeLa細胞におけるGal3のサイレンシングは、多数の遺伝子11のスプライシングパターンを変化させる。
NEでは、プレフォームスプライセソソーム12を分解するためにインキュベートされ、snRNPは7Sから60S以上のグリセロール勾配で堆積する複数の複合体に見られる。グリセロール勾配分画は、スプライセソーム複合体および成分の分離のための一般的な技術であるが(例えば、参照13,14,15参照)、我々は抗体免疫沈降を用いて特定の画分を特徴付け、この方法を拡張した。10SのsnRNP沈積物は、Gal3と一緒にU1 snRNAのみを含む。10S分の免疫沈降は、Gal3またはU1 snRNPに特異的な抗セラを有するU1およびGal3の両方が、一部のU1 snRNPモノ粒子がGal310に結合していることを示す共沈殿する。U1 snRNPは、スプライセソームアセンブリ1,5においてmRNP前に結合する最初の複合体であるため、このステップは、Gal3がスプライシング経路に入り込む可能性のある部位を表す。これに基づき、ビーズを含む抗Gal3に結合した10S Gal3-U1 snRNPモノ粒子がU1 snRNP枯渇NEにスプライシング活性を回復し、Gal3がスプライオソーム経路16に採用される1つのメカニズムとしてこの複合体を確立することを示した。これは、スプライシング反応の特定の段階でスプライセソームを分離し、関連する因子17,18をカタログ化する試みとは対照的です。このような研究では、ある時点で特定の因子の存在が確認されるが、それらがロードされたメカニズムは確認されない。
我々は、NEの調製、スプライシング基質、スプライシング反応混合物の組立、およびプレmRNAスプライシング19におけるガレクチンの役割の文書における製品の分析について詳細に説明した。我々は、核抽出物の分画を用いて、Gal3-U1 snRNP複合体で濃縮された分画を得るための実験手順と、U1枯渇核抽出物中のスプライシング活性を再構成するための後者複合体の免疫選択について説明する。
図1:ビーズ上のGal3-U1 snRNP複合体によるU1 snRNPの枯渇した核抽出物におけるスプライシング活性の相補を示す模式図 (A)NEインバッファーC(NE(C)))は、プロテインA-セファローズビーズと共有結合したタンパク質A-セファローズビーズ(α1ビーズ)と結合した。非バインドの分数は U1 snRNP (U1ΔNE) の枯渇です。(B) NEインバッファーD(NE(D))は、超遠心化により12%~32%のグリセロール勾配に分画される。10S領域(画3〜5)に対応する画分は、抗Gal3抗体(αGal3ビーズ)と共有結合してビーズと組み合わされて混合される。ビーズに結合した材料には、Gal3-U1 snRNP モノ粒子が含まれています。(C)Part(B)のGal3-U1 snRNP複合体を、32P標識MINXプレmRNA基質を用いたスプライシングアッセイで第1部(A)からU1ΔNEと混合し、スプライシング反応の中間体および生成物をゲル電気泳動とオートラジオグラフィーで分析する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Protocol
1. 一般的な手順に関する注意事項
- すべての化学物質(緩衝成分、酵素など)にリボヌクレアーゼ(RNase)を含めないようにしてください。一般的なラボ使用からすべての市販の試薬ボトルを購入した後遺言。実験手順のすべてのステップのために手袋を着用してください。焼き付けたガラス製品と調理器具(下記のステップ1.2を参照)と、処理済みのソリューション(下記のステップ1.3を参照)のみを使用してください。
- すべてのガラス製品(ビーカー、フラスコ、ボトル、ピペットなど)を177°Cで最低4時間焼きます。 同じ条件で焼く前に、他の器具(スパチュラ、攪拌棒など)をアルミホイルで包みます。
- 二重蒸留水(ddH2O)でジエチルピロカーボネート(DEPC)の0.1%(vol/vol)溶液を調製します。磁気攪拌棒を使用して、この溶液を一晩かき混ぜ、次にオートクレーブ。この DEPC 処理 H2O を使用して、Tris を含むすべてのソリューションを作成します。その後、ボトルトップ真空フィルターを使用して滅菌をフィルタします。通常の ddH2O を使用して、他のすべてのソリューションを準備します (Tris なし)。その後、DEPC(0.1%、vol/vol)とオートクレーブで扱います。
注: 次の実験手順で使用されるバッファは、 表 1 にアルファベット順に示します。
| バッファの名前 | 組成 |
| ホレートバッファー | 0.2 Mホウ酸ナトリウム、pH 9 |
| バッファC | 20 mM HEPES, pH 7.9, 25% (vol/vol) グリセロール, 0.42 M NaCl, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM フェニルメチルスルホニルフッ化物 (PMSF), 0.5 mM ジチオスレイトール (DT) |
| バッファD | 10 mM HEPES, pH 7.9, 20% (vol/vol) グリセロール, 0.1 M KCl, 0.2 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 0.5 mM DTT |
| 60%D | 60% バッファ D および 40% H2O |
| エタノールアミン | 0.2 Mエタノールアミン、pH 8 |
| HEPES結合バッファー | 20 mM ヘペス、pH 7.9 |
| ヘペス洗浄バッファー | 20 mM HEPES, pH 7.9, 0.5 M NaCl |
| RNAローディングバッファー | 90% ホルムアミド、 20 mM EDTA, pH 8, 0.05% (w/v) ブロモフェノールブルー |
| SDS-ページ・バッファー | 25 mM トリス、169 mMグリシン、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、pH 8.8 |
| SDS サンプル・バッファー | 62.5 mM トリス、pH 6.8、2%SDS、10%グリセロール、5%2メルカプトエタノール、0.1%(w/v)ブロモフェノールブルー |
| RNAゲル用TBEバッファー | 89 mM トリス、89 mM ホウ酸、2.5 mM EDTA、pH 8.3 |
| TE バッファ | 10 mM トリス、pH 8、1 mM EDTA |
| 転送バッファ | 25 mM トリス、1.92 Mグリシン、20%メタノール、pH 8.3 |
| T TBS バッファ | 10 mM トリス、0.5 M NaCl、0.05% トゥイーン 20、 pH 7.5 |
| TX洗浄バッファー | 0.05% トリトン X-100 (TX) 60%D |
表1:バッファの名前と構成
2. U1 snRNP(U1 ΔNE)のNE枯渇の準備
- 免疫吸着用抗U1ビーズの調製
- プレ膨らみ 50 mg プロテイン A-セファロース CL-4B ビーズ過剰 DEPC 処理 H2O で、約 200 μL の腫れたビーズを生成し、HEPES 洗浄バッファーで洗浄します。
- この洗浄とその後のすべての洗浄では、遠心分離(10〜15sの4°Cで揺れるバケットローターで1,000 x g )ビーズをペレットにし、マイクロピペッタを使用して非結合洗浄を除去し、廃棄します。
- U1 snRNPに特異的なヒト自己免疫血清150μL(1:1の比率でビーズの体積に対する抗体の体積)を洗浄ビーズ150 μL混合します。
- 調整, (上記のステップ2.1.3から〜300 μL) の総体積に基づいて, 混合物に 20 mM HEPES, pH 7.9, HEPES結合バッファーの条件に対応します;この混合物を室温で60分間連続的に揺らしてインキュベートする。
- 1 mLのホウ酸塩バッファー(0.2 M ホウ酸ナトリウム、pH 9)で抗体と結合したビーズを洗浄し、同じホウ酸塩バッファーの 1 mL で再懸濁します。
- プロテインA-セファローズビーズに結合した抗体を共有結合するには、20 mMの最終濃度にジメチルピメリミドを加え、60分間揺れると室温でインキュベートします。
- 1 mLのホウ酸塩バッファーでビーズを洗います。
- 未反応のクロスリンク試薬をブロックするには、0.2 Mエタノールアミン(pH 8)の1 mLを加え、60分間揺らしながら室温でインキュベートします。
- 抗体結合ビーズを洗浄し、以下抗U1ビーズとして指定し、0.5 mLのTX洗浄バッファー(60%Dで0.05%トリトンX-100)で2回洗浄する。
- NE からの U1 snRNP の枯渇 ( 図 1A を参照)
注:HeLa細胞からNEを調製するための手順は、最初Dignamら20によって開発されました。我々は、ASS19 (その参照のステップ2.1および3.1を参照)のためのNEの調製のための材料と詳細な方法を説明しました。NE は、最初に準備されたとおり、バッファ C にあり、以降は NE(C) として指定されます。バッファDに対して透析したNE(C)はNE(D)として指定されます。- 上記のステップ2.1.9から100 μLの抗U1ビーズを使用してNE(C)の200 μLをインキュベートします。
- 混合物に5μLのRNasinを加えます。
- マイクロチューブのヘッドオーバーテールを4°Cで1時間回転させます。
- ペレットは、遠心分離(10〜15sの4°Cでの振れるバケットローターで1,000 x g )、ハミルトンシリンジを用いて非結合材料(U1ΔNE)を収集する。
- U1ΔNEの全容を、元の非枯渇NE(C)の別個の50 μLアリコートと共に、マイクロダイアリザーの別々のコンパートメントで、攪拌しながら、8K分子量カットオフを有する透析膜を用いて60%Dに対して75分間透析する。
- 透析の直後に、これらの製剤(U1ΔNEとNEを60%D)で20 μLアリコートに分けます。その後、ドライアイス/エタノール浴で凍結し、-80°Cで保存します。
- 抗U1ビーズに結合したU1ΔNEと物質のRNAとタンパク質の含有量の解析
- 非結合材料(U1ΔNE)の除去後(ステップ2.2.4)、TX洗浄バッファーの0.5mLを添加することにより、抗U1ビーズに結合した材料を洗浄する。ペレットは、遠心分離(10〜15sの4°Cで振るバケットローターで1,000 x g )をペレットにし、マイクロピペットを使用して上清を除去し、廃棄します。
- 洗浄手順2.3.1を2回繰り返します。
- 2x SDSサンプルバッファーの100 μLを100 μLのビーズに加え、室温で10分間インキュベートすることにより、抗U1ビーズに結合した材料を取り除きます。
- 遠心分離(10-15 sの4°Cでスイングバケットローターで1,000 x g )によって混合物をペレット化します。ハミルトンシリンジで上清を取り除き、ドライアイス/エタノール浴で凍結します。-80°Cで保管してください。
- 非枯渇NE、枯渇したNE(U1ΔNE)、ビーズに結合した材料(上記のステップ2.3.3および2.3.4で説明したようにSDSサンプルバッファによってビーズから取り除かれた)を比較します。RNA分析の場合はステップ2.3.6-2.3.8、タンパク質分析の場合はステップ2.3.9~2.3.10に従ってください。
- 各サンプルに対して、200 μL のフェノールクロロホルム (50:50, v/v) で RNA を抽出します。その後、クロロホルム-イソアミルアルコール(25:1、v/v)を180 μLで再び抽出します。抽出後、300 μLのコールド200プルーフエタノールを加え、反転して混合し、沈殿したRNAを-20°Cで一晩保存します。
- エタノール沈殿したRNAを遠心分離する(4°Cで10分間12,000 x g )。ペレットを150 μLの冷たい70%エタノールで洗浄します。遠心分離機(12,000 x g)4 °Cで15分間マイクロピペットを使用して上清を取り出し、ペレットを熱なしで10〜15分間スピードヴァックで乾燥させます。
- 乾燥したRNAペレットを10μLのRNAローディングバッファーに再懸濁し、穏やかに渦を、75〜85°Cに加熱して90sにし、氷上で2分間インキュベートします。ゲル電気泳動(16mAで2h)から13%ポリアクリルアミド-8.3M尿素ゲルでsnRNAを分離し、次に臭化エチジウムで染色するか、または北部ブロッティング10,16を受ける。
- タンパク質サンプルを、ステップ2.3.5からSDSサンプルバッファーに、SDS-PAGE(ドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動)バッファーで約45〜50分間200Vで12.5%ポリアクリルアミドゲルおよびエレクトロフォールにロードします。
- 分離したタンパク質をニトロセルロース膜に400 mAで2時間移動バッファーに移します。転写後、10%非脂肪乾燥乳を含むT-TBSで一晩インキュベートして膜を遮断する。次いで、膜を免疫ブロットして、特定のタンパク質8,21を明らかにする。
3. 抗Gal3によるグリセロール勾配の10S分分の免疫沈降
- 免疫吸着用抗Gal3ビーズの調製
注:ウサギ#2421 とウサギ#4910のためのGal3に対するウサギポリクローナルアンチゼラの派生と特性化は、前述されています。- ウサギ#49からの免疫前血清をコントロールとして使用してください。
- 抗Gal3ビーズの調製については、抗U1ビーズの調製のために先に説明した手順(ステップ2.1)に従い、ステップ2.1.3に対応する例外を除いて、アンチ血清(例えば、抗Gal3、#49)ビーズの比率は3:1である。
- 使用直前に、抗体結合ビーズを洗浄し、以下抗Gal3ビーズとして指定し、0.5 mLのTX洗浄バッファーで2回使用します。上清を取り除き、最初にマイクロピペットで液体のほとんどを取り出し、次にハミルトン注射器でビーズから液体を取り出します。捨てる。
- 抗Gal3によるグリセロールの勾配分の免疫沈降( 図1Bを参照)
- 12%~32%のグリセロール勾配10に対する分画NE(D)グリセロール勾配画分3、4、5(勾配の上から番号付け)を組み合わせて混ぜ合わせます。
- 2つのサンプルを準備し、それぞれ150 μLの勾配画数3~5(ステップ3.2.1)を組み合わせ、抗Gal3ビーズの50 μLに入れます。
- 並行して、150 μLの分画1(U1 snRNP10と複雑ではないGal3を含み、ステップ3.2.1)をそれぞれ2サンプルずつ調製し、抗Gal3ビーズの50 μLに入れます。
- コントロールとして、50 μL抗Gal3ビーズの別のマイクロチューブに60%Dの150 μLを配置します。
- チューブをタップして軽く混ぜ、マイクロチューブのヘッドオーバーテールを4°Cで1時間回転させます。
- 穏やかな遠心分離(10-15 sの4°Cで揺れるバケツローターで1,000 x g )によって混合物をペレット化する。
- ハミルトンシリンジを使用して上清(非結合材料)を取り除く。ビーズを洗浄せず、スプライシング反応の添加にすぐに使用してください(セクション4.2)。
- 10Sの勾配画分の抗Gal3沈殿からの結合されていない物質および結合材料におけるRNAおよびタンパク質含有量の分析
- 10S勾配画分の反Gal3沈殿からの結合および非結合材料の成分の分析のために、非結合材料(ステップ3.2.6後の上清)を収集し、新鮮なマイクロチューブに移し、-20°Cで凍結する。
- ステップ3.2.6(抗Gal3に結合した材料を含む)から沈殿したビーズを、0.5 mLのTX洗浄バッファーを加えて洗浄します。
- 穏やかな遠心分離(10-15 sのための4 °Cでスイングバケットローターで1,000 x g )によって混合物をペレット。上清をマイクロピペットで取り出し、捨てる。洗浄手順をさらに2回繰り返します。
- 洗浄およびペレット化された抗Gal3ビーズに、2X SDSサンプルバッファーの50 μLを加えます。
- ビーズを軽く混ぜ、室温で10分間インキュベートします。
- 穏やかな遠心分離(10-15sの4°Cでスイングバケットローターで1,000 x g )で混合物をペレットし、ハミルトンシリンジによって上澄み物を収集し、-20°Cで新鮮なマイクロチューブに保存します。
- RNAおよびタンパク質成分の観点から、非結合材料(セクション3.3.1)と結合材料(ステップ3.3.6)を、ステップ2.3.6で説明した手順を使用して、RNAおよびタンパク質成分の観点から比較します。それぞれ2.3.10に。
4. スプライシング反応の組み立てと製品の分析
- スプライシング基板の調製
注:MINXと指定されたプレmRNA基板には、アデノウイルス22の2つのエキソン配列と1つのイントロン配列が含まれています。プラスミド中のMINX DNA配列は、T3、T7、またはSP6 RNAポリメラーゼプロモーターの制御下にあります。BamHI制限エンドヌクレアーゼを用いたMINXプラスミドDNAの線形化のための材料および詳細な方法、α-32P[GTP]の存在下でのSP6 RNAポリメラーゼによる転写、およびスプライシングアッセイ用 の32P標識MINXの精製は、前に説明 した(その参照のステップ2.2および3.2を参照)。- 放射性標識MINXをエタノール沈殿物として-20°Cで保管します。転写後4~6週間以内に標識されたスプライシング基板を使用してください。
- 使用直前に、エタノールを遠心分離機に 32P標識MINXを12,000 x g で4°Cで10分間沈殿させた。上清をマイクロピペットで取り出し、捨てる。
- 150 μLの70%エタノールと遠心分離機を12,000 x g で4°Cで15分間加えます。 上清を捨て、15分間熱を出さないスピードヴァックでペレットを乾燥させます。
- ペレットを50 μLのDEPC水で再水和します。2つのGF/Cフィルタのそれぞれで2μLをスポットします。フィルターを冷たい5%トリクロロ酢酸(TCA)で10分間浸漬します。冷たい5%TCAでリンスし、続いて真空フラスコに180プルーフエタノールを入れなさい。空気はフィルターを乾燥させ、安全解決の4 mLのシンチレーションのカウントに供する。
- スプライシングアッセイ用に、60%D~104 cpm/μLに32P標識MINXを希釈。
- スプライシング反応の組み立て( 図1Cを参照)
- 氷上で、全容容24μLU1ΔNE(ステップ2.2.6から)、3.5 mM MgCl2のスプライシング反応を組み立て、 1.5 mM ATP、20 mM クレアチンリン酸、0.5 mM DTT、20 単位 RNasin、4 μL 32P ラベル付き MINX スプライシング基板(104 cpm/μL)、60%D)、セクション 3.2.7 からビーズの各チューブに追加します。U1ΔNEを使用せずに24 μLの全容で同一のスプライシング反応を組み立て、ステップ3.2.7からビーズの各チューブに追加します。
- コントロールスプライシング反応を12 μLの総体積(4 μL NE(D)、3.5 mM MgCl2、1.5 mM ATP、20 mM クレアチンリン酸、0.5 mM DTT、20単位RNasin、2 μL 32P標識MINXスプライシング基板(104 cpm/μL)、60D%で調製します。
- チューブをタップして軽く混ぜ、エンドオーバーテールを30°Cで90分間回転させます。ペレットは、4°Cのスイングバケットローターで1,000xgで10〜15sの穏やかな遠心分離によって混合物を混合する。
- 反応を停止し、ビーズを含むチューブに2x SDSサンプルバッファーの24 μLを加え、2x SDSサンプルバッファーの12 μLをNEを含むコントロールチューブに添加してビーズからタンパク質を溶出します。チューブを100°Cで7分間加熱します。
- 4°Cのスイングバケットローターで10〜15sの場合は、1,000 x g でチューブを静かに遠心分離します。
- 上清(溶出)を新鮮なマイクロチューブに移します:ビーズチューブから約48 μL、NEコントロールチューブから24 μL。
- タンパク質を消化し、溶解させるタンパク質にプロテアーゼK(20 mg/mL)を加える:ビーズから48 μL溶出に5 μLを加え、24 μL NEコントロールに2.5 μLを加えます。
- 37°Cで40分間インキュベートします。
- 4°Cのスイングバケットローターで1000xgのチューブを10sで静かに遠心分離します。
- 39.5 μL TE と 10 μL 3 M 酢酸ナトリウムでビーズ溶出を希釈します。NEコントロールを63.5 μL TEと10 μL 3 M酢酸ナトリウムで希釈します。
- RNAを抽出して分析する(セクション4.3)。
- スプライシング反応の産物の分析
- 各サンプルのRNAをフェノールクロロホルムで抽出し、続いてクロロホルム-イソアミルアルコールを抽出します。エタノール、遠心分離機、ペレットを洗浄し、上清を除去し、ステップ2.3.6および2.3.7で説明したのと同じ手順に従ってペレットを乾燥させてRNAを沈殿させます。
- 乾燥したRNAペレットを10μLのRNAローディングバッファーに再懸濁し、穏やかに渦を、75〜85°Cに加熱して90sにし、氷上で2分間インキュベートします。
- 8.3 M尿素で13%ポリアクリルアミド(ビサクリアミド:アクリルアミド、1.9:50[wt/wt])を含む溶液の20 mLを調製する。この溶液を用いて長さ15cmのゲルをキャストする。
- ゲルが投げられたら、TBEを実行バッファとして使用して、400 Vで(サンプルをロードせずに)400 Vで、TBEを実行するバッファとして使用します。このステップの後、TBEランニングバッファでウェルを洗います。
- RNAサンプルを、RNAローディングバッファに、そしてTBEランニングバッファを持つエレクトロファーを400Vで3.5〜4時間ロードします。電気泳動後、蒸留水にゲルを10分間浸漬して回転させることで尿素を取り除きます。
- 3Mフィルター紙でゲルを真空乾燥し、まず80°Cで2時間15分間、次に熱なしで30分間ゆっくりと冷却します。乾燥したゲルをフィルム上のオートラジオグラフィーに供し、放射性成分の移動位置を検出する。
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Representative Results
U1 snRNP(2.2.6からU1ΔNE)とGal3-U1 snRNP複合体を欠乏させた、抗Gal3(ステップ3.2.7)によりグリセロール勾配免疫沈降した10S領域から、スプライシング反応で混合した。この反応混合物には、U1 snRNA(図2A、レーン3)、ならびにU1特異的タンパク質、U1-70K(図2B、レーン3)が含まれていた。予想通り、抗Gal3はGal3を沈殿させた(図2B、レーン3)。これらの成分(U1 snRNA、U1-70Kタンパク質、およびGal3)は、予免疫(PI)対照沈殿には見つからなかった(図2A、図2B、レーン2)。正の対照として行われた非枯渇NE(図2C、レーン1)と比較して、U1ΔNEはスプライシング活性を示さなかった(図2C、レーン2)。U1ΔNEにおけるスプライシング活性は、ビーズ結合Gal3-U1 snRNP複合体によって再構成することができる(図2C、レーン6)。スプライシング反応の両方の製品は、合体エキソンおよび切除イントロンラリアト(右側の矢印で強調)、ならびに中間体、エキソン1およびラリアットエキソン2、を発見した。分数3~5の成分は、U1ΔNEへのスプライシングの復元において重要でした。分画3〜5を免疫沈降で単独で置換した場合、U1ΔNEとの混合(図2C、レーン2)ではスプライシング活性が認められず、抗Gal3ビーズが後者のスプライシング活性の回復に関与していないことを示す。さらに説得力のある、分画3~5を免疫沈降法において画分1に置換し、次いでU1ΔNEに添加した場合、スプライシング反応の中間体または産物は見つからなかった(図2C、レーン4)。これまでの分析では、分数1のGal3が遊離Gal3タンパク質を表し、分画1から免疫沈降したRNP複合体10および北部のブロット法と関連せず、U1 snRNA16を明らかにできなかったことが明らかとなったことが明らかとなった。最後に、分画1および画分3~5からの免疫沈降は、U1ΔNEの不在時にアッセイした場合にスプライシング活性を示さなかった(図2C、レーン3および5、それぞれ)。
図2:グリセロール勾配の10S領域の抗Gal3沈殿のRNAおよびポリペプチド組成物の代表的な結果およびU1 snRNP(U1ΔNE)の枯渇した核抽出物におけるスプライシングを再構成する能力。 (a)U1 snRNAのノーザンブロッティング分析は、抗Gal3(αGal3;レーン3)と結合したビーズとビーズを結合した(PI;レーン2)。レーン1は、免疫沈降に供したグリセロール勾配画分の20%を表す。レーン2およびレーン3は、それぞれビーズから溶出した結合材料の25%を表す。(B)前免疫血清(レーン2)または抗Gal3(レーン3)と結合したビーズに結合したポリペプチドのウェスタンブロッティング分析。タンパク質の同一性は右側に示されています。レーン1は、免疫沈降に供したグリセロール勾配画分の20%を表す。レーン2およびレーン3は、それぞれビーズから溶出した結合材料の75%を表す。(c)グリセロール勾配画分1の免疫沈降物(αGal3)免疫沈降量によるU1ΔNEへのスプライシング活性を復元する能力の分析(Fr1)、画分3〜5(Fr3-5)、または60%緩衝D(60%D)。+または-は、太字の実線の上に、スプライシング反応混合物におけるこれらの析出物のそれぞれの有無を示す。太字の実線の下にある + または - 記号は、U1ΔNE (またはバッファー D 内の NE) の有無を示します。レーン1:4 μL NEを12μLのスプライシングアッセイで、その100%がゲル分析を行った。レーン2~6では、スプライシングアッセイの総体積は24μLで、その50%がゲル分析を行った。レーン2:8 μL U1ΔNE+60%D.レーン3の降水からのビーズ:Fr1の沈殿からのビーズ。レーン4:8 μL U1ΔNE+Fr1の降水からのビーズ。レーン5:Fr3-5の降水からビーズ。レーン6:8 μL U1ΔNE+Fr 3-5の降水からのビーズ。mRNA前基質、中間体、および製品(イントロンラリアットおよび合体エキソン、矢印で強調)の移動位置は右側に示されています。パネルCのデータは、Haudekら 16のパネルA、図2に示されているのと同じ実験から導出されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図2に示す結果は、抗Gal3(#49)で得られた。同じ結果は別の抗Gal3(#24)で観察することができたが、ウサギ#49からのプレ免疫血清は、分数3-516でインキュベーションに続いてU1ΔNEのスプライシングを再構成することができなかった。これらの結果のすべては、プレmRNA基質がビーズ上に固定化された10S Gal3-U1 snRNP粒子に結合し、三元複合体がスプライシング経路において機能的であることを強く示唆している。
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Discussion
このレポートは、抗Gal3コーティングビーズに閉じ込められたGal3 - U1 snRNP複合体がmRNA前の基質に結合し、この三級複合体がU1 snRNP枯渇NEにスプライシング活性を回復させることができることを文書化する実験的詳細を提供します。.初期の免疫蛍光および細胞下分画研究は、Gal3とスプライシング機構の構成要素との関連の最初のヒントを提供した:スナンプとセリンとアルギニンのSmコアポリペプチドと核斑点における共局在化 hnRNPおよびsnRNP24の密度(1.3-1.35 g/mL)のspicing因子24,25およびセシウムの沈下の家族.その後の枯渇再構成実験は、Gal3(およびガレクチンファミリーの別のメンバー、ガレクチン-1(Gal1))が必要であったが、冗長な、無細胞スプライシングアッセイの要因7,8を示した。
NEがグリセロール勾配で分画されると、抗Gal3を有する勾配画分の免疫沈降は、異なるsnRNAおよび関連タンパク質の異なる比率を有する別個の複合体を生じ、Gal3がmRNA前スプライシング基質10の存在しない場合に複数のsnRNPsに関連していることを示唆している。特に、Gal3およびU1 snRNPは、勾配の〜10S領域(12%〜32%グリセロール勾配の画分3〜5)に沈着する単粒子に集積される。プレmRNAの5'スプライス部位へのU1 snRNPの結合は、スプライセソームアセンブリ5,26の初期工程を表すため、Gal3はU1 snRNPとの関連を介してスプライシング経路に入り込む可能性があった。この概念は、Gal3が10S Gal3-U1 snRNP複合体の一部として、スプライス部位を欠いている制御RNAではなく、mRNA前の基質と関連付けられることが判明したという観測によって支持され、U1 snRNPによる5'スプライス部位認識は、その組み立てにおいて重要な必要条件であったことを示唆している。また、微小コアクカルシウムを用いたGal3-U1 snRNP粒子を含む画分の前処理は、前mRNA10上へのGal3の負荷を廃止した。重要な問題は、Gal3、U1 snRNP、およびpre-mRNAからなるこの初期の三次複合体が、スプライシング経路にコミットされた機能的E複合体またはスプライシング経路に入ることができない行き止まりH複合体を表すかどうかである5,26。我々は、Gal3 - U1 snRNPがU1 snRNPの枯渇したNEのスプライシング活性を、スプライシング能力(U1ΔNE)の付随的損失で再構成できるかどうかをテストすることによって、この問題に対処した。本条に詳述したプロトコルを有する我々の実験の結果は、Gal3-U1 snRNPが機能的E複合体を形成するためにmRNA前基質に結合し、U1 snRNPがスプライシング経路16にGal3を組み込む必要があることを示している。
説明した実験プロトコル内の2つの重要なステップに注意する必要があります。まず、ステップ3.2.7は、グリセロール画分の抗Gal3沈殿後の上清非結合物質の除去を求める。ペレット状のアガロースビーズから液体を完全に除去するには、ハミルトンシリンジの針先端をビーズの底に挿入する必要があります。これは、ビーズが注射針を詰まらせないように注意深く行う必要がありますまたは後者がチューブから引き出される際に針に付着することによって失われます。第二に、ペレット化ビーズを、できるだけ遅延を少なくしてスプライシング反応の組み立てに使用することが重要である。この 2 つの手順の調整は、この手順を成功させるために重要でした。この関連で、我々は最近、ビーズに対する抗Gal3抗体の共有結合におけるプロテインA-セファロースCL-4BビーズをプロテインA-磁気ナノ粒子に置き換えることによって、ペレット画分中のGal3-U1 snRNP複合体の回収を改善することにも留意すべきである。
重要な結論は、スプライシング活性を欠いたU1ΔNEが、抗Gal3抗体で共有体化されたビーズによって免疫沈降した10S Gal3-U1 snRNP粒子免疫によって補完される実験に由来する。イントロン除去の明らかな証拠があったが、エキソン結合の効率は、ビーズの不在時に行われた反応で観察されたものよりも少なかった( 図2Cのレーン6対レーン1を比較)。当社の無細胞スプライシングアッセイでは、プレmRNA基質における放射能の約30%が、典型的には、合体エキソンに変換される。このエキソン結紮の欠損は、U1ΔNE(図1A)またはGal3 - U1 snRNP複合体(図1B)のいずれかで、重要な成分の最適でない量がいくらかあるためである可能性があります。(b)いくつかの構造的制約(例えば、立体構造変化を起こすのが難しい)のGal3-U1 snRNPは、スプライシング反応中に抗Gal3ビーズに固定化される(図1C)。
他の研究者は、特定の複合体をトラップし、触媒活性またはスプライセオソーム構造のいくつかの順序の進行を文書化するために固相免疫選択の使用を報告しています。例えば、Chiuら(Cwc25)は、第1の触媒反応に、抗体閉じ込められた組み立てスプライセソーム上のプレmRNA基質を追いかけることができ、中間体、エキソン1およびラリアットエキソン2227を得た。同じ酵母系では、クリシュナンらはプロテインAタグを使用して、バイオチン化IgGを介して、第1スプライシングステップ28の前にmRNAリモデリング(5スプライス部位と分岐点の間の距離)の生物物理学的研究で、レンサビジンコーティングされた磁気ビーズに精製されたバクトスプライセソーム複合体を固定化した。我々の現在の記事は、スプライシング反応の両方のステップを完了するという点でこれらの以前の研究を拡張し、したがって、技術的性質の重要性を運ぶ可能性があります:これらの同じ一連の手順は、これらの要因がいつどのようにスプライセオソーマル複合体にロードするかを調べるためにsnRNPに関連付ける他の任意の数のスプライシング因子に適用することができます。スプライシング反応からmRNA生成物の形成を監視する能力は、これらの組み立てられたスプライセソームが実際に機能的であるという強力な証拠を構成する。これは、プロテオミクスアプローチを使用した以前のレポートでは、因子が複合体にどのようにロードされたかではなく、特定の複合体内のいくつかの要因の存在のみをカタログ化するので、スプライセオソームがどのように形成されるかについての我々の理解をさらに深めるかもしれません。
スプライシングにおけるその役割を評価する他のタンパク質またはsnRNPsに対するこれらの手順の一般的な適用性の明確な制限は、その関連する複合体を効率的に沈殿させる特定の要因に対して向けられた特定の抗体の入手可能性である。例えば、多くのウサギ由来のポリクローナル抗Gal3抗セラ(例えば、#24、#49)は、核抽出物またはグリセロール画分からGal3-U1 snRNP複合体を免疫沈降させた(U1 snRNAおよびU1 70Kタンパク質は、コチエンチした共沈殿、Gal3)。対照的に、Gal3、Mac-2およびNCL-GAL3に対して向けられた2つの市販のモノクローナル抗体は、同じ結果を生み出すことができなかった。Mac-2およびNCL-GAL3のエピトープは、Gal3ポリペプチド29 のアミノ末端ドメインにマッピングされており、それぞれのエピトープがGal3-U1 snRNP複合体でアクセスできない可能性があります。さらに、抗体結合因子(例えば、Gal3)およびそれに関連する複合体(例えば、U1 snRNP)は、mRNA以前または他のスプライセソーム成分とのさらなる相互作用を形成できなくなった。これは、抗体による物理的干渉または抗体が共有結合されるマトリックスによるものであってもよい。したがって、対象となる各システムは、ケースバイケースで評価する必要があります。しかし、これらの制限にもかかわらず、特定のスプライシング因子の枯渇した抽出物におけるスプライシング活性を再構成するためにビーズ上でアフィニティまたは免疫選択された複合体を使用するスキームは、一般的に他のシステムに適用できる可能性があるようです。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
この研究は、国立科学財団グラントMCB-0092919とミシガン州立大学の壁内研究助成金09-CDFP-2001(RJPへ)、国立衛生研究所GM-38740とミシガンAgBioResearchプロジェクトMICL02455(JLWへ)によって支援されています。
スプライシングアッセイに使用されるMINXプレmRNA基質は、スーザン・ベルゲット博士(米国テキサス州ヒューストンのベイラー医科大学)からの親切な贈り物でした。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-U1 snRNP | The Binding Site | Hu ENA-RNP #33471 | human autoimmune serum specific for U1 snRNP |
| bottle top vacuum filter | Fisher Scientific | Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) | for filtering solutions containing Tris |
| centrifuge | International Equipment Company | IEC Model PR-6 | for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation |
| diethylpyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 159220-5G | for treatment of water used in preparation of all solutions |
| dimethylpimelimidate (DMP) | Sigma-Aldrich | 80490-5G | for cross-linking antibody to Sepharose beads |
| electrophoresis cell | BioRad Laboratories, Inc | Mini-Protean II | for SDS-PAGE separation of proteins |
| ethanolamine | Sigma-Aldrich | 411000-100ml | for blocking after the cross-linking reaction |
| gel electrophoresis system | Hoefer, Inc | HSI SE 500 Series | for separating snRNAs by gel electrophoresis |
| gel slab dryer | BioRad | Model 224 | for drying gel slabs for autoradiography |
| Hybond ECL membrane | GE Healthcare | RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) | for immunoblotting of proteins on membrane |
| microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) | Pierce | Microdialyzer System 100 | for exchanging the buffer of nuclear extract |
| microdialyzer membranes (8K cutoff) | Pierce | 66310 | for exchanging the buffer of nuclear extract |
| non-fat dry milk | Spartan Stores | Spartan Instant Non-fat Dry Milk | |
| Protein A Sepharose CL-4B | Millipore-Sigma | GE 17-0780-01 | for coupling antibody to beads |
| Proteinase K | Millipore-Sigma | P2308-5mg | for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs |
| RNasin | Promega | N2111 | for inhibiting ribonuclease activity |
| rocker/rotator | Lab Industries, Inc | Labquake Shaker 400-110 | for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation |
| Safety-Solve | Research Products International Corp. | No. 111177 | scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate |
| scintillation counter | Beckman Instruments | LS6000SC | scintillation counter for determination of radioactivity |
| speed vaccum concentrator | Savant | SVC 100H | for drying ethanol-precipitated RNA pellets |
| Transphor electrophoresis unit | Hoefer, Inc | Hoefer TE Series Transphor | for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane |
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