Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Комплементация сплайсинговой активности комплексом Галектин-3 - U1 snRNP на бусинах

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

В данной статье описаны экспериментальные процедуры для (а) истощения U1 snRNP из ядерных экстрактов с сопутствующей потерей сплайсинговой активности; и (b) восстановление сплайсинговой активности в U1-обедненном экстракте частицами snRNP галектина-3-U1, связанными с ковалентно связанными с анти-галектин-3 антителами.

Abstract

Классические эксперименты по истощению-восстановлению показывают, что галектин-3 является обязательным фактором сплайсинга в ядерных экстрактах. Механизм включения галектина-3 в сплайсинговый путь рассматривается в данной работе. Осаждение клеточных ядерных экстрактов HeLa на 12%-32% градиентах глицерина дает фракции, обогащенные эндогенной частицей ~10S, содержащей галектин-3 и U1 snRNP. Теперь мы описываем протокол для истощения ядерных экстрактов U1 snRNP с сопутствующей потерей сплайсинговой активности. Сплайсинговая активность в U1-истощенном экстракте может быть восстановлена частицей snRNP галектина-3 - U1, захваченной на бусинах агарозы, ковалентно связанной с антителами против галектина-3. Результаты показывают, что троичный комплекс галектин-3 - U1 snRNP - пре-мРНК является функциональным комплексом Е, приводящим к промежуточным продуктам и продуктам реакции сплайсинга, и что галектин-3 попадает в путь сплайсинга через его ассоциацию с U1 snRNP. Схема использования комплексов аффинно- или иммуно-, выбранных на шариках, для восстановления сплайсинговой активности в экстрактах, обедненных специфическим фактором сплайсинга, может быть в целом применима к другим системам.

Introduction

Производство большинства эукариотических мессенджерных РНК (мРНК) включает удаление интронов и лигирование экзонов в ядерном процессе, называемом сплайсингом премрнК1. Два класса РНК-белковых комплексов (RNP) направляют обработку пре-мессенджерной РНК в зрелую мРНК через сплайсеосомальные комплексы. Один класс, зарождающиеся предмаршированные RNP, образуется котранскрипционно путем связывания гетерогенных ядерных белков RNP и других РНК-связывающих белков, включая некоторых членов семейства SR, давая комплексы hnRNP2. Второй класс, богатый урацилом малые ядерные RNP (U snRNP с U1, U2, U4, U5 и U6 snRNAs) связан с U-специфическими и основными белками3,4. U snRNP взаимодействуют упорядоченным образом с определенными областями предмарш-мессенджерных RNP в динамическом пути ремоделирования, поскольку интроны иссекаются, а экзоны лигируются для получения зрелых mRNPs5. Многие дополнительные ядерные белки участвуют в этих событиях обработки6.

Галектин-1 (Gal1) и галектин-3 (Gal3) являются двумя белками, которые являются необходимыми факторами в пути сплайсинга, как показано исследованиями истощения-восстановления7,8. Удаление обоих галектинов из сращивания компетентных ядерных экстрактов (NE) отменяет сплайсеосомную сборку и сплайсинговую деятельность на ранней стадии. Добавление любого галектина к такому вдвойне истощенному NE восстанавливает обе активности. Gal1 и Gal3 являются компонентами активных сплайсеосом, о чем свидетельствует специфическая иммунопреципитация пре-мРНК, сплайсинговых промежуточных продуктов и зрелой мРНК антисывороткой, специфичной для Gal1 или Gal39. Важно отметить, что Gal3 ассоциируется с эндогенной U snRNA, содержащей частицы в NE вне пути сплайсинга, как показано осаждением snRNP анти-Gal3 antisera10. Наконец, глушение Gal3 в клетках HeLa изменяет паттерны сплайсинга многочисленных генов11.

В NE, предварительно инкубированном для разборки предварительно сформированных сплайсеосом12, snRNP обнаруживаются в нескольких комплексах, осажденных в градиентах глицерина от 7S до более 60S. Хотя фракционирование градиента глицерина является распространенным методом выделения сплайсеосомальных комплексов и компонентов (см., например, ссылки13,14,15), мы расширили этот метод, охарактеризовав специфические фракции с использованием иммунопреципитаций антител. SnRNP осадок при 10S содержит только U1 snRNA вместе с Gal3. Иммунопреципитация фракции 10S с антисыворотки, специфичной для Gal3 или U1 snRNP, осаждает как U1, так и Gal3, указывая на то, что некоторые из моночастиц U1 snRNP связаны с Gal310. Поскольку U1 snRNP является первым комплексом, который связывается с pre-mRNP в сплайсеосомальной сборке1,5, этот шаг представляет собой потенциальный входной участок для Gal3 в путь сплайсинга. На этой основе мы показали, что моночастицы 10S Gal3-U1 snRNP, связанные с бусинами, содержащими анти-Gal3, восстанавливают активность сплайсинга к U1 snRNP истощенной NE, устанавливая этот комплекс как один механизм, с помощью которого Gal3 набирается в сплайсеосомальный путь16. Это контрастирует с попытками выделения сплайсеосом на определенных этапах реакции сплайсинга и каталогизации связанных с ними факторов17,18. В таких исследованиях констатируется наличие определенных факторов в какой-то момент времени, но не механизм, с помощью которого они были загружены.

Ранее мы подробно описали подготовку NE, сплайсинговую подложку, сборку реакционной смеси сплайсинга и анализ продуктов в нашей документации о роли галектинов в сплайсинге премрнК19. Теперь описаны экспериментальные процедуры фракционирования ядерных экстрактов для получения фракции, обогащенной комплексом SnRNP Gal3 - U1, и иммуноотбора последнего комплекса для восстановления сплайсинговой активности в ядерном экстракте, обедненном U1.

Figure 1
Рисунок 1: Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая дополнение сплайсинговой активности в ядерном экстракте, обедненном U1 snRNP комплексом Gal3-U1 snRNP на шариках. (A) NE в буфере C (NE(C)) инкубируют с белком A-Sepharose бусинами, ковалентно связанными с анти-U1 snRNP (бусины αU1). Несвязанная фракция обедняется U1 snRNP (U1ΔNE). (B) NE в буфере D (NE(D)) фракционируют по 12%-32% градиенту глицерина путем ультрацентрифугирования. Фракции, соответствующие области 10S (фракции 3-5), объединяют и смешивают с бусинами, ковалентно связанными с антителами против Gal3 (шарики αGal3). Материал, связанный с шариками, содержит моночастицу Gal3-U1 snRNP. (C) Комплекс SnRNP Gal3-U1 из части (B) смешивают с U1ΔNE из части (A) в сплайсинговом анализе с использованием 32P-меченого субстрата MINX pre-mRNA, а промежуточные продукты и продукты реакции сплайсинга анализируют с помощью гелевого электрофореза и ауторадиографии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Примечания по общим процедурам

  1. Убедитесь, что все химические вещества (буферные компоненты, ферменты и т. д.) не содержат рибонуклеазы (РНКазы). Изолируйте все коммерчески приобретенные бутылки с реагентами от общего лабораторного использования. Надевайте перчатки на все этапы экспериментальной процедуры. Используйте только стеклянную посуду и посуду, которые были запечены (см. шаг 1.2 ниже) и растворы, которые были предварительно обработаны (см. шаг 1.3 ниже).
  2. Выпекайте всю стеклянную посуду (стаканы, колбы, бутылки, пипетки и т.д.) не менее 4 ч при 177 °C. Заверните другую посуду (шпатели, перемешиватели и т.д.) в алюминиевую фольгу перед выпечкой в тех же условиях.
  3. Готовят 0,1% (об./об.) раствор диэтилпирокарбоната (DEPC) в двухдистиллированной воде (ddH2O). Используя магнитный перемешиватель, перемешайте этот раствор в течение ночи, а затем автоклав. Используйте этот обработанный DEPC H2O для приготовления всех растворов, содержащих Tris; затем фильтр стерилизуют с помощью вакуумного фильтра для бутылок. Используйте обычный ddH2O для приготовления всех остальных растворов (без Tris); затем обрабатывают DEPC (0,1%, об/об) и автоклавом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буферы, используемые в следующем наборе экспериментальных процедур, перечислены в алфавитном порядке в таблице 1.
Имя буфера Состав
Боратный буфер 0,2 М бората натрия, рН 9
Буфер C 20 мМ HEPES, рН 7,9, 25% (об./об.) глицерин, 0,42 М NaCl, 1,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторид (PMSF), 0,5 мМ дитиотрейтол (DTT)
Буфер D 10 мМ HEPES, рН 7,9, 20% (об./об.) глицерин, 0,1 М KCl, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мМ PMSF, 0,5 мМ DTT
60%Д 60% буфер D и 40% H2O
Этаноламин 0,2 М этаноламина, рН 8
Буфер связывания HEPES 20 мМ HEPES, рН 7,9
Буфер для промывки HEPES 20 мМ HEPES, рН 7,9, 0,5 М NaCl
Буфер загрузки РНК 90% формамид, 20 мМ ЭДТА, рН 8, 0,05% (мас./об.) бромфенола синего
Буфер SDS-PAGE 25 мМ Tris, глицин 169 мМ, 0,1% додецилсульфата натрия (SDS), рН 8,8
Буфер образцов SDS 62,5 мМ Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерин, 5% 2-меркаптоэтанол, 0,1% (мас./об.) бромфенол-синий
Буфер TBE для РНК-гелей 89 мМ Tris, борная кислота 89 мМ, ЭДТА 2,5 мМ, рН 8,3
Буфер TE 10 мМ Трис, рН 8, 1 мМ ЭДТА
Буфер передачи 25 мМ Tris, 1,92 М глицина, 20% метанола, рН 8,3
Буфер T-TBS 10 мМ Tris, 0,5 М NaCl, 0,05% анимации 20, рН 7,5
TX буфер промывки 0,05% Тритон X-100 (TX) в 60% D

Таблица 1: Название и состав буферов

2. Препарат NE истощен U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Препарат шариков против U1 для иммуносансорбции
    1. Предварительно набухайте 50 мг бусин белка A-Sepharose CL-4B в избытке H2O, обработанном DEPC, чтобы произвести приблизительно 200 мкл набухших шариков, а затем промыть в буфере для промывки HEPES.
    2. Для этой промывки и всех последующих промывок гранулируют шарики центрифугированием (1000 х г в качающемся роторе ведра при 4 °C в течение 10-15 с) и удаляют несвязанную промывку с помощью микропипеттера и выбрасывают.
    3. Смешать 150 мкл промытых шариков со 150 мкл аутоиммунной сыворотки человека, специфичной для U1 snRNP (объем антитела к объему шариков в соотношении 1:1).
    4. Отрегулируйте, исходя из общего объема (~300 мкл из шага 2.1.3 выше), смесь до 20 мМ HEPES, рН 7,9, соответствующего условиям буфера связывания HEPES; инкубируют эту смесь с непрерывным раскачиванием при комнатной температуре в течение 60 мин.
    5. Промыть шарики, связанные антителами, 1 мл боратного буфера (0,2 М бората натрия, рН 9) и повторно суспендировать в 1 мл того же боратного буфера.
    6. Чтобы ковалентно соединить антитело, связанное с белком А-сефарозные шарики, добавляют диметилпимелимидат до конечной концентрации 20 мМ и инкубируют при комнатной температуре с раскачиванием в течение 60 мин.
    7. Вымойте шарики 1 мл боратного буфера.
    8. Чтобы заблокировать любой непрореагировавший сшивающий реагент, добавляют 1 мл 0,2 М этаноламина (рН 8) и инкубируют при комнатной температуре с раскачиванием в течение 60 мин.
    9. Промывайте бусины, связанные с антителами, в дальнейшем обозначаемые как бусины против U1, дважды с 0,5 мл буфера промывки TX (0,05% Triton X-100 в 60% D).
  2. Истощение U1 snRNP из NE (см. Рисунок 1A)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура получения NE из клеток HeLa была первоначально разработана Dignam et al.20. Мы описали материалы и подробные методы подготовки NE к анализу сращивания19 (см. шаги 2.1 и 3.1 этой ссылки). NE, как первоначально подготовлено, находится в буфере C и в дальнейшем будет обозначен как NE(C). NE(C), диализованный по отношению к буферу D и уравновешенный буфером D, будет обозначен как NE(D).
    1. Инкубировать 200 мкл NE(C) со 100 мкл шариков против U1 со стадии 2.1.9 выше.
    2. Добавьте в смесь 5 мкл РНАзина.
    3. Поверните микротрубку головой над хвостом при 4 °C в течение 1 ч.
    4. Гранулируйте смесь центрифугированием (1000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с) и собирайте несвязанный материал (U1ΔNE) с помощью шприца Гамильтона.
    5. Диализуйте весь объем U1ΔNE вместе с отдельной 50-мкл аликвотой исходного неображенного NE(C) в отдельных отсеках микродиализатора, с перемешиванием, в течение 75 мин против 60% D с использованием диализной мембраны с отсечкой молекулярной массы 8 К.
    6. Сразу после диализа разделить эти препараты (U1ΔNE и NE в 60% D) на 20 мкл аликвот; затем заморозить в ванне с сухим льдом/этанолом и хранить при -80 °C.
  3. Анализ содержания РНК и белка в U1ΔNE и материала, связанного на бусинах против U1
    1. После удаления несвязанного материала (U1ΔNE) (этап 2.2.4) промыть материал, связанный с шариками против U1, добавив 0,5 мл буфера промывки TX. Гранулируйте смесь центрифугированием (1000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с) и удаляйте супернатант с помощью микропипеттера и выбрасывайте.
    2. Повторите шаги стирки 2.3.1 дважды.
    3. Удалите материал, связанный с шариками против U1, добавив 100 мкл 2x буфера образцов SDS к 100 мкл шариков и инкубируя в течение 10 минут при комнатной температуре.
    4. Гранулирование смеси центрифугированием (1 000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °С в течение 10-15 с); удалить супернатант шприцем Гамильтона и заморозить в ванне с сухим льдом / этанолом. Хранить при температуре -80 °C.
    5. Сравните неразрушенный NE, истощенный NE (U1ΔNE) и материал, связанный с шариками (удаленный из бусин буфером образцов SDS, как описано в шагах 2.3.3 и 2.3.4 выше). Выполните шаги 2.3.6-2.3.8 для анализа РНК или шаги 2.3.9-2.3.10 для анализа белка.
    6. Для каждого образца экстрагируют РНК с 200 мкл фенол-хлороформа (50:50, v/v); затем снова экстрагировать 180 мкл хлороформ-изоамилового спирта (25:1, v/v). После экстракции добавляют 300 мкл холодного 200-стойкого этанола, инвертируют для смешивания и хранят осажденную РНК в течение ночи при -20 °C.
    7. Центрифугируют осажденную этанолом РНК (12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C). Промыть гранулы 150 мкл холодного 70% этанола. Центрифуга снова (12 000 х г) при 4 °C в течение 15 мин. Удалите супернатант с помощью микропипеттера и высушите гранулы в вакууме со скоростью в течение 10-15 мин без нагрева.
    8. Повторно суспендируют высушенную РНК-гранулу в 10 мкл РНК-нагрузочного буфера, осторожно вихрь, нагревают до 75-85 °С в течение 90 с, а затем инкубируют на льду в течение 2 мин. Разделяют snRNAs гелевым электрофорезом (2 ч при 16 мА) через 13% полиакриламид - 8,3 М гелей мочевины и затем либо окрашивают бромидом этидия, либо подвергают северному блоттингу10,16.
    9. Загрузите образцы белка в буфере образцов SDS со стадии 2.3.5 на 12,5% полиакриламидные гели и электрофорез при 200 В в течение приблизительно 45-50 мин в буфере SDS-PAGE (электрофорез полиакриламидного геля додецилсульфата натрия).
    10. Перенос отделенных белков на нитроцеллюлозную мембрану при 400 мА в течение 2 ч в трансферном буфере. После переноса блокируют мембрану путем инкубации на ночь в T-TBS, содержащем 10% обезжиренного сухого молока. Затем иммуноблотируют мембрану, чтобы выявить специфические белки8,21.

3. Иммунопреципитация 10S фракций градиентов глицерина анти-Gal3

  1. Препарат шариков анти-Gal3 для иммуносансорбции
    ПРИМЕЧАНИЕ: Происхождение и характеристика поликлональной антисыворотки кролика против Gal3 для кролика #2421 и для кролика #4910 были описаны ранее.
    1. Используйте преиммунную сыворотку от кролика No49 в качестве контроля.
    2. Для приготовления бусин анти-Gal3 следуйте процедуре, ранее описанной для приготовления бусин anti-U1 (этап 2.1), за исключением того, что, соответствующее шагу 2.1.3, отношение антисыворотки (например, анти-Gal3, #49) к бусинам составляет 3:1.
    3. Непосредственно перед использованием промывайте бусины, связанные с антителами, в дальнейшем обозначаемые как бусины против Gal3, дважды с 0,5 мл буфера промывки TX. Удалите супернатант, сначала с помощью микропипеттера, чтобы получить большую часть жидкости, а затем с помощью шприца Гамильтона, чтобы получить жидкость из шариков; отбрасывать.
  2. Иммунопреципитатон фракций градиента глицерина анти-Gal3 (см. Рисунок 1B)
    1. Фракционировать NE(D) более 12%-32% градиента глицерина10. Смешайте и смешайте фракции градиента глицерина 3, 4 и 5 (пронумерованные из верхней части градиента), которые находятся вблизи области 10S градиента.
    2. Подготовьте два образца, каждый со 150 мкл аликвотой комбинированных фракций градиента 3-5 (стадия 3.2.1), и поместите в 50 мкл шариков анти-Gal3.
    3. Параллельно готовят два образца по 150 мкл фракции 1 (содержащие Gal3, не в комплексе с U1 snRNP10; стадия 3.2.1) и помещают в 50 мкл бусины против Gal3.
    4. В качестве контроля поместите 150 мкл 60% D в другую микропробирку из 50 мкл анти-Gal3 шариков.
    5. Осторожно перемешайте, постукивая по трубке, затем поверните микротрубку головой над хвостом при 4°C в течение 1 ч.
    6. Гранулирование смеси путем щадящей центрифугации (1 000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с).
    7. Удалите супернатант (несвязанный материал) с помощью шприца Гамильтона. Не мойте шарики и используйте сразу для добавления реакций сращивания (раздел 4.2).
  3. Анализ содержания РНК и белка в несвязанном и связанном материале из осаждения анти-Gal3 фракций градиента 10S
    1. Для анализа компонентов связанного и несвязанного материала из осаждения анти-Gal3 фракций градиента 10S собирают несвязанный материал (супернатант после стадии 3.2.6), переносят в свежую микропробирку и замораживают при -20 °C.
    2. Промыть осажденные шарики с этапа 3.2.6 (содержащего материал, связанный с анти-Gal3), добавив 0,5 мл буфера промывки TX.
    3. Гранулирование смеси путем щадящего центрифугирования (1 000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с); удалить супернатант с помощью микропипеттера и выбросить. Повторите шаги стирки еще дважды.
    4. Добавьте 50 мкл буфера образцов 2X SDS в промытые и гранулированные шарики против Gal3.
    5. Аккуратно перемешайте шарики и высиживайте в течение 10 минут при комнатной температуре.
    6. Гранулируйте смесь щадящим центрифугированием (1000 х г в качающемся роторе ведра при 4 °C в течение 10-15 с), соберите супернатант шприцем Гамильтона и храните в свежей микротрубке при -20 °C.
    7. Сравните несвязанный материал (раздел 3.3.1) и связанный материал (этап 3.3.6) осаждения анти-Gal3 в терминах РНК и белковых компонентов, используя процедуры, описанные в шагах 2.3.6. до пункта 2.3.10, соответственно.

4. Сборка реакции сращивания и анализ продуктов

  1. Подготовка сращивающей подложки
    ПРИМЕЧАНИЕ: Субстрат пре-мРНК, обозначенный MINX, содержит две последовательности экзонов и одну интронную последовательность из Аденовируса22. Последовательность ДНК MINX в плазмиде находится под контролем промоторов РНК-полимеразы T3, T7 или SP6. Материалы и подробные способы линеаризации плазмидной ДНК MINX эндонуклеазой рестрикции BamHI, транскрипции полимеразой РНК SP6 в присутствии α-32P[GTP] и очистки меченой 32P MINX для сплайсинговых анализов описаны ранее19 (см. шаги 2.2 и 3.2 этой ссылки).
    1. Хранить радиомеченный MINX в виде этанолового осадка при -20 °C; использовать меченый сращивающий субстрат в течение 4-6 недель после транскрипции.
    2. Непосредственно перед использованием центрифугируйте осажденный этанолом 32P-меченый MINX при 12 000 х г в течение 10 мин при 4 °C; удалить супернатант с помощью микропипеттера и выбросить.
    3. Добавьте 150 мкл 70% этанола и центрифугу при 12 000 х г в течение 15 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант и высушите гранулы в вакууме без нагрева в течение 15 мин.
    4. Регидратируйте гранулы в 50 мкл воды DEPC. Пятно 2 мкл на каждом из двух фильтров GF/C; погрузить фильтры в холодную 5% трихлоруксусную кислоту (ТЦА) на 10 мин. Промыть холодным 5% TCA, а затем 180-стойким этанолом на вакуумной колбе. Воздух сушит фильтры и подвергает сцинтилляционному подсчету в 4 мл Safety-Solve.
    5. Разбавляйте 32P-меченый MINX в 60% D до 104 cpm/μL для анализа сплайсинга.
  2. Сборка реакции сращивания (см. рисунок 1С)
    1. Собирают на льду реакции сращивания в общем объеме 24 мкл (8 мкл U1ΔNE (со стадии 2.2.6), 3,5 мМ MgCl2, 1,5 мМ АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0,5 мМ DTT, 20 единиц РНКазина, 4 мкл 32P-меченого сварочного субстрата MINX (104 cpm/μL), 60% D) и добавляют в каждую трубку шарики из секции 3.2.7. Соберите идентичный набор реакций сплайсинга в общем объеме 24 мкл, но без U1ΔNE, и добавьте в каждую трубку шарики из стадии 3.2.7.
    2. Готовят контрольную реакцию сплайсинга в общем объеме 12 мкл (4 мкл NE(D), 3,5 мМ MgCl2, 1,5 мМ АТФ, 20 мМ креатинфосфата, 0,5 мМ DTT, 20 единиц РНКазина, 2 мкл 32P-меченого сращивающего субстрата MINX (104 ч/мкл), 60% D).
    3. Осторожно перемешайте трубки, постукивая и поворачивая торец над хвостом при 30°C в течение 90 минут. Гранулируйте смесь щадящей центрифугированием при 1000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °С в течение 10-15 с.
    4. Остановите реакцию и элюируйте белки из шариков, добавив 24 мкл 2x буфера образцов SDS к пробиркам, содержащим шарики, и 12 мкл 2x буфера образцов SDS в контрольную трубку, содержащую NE, но без шариков. Нагревайте трубки при 100 °C в течение 7 мин.
    5. Осторожно центрифугируйте трубы при 1000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10-15 с.
    6. Перенос супернатантов (элюций) в свежие микротрубки: приблизительно 48 мкл из шариковых пробирок и 24 мкл из контрольной трубки NE.
    7. Добавьте протеиназу K (20 мг/мл) для переваривания и солюбилизации белков: добавьте 5 мкл к элюированию 48 мкл из шариков и добавьте 2,5 мкл к контроле NE 24 мкл.
    8. Инкубировать пробирки при 37°C в течение 40 мин.
    9. Осторожно центрифугируйте трубы при 1 000 х г в качающемся роторе ковша при 4 °C в течение 10 с.
    10. Разбавить шариковые элюи с 39,5 мкл TE и 10 мкл 3 М ацетата натрия. Разбавить контроль NE 63,5 мкл TE и 10 мкл 3 М ацетата натрия.
    11. Извлеките и проанализируйте РНК, как описано ниже (раздел 4.3).
  3. Анализ продуктов реакции сращивания
    1. Экстрагировать РНК в каждом образце фенол-хлороформом, а затем хлороформом-изоамильным спиртом; осаждение РНК этанолом, центрифуга, промывка гранул, удаление супернатанта и сушка гранул в соответствии с той же процедурой, которая описана на этапах 2.3.6 и 2.3.7.
    2. Повторно суспендируют высушенную РНК-гранулу в 10 мкл РНК-нагрузочного буфера, осторожно вихрь, нагревают до 75-85 °С в течение 90 с, а затем инкубируют на льду в течение 2 мин.
    3. Готовят 20 мл раствора, содержащего 13% полиакриламид (бисакриламид:акриламид, 1,9:50 [мас./мас.]) в 8,3 М мочевины; литые гели длиной 15 см с использованием этого раствора.
    4. После того, как гель отлит, электрофоризируйте его (без загрузки образцов) при 400 В в течение 20 мин, используя TBE в качестве рабочего буфера. После этого шага промывайте скважины с помощью рабочего буфера TBE.
    5. Загрузите образцы РНК в буфер загрузки РНК и электрофорез с работающим буфером TBE при 400 В в течение 3,5-4 ч. После электрофореза удаляют мочевину, погружая и вращая гель в дистиллированную воду в течение 10 мин.
    6. Вакуумная сушка геля на фильтровальной бумаге 3 M, сначала в течение 2 ч 15 мин при 80 °C, а затем в течение 30 мин без нагрева, чтобы медленно охладить его. Подвергнуте высушенный гель ауторадиографии на пленке для выявления положений миграции радиоактивных компонентов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

NE, обедненные комплексами U1 snRNP (U1ΔNE из раздела 2.2.6) и Gal3 - U1 snRNP из области 10S градиента глицерина, иммунопреципитированного анти-Gal3 (стадия 3.2.7), смешивали в реакции сплайсинга. Эта реакционная смесь содержала u1 snRNA (рисунок 2A, полоса 3), а также U1-специфический белок U1-70K (рисунок 2B, полоса 3). Как и ожидалось, анти-Gal3 выпал в осадок Gal3 (рисунок 2B, полоса 3). Эти компоненты (U1 snRNA, белок U1-70K и Gal3) не были обнаружены в преиммунном (PI) контрольном осаждении (Рисунок 2A, Рисунок 2B, полоса 2). По сравнению с неисчерпаемым NE, проводимым в качестве положительного контроля (рисунок 2C, полоса 1), U1ΔNE не проявлял сращивающей активности (рисунок 2C, полоса 2). Сплайсинговая активность в U1ΔNE может быть восстановлена с помощью связанного с шариком комплекса Gal3 - U1 snRNP (рисунок 2C, полоса 6). Были обнаружены оба продукта реакции сплайсинга, лигированные экзоны и иссеченный интронный лариат (выделенный стрелками справа), а также промежуточные продукты, экзон 1 и экзон лариата 2. Компоненты фракций 3-5 имели решающее значение при восстановлении сплайсинга до U1ΔNE. Когда фракции 3-5 заменяли только буфером (60% D) в иммунопреципитации, при смешивании с U1ΔNE не наблюдалось никакой сплайсинговой активности (рисунок 2C, полоса 2), что указывает на то, что бусины анти-Gal3 не несут ответственности за восстановление сплайсинговой активности в последнем. Более убедительно, когда фракции 3-5 заменяли фракцией 1 в процедуре иммунопреципитации, а затем добавляли к U1ΔNE, не было обнаружено никаких промежуточных продуктов или продуктов реакции сплайсинга (рисунок 2C, полоса 4). Предыдущий анализ задокументировал, что Gal3 во фракции 1 представлял собой свободный белок Gal3, не связанный с каким-либо комплексом RNP10, и северное блоттирование материала, иммунопреципитализованного из фракции 1, не выявило никакой U1 snRNA16. Наконец, иммунопреципитаты из фракций1 и фракций 3-5 не проявляли сплайсинговой активности при анализе в отсутствие U1ΔNE (рисунок 2C, полосы 3 и 5 соответственно).

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты РНК и полипептидных композиций антигал3-осадка области 10S градиента глицерина и его способность восстанавливать сплайсинг в ядерном экстракте, обедненном U1 snRNP (U1ΔNE). (A) Анализ северного блоттинга u1 snRNA, связанной с шариками в сочетании с преиммунной сывороткой (PI; полоса 2) или с шариками в сочетании с анти-Gal3 (αGal3; полоса 3). Полоса 1 представляет собой 20% от количества комбинированных фракций градиента глицерина, подвергаемых иммунопреципитации. Полоса 2 и полоса 3 представляют собой по 25% связанного материала, элюированного из соответствующих бусин. (B) Вестерн-блоттинг полипептидов, связанных с шариками, в сочетании с преиммунной сывороткой (полоса 2) или антигал3 (полоса 3). Белковые идентичности указаны справа. Полоса 1 представляет собой 20% от количества комбинированных фракций градиента глицерина, подвергаемых иммунопреципитации. Полоса 2 и полоса 3 представляют собой 75% связанного материала, элюированного из соответствующих бусин. (C) Анализ способности восстанавливать сплайсинговую активность U1ΔNE анти-Gal3 (αGal3) иммунопреципитатов градиента глицерина фракции 1 (Fr 1), фракций 3-5 (Fr 3-5) или 60% буфера D (60% D). Знак + или - над выделенной жирным шрифтом сплошной линией указывает на наличие или отсутствие каждого из этих осадков в реакционной смеси сращивания. Знак + или - под выделенной жирным шрифтом сплошной линией указывает на наличие или отсутствие U1ΔNE (или NE в буфере D). Полоса 1: 4 мкл NE в сращивающем анализе 12 мкл, 100% из которых были подвергнуты гелевому анализу. Для полос 2-6 общий объем сращивающего анализа составил 24 мкл, 50% из которых были подвергнуты гелевому анализу. Полоса 2: 8 мкл U1ΔNE плюс бусины из осадков 60% D. Полоса 3: бусины из осадков Fr 1. Полоса 4: 8 мкл U1ΔNE плюс шарики из осадков Fr 1. Полоса 5: бусины из осадков Fr 3-5. Полоса 6: 8 мкл U1ΔNE плюс шарики из осадков Fr 3-5. Справа обозначены положения миграции субстрата премрнК, промежуточных продуктов и продуктов (интронный лариат и лигированные экзоны, выделенные стрелками). Данные, приведенные на панели С, получены в результате того же эксперимента, что и на панели А, рисунок 2 Хаудека и др.16. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Результаты, показанные на рисунке 2 , были получены с анти-Gal3 (#49). Те же результаты можно было наблюдать с другим анти-Gal3 (#24), но преиммунная сыворотка от кролика #49 не смогла восстановить сплайсинг в U1ΔNE после инкубации с фракциями 3-516. Все эти результаты убедительно свидетельствуют о том, что субстрат пре-мРНК может связываться с частицей 10S Gal3 - U1 snRNP, иммобилизованной на шариках, и что троичный комплекс функционален в пути сплайсинга.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В этом отчете представлены экспериментальные детали, которые документируют комплекс Gal3 - U1 snRNP, захваченный на бусинах, покрытых анти-Gal3, может связываться с субстратом пре-мРНК, и этот троичный комплекс может восстанавливать активность сплайсинга к обедненному U1 snRNP NE. Gal3 является одним из членов семейства белков, первоначально выделенных на основе его галактозно-специфической углеводсвязывающей активности23 . Ранние исследования иммунофлуоресценции и субклеточного фракционирования дали начальный намек на связь Gal3 с компонентами механизма сплайсинга: колокализация в ядерных спеклах с полипептидами Ядра Sm snRNP и семейством факторов пропивания, богатым серином и аргинином (SR)24,25 и осаждением на градиентах сульфата цезия при плотности (1,3-1,35 г/мл), соответствующей плотности hnRNP и snRNP24 . Последующие эксперименты по истощению-восстановлению, в свою очередь, показали, что Gal3 (а также другой член семейства галектинов, галектин-1 (Gal1)) были необходимыми, но избыточными факторами в анализах бесклеточного сплайсинга7,8.

Когда NE фракционируется над градиентом глицерина, иммунопреципитация фракций градиента с анти-Gal3 дает отчетливые комплексы с различными соотношениями различных snRNAs и ассоциированных белков, предполагая, что Gal3 связан с несколькими snRNP в отсутствие субстрата пре-мРНК-сплайсинга10. В частности, Gal3 и U1 snRNP собраны в моночастицу, которая откладывается в область ~10S градиента (фракции 3-5 12%-32% глицеринового градиента). Поскольку связывание U1 snRNP с 5'-сращенным участком пре-мРНК представляет собой начальный этап сборки сплайсеосом5,26, было возможно, что Gal3 может получить вход в путь сплайсинга через его ассоциацию с U1 snRNP. Это мнение подтверждается наблюдением, что Gal3, как часть комплекса snRNP 10S Gal3-U1, может быть обнаружено, что он ассоциируется с субстратом пре-мРНК, но не с контрольной РНК, не имеющей сайтов сращивания, предполагая, что распознавание сайта сращивания U1 snRNP было ключевым требованием в его сборке в сплайсеосому. Более того, предварительная обработка фракций, содержащих частицу SnRNP Gal3-U1, микрококковой нуклеазой отменила нагрузку Gal3 на пре-mRNA10. Ключевой вопрос, таким образом, заключается в том, представляет ли этот ранний троичный комплекс, состоящий из Gal3, U1 snRNP и пре-мРНК, функциональный комплекс E, посвященный пути сплайсинга, или тупиковый комплекс H, который не может войти в путь сплайсинга5,26. Мы решили этот вопрос, проверив, может ли SnRNP Gal3 - U1 восстановить активность сплайсинга в NE, истощенной U1 snRNP с сопутствующей потерей способности сплайсинга (U1ΔNE). Результаты наших экспериментов, протокол которых подробно описан в настоящей статье, указывают на то, что Gal3 - U1 snRNP связывается с субстратом пре-мРНК с образованием функционального комплекса E и что U1 snRNP требуется для включения Gal3 в сплайсинговый путь16.

Необходимо отметить два критических шага в рамках описанного экспериментального протокола. Во-первых, этап 3.2.7 предусматривает удаление несвязанного материала супернатанта после осаждения фракций глицерина анти-Gal3. Полное удаление жидкости из гранулированных шариков агарозы требует, чтобы наконечник иглы шприца Гамильтона был вставлен в нижнюю часть шариков. Это нужно делать осторожно, чтобы бусины не засоряли шприцевую иглу и не терялись прилипании к игле, так как последняя вытаскивается из трубки. Во-вторых, важно, чтобы гранулированные шарики использовались для сборки реакций сращивания с как можно меньшей задержкой. Координация этих двух шагов имела решающее значение для успеха процедуры. В этой связи следует также отметить, что в последнее время мы улучшили восстановление комплексов SnRNP Gal3-U1 в гранулированной фракции путем замены шариков белка A-Sepharose CL-4B белковыми А-магнитными наночастицами в ковалентной связи антитела анти-Gal3 с шариками.

Ключевой вывод сделан из экспериментов, в которых U1ΔNE, лишенный сплайсинговой активности, дополняется частицей 10S Gal3 - U1 snRNP, иммунопреципированной шариками, ковалентно дериватизированными антителами против Gal3. Хотя имелись явные доказательства удаления интрона, эффективность соединения экзонов была меньше, чем в реакции, проводимой в отсутствие шариков (сравните полосу 6 с полосой 1 на рисунке 2C). В наших бесклеточных сплайсинговых анализах примерно 30% радиоактивности в субстрате премрнК обычно превращается в лигированные экзоны. Этот недостаток в лигировании экзонов может быть обусловлен: а) некоторым менее оптимальным количеством критического компонента либо в U1ΔNE (рисунок 1A), либо в комплексе Gal3 - U1 snRNP (рисунок 1B); или (b) некоторые структурные ограничения (например, трудности с прохождением конформационного изменения) SnRNP Gal3 - U1, иммобилизованных на бусинах против Gal3 во время реакции сращивания (рисунок 1C).

Другие исследователи сообщили об использовании твердофазного иммуноотбора для улавливания специфических комплексов и документирования каталитической активности или некоторого упорядоченного прогрессирования сплайсеосомных структур. Например, Chiu et al. показали, что добавление фактора сплайсинга дрожжей Cwc25 может преследовать субстрат пре-мРНК на захваченной антителами собранной сплайсеосоме в первую каталитическую реакцию, давая промежуточные продукты, экзон 1 и лариат-экзон227. В той же дрожжевой системе Krishnan et al. использовали белковую А-метку для иммобилизации через биотинилированный-IgG очищенный комплекс сплайсеосом Bact для магнитных шариков, покрытых стрептавидином, в биофизическом исследовании ремоделирования премрнК (расстояние между 5'-ным местом сращивания и точкой ветвления) до первого этапа сращивания28. Наша настоящая статья расширяет эти более ранние исследования с точки зрения завершения обеих стадий реакции сплайсинга и, следовательно, может иметь значение технического характера: этот же набор процедур может быть применен к любому количеству других факторов сплайсинга, которые связаны с snRNP, чтобы изучить, когда и как эти факторы влияют на сплайсеосомальные комплексы. Способность контролировать образование продукта мРНК в результате реакции сплайсинга является убедительным доказательством того, что эти собранные сплайсеосомы действительно функциональны. Это может способствовать нашему пониманию того, как формируются сплайсеосомы, поскольку предыдущие отчеты с использованием протеомных подходов17 каталогизируют только наличие некоторых факторов в данном комплексе, а не то, как факторы могли быть загружены в комплекс.

Явным ограничением общей применимости этих процедур к другим белкам или snRNP для оценки их роли в сплайсинге является наличие специфического антитела, направленного против конкретного фактора, который будет эффективно ускорять его ассоциированный комплекс. Например, поликлональные анти-Gal3 антисферы из ряда кроликов (например, #24, #49) иммунопреципитировали комплекс Gal3-U1 snRNP из ядерного экстракта или глицериновых фракций 3-5 (белки U1 snRNA и U1 70K, осажденные совместно с родственным антигеном Gal3). Напротив, два коммерчески доступных моноклональных антитела, направленных против Gal3, Mac-2 и NCL-GAL3, не дали одинаковых результатов. Эпитопы Mac-2 и NCL-GAL3 были сопоставлены с аминотерминальным доменом полипептида Gal329 , и возможно, что их соответствующие эпитопы недоступны в комплексе Gal3-U1 snRNP. Кроме того, связанный с антителами фактор (например, Gal3) и связанный с ним комплекс (например, U1 snRNP) могут больше не иметь возможности образовывать дополнительные взаимодействия с пре-мРНК или другими сплайсеосомальными компонентами. Это может быть связано с физическим вмешательством антитела или матрицы, с которой антитело ковалентно связано. Поэтому каждая интересующая система должна оцениваться в каждом конкретном случае. Однако, несмотря на эти ограничения, представляется, что схема использования комплексов, аффинных или иммуно-выбранных на шариках, для восстановления сплайсинговой активности в экстрактах, лишенных определенного фактора сплайсинга, может быть в целом применима к другим системам.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана грантом Национального научного фонда MCB-0092919 и грантом Мичиганского государственного университета 09-CDFP-2001 (для RJP) и грантом Национальных институтов здравоохранения GM-38740 и Мичиганским agBioResearch Project MICL02455 (для JLW).

Субстрат MINX пре-мРНК, используемый в анализах сплайсинга, был добрым подарком от доктора Сьюзан Бергет (Медицинский колледж Бейлора, Хьюстон, Техас, США).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

Tags

Биохимия выпуск 166 сплайсинг премрнК сплайсеосома бесклеточный анализ сплайсинга фракционирование градиента глицерина комплекс U1 snRNP галектины
Комплементация сплайсинговой активности комплексом Галектин-3 - U1 snRNP на бусинах
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Voss, P. G., Haudek, K. C.,… More

Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter