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Biochemistry

Complémentation de l’activité d’épissage par un complexe Galectin-3 - U1 snRNP sur perles

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

Cet article décrit les procédures expérimentales pour (a) l’épuisement du PNSNS U1 à partir d’extraits nucléaires, avec perte concomitante de l’activité d’épissage; et b) reconstitution de l’activité d’épissage dans l’extrait appauvri en U1 par des particules de galectine-3 -U1 snRNP liées à des billes couplées de manière covalente à des anticorps anti-galectine-3.

Abstract

Les expériences classiques d’épuisement-reconstitution indiquent que la galectine-3 est un facteur d’épissage requis dans les extraits nucléaires. Le mécanisme d’incorporation de la galectine-3 dans la voie d’épissage est abordé dans cet article. La sédimentation d’extraits nucléaires de cellules HeLa sur des gradients de glycérol de 12% à 32% donne des fractions enrichies en une particule endogène ~10S qui contient de la galectine-3 et du snRNP U1. Nous décrivons maintenant un protocole visant à épuiser les extraits nucléaires de SnRNP U1 avec perte concomitante d’activité d’épissage. L’activité d’épissage dans l’extrait appauvri en U1 peut être reconstituée par la particule de galectine-3 - U1 snRNP piégée sur des billes d’agarose couplées de manière covalente à des anticorps anti-galectine-3. Les résultats indiquent que le complexe ternaire pré-ARNm galectine-3 - U1 snRNP - est un complexe fonctionnel E conduisant à des intermédiaires et des produits de la réaction d’épissage et que la galectine-3 pénètre dans la voie d’épissage par son association avec U1 snRNP. Le schéma consistant à utiliser des complexes d’affinité ou d’immuno-sélection sur des billes pour reconstituer l’activité d’épissage dans des extraits appauvris d’un facteur d’épissage spécifique peut être généralement applicable à d’autres systèmes.

Introduction

La production de la plupart des ARN messagers eucaryotes (ARNm) implique l’élimination des introns et la ligature des exons dans un processus nucléaire appelé épissage pré-ARNm1. Deux classes de complexes ARN-protéine (RNP) dirigent le traitement de l’ARN pré-messager en ARNm mature via des complexes splicéosomiques. Une classe, les RNP pré-messagers naissants, est formée co-transcriptionnellement par la liaison de protéines RNP nucléaires hétérogènes et d’autres protéines de liaison à l’ARN, y compris certains membres de la famille SR, produisant des complexes hnRNP2. Les petits RNP nucléaires de deuxième classe, riches en uraciles (SNNP U avec des SNRNA U1, U2, U4, U5 et U6) sont associés à des protéines spécifiques à l’U et au noyau3,4. Les SNNP U interagissent de manière ordonnée avec des régions spécifiques des RNP pré-messagers dans une voie de remodelage dynamique à mesure que les introns sont excisés et que les exons sont ligaturés pour produire des ARNm matures5. De nombreuses protéines nucléaires supplémentaires participent à ces événements de traitement6.

La galectine-1 (Gal1) et la galectine-3 (Gal3) sont deux protéines qui sont des facteurs requis dans la voie d’épissage, comme le montrent les études d’épuisement-reconstitution7,8. L’élimination des deux galectines de l’épissage d’extraits nucléaires compétents (NE) abolit l’assemblage et l’épissage des épissages à un stade précoce. L’ajout de l’une ou l’autre galectine à un NE doublement appauvri restaure les deux activités. Gal1 et Gal3 sont des composants des spliceosomes actifs, comme en témoigne l’immunoprécipitation spécifique du pré-ARNm, des intermédiaires d’épissage et de l’ARNm mature par antisérum spécifique pour Gal1 ou Gal39. Il est important de noter que Gal3 s’associe à des particules endogènes contenant de l’ARN U dans le NE en dehors de la voie d’épissage, comme le montre la précipitation des snRNP par l’antisérum anti-Gal310. Enfin, le silence de Gal3 dans les cellules HeLa modifie les schémas d’épissage de nombreux gènes11.

Dans le NE pré-incubé pour désassembler les spliceosomes préformés12, les snRNP se retrouvent dans de multiples complexes sédimentant dans des gradients de glycérol de 7S à plus de 60S. Bien que le fractionnement du gradient de glycérol soit une technique courante pour l’isolement des complexes et composants splicéosomiques (voir références13,14,15 par exemple), nous avons étendu cette méthode en caractérisant des fractions spécifiques à l’aide d’immunoprécipitations d’anticorps. Un snRNP sédimentant à 10S ne contient que de l’ARNS U1 avec Gal3. L’immunoprécipitation de la fraction 10S avec des antisérums spécifiques pour Gal3 ou U1 snRNP co-précipite à la fois U1 et Gal3 indiquant que certaines des monoparticules SnRNP U1 sont liées à Gal310. Comme U1 snRNP est le premier complexe qui se lie au pré-mRNP dans l’assemblage splicéosomal1,5, cette étape représente un site d’entrée potentiel pour Gal3 dans la voie d’épissage. Sur cette base, nous avons montré que les monoparticules de snRNP 10S Gal3-U1 liées à des perles contenant des anti-Gal3 ont restauré l’activité d’épissage à un NE appauvri en U1 snRNP, établissant ce complexe comme un mécanisme par lequel Gal3 est recruté dans la voie splicéosomale16. Cela contraste avec les tentatives d’isoler les spliceosomes à des stades spécifiques de la réaction d’épissage et de catalogage des facteurs associés17,18. Dans de telles études, la présence de certains facteurs à un moment donné est déterminée, mais pas le mécanisme par lequel ils ont été chargés.

Nous avions précédemment décrit en détail la préparation du NE, le substrat d’épissage, l’assemblage du mélange réactionnel d’épissage et l’analyse des produits dans notre documentation sur le rôle des galectines dans l’épissage pré-ARNm19. Nous décrivons maintenant les procédures expérimentales de fractionnement d’extraits nucléaires pour obtenir une fraction enrichie en complexe snRNP Gal3 - U1 et pour l’immuno-sélection de ce dernier complexe afin de reconstituer l’activité d’épissage dans un extrait nucléaire appauvri en U1.

Figure 1
Figure 1 : Schéma illustrant la complémentarité de l’activité d’épissage dans l’extrait nucléaire appauvri en U1 snRNP par un complexe snRNP Gal3-U1 sur des billes. (A) NE dans le tampon C (NE(C)) est incubé avec des billes de protéine A-sépharose couplées de manière covalente avec des billes anti-U1 snRNP (αU1). La fraction non liée est appauvrie en U1 snRNP (U1ΔNE). (B) LE NE dans le tampon D (NE(D)) est fractionné sur un gradient de glycérol de 12 % à 32 % par ultracentrifugation. Les fractions correspondant à la région 10S (fractions 3-5) sont combinées et mélangées avec des billes couplées de manière covalente avec des anticorps anti-Gal3 (billes αGal3). Le matériau lié aux perles contient une monoparticule Gal3-U1 snRNP. (C) Le complexe snRNP Gal3-U1 de la partie (B) est mélangé avec U1ΔNE de la partie (A) dans un essai d’épissage utilisant un substrat pré-ARNm MINX marqué 32P et les intermédiaires et produits de la réaction d’épissage sont analysés par électrophorèse sur gel et autoradiographie. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocol

1. Notes sur les procédures générales

  1. S’assurer que tous les produits chimiques (composants tampons, enzymes, etc.) sont exempts de ribonucléase (RNase). Séquestrer tous les flacons de réactif achetés dans le commerce à partir d’une utilisation générale en laboratoire. Portez des gants pour toutes les étapes de la procédure expérimentale. N’utilisez que de la verrerie et des ustensiles cuits au four (voir l’étape 1.2 ci-dessous) et des solutions prétraitées (voir l’étape 1.3 ci-dessous).
  2. Cuire toute la verrerie (béchers, flacons, bouteilles, pipettes, etc.) pendant au moins 4 h à 177 °C. Envelopper les autres ustensiles (spatules, agitateurs, etc.) dans du papier d’aluminium avant de cuire dans les mêmes conditions.
  3. Préparer une solution à 0,1 % (vol/vol) de diéthylpyrocarbonate (DEPC) dans de l’eau double distillée (ddH2O). À l’aide d’une barre d’agitation magnétique, remuez cette solution pendant la nuit, puis autoclavez. Utilisez ce H2O traité au DEPC pour fabriquer toutes les solutions contenant du Tris; ensuite, filtrer stériliser à l’aide d’un filtre à vide à bouchon de bouteille. Utilisez régulièrement du ddH2O pour préparer toutes les autres solutions (sans Tris); ensuite, traiter avec du DEPC (0,1%, vol/vol) et un autoclave.
    REMARQUE : Les tampons utilisés dans l’ensemble suivant de procédures expérimentales sont énumérés par ordre alphabétique dans le tableau 1.
Nom de la mémoire tampon Composition
Tampon de borate Borate de sodium 0,2 M, pH 9
Tampon C 20 mM HEPES, pH 7,9, 25 % (vol/vol) de glycérol, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle (PMSF), 0,5 mM de dithiothréitol (TNT)
Tampon D 10 mM HEPES, pH 7,9, 20 % (vol/vol) de glycérol, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM TNT
60 %D 60% De tampon D et 40% de H2O
Éthanolamine 0,2 M éthanolamine, pH 8
Tampon de liaison HEPES 20 mM HEPES, pH 7,9
Tampon de lavage HEPES 20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
Tampon de chargement d’ARN Formamide à 90 %, EDTA à 20 mM, pH 8, 0,05 % (p/v) de bleu de bromophénol
Tampon SDS-PAGE 25 mM de Tris, 169 mM de glycine, 0,1 % de dodécylsulfate de sodium (FDS), pH 8,8
Exemple de tampon SDS 62,5 mM Tris, pH 6,8, 2 % SDS, 10 % glycérol, 5 % 2-mercaptoéthanol, 0,1 % (p/v) de bleu de bromophénol
Tampon TBE pour gels d’ARN 89 mM Tris, 89 mM d’acide borique, 2,5 mM d’EDTA, pH 8,3
Tampon TE 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Tampon de transfert 25 mM de Tris, 1,92 M de glycine, 20 % de méthanol, pH 8,3
Tampon T-TBS 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05 % Tween 20, pH 7,5
Tampon de lavage TX 0,05 % Triton X-100 (TX) en 60 %D

Tableau 1 : Nom et composition des tampons

2. Préparation du NE appauvri en U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Préparation de billes anti-U1 pour l’immunoadsorption
    1. Pré-gonfler 50 mg de perles de protéine A-sépharose CL-4B en excès de H2O traité par DEPC pour produire environ 200 μL de billes gonflées, puis laver dans un tampon de lavage HEPES.
    2. Pour ce lavage et tous les lavages ultérieurs, abreuver les billes par centrifugation (1 000 x g dans un rotor de godet oscillant à 4 °C pendant 10-15 s) et retirer le lavage non lié à l’aide d’un micropipetteur et jeter.
    3. Mélanger 150 μL de billes lavées avec 150 μL de sérum auto-immun humain spécifique pour U1 snRNP (volume d’anticorps par rapport au volume de perles dans un rapport de 1:1).
    4. Ajuster, sur la base du volume total de (~300 μL à partir de l’étape 2.1.3 ci-dessus), le mélange à 20 mM HEPES, pH 7,9, correspondant aux conditions du tampon de liaison HEPES; incuber ce mélange avec un balancement continu à température ambiante pendant 60 min.
    5. Laver les billes liées avec des anticorps avec 1 mL de tampon de borate (0,2 M de borate de sodium, pH 9) et remettre en suspension dans 1 mL du même tampon de borate.
    6. Pour coupler de manière covalente l’anticorps lié aux billes de protéine A-sépharose, ajouter le diméthylpimélimidate à une concentration finale de 20 mM et incuber à température ambiante avec un basculement pendant 60 min.
    7. Laver les billes avec 1 mL de tampon de borate.
    8. Pour bloquer tout réactif de réticulation non réagi, ajouter 1 mL d’éthanolamine de 0,2 M (pH 8) et incuber à température ambiante avec bascule pendant 60 min.
    9. Laver les billes couplées aux anticorps, ci-après désignées comme perles anti-U1, deux fois avec 0,5 mL de tampon de lavage TX (0,05 % triton X-100 dans 60 % D).
  2. Épuisement du PNNSN SNN U1 du NE (voir figure 1A)
    REMARQUE: La procédure de préparation du NE à partir de cellules HeLa a été initialement développée par Dignam et al.20. Nous avons décrit les matériaux et les méthodes détaillées de préparation du NE pour les essais d’épissage19 (voir les étapes 2.1 et 3.1 de cette référence). NE, tel que préparé initialement, est dans le tampon C et sera désigné ci-après comme NE(C). NE(C) dialysé contre et équilibré avec le tampon D sera désigné comme NE(D).
    1. Incuber 200 μL de NE(C) avec 100 μL de billes anti-U1 de l’étape 2.1.9 ci-dessus.
    2. Ajouter 5 μL de RNasin au mélange.
    3. Faire pivoter le microtube tête-dessus queue à 4 °C pendant 1 h.
    4. Pastuler le mélange par centrifugation (1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10-15 s) et recueillir le matériau non lié (U1ΔNE) à l’aide d’une seringue Hamilton.
    5. Dialysez le volume entier d’U1ΔNE, ainsi qu’une aliquote séparée de 50 μL du NE(C) non épuisé d’origine, dans des compartiments séparés d’un microdialyseur, sous agitation, pendant 75 min contre 60% D à l’aide d’une membrane de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 8 K.
    6. Immédiatement après la dialyse, diviser ces préparations (U1ΔNE et NE dans 60% D) en aliquotes de 20 μL; puis congeler dans un bain de glace carbonique/éthanol et conserver à -80 °C.
  3. Analyse de la teneur en ARN et en protéines de l’U1ΔNE et du matériel lié sur les billes anti-U1
    1. Après le retrait du matériau non lié (U1ΔNE) (étape 2.2.4), lavez le matériau lié aux billes anti-U1 en ajoutant 0,5 mL de tampon de lavage TX. Mettez le mélange en granulés par centrifugation (1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10 à 15 s) et retirez le surnageant à l’aide d’un micropipetteur et jetez-le.
    2. Répétez deux fois les étapes de lavage 2.3.1.
    3. Retirez le matériau lié aux billes anti-U1 en ajoutant 100 μL de tampon d’échantillon SDS 2x à 100 μL des billes et en incubant pendant 10 min à température ambiante.
    4. Pastillez le mélange par centrifugation (1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10-15 s); retirer le surnageant à l’aide de la seringue Hamilton et le congeler dans un bain de glace carbonique et d’éthanol. Conserver à -80 °C.
    5. Comparez le NE non épuisé, le NE appauvri (U1ΔNE) et le matériau lié aux billes (retiré des billes par le tampon d’échantillon SDS comme décrit aux étapes 2.3.3 et 2.3.4 ci-dessus). Suivez les étapes 2.3.6 à 2.3.8 pour l’analyse de l’ARN ou les étapes 2.3.9 à 2.3.10 pour l’analyse des protéines.
    6. Pour chaque échantillon, extraire l’ARN avec 200 μL de phénol-chloroforme (50:50, v/v); puis extraire à nouveau avec 180 μL d’alcool chloroforme-isoamylique (25:1, v/v). Après l’extraction, ajouter 300 μL d’éthanol froid résistant à 200, inverser pour mélanger et conserver l’ARN précipité pendant la nuit à -20 °C.
    7. Centrifuger l’ARN précipité à l’éthanol (12 000 x g pendant 10 min à 4 °C). Laver les granulés avec 150 μL d’éthanol froid à 70 %. Centrifuger à nouveau (12 000 x g) à 4 °C pendant 15 min. Retirez le surnageant à l’aide d’un micropipeteur et séchez les granulés dans un aspirateur de vitesse pendant 10 à 15 minutes sans chaleur.
    8. Remettre en suspension la pastille d’ARN séchée dans 10 μL de tampon de chargement d’ARN, tourbillonner doucement, chauffer à 75-85 °C pendant 90 s, puis incuber sur de la glace pendant 2 min. Séparer les SNRNA par électrophorèse sur gel (2 h à 16 mA) à l’aide de gels d’urée à 13 % de polyacrylamide - 8,3 M, puis soit les tacher avec du bromure d’éthidium, soit les soumettre à un bâchage nordique10,16.
    9. Chargez les échantillons de protéines, dans le tampon d’échantillon SDS de l’étape 2.3.5, sur des gels de polyacrylamide à 12,5% et de l’électrophorèse à 200 V pendant environ 45 à 50 minutes dans un tampon SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium).
    10. Transférer les protéines séparées dans la membrane de nitrocellulose à 400 mA pendant 2 h dans un tampon de transfert. Après le transfert, bloquez la membrane en incubant pendant la nuit dans du T-TBS contenant 10% de lait sec non gras. Ensuite, immunoblotez la membrane pour révéler des protéines spécifiques8,21.

3. Immunoprécipitation de fractions 10S de gradients de glycérol par anti-Gal3

  1. Préparation de billes anti-Gal3 pour l’immunoadsorption
    NOTE: La dérivation et la caractérisation de l’antisérum polyclonal de lapin contre Gal3 pour le lapin #2421 et pour le lapin #4910 ont été décrites précédemment.
    1. Utilisez le sérum préimmun du lapin #49 comme témoin.
    2. Pour la préparation des billes anti-Gal3, suivez la procédure décrite précédemment pour la préparation des perles anti-U1 (étape 2.1), à l’exception que correspondant à l’étape 2.1.3, le rapport entre l’antisérum (par exemple, anti-Gal3, #49) et les perles est de 3:1.
    3. Juste avant utilisation, laver les billes couplées aux anticorps, ci-après désignées comme perles anti-Gal3, deux fois avec 0,5 mL de tampon de lavage TX. Retirez le surnageant, d’abord avec un micropipeteur pour extraire la majeure partie du liquide, puis avec une seringue Hamilton pour extraire le liquide des perles; jeter.
  2. Immunoprécipitaton des fractions du gradient glycérol par anti-Gal3 (voir Figure 1B)
    1. Fractionner NE(D) sur un gradient de glycérol de 12 % à 32 %10. Combinez et mélangez les fractions de gradient de glycérol 3, 4 et 5 (numérotées à partir du haut du gradient), qui sont proches de la région 10S du gradient.
    2. Préparer deux échantillons, chacun avec 150 μL aliquote de fractions de gradient combinées 3-5 (étape 3.2.1), et placer dans 50 μL de billes anti-Gal3.
    3. En parallèle, préparer deux échantillons contenant chacun 150 μL de fraction 1 (contenant Du Gal3 non en complexe avec U1 snRNP10 ; étape 3.2.1) et placer dans 50 μL de billes anti-Gal3.
    4. Comme témoin, placer 150 μL de 60% D dans un autre microtube de 50 μL de billes anti-Gal3.
    5. Mélanger doucement en tapotant le tube, puis faire pivoter le microtube tête-dessus queue à 4°C pendant 1 h.
    6. Pastillez le mélange par centrifugation douce (1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10-15 s).
    7. Retirez le surnageant (matériau non lié) à l’aide d’une seringue Hamilton. Ne pas laver les billes et utiliser immédiatement pour l’ajout des réactions d’épissage (rubrique 4.2).
  3. Analyse de la teneur en ARN et en protéines dans le matériau non lié et lié à partir de la précipitation anti-Gal3 des fractions de gradient 10S
    1. Pour l’analyse des composants du matériau lié et non lié à partir de la précipitation anti-Gal3 des fractions de gradient 10S, recueillir le matériau non lié (surnageant après l’étape 3.2.6), le transférer dans un microtube frais et congeler à -20 °C.
    2. Laver les billes précipitées de l’étape 3.2.6 (contenant un matériau lié à l’anti-Gal3) en ajoutant 0,5 mL de tampon de lavage TX.
    3. Pastillez le mélange par centrifugation douce (1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10-15 s); retirer le surnageant à l’aide d’un micropipetteur et jeter. Répétez les étapes de lavage deux fois de plus.
    4. Ajouter 50 μL de tampon d’échantillon SDS 2X aux billes anti-Gal3 lavées et granulées.
    5. Mélanger doucement les perles et incuber pendant 10 min à température ambiante.
    6. Pastuler le mélange par centrifugation douce (1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10-15 s), recueillir le surnageant par seringue Hamilton et le conserver dans un microtube frais à -20 °C.
    7. Comparer le matériau non lié (section 3.3.1) et le matériau lié (étape 3.3.6) de la précipitation anti-Gal3 en termes d’ARN et de composants protéiques, en utilisant les procédures décrites à l’étape 2.3.6. à 2.3.10, respectivement.

4. Assemblage de la réaction d’épissage et analyse des produits

  1. Préparation du substrat d’épissage
    REMARQUE: Le substrat pré-ARNm, désigné MINX, contient deux séquences d’exons et une séquence d’introns d’Adénovirus22. La séquence d’ADN MINX dans le plasmide est sous le contrôle de promoteurs de l’ARN polymérase T3, T7 ou SP6. Les matériaux et les méthodes détaillées pour la linéarisation de l’ADN plasmidique MINX avec l’endonucléase de restriction BamHI, la transcription par l’ARN polymérase SP6 en présence de α-32P [GTP] et la purification du MINX marqué 32P pour les essais d’épissage sont décrits précédemment19 (voir les étapes 2.2 et 3.2 de cette référence).
    1. Conserver le MINX radiomarqué sous forme de précipité d’éthanol à -20 °C; utiliser le substrat d’épissage étiqueté dans les 4 à 6 semaines suivant la transcription.
    2. Juste avant utilisation, centrifuger l’éthanol précipité MINX marqué 32P à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C; retirer le surnageant à l’aide d’un micropipetteur et jeter.
    3. Ajouter 150 μL d’éthanol à 70 % et centrifuger à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Jetez le surnageant et séchez la pastille dans un aspirateur de vitesse sans chaleur pendant 15 min.
    4. Réhydrater la pastille dans 50 μL d’eau DEPC. Spot 2 μL sur chacun des deux filtres GF/C; immerger les filtres dans de l’acide trichloroacétique (TCA) froid à 5% pendant 10 min. Rincer à froid 5% de TCA, suivi d’éthanol à 180 épreuves sur une fiole sous vide. Sécher les filtres à l’air libre et les soumettre à la scintillation en 4 mL de Safety-Solve.
    5. Diluer le MINX marqué au 32P dans 60 % D à 104 cpm/μL pour le dosage d’épissage.
  2. Assemblage de la réaction d’épissage (voir Figure 1C)
    1. Assembler, sur glace, les réactions d’épissage dans un volume total de 24 μL (8 μL U1ΔNE (à partir de l’étape 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM de phosphate de créatine, 0,5 mM DTT, 20 unités RNasin, 4 μL de substrat d’épissage MINX marqué 32P (104 cpm/μL), 60 % D) et ajouter à chaque tube de billes de la section 3.2.7. Assembler un ensemble identique de réactions d’épissage dans un volume total de 24 μL mais sans U1ΔNE et ajouter à chaque tube des billes de l’étape 3.2.7.
    2. Préparer une réaction d’épissage témoin dans un volume total de 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM de phosphate de créatine, 0,5 mM de TNT, 20 unités de RNasin, substrat d’épissage MINX marqué 2 μL 32P (104 cpm/μL), 60 % D).
    3. Mélanger doucement les tubes en tapotant et faire pivoter l’extrémité sur la queue à 30°C pendant 90 min. Pastillez le mélange par centrifugation douce à 1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10-15 s.
    4. Arrêtez la réaction et éliminez les protéines des billes en ajoutant 24 μL de tampon d’échantillon SDS 2x aux tubes contenant des billes, et 12 μL de tampon d’échantillon SDS 2x au tube témoin contenant NE mais pas de perles. Chauffer les tubes à 100 °C pendant 7 min.
    5. Centrifugez doucement les tubes à 1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10 à 15 s.
    6. Transférer les surnageants (élutions) dans des microtubes frais : environ 48 μL des tubes de billes et 24 μL du tube de contrôle NE.
    7. Ajouter la protéinase K (20 mg/mL) pour digérer et solubiliser les protéines : ajouter 5 μL à l’élution de 48 μL des billes et ajouter 2,5 μL au témoin NE de 24 μL.
    8. Incuber les tubes à 37°C pendant 40 min.
    9. Centrifugez doucement les tubes à 1 000 x g dans un rotor à godet oscillant à 4 °C pendant 10 s.
    10. Diluer les élutions des billes avec 39,5 μL TE et 10 μL 3 M d’acétate de sodium. Diluer le témoin NE avec 63,5 μL TE et 10 μL 3 M d’acétate de sodium.
    11. Extraire et analyser l’ARN comme décrit ci-dessous (rubrique 4.3).
  3. Analyse des produits de la réaction d’épissage
    1. Extraire les ARN de chaque échantillon avec du phénol-chloroforme, suivi d’alcool chloroforme-isoamylique; précipiter les ARN avec de l’éthanol, centrifuger, laver les granulés, retirer le surnageant et sécher les granulés selon la même procédure que celle décrite aux étapes 2.3.6 et 2.3.7.
    2. Remettre en suspension la pastille d’ARN séchée dans 10 μL de tampon de chargement d’ARN, tourbillonner doucement, chauffer à 75-85 °C pendant 90 s, puis incuber sur de la glace pendant 2 min.
    3. Préparer 20 mL d’une solution contenant 13 % de polyacrylamide (bisacrylamide:acrylamide, 1,9:50 [wt/wt]) dans 8,3 M d’urée; gels coulés de 15 cm de longueur en utilisant cette solution.
    4. Une fois le gel coulé, électrophorèsez-le (sans aucun échantillon chargé) à 400 V pendant 20 min en utilisant TBE comme tampon de fonctionnement. Après cette étape, lavez les puits avec un tampon de fonctionnement TBE.
    5. Chargez les échantillons d’ARN, dans un tampon de chargement d’ARN, et électrophorèse avec tampon de fonctionnement TBE à 400 V pendant 3,5 à 4 h. Après électrophorèse, retirer l’urée en immergeant et en faisant pivoter le gel dans de l’eau distillée pendant 10 min.
    6. Sécher le gel sous vide sur du papier filtre 3 M, d’abord pendant 2 h 15 min à 80 °C puis pendant 30 min sans chaleur pour le refroidir lentement. Soumettre le gel séché à une autoradiographie sur film pour détecter les positions de migration des composants radioactifs.

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Representative Results

L’épuisement ne-ne des complexes U1 snRNP (U1ΔNE de la section 2.2.6) et Gal3 - U1 snRNP de la région 10S du gradient glycérol immunoprécipité par anti-Gal3 (étape 3.2.7) a été mélangé dans une réaction d’épissage. Ce mélange réactionnel contenait de l’ARNN U1 (figure 2A, voie 3), ainsi que la protéine spécifique U1, U1-70K (figure 2B, voie 3). Comme prévu, l’anti-Gal3 a précipité Gal3 (Figure 2B, voie 3). Ces composants (ARNn U1, protéine U1-70K et Gal3) n’ont pas été trouvés dans les précipitations de contrôle pré-immunitaire (IP) (Figure 2A, Figure 2B, voie 2). Par rapport à un NE non épuisé effectué comme témoin positif (Figure 2C, voie 1), U1ΔNE n’a pas présenté d’activité d’épissage (Figure 2C, voie 2). L’activité d’épissage dans l’U1ΔNE pourrait être reconstituée par le complexe snRNP Gal3 - U1 lié aux billes (Figure 2C, voie 6). Les deux produits de la réaction d’épissage, les exons ligaturés et le lariat intron excisé (mis en évidence par des flèches à droite), ainsi que les intermédiaires, l’exon 1 et l’exon 2 du lariat, ont été trouvés. Les composants des fractions 3 à 5 ont été essentiels pour restaurer l’épissage en U1ΔNE. Lorsque les fractions 3 à 5 ont été remplacées par un tampon seul (60 % D) dans l’immunoprécipitation, aucune activité d’épissage n’a pu être observée lors du mélange avec de l’U1ΔNE (Figure 2C, voie 2), ce qui indique que les billes anti-Gal3 n’étaient pas responsables de la restauration de l’activité d’épissage dans cette dernière. De manière plus convaincante, lorsque les fractions 3 à 5 ont été remplacées par la fraction 1 dans la procédure d’immunoprécipitation, puis ajoutées à U1ΔNE, aucun intermédiaire ou produit de la réaction d’épissage n’a été trouvé (Figure 2C, voie 4). Une analyse antérieure avait documenté que le Gal3 en fraction 1 représentait une protéine Gal3 libre, non associée à un complexe RNP10 et que le transfert nord du matériau immunoprécipité à partir de la fraction 1 n’a révélé aucun SNNA U116. Enfin, les immunoprécipités de la fraction 1 et des fractions 3 à 5 n’ont pas présenté d’activité d’épissage lorsqu’ils ont été dosés en l’absence d’U1ΔNE (figure 2C, voies 3 et 5, respectivement).

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentatifs des compositions d’ARN et de polypeptides du précipité anti-Gal3 de la région 10S du gradient glycérol et de sa capacité à reconstituer l’épissage dans l’extrait nucléaire appauvri en U1 snRNP (U1ΔNE). (A) Analyse par transfert de Northern de l’ARNNc U1 lié à des perles couplées à du sérum pré-immunitaire (PI; voie 2) ou à des perles couplées à des anti-Gal3 (αGal3; voie 3). La voie 1 représente 20 % de la quantité de fractions combinées du gradient glycérol soumises à l’immunoprécipitation. La voie 2 et la voie 3 représentent chacune 25 % du matériau lié élué à partir des perles respectives. (B) Analyse par transfert western de polypeptides liés à des billes couplés à du sérum pré-immunitaire (voie 2) ou anti-Gal3 (voie 3). Les identités protéiques sont indiquées à droite. La voie 1 représente 20 % de la quantité de fractions combinées du gradient glycérol soumises à l’immunoprécipitation. La voie 2 et la voie 3 représentent chacune 75 % du matériau lié élué à partir des perles respectives. (C) Analyse de la capacité à restaurer l’activité d’épissage à U1ΔNE par les immunoprécipités anti-Gal3 (αGal3) de la fraction 1 du gradient glycérol (Fr 1), des fractions 3-5 (Fr 3-5) ou du tampon D à 60% (60% D). Le signe + ou - au-dessus de la ligne continue en gras indique la présence ou l’absence de chacun de ces précipités dans le mélange réactionnel d’épissage. Le signe + ou - sous la ligne continue en gras indique la présence ou l’absence de U1ΔNE (ou NE dans la mémoire tampon D). Voie 1 : 4 μL NE dans un essai d’épissage de 12 μL, dont 100 % ont été soumis à une analyse de gel. Pour les voies 2 à 6, le volume total du test d’épissage était de 24 μL, dont 50 % ont été soumis à une analyse de gel. Voie 2: 8 μL U1ΔNE plus perles de précipitations de 60% D. Voie 3: perles de précipitations de Fr 1. Voie 4 : 8 μL U1ΔNE plus perles provenant des précipitations de Fr 1. Voie 5: perles de précipitations de Fr 3-5. Voie 6: 8 μL U1ΔNE plus perles de précipitations de Fr 3-5. Les positions de migration du substrat pré-ARNm, des intermédiaires et des produits (lariat intron et exons ligaturés, mis en évidence par des flèches) sont indiquées à droite. Les données du panel C sont dérivées de la même expérience que celle illustrée dans le panneau A, figure 2 de Haudek et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les résultats présentés à la figure 2 ont été obtenus avec de l’anti-Gal3 (#49). Les mêmes résultats ont pu être observés avec un autre anti-Gal3 (#24) mais le sérum pré-immunitaire du lapin #49 n’a pas réussi à reconstituer l’épissage en U1ΔNE après incubation avec des fractions 3-516. Tous ces résultats suggèrent fortement que le substrat pré-ARNm peut se lier à la particule 10S Gal3 - U1 snRNP immobilisée sur les perles et que le complexe ternaire est fonctionnel dans la voie d’épissage.

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Discussion

Ce rapport fournit les détails expérimentaux qui documentent un complexe snRNP Gal3 - U1 piégé sur des billes enrobées anti-Gal3 peut se lier au substrat pré-ARNm et ce complexe ternaire peut restaurer l’activité d’épissage à un NE appauvri en U1 snRNP. Gal3 est un membre d’une famille de protéines isolées à l’origine sur la base de son activité de liaison aux glucides spécifiques au galactose23 . Les premières études d’immunofluorescence et de fractionnement subcellulaire ont fourni l’indice initial d’une association de Gal3 avec des composants de la machinerie d’épissage : colocalisation dans les taches nucléaires avec des polypeptides à noyau Sm de snRNPs et la famille de facteurs d’épices riches en sérine et en arginine (SR)24,25 et sédimentation sur des gradients de sulfate de césium à une densité (1,3-1,35 g/mL) correspondant à celles de hnRNP et snRNP24 . Des expériences ultérieures d’épuisement-reconstitution, à leur tour, ont montré que Gal3 (ainsi qu’un autre membre de la famille des galectines, la galectine-1 (Gal1)) étaient nécessaires, mais redondants, des facteurs dans les essais d’épissage sans cellules7,8.

Lorsque l’ON est fractionné sur un gradient de glycérol, l’immunoprécipitation des fractions de gradient avec l’anti-Gal3 a donné des complexes distincts avec des rapports variables de différents ARNn et protéines associées, ce qui suggère que Gal3 est associé à plusieurs snRNP en l’absence de substrat d’épissage pré-ARNm10. En particulier, Gal3 et U1 snRNP sont assemblés en une monoparticule qui sédimente à la région ~10S du gradient (fractions 3-5 d’un gradient de glycérol 12%-32%). Étant donné que la liaison de U1 snRNP au site d’épissure 5' du pré-ARNm représente l’étape initiale de l’assemblage des splicéosomes5,26, il était possible que Gal3 puisse entrer dans la voie d’épissage via son association avec U1 snRNP. Cette notion est étayée par l’observation que Gal3, en tant que partie du complexe 10S Gal3-U1 snRNP, pourrait être associé à un substrat pré-ARNm mais pas à un ARN témoin dépourvu de sites d’épissure, suggérant que la reconnaissance du site d’épissure 5'-splice par U1 snRNP était une condition essentielle à son assemblage en spliceosome. De plus, le prétraitement des fractions contenant la particule Gal3-U1 snRNP avec la nucléase micrococcique a supprimé la charge de Gal3 sur le pré-ARNm10. La question clé est donc de savoir si ce complexe ternaire précoce, composé de Gal3, U1 snRNP et pré-ARNm, représente un complexe fonctionnel E engagé dans la voie d’épissage ou un complexe H sans issue qui ne peut pas entrer dans la voie d’épissage5,26. Nous avons abordé cette question en testant si le snRNP Gal3 - U1 peut reconstituer l’activité d’épissage dans le NE appauvri en U1 snRNP avec une perte concomitante de capacité d’épissage (U1ΔNE). Les résultats de nos expériences, dont le protocole est détaillé dans le présent article, indiquent que Gal3 - U1 snRNP se lie au substrat pré-ARNm pour former un complexe fonctionnel E et que U1 snRNP est nécessaire pour incorporer Gal3 dans la voie d’épissage16.

Deux étapes critiques du protocole expérimental décrit doivent être notées. Tout d’abord, l’étape 3.2.7 appelle à l’élimination du matériau non lié surnageant après précipitation anti-Gal3 des fractions de glycérol. L’élimination complète du liquide des billes d’agarose granulées nécessite que l’extrémité de l’aiguille de la seringue Hamilton soit insérée au fond des perles. Cela doit être fait avec soin afin que les perles n’obstruent pas l’aiguille de la seringue ou ne se perdent pas en adhérant à l’aiguille lorsque celle-ci est retirée du tube. Deuxièmement, il est important que les billes granulées soient utilisées pour l’assemblage des réactions d’épissage avec le moins de retard possible. La coordination de ces deux étapes a été essentielle au succès de la procédure. À cet égard, il convient également de noter que nous avons récemment amélioré la récupération des complexes snRNP Gal3-U1 dans la fraction de granulés en remplaçant les billes de protéine A-sépharose CL-4B par des nanoparticules magnétiques de protéine A dans le couplage covalent de l’anticorps anti-Gal3 aux billes.

La principale conclusion est dérivée d’expériences dans lesquelles U1ΔNE, dépourvu d’activité d’épissage, est complété par la particule 10S Gal3 - U1 snRNP immunoprécipitée par des billes dérivées covalentement avec des anticorps anti-Gal3. Bien qu’il y ait eu des preuves claires de l’élimination de l’intron, l’efficacité de l’assemblage des exons était inférieure à celle observée dans la réaction menée en l’absence de billes (comparez la voie 6 par rapport à la voie 1 à la figure 2C). Dans nos essais d’épissage sans cellules, environ 30% de la radioactivité dans le substrat pré-ARNm est généralement convertie en exons ligaturés. Ce déficit en ligature des exons pourrait être dû à : (a) une certaine quantité moins qu’optimale d’un composant critique, soit dans U1ΔNE (Figure 1A) soit dans le complexe Gal3 - U1 snRNP (Figure 1B) ; ou (b) certaines contraintes structurelles (p. ex., difficulté à subir un changement conformationnel) du snRNP Gal3 - U1 immobilisé sur les billes anti-Gal3 pendant la réaction d’épissage (figure 1C).

D’autres chercheurs ont rapporté l’utilisation de l’immuno-sélection en phase solide pour piéger des complexes spécifiques et documenter l’activité catalytique ou une progression ordonnée des structures splicéosomes. Par exemple, Chiu et al. ont montré que l’ajout du facteur d’épissage de levure Cwc25 peut chasser le substrat pré-ARNm sur un spliceosome assemblé piégé par anticorps dans la première réaction catalytique, donnant les intermédiaires, l’exon 1 et l’exon 227 du lariat. Dans le même système de levure, Krishnan et al. ont utilisé une protéine A-tag pour immobiliser, via des IgG biotinylées, le complexe de spliceosomes Bact purifié en billes magnétiques recouvertes de streptavidine dans une étude biophysique du remodelage pré-ARNm (distance entre le site d’épissure 5'et le point de branchement) avant la première étape d’épissage28. Notre présent article prolonge ces études antérieures en termes d’achèvement des deux étapes de la réaction d’épissage et, par conséquent, peut avoir une signification de nature technique: ces mêmes procédures pourraient être appliquées à un certain nombre d’autres facteurs d’épissage associés aux snRNP pour examiner quand et comment ces facteurs se chargent sur les complexes splicéosoux. La capacité de surveiller la formation de produits d’ARNm à partir de la réaction d’épissage constitue une preuve solide que ces spliceosomes assemblés sont effectivement fonctionnels. Cela peut nous aider à mieux comprendre comment les spliceosomes se forment, car les rapports précédents utilisant des approches protéomiques17 ne cataloguent que la présence de certains facteurs dans un complexe donné plutôt que la façon dont les facteurs peuvent avoir été chargés sur le complexe.

Une limitation claire de l’applicabilité générale de ces procédures à d’autres protéines ou snRNP pour évaluer leur rôle dans l’épissage est la disponibilité d’un anticorps spécifique dirigé contre le facteur particulier qui précipitera efficacement son complexe associé. Par exemple, les antisérums polyclonaux anti-Gal3 d’un certain nombre de lapins (p. ex., #24, #49) ont immunoprécipité le complexe Gal3-U1 snRNP à partir d’extrait nucléaire ou de fractions de glycérol 3-5 (ARNNc U1 et protéine U1 70K co-précipitées avec l’antigène apparenté, Gal3). En revanche, deux anticorps monoclonaux disponibles dans le commerce dirigés contre Gal3, Mac-2 et NCL-GAL3, n’ont pas donné les mêmes résultats. Les épitopes de Mac-2 et NCL-GAL3 ont été mappés au domaine amino-terminal du polypeptide Gal329 et il est possible que leurs épitopes respectifs ne soient pas accessibles dans le complexe snRNP Gal3-U1. De plus, un facteur lié aux anticorps (p. ex., Gal3) et son complexe associé (p. ex., U1 snRNP) peuvent ne plus être en mesure de former des interactions supplémentaires avec le pré-ARNm ou d’autres composants splicéosomiques. Cela peut être dû à une interférence physique de l’anticorps ou de la matrice à laquelle l’anticorps est couplé de manière covalente. Par conséquent, chaque système d’intérêt doit être évalué au cas par cas. Malgré ces limitations, cependant, il semble que le schéma consistant à utiliser des complexes d’affinité ou d’immuno-sélection sur des billes pour reconstituer l’activité d’épissage dans des extraits appauvris d’un facteur d’épissage spécifique puisse être généralement applicable à d’autres systèmes.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la subvention MCB-0092919 de la National Science Foundation et la subvention de recherche intra-muros 09-CDFP-2001 de la Michigan State University (à RJP) et par la subvention GM-38740 des National Institutes of Health et le projet MICL02455 du Michigan AgBioResearch (à JLW).

Le substrat pré-ARNm MINX utilisé dans les essais d’épissage était un cadeau aimable du Dr Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, États-Unis).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

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References

  1. Hoskins, A. A., Moore, M. J. The spliceosome: a flexible, reversible macromolecular machine. Trends In Biochemical Sciences. 37, 179-188 (2012).
  2. Choi, Y. D., Grabowski, P., Sharp, P. A., Dreyfuss, G. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins: role in RNA splicing. Science. 231, 1534-1539 (1986).
  3. Lerner, M., Steitz, J. A. Snurps and scyrps. Cell. 25, 298-300 (1981).
  4. Maniatis, T., Reed, R. The role of small nuclear ribonucleoprotein particles in pre-mRNA splicing. Nature. 325, 673-678 (1987).
  5. Hoskins, A. A., et al. Ordered and dynamic assembly of single spliceosomes. Science. 331, 1289-1295 (2011).
  6. Coppin, L., Leclerc, J., Vincent, A., Porchet, N., Pigny, P. Messenger RNA life-cycle in cancer: emerging role of conventional and non-conventional RNA-binding proteins. International Journal of Molecular Sciences. 19, 650-676 (2018).
  7. Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Identification of galectin-3 as a factor in pre-mRNA splicing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 1213-1217 (1995).
  8. Vyakarnam, A., Dagher, S. F., Wang, J. L., Patterson, R. J. Evidence for a role for galectin-1 in pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 17, 4730-4737 (1997).
  9. Wang, W., Park, J. W., Wang, J. L., Patterson, R. J. Immunoprecipitation of spliceosomal RNAs by antisera to galectin-1 and galectin-3. Nucleic Acids Research. 34, 5166-5174 (2006).
  10. Haudek, K. C., Voss, P. G., Locascio, L. E., Wang, J. L., Patterson, R. J. A mechanism for incorporation of galectin-3 into the spliceosome through its association with U1 snRNP. Biochemistry. 48, 7705-7712 (2009).
  11. Fritsch, K., et al. Galectin-3 interacts with components of the nuclear ribonucleoprotein complex. BMC Cancer. 16, 502-511 (2016).
  12. Conway, G. C., Krainer, A. R., Spector, D. L., Roberts, R. J. Multiple splicing factors are released from endogenous complexes during in vitro pre-mRNA splicing. Molecular and Cellular Biology. 9, 5273-5280 (1989).
  13. Dery, K. J., Yean, S. L., Lin, R. J. Assembly and glycerol gradient isolation of yeast spliceosomes containing transcribed or synthetic U6 snRNA. Methods in Molecular Biology. 488, 41-63 (2008).
  14. Yoshimoto, R., Kataoka, N., Okawa, K., Ohno, M. Isolation and characterization of post-splicing lariat-intron complexes. Nucleic Acids Research. 37, 891-902 (2009).
  15. Malca, H., Shomron, N., Ast, G. The U1 snRNP base pairs with the 5' splice site within a penta-snRNP complex. Molecular and Cellular Biology. 23, 3442-3455 (2003).
  16. Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L., Patterson, R. J. A 10S galectin-3 - snRNP complex assembles into active spliceosomes. Nucleic Acids Research. 44, 6391-6397 (2016).
  17. Rappsilber, J., Ryder, U., Lamond, A. I., Mann, M. Large-scale proteomic analysis of the human spliceosome. Genome Research. 12, 1231-1245 (2002).
  18. Jurica, M. S., Moore, M. J. Capturing splicing complexes to study structure and mechanism. Methods. 28, 336-345 (2002).
  19. Patterson, R. J., Haudek, K. C., Voss, P. G., Wang, J. L. Examination of the role of galectins in pre-mRNA splicing. Methods in Molecular Biology. 1207, 431-449 (2015).
  20. Dignam, J. D., Lebovitz, R. M., Roeder, R. G. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Research. 11, 1475-1489 (1983).
  21. Agarwal, N., Sun, Q., Wang, S. Y., Wang, J. L. Carbohydrate-binding protein 35. I. Properties of the recombinant polypeptide and the individuality of the domains. Journal of Biological Chemistry. 268, 14932 (1993).
  22. Zillmann, M., Zapp, M. I., Berget, S. M. Gel electrophoretic isolation of splicing complexes containing U1 small nuclear ribonucleoprotein particles. Molecular and Cellular Biology. 8, 814-821 (1988).
  23. Barondes, S. H., et al. Galectins: a family of animal β-galactoside-binding proteins. Cell. 76, 597-598 (1994).
  24. Laing, J. G., Wang, J. L. Identification of carbohydrate binding protein 35 in heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex. Biochemistry. 27, 5329-5334 (1988).
  25. Vyakarnam, A., Lenneman, A. J., Lakkides, K. M., Patterson, R. J., Wang, J. L. A comparative nuclear localization study of galectin-1 with other splicing components. Experimental Cell Research. 242, 419-428 (1998).
  26. Michaud, S., Reed, R. An ATP-independent complex commits pre-mRNA to the mammalian spliceosome assembly pathway. Genes & Development. 5, 2534-2546 (1991).
  27. Chiu, Y. -F., et al. Cwc25 is a novel splicing factor required after Prp2 and Yju2 to facilitate the first catalytic reaction. Molecular and Cellular Biology. 29, 5671-5678 (2009).
  28. Krishnan, R., et al. Biased Brownian ratcheting leads to pre-mRNA remodeling and capture prior to first-step splicing. Nature Structural and Molecular Biology. 20, 1450-1457 (2013).
  29. Gray, R. M., et al. Distinct effects on splicing of two monoclonal antibodies directed against the amino-terminal domain of galectin-3. Archives of Biochemistry and Biophysics. 475, 100-108 (2008).

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Complémentation de l’activité d’épissage par un complexe Galectin-3 - U1 snRNP sur perles
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Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

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