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Biochemistry

Komplementierung der Spleißaktivität durch einen Galectin-3 - U1 snRNP Komplex auf Perlen

Published: December 9, 2020 doi: 10.3791/61990
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Michigan State University, 2Department of Microbiology and Molecular Genetics, Michigan State University

Summary

Dieser Artikel beschreibt die experimentellen Verfahren zur (a) Depletion von U1 snRNP aus Kernextrakten mit gleichzeitigem Verlust der Spleißaktivität; und (b) Rekonstitution der Spleißaktivität im U1-depletierten Extrakt durch Galectin-3 - U1-snRNP-Partikel, die an Perlen gebunden sind, kovalent gekoppelt mit Anti-Galectin-3-Antikörpern.

Abstract

Klassische Depletions-Rekonstitutionsexperimente deuten darauf hin, dass Galectin-3 ein erforderlicher Spleißfaktor in Kernextrakten ist. Der Mechanismus der Integration von Galectin-3 in den Spleißweg wird in diesem Artikel behandelt. Die Sedimentation von HeLa-Zellkernextrakten auf 12%-32% Glyceringradienten ergibt Fraktionen, die in einem endogenen ~10S-Partikel angereichert sind, das Galectin-3 und U1 snRNP enthält. Wir beschreiben nun ein Protokoll zur Depletion von Kernextrakten von U1 snRNP mit gleichzeitigem Verlust der Spleißaktivität. Die Spleißaktivität im U1-depletierten Extrakt kann durch das Galectin-3 - U1 snRNP-Partikel rekonstituiert werden, das auf Agaroseperlen eingeschlossen ist, kovalent gekoppelt mit Anti-Galectin-3-Antikörpern. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der galectin-3 - U1 snRNP - pre-mRNA ternäre Komplex ein funktioneller E-Komplex ist, der zu Zwischenprodukten und Produkten der Spleißreaktion führt und dass Galectin-3 durch seine Assoziation mit U1 snRNP in den Spleißweg eintritt. Das Schema der Verwendung von Komplexen, affinitäts- oder immunselektioniert auf Kügelchen zur Rekonstitution der Spleißaktivität in Extrakten, die von einem bestimmten Spleißfaktor erschöpft sind, kann allgemein auf andere Systeme anwendbar sein.

Introduction

Die Produktion der meisten eukaryotischen Boten-RNAs (mRNAs) beinhaltet die Entfernung von Introns und die Ligatur von Exons in einem Kernprozess, der als Prä-mRNA-Spleißen bezeichnet wird1. Zwei Klassen von RNA-Protein-Komplexen (RNPs) lenken die Verarbeitung von Pre-Messenger-RNA in reife mRNA über spleißosomale Komplexe. Eine Klasse, entstehende Prä-Messenger-RNPs, wird co-transkriptionell durch die Bindung heterogener kerniger RNP-Proteine und anderer RNA-bindender Proteine, einschließlich einiger Mitglieder der SR-Familie, gebildet, was hnRNP-Komplexe ergibt2. Die zweite Klasse, Uracil-reiche kleine Kern-RNPs (U snRNPs mit U1, U2, U4, U5 und U6 snRNAs) ist mit U-spezifischen und Kernproteinen assoziiert3,4. Die U-snRNPs interagieren geordnet mit bestimmten Regionen von Pre-Messenger-RNPs in einem dynamischen Remodeling-Pfad, wenn Introns herausgeschnitten und Exons ligatiert werden, um reife mRNPs zu erzeugen5. Viele weitere Kernproteine sind an diesen Verarbeitungsereignissen beteiligt6.

Galectin-1 (Gal1) und Galectin-3 (Gal3) sind zwei Proteine, die erforderliche Faktoren im Spleißweg sind, wie Ausschöpfungs-Rekonstitutionsstudien zeigen7,8. Die Entfernung beider Galectine aus dem Spleißen kompetenter Kernextrakte (NE) schafft die Spleißosomenmontage und die Spleißaktivität frühzeitig ab. Die Zugabe von Galektin zu einem so doppelt erschöpften NE stellt beide Aktivitäten wieder her. Gal1 und Gal3 sind Komponenten aktiver Spleißosomen, wie durch spezifische Immunpräzipitation von pre-mRNA, spleißenden Zwischenprodukten und reifer mRNA durch Antiserum spezifisch für Gal1 oder Gal39 belegt wird. Wichtig ist, dass Gal3 mit endogener U-snRNA assoziiert ist, die Partikel im NORDOSTEN außerhalb des Spleißweges enthält, wie die Ausfällung von snRNPs durch Anti-Gal3-Antisera10 zeigt. Schließlich verändert das Stummschalten von Gal3 in HeLa-Zellen die Spleißmuster zahlreicher Gene11.

In NE, die vorinkubiert wurden, um vorgeformte Spleißosomen12 zu zerlegen, werden snRNPs in mehreren Komplexen gefunden, die in Glyceringradienten von 7S bis größer als 60S sedimentieren. Obwohl die Glyceringradientenfraktionierung eine gängige Technik zur Isolierung von spleißosomalen Komplexen und Komponenten ist (siehe z.B. Referenzen 13,14,15), haben wir diese Methode erweitert, indem wir spezifische Fraktionen mittels Antikörperimmunpräzipitationen charakterisieren. Eine snRNP-Sedimentation bei 10S enthält nur U1-snRNA zusammen mit Gal3. Die Immunpräzipitation der 10S-Fraktion mit Antiseren, die spezifisch für Gal3 oder U1 snRNP sind, ko-präzipitiert sowohl U1 als auch Gal3, was darauf hindeutet, dass einige der U1-snRNP-Monopartikel an Gal310 gebunden sind. Da U1 snRNP der erste Komplex ist, der in der spleißosomalen Montage an prä-mRNP bindet1,5, stellt dieser Schritt eine potenzielle Eintrittsstelle für Gal3 in den Spleißweg dar. Auf dieser Grundlage zeigten wir, dass 10S Gal3-U1 snRNP-Monopartikel, die an Anti-Gal3-haltige Kügelchen gebunden waren, die Spleißaktivität eines U1-snRNP-erschöpften NE wiederherstellten, was diesen Komplex als einen Mechanismus etablierte, durch den Gal3 in den spleißosomalen Weg rekrutiert wird16. Dies steht im Gegensatz zu Versuchen, Spleißosomen in bestimmten Stadien der Spleißreaktion zu isolieren und die damit verbundenen Faktoren zu katalogisieren17,18. In solchen Studien wird das Vorhandensein bestimmter Faktoren zu einem bestimmten Zeitpunkt festgestellt, nicht jedoch der Mechanismus, durch den sie belastet wurden.

Zuvor hatten wir die Herstellung von NE, das Spleißsubstrat, die Montage des Spleißreaktionsgemisches und die Analyse von Produkten in unserer Dokumentation der Rolle von Galectinen beim Pre-mRNA-Spleißen ausführlich beschrieben19. Wir beschreiben nun die experimentellen Verfahren zur Fraktionierung von Kernextrakten zur Erlangung einer mit Gal3 - U1 snRNP-Komplex angereicherten Fraktion und zur Immunselektion des letzteren Komplexes zur Rekonstitution der Spleißaktivität in einem U1-depletierten Kernextrakt.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung der Komplementierung der Spleißaktivität in Kernextrakt, der an U1-snRNP durch einen Gal3-U1-snRNP-Komplex auf Kügelchen abgereichert ist. (A) NE in Puffer C (NE(C)) wird mit Protein A-Sepharose-Perlen kovalent gekoppelt mit Anti-U1-SnRNP (αU1-Perlen) inkubiert. Der ungebundene Anteil ist an U1 snRNP (U1ΔNE) erschöpft. (B) NE in Puffer D (NE(D)) wird über einen 12%-32%igen Glyceringradienten durch Ultrazentrifugation fraktioniert. Fraktionen, die der 10S-Region (Fraktionen 3-5) entsprechen, werden kombiniert und mit Perlen gemischt, die kovalent mit Anti-Gal3-Antikörpern (αGal3-Perlen) gekoppelt sind. Das an die Kügelchen gebundene Material enthält ein Gal3-U1 snRNP-Monopartikel. (C) Der Gal3-U1 snRNP-Komplex aus Teil (B) wird mit U1ΔNE aus Teil (A) in einem Spleißassay unter Verwendung eines 32P-markierten MINX-Prä-mRNA-Substrats gemischt und die Zwischenprodukte und Produkte der Spleißreaktion werden durch Gelelektrophorese und Autoradiographie analysiert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Protocol

1. Hinweise zu den allgemeinen Verfahren

  1. Stellen Sie sicher, dass alle Chemikalien (Pufferkomponenten, Enzyme usw.) frei von Ribonuklease (RNase) gehalten werden. Sequester alle kommerziell gekauften Reagenzflaschen aus dem allgemeinen Laborgebrauch. Tragen Sie Handschuhe für alle Schritte des experimentellen Verfahrens. Verwenden Sie nur Gebackene Gläser und Utensilien (siehe Schritt 1.2 unten) und vorbehandelte Lösungen (siehe Schritt 1.3 unten).
  2. Alle Gläser (Becher, Kolben, Flaschen, Pipetten usw.) für mindestens 4 h bei 177 °C backen. Wickeln Sie andere Utensilien (Spatel, Rührstangen usw.) vor dem Backen unter den gleichen Bedingungen in Alufolie.
  3. Eine 0,1%ige (vol/vol) Lösung von Diethylpyrocarbonat (DEPC) in doppelt destilliertem Wasser (ddH2O) herstellen. Mit einem magnetischen Rührstab diese Lösung über Nacht umrühren und dann autoklavieren. Verwenden Sie dieses DEPC-behandelte H2O, um alle Lösungen herzustellen, die Tris enthalten; Filtern Sie dann mit einem Flaschendevakuumfilter. Verwenden Sie normales ddH2O, um alle anderen Lösungen (ohne Tris) vorzubereiten; dann mit DEPC (0,1%, vol/vol) und Autoklav behandeln.
    ANMERKUNG: Die in den folgenden experimentellen Verfahren verwendeten Puffer sind in Tabelle 1 alphabetisch aufgeführt.
Name des Puffers Zusammensetzung
Boratpuffer 0,2 M Natriumborat, pH 9
Puffer C 20 mM HEPES, pH 7,9, 25% (vol/vol) Glycerin, 0,42 M NaCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 0,5 mM Dithiothreitol (DTT)
Puffer D 10 mM HEPES, pH 7,9, 20% (vol/vol) Glycerin, 0,1 M KCl, 0,2 mM EDTA, 0,5 mM PMSF, 0,5 mM DTT
60%D 60% Puffer D und 40% H2O
Ethanolamin 0,2 M Ethanolamin, pH 8
HEPES-Bindungspuffer 20 mM HEPES, pH 7,9
HEPES Waschpuffer 20 mM HEPES, pH 7,9, 0,5 M NaCl
RNA-Ladepuffer 90% Formamid, 20 mM EDTA, pH 8, 0,05% (w/v) Bromphenolblau
SDS-PAGE-Puffer 25 mM Tris, 169 mM Glycin, 0,1% Natriumdodecylsulfat (SDS), pH 8,8
SDS-Probenpuffer 62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% Glycerin, 5% 2-Mercaptoethanol, 0,1% (w/v) Bromphenolblau
FSME-Puffer für RNA-Gele 89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2,5 mM EDTA, pH 8,3
TE-Puffer 10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA
Übertragungspuffer 25 mM Tris, 1,92 M Glycin, 20% Methanol, pH 8,3
T-TBS-Puffer 10 mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,05% Tween 20, pH 7,5
TX Waschpuffer 0,05% Triton X-100 (TX) in 60%D

Tabelle 1: Name und Zusammensetzung der Puffer

2. Herstellung von NE erschöpft von U1 snRNP (U1 ΔNE)

  1. Herstellung von Anti-U1-Kügelchen für die Immunadsorption
    1. 50 mg Protein A-Sepharose CL-4B Perlen im Überschuss dePC-behandeltes H2O vorschwillieren, um etwa 200 μL geschwollene Perlen zu erzeugen und dann in HEPES-Waschpuffer zu waschen.
    2. Für diese Wäsche und alle nachfolgenden Wäschen die Kügelchen durch Zentrifugation (1.000 x g in einem schwenkbaren Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s) pelletieren und die ungebundene Wäsche mit einem Mikropipettor entnehmen und entsorgen.
    3. Mischen Sie 150 μL gewaschene Perlen mit 150 μL humanem Autoimmunserum, das spezifisch für U1 snRNP ist (Volumen des Antikörpers zum Volumen der Perlen im Verhältnis 1: 1).
    4. Auf der Grundlage des Gesamtvolumens von (~300 μL aus Schritt 2.1.3 oben) wird das Gemisch auf 20 mM HEPES, pH 7,9, entsprechend den Bedingungen des HEPES-Bindungspuffers eingestellt; Inkubieren Sie diese Mischung mit kontinuierlichem Schaukeln bei Raumtemperatur für 60 min.
    5. Waschen Sie die mit Antikörpern gebundenen Kügelchen mit 1 ml Boratpuffer (0,2 M Natriumborat, pH 9) und resuspendieren Sie in 1 ml desselben Boratpuffers.
    6. Um den an das Protein A-Sepharose gebundenen Antikörper kovalent zu koppeln, Dimethylpimelimidat in eine Endkonzentration von 20 mM zu geben und bei Raumtemperatur mit Schaukeln für 60 min zu inkubieren.
    7. Waschen Sie die Perlen mit 1 ml Boratpuffer.
    8. Um ein nicht umgesetztes Vernetzungsreagenz zu blockieren, fügen Sie 1 ml 0,2 M Ethanolamin (pH 8) hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur mit Schaukeln für 60 min.
    9. Waschen Sie die Antikörper-gekoppelten Kügelchen, im Folgenden als Anti-U1-Kügelchen bezeichnet, zweimal mit 0,5 ml TX-Waschpuffer (0,05% Triton X-100 in 60% D).
  2. Depletion von U1 snRNP aus NE (siehe Abbildung 1A)
    HINWEIS: Das Verfahren zur Herstellung von NE aus HeLa-Zellen wurde ursprünglich von Dignam et al.20 entwickelt. Wir haben die Materialien und detaillierten Methoden zur Herstellung von NE für Spleißassays19 beschrieben (siehe Schritte 2.1 und 3.1 dieser Referenz). NE, wie ursprünglich vorbereitet, befindet sich in Puffer C und wird im Folgenden als NE(C) bezeichnet. NE(C), das gegen Puffer D dialysiert und mit puffer D ausgeglichen ist, wird als NE(D) bezeichnet.
    1. Inkubieren Sie 200 μL NE(C) mit 100 μL Anti-U1-Perlen aus Schritt 2.1.9 oben.
    2. Fügen Sie 5 μL RNasin zu der Mischung hinzu.
    3. Drehen Sie das Mikroröhrchen 1 h lang Kopf über Schwanz bei 4 °C.
    4. Pelletieren Sie die Mischung durch Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s) und sammeln Sie das ungebundene Material (U1ΔNE) mit einer Hamilton-Spritze.
    5. Dialysieren Sie das gesamte Volumen von U1ΔNE, zusammen mit einem separaten 50 μL Aliquot des ursprünglichen, nicht vollständigen NE(C), in separaten Kompartimenten eines Mikrodialysators unter Rühren für 75 min gegen 60% D unter Verwendung einer Dialysemembran mit 8 K Molekulargewichtsgrenzung.
    6. Diese Präparate (U1ΔNE und NE in 60% D) werden unmittelbar nach der Dialyse in 20 μL Aliquots aufgeteilt; anschließend in einem Trockeneis/Ethanol-Bad einfrieren und bei -80 °C lagern.
  3. Analyse des RNA- und Proteingehalts von U1ΔNE und an Anti-U1-Kügelchen gebundenem Material
    1. Nach dem Entfernen des ungebundenen Materials (U1ΔNE) (Schritt 2.2.4) wird das an den Anti-U1-Kügelchen gebundene Material durch Zugabe von 0,5 ml TX-Waschpuffer gewaschen. Pelletieren Sie die Mischung durch Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s) und entfernen Sie den Überstand mit einem Mikropipettor und entsorgen Sie ihn.
    2. Wiederholen Sie die Waschschritte 2.3.1 zweimal.
    3. Entfernen Sie das an die Anti-U1-Kügelchen gebundene Material, indem Sie 100 μL 2x SDS-Probenpuffer zu 100 μL der Kügelchen hinzufügen und für 10 min bei Raumtemperatur inkubieren.
    4. Pellet die Mischung durch Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s); Entfernen Sie den Überstand mit der Hamilton-Spritze und frieren Sie ihn in einem Trockeneis-/Ethanolbad ein. Bei -80 °C lagern.
    5. Vergleichen Sie das nicht depleted NE, das erschöpfte NE (U1ΔNE) und das an die Perlen gebundene Material (aus den Kügelchen entfernt durch SDS-Probenpuffer, wie in den Schritten 2.3.3 und 2.3.4 oben beschrieben). Befolgen Sie die Schritte 2.3.6-2.3.8 für die RNA-Analyse oder die Schritte 2.3.9-2.3.10 für die Proteinanalyse.
    6. Extrahieren Sie für jede Probe die RNA mit 200 μL Phenol-Chloroform (50:50, v/v); anschließend erneut mit 180 μL Chloroform-Isoamylalkohol (25:1, v/v) extrahieren. Nach der Extraktion 300 μL kaltes 200-beständiges Ethanol zugeben, zum Mischen invertieren und die ausgefällte RNA über Nacht bei -20 °C lagern.
    7. Zentrifugieren Sie die Ethanol-ausgefällte RNA (12.000 x g für 10 min bei 4 °C). Waschen Sie die Pellets mit 150 μL kaltem 70% Ethanol. Zentrifugiere erneut (12.000 x g) bei 4 °C für 15 min. Entfernen Sie den Überstand mit einem Mikropipettor und trocknen Sie die Pellets in einem Geschwindigkeitssauger für 10-15 min ohne Hitze.
    8. Resuspendieren Sie das getrocknete RNA-Pellet in 10 μL RNA-Ladepuffer, wirbeln Sie vorsichtig, erhitzen Sie es auf 75-85 ° C für 90 s und inkubieren Sie es dann für 2 min auf Eis. Trennen Sie die snRNAs durch Gelelektrophorese (2 h bei 16 mA) durch 13% Polyacrylamid - 8,3 M Harnstoffgele und färben Sie sie dann entweder mit Ethidiumbromid an oder unterliegen Sie einem Northern Blotting10,16.
    9. Laden Sie die Proteinproben in SDS-Probenpuffer aus Schritt 2.3.5 auf 12,5% Polyacrylamidgele und Elektrophorrese bei 200 V für ca. 45-50 min in SDS-PAGE-Puffer (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese).
    10. Übertragen Sie die getrennten Proteine auf die Nitrocellulosemembran bei 400 mA für 2 h im Transferpuffer. Blockieren Sie nach dem Transfer die Membran durch Inkubation über Nacht in T-TBS, das 10% fettfreie Trockenmilch enthält. Dann immunoblot die Membran, um spezifische Proteine aufzudecken8,21.

3. Immunpräzipitation von 10S-Fraktionen von Glyceringradienten durch Anti-Gal3

  1. Herstellung von Anti-Gal3-Perlen zur Immunadsorption
    HINWEIS: Die Ableitung und Charakterisierung von kaninchenpolyklonalen Antiseren gegen Gal3 für Kaninchen #2421 und für Kaninchen #4910 wurden zuvor beschrieben.
    1. Verwenden Sie Präimmunserum von Kaninchen # 49 als Kontrolle.
    2. Für die Herstellung von Anti-Gal3-Perlen befolgen Sie das zuvor beschriebene Verfahren zur Herstellung von Anti-U1-Perlen (Schritt 2.1), mit der Ausnahme, dass entsprechend Schritt 2.1.3 das Verhältnis von Antiserum (z. B. Anti-Gal3, Nr. 49) zu Perlen 3: 1 beträgt.
    3. Kurz vor Gebrauch die Antikörper-gekoppelten Kügelchen, im Folgenden als Anti-Gal3-Kügelchen bezeichnet, zweimal mit 0,5 ml TX-Waschpuffer waschen. Entfernen Sie den Überstand, zuerst mit einem Mikropipettor, um den größten Teil der Flüssigkeit herauszuholen, und dann mit einer Hamilton-Spritze, um die Flüssigkeit aus den Perlen zu bekommen; abwerfen.
  2. Immunpräzipitation von Glyceringradientenfraktionen durch Anti-Gal3 (siehe Abbildung 1B)
    1. Fraktionieren Sie NE(D) über einen 12%-32%igen Glyceringradienten10. Kombinieren und mischen Sie die Glyceringradientenfraktionen 3, 4 und 5 (nummeriert von der Spitze des Gradienten), die sich in der Nähe des 10S-Bereichs des Gradienten befinden.
    2. Bereiten Sie zwei Proben mit jeweils 150 μL Aliquot kombinierter Gradientenfraktionen 3-5 (Schritt 3.2.1) vor und geben Sie sie in 50 μL Anti-Gal3-Kügelchen.
    3. Bereiten Sie parallel zwei Proben mit jeweils 150 μL Fraktion 1 vor (enthält Gal3 nicht im Komplex mit U1 snRNP10; Schritt 3.2.1) und legen Sie sie in 50 μL Anti-Gal3-Kügelchen.
    4. Als Kontrolle geben Sie 150 μL 60% D in ein anderes Mikroröhrchen mit 50 μL Anti-Gal3-Perlen.
    5. Mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf das Rohr klopfen, und drehen Sie dann das Mikroröhrchen bei 4 ° C für 1 h.
    6. Pelletieren Sie die Mischung durch schonende Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s).
    7. Entfernen Sie den Überstand (ungebundenes Material) mit einer Hamilton-Spritze. Waschen Sie die Perlen nicht und verwenden Sie sie sofort für die Zugabe der Spleißreaktionen (Abschnitt 4.2).
  3. Analyse des RNA- und Proteingehalts im ungebundenen und gebundenen Material aus der Anti-Gal3-Fällung von 10S-Gradientenfraktionen
    1. Zur Analyse der Komponenten des gebundenen und ungebundenen Materials aus der Anti-Gal3-Ausfällung der 10S-Gradientenfraktionen wird das ungebundene Material (Überstand nach Schritt 3.2.6) aufgefangen, in ein frisches Mikroröhrchen überführt und bei -20 °C eingefroren.
    2. Die ausgefällten Kügelchen aus Schritt 3.2.6 (die an Anti-Gal3 gebundenes Material enthalten) werden durch Zugabe von 0,5 ml TX-Waschpuffer gewaschen.
    3. Pellet die Mischung durch schonende Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s); Entfernen Sie den Überstand mit einem Mikropipettor und verwerfen Sie ihn. Wiederholen Sie die Waschschritte noch zweimal.
    4. 50 μL 2X SDS Probenpuffer zu den gewaschenen und pelletierten Anti-Gal3-Kügelchen geben.
    5. Mischen Sie die Perlen vorsichtig und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur.
    6. Pelletieren Sie die Mischung durch schonende Zentrifugation (1.000 x g in einem schwingenden Eimerrotor bei 4 °C für 10-15 s), sammeln Sie den Überstand durch Hamilton Spritze und lagern Sie ihn in einem frischen Mikroröhrchen bei -20 °C.
    7. Vergleichen Sie das ungebundene Material (Abschnitt 3.3.1) und das gebundene Material (Schritt 3.3.6) der Anti-Gal3-Fällung in Bezug auf RNA- und Proteinkomponenten unter Verwendung der in Schritt 2.3.6 beschriebenen Verfahren. bis 2.3.10.

4. Montage der Spleißreaktion und Analyse der Produkte

  1. Vorbereitung des Spleißsubstrats
    HINWEIS: Das prä-mRNA-Substrat, minX genannt, enthält zwei Exonsequenzen und eine Intronsequenz aus dem Adenovirus22. Die MINX-DNA-Sequenz im Plasmid steht unter der Kontrolle von T3-, T7- oder SP6-RNA-Polymerase-Promotoren. Die Materialien und detaillierten Methoden zur Linearisierung der MINX-Plasmid-DNA mit BamHI-Restriktionsendonuklease, zur Transkription durch SP6-RNA-Polymerase in Gegenwart von α-32P[GTP] und zur Aufreinigung von 32P-markiertem MINX für Spleißassays sind zuvor beschrieben19 (siehe Schritte 2.2 und 3.2 dieser Referenz).
    1. Lagern Sie das radioaktiv markierte MINX als Ethanolausscheidung bei -20 °C; Verwenden Sie das markierte Spleißsubstrat innerhalb von 4-6 Wochen nach der Transkription.
    2. Kurz vor Gebrauch zentrifugieren Sie das ethanolgeleitete 32P-markierte MINX bei 12.000 x g für 10 min bei 4 °C; Entfernen Sie den Überstand mit einem Mikropipettor und verwerfen Sie ihn.
    3. 150 μL 70% Ethanol zugeben und bei 12.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugieren. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das Pellet in Geschwindigkeit vac ohne Hitze für 15 min.
    4. Rehydrieren Sie das Pellet in 50 μL DEPC-Wasser. Spot 2 μL auf jedem der beiden GF/C-Filter; Tauchen Sie die Filter für 10 min in kalte 5% Trichloressigsäure (TCA). Spülen Sie mit kaltem 5% TCA, gefolgt von 180-beständigem Ethanol auf einer Vakuumflasche. Trocknen Sie die Filter an der Luft und unterziehen Sie die Szintillationszählung in 4 mL Safety-Solve.
    5. Verdünnen Sie 32P-markiertes MINX in 60% D auf 104 cpm/μL für den Spleißassay.
  2. Aufbau der Spleißreaktion (siehe Abbildung 1C)
    1. Auf Eis spleißende Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 24 μL (8 μL U1ΔNE (aus Schritt 2.2.6), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM Kreatinphosphat, 0,5 mM DTT, 20 Einheiten RNasin, 4 μL 32P-markiertes MINX-Spleißsubstrat (104 cpm/μL), 60% D) zusammensetzen und in jedes Röhrchen mit Perlen aus Abschnitt 3.2.7 geben. Fügen Sie einen identischen Satz von Spleißreaktionen in einem Gesamtvolumen von 24 μL, aber ohne U1ΔNE zusammen und fügen Sie jedem Kürmchen Perlen aus Schritt 3.2.7 hinzu.
    2. Vorbereiten einer Kontrollspleißreaktion in einem Gesamtvolumen von 12 μL (4 μL NE(D), 3,5 mM MgCl2, 1,5 mM ATP, 20 mM Kreatinphosphat, 0,5 mM DTT, 20 Einheiten RNasin, 2 μL 32P-markiertes MINX-Spleißsubstrat (104 cpm/μL), 60% D).
    3. Mischen Sie die Rohre vorsichtig durch Klopfen und drehen Sie es bei 30 ° C für 90 min. Pelletieren Sie die Mischung durch schonende Zentrifugation bei 1.000 x g in einem schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C für 10-15 s.
    4. Stoppen Sie die Reaktion und eluieren Sie die Proteine von den Kügelchen, indem Sie 24 μL 2x SDS-Probenpuffer zu den Röhrchen mit Perlen und 12 μL 2x SDS-Probenpuffer in das Kontrollröhrchen geben, das NE, aber keine Kügelchen enthält. Erhitzen Sie die Rohre bei 100 °C für 7 min.
    5. Zentrifugieren Sie die Rohre vorsichtig bei 1.000 x g in einem schwenkbaren Schaufelrotor bei 4 °C für 10-15 s.
    6. Die Überstände (Elutionen) werden in frische Mikroröhrchen überführt: ca. 48 μL aus den Kügelchen und 24 μL aus dem NE-Steuerrohr.
    7. Proteinase K (20 mg/ml) hinzufügen, um die Proteine zu verdauen und zu lösen: Fügen Sie 5 μL zur 48 μL-Elution aus Perlen hinzu und fügen Sie 2,5 μL zur 24 μL NE-Kontrolle hinzu.
    8. Die Röhrchen bei 37°C für 40 min inkubieren.
    9. Vorsichtig zentrifugieren Sie die Rohre bei 1.000 x g in einem schwingenden Schaufelrotor bei 4 °C für 10 s.
    10. Verdünnen Sie die Perlenelutionen mit 39,5 μL TE und 10 μL 3 M Natriumacetat. Verdünnen Sie die NE-Kontrolle mit 63,5 μL TE und 10 μL 3 M Natriumacetat.
    11. Extrahieren und analysieren Sie die RNA wie unten beschrieben (Abschnitt 4.3).
  3. Analyse der Produkte der Spleißreaktion
    1. Extrahieren Sie die RNAs in jeder Probe mit Phenol-Chloroform, gefolgt von Chloroform-Isoamylalkohol; die RNAs mit Ethanol ausfällen, zentrifugieren, die Pellets waschen, den Überstand entfernen und die Pellets nach dem gleichen Verfahren wie in den Schritten 2.3.6 und 2.3.7 beschrieben trocknen.
    2. Resuspendieren Sie das getrocknete RNA-Pellet in 10 μL RNA-Ladepuffer, wirbeln Sie vorsichtig, erhitzen Sie es auf 75-85 ° C für 90 s und inkubieren Sie es dann für 2 min auf Eis.
    3. 20 mL einer Lösung, die 13% Polyacrylamid (Bisacrylamid:Acrylamid, 1,9:50 [gew./gew.]) enthält, in 8,3 M Harnstoff herstellen; gegossene Gele mit einer Länge von 15 cm mit dieser Lösung.
    4. Sobald das Gel gegossen ist, elektrophorisieren Sie es (ohne geladene Proben) bei 400 V für 20 minuten mit FSME als Laufpuffer. Nach diesem Schritt waschen Sie die Vertiefungen mit FSME-Laufpuffer.
    5. Laden Sie die RNA-Proben in RNA-Ladepuffer und Elektrophorrese mit FSME-Laufpuffer bei 400 V für 3,5 bis 4 h. Nach der Elektrophorese entfernen Sie den Harnstoff, indem Sie das Gel 10 Minuten lang in destilliertem Wasser eintauchen und drehen.
    6. Vakuumtrocknen Sie das Gel auf 3 M Filterpapier, zuerst für 2 h 15 min bei 80 °C und dann für 30 min ohne Hitze, um es langsam abzukühlen. Unterziehen Sie das getrocknete Gel einer Autoradiographie auf Film, um die Migrationspositionen der radioaktiven Bestandteile zu erkennen.

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Representative Results

NE-depletierte U1-snRNP-Komplexe (U1ΔNE aus Abschnitt 2.2.6) und Gal3-U1-snRNP-Komplexe aus der 10S-Region des Glyceringradientenimimpräzipitats durch Anti-Gal3 (Schritt 3.2.7) wurden in einer Spleißreaktion gemischt. Dieses Reaktionsgemisch enthielt U1-snRNA (Abbildung 2A, Bahn 3) sowie das U1-spezifische Protein U1-70K (Abbildung 2B, Bahn 3). Wie erwartet, fiel der Anti-Gal3 Gal3 aus (Abbildung 2B, Bahn 3). Diese Komponenten (U1-snRNA, U1-70K-Protein und Gal3) wurden in der präimmunen (PI) Kontrollfällung nicht gefunden (Abbildung 2A, Abbildung 2B, Spur 2). Im Vergleich zu einer nicht erschöpften NE, die als Positivkontrolle durchgeführt wurde (Abbildung 2C, Bahn 1), zeigte U1ΔNE keine Spleißaktivität (Abbildung 2C, Spur 2). Die Spleißaktivität im U1ΔNE konnte durch den perlengebundenen Gal3 - U1 snRNP-Komplex rekonstituiert werden (Abbildung 2C, Bahn 6). Es wurden sowohl Produkte der Spleißreaktion, ligierte Exons und exzidierte Intronlariat (rechts durch Pfeile hervorgehoben), als auch Zwischenprodukte, Exon 1 und Lariat Exon 2, gefunden. Die Komponenten der Fraktionen 3-5 waren entscheidend für die Wiederherstellung des Spleißens auf U1ΔNE. Wenn die Fraktionen 3-5 bei der Immunpräzipitation durch Puffer allein (60% D) ersetzt wurden, konnte beim Mischen mit U1ΔNE keine Spleißaktivität beobachtet werden (Abbildung 2C, Bahn 2), was darauf hindeutet, dass die Anti-Gal3-Perlen nicht für die Wiederherstellung der Spleißaktivität in letzterem verantwortlich waren. Überzeugender ist, dass, wenn die Fraktionen 3-5 im Immunpräzipitationsverfahren durch die Fraktion 1 ersetzt und dann zu U1ΔNE hinzugefügt wurden, keine Zwischenprodukte oder Produkte der Spleißreaktion gefunden wurden (Abbildung 2C, Spur 4). Frühere Analysen hatten dokumentiert, dass das Gal3 in Fraktion 1 ein freies Gal3-Protein darstellte, das nicht mit einem RNP-Komplex10 in Verbindung gebracht wurde, und dass das Northern Blotting des aus Fraktion 1 immunpräzipitierten Materials keine U1-snRNA16 ergab. Schließlich zeigten Immunpräzipitate aus Fraktion1 und den Fraktionen 3-5 keine Spleißaktivität, wenn sie in Abwesenheit von U1ΔNE untersucht wurden (Abbildung 2C, Bahnen 3 bzw. 5).

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse der RNA- und Polypeptidzusammensetzungen des Anti-Gal3-Niederschlags der 10S-Region des Glyceringradienten und seine Fähigkeit, das Spleißen in Kernextrakt zu rekonstituieren, der von U1 snRNP (U1ΔNE) abgereichert ist. (A) Northern-Blotting-Analyse von U1-snRNA, die an Perlen gebunden ist, gekoppelt mit Präimmunserum (PI; Bahn 2) oder an Perlen gekoppelt mit Anti-Gal3 (αGal3; Bahn 3). Bahn 1 repräsentiert 20% der Menge der kombinierten Glyceringradientenfraktionen, die einer Immunpräzipitation unterzogen werden. Bahn 2 und Bahn 3 repräsentieren jeweils 25% des gebundenen Materials, das aus den jeweiligen Kügelchen eluiert wird. (B) Western-Blotting-Analyse von Polypeptiden, die an Perlen gebunden sind, gekoppelt mit Präimmunserum (Bahn 2) oder Anti-Gal3 (Bahn 3). Proteinidentitäten sind auf der rechten Seite angegeben. Bahn 1 repräsentiert 20% der Menge der kombinierten Glyceringradientenfraktionen, die einer Immunpräzipitation unterzogen werden. Bahn 2 und Bahn 3 repräsentieren jeweils 75% des gebundenen Materials, das aus den jeweiligen Kügelchen eluiert wird. (C) Analyse der Fähigkeit, die Spleißaktivität von U1ΔNE wiederherzustellen, durch Anti-Gal3 (αGal3)-Immunpräzipitate der Glyceringradientenfraktion 1 (Fr 1), der Fraktionen 3-5 (Fr 3-5) oder 60% Puffer D (60% D). Das + oder - Zeichen über der fett gedruckten durchgezogenen Linie zeigt das Vorhandensein oder Fehlen jedes dieser Ausscheidungen im Spleißreaktionsgemisch an. Das + oder - Zeichen unter der fett gedruckten durchgezogenen Linie zeigt das Vorhandensein oder Fehlen von U1ΔNE (oder NE in Puffer D) an. Bahn 1: 4 μL NE in einem 12 μL Spleißassay, von denen 100% einer Gelanalyse unterzogen wurden. Für die Bahnen 2-6 betrug das Gesamtvolumen des Spleißassays 24 μL, von denen 50% einer Gelanalyse unterzogen wurden. Bahn 2: 8 μL U1ΔNE plus Kügelchen aus Niederschlag von 60% D. Bahn 3: Kügelchen aus Niederschlag von Fr 1. Bahn 4: 8 μL U1ΔNE plus Kügelchen aus Fällungen von Fr 1. Bahn 5: Perlen aus Niederschlägen von Fr 3-5. Bahn 6: 8 μL U1ΔNE plus Kügelchen aus Fällung von Fr 3-5. Die Migrationspositionen des pre-mRNA-Substrats, der Zwischenprodukte und der Produkte (Intronlariat und ligatierte Exons, hervorgehoben durch Pfeile) sind rechts angegeben. Die Daten in Panel C stammen aus demselben Experiment wie in Panel A, Abbildung 2 von Haudek et al.16. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die in Abbildung 2 gezeigten Ergebnisse wurden mit Anti-Gal3 (#49) erzielt. Die gleichen Ergebnisse konnten mit einem anderen Anti-Gal3 (#24) beobachtet werden, aber das Präimmunserum von Kaninchen #49 konnte das Spleißen in U1ΔNE nach inkubation mit den Fraktionen 3-516 nicht rekonstituieren. Alle diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass das pre-mRNA-Substrat an das auf Kügelchen immobilisierte 10S Gal3 - U1 snRNP-Partikel binden kann und dass der ternäre Komplex im Spleißweg funktionsfähig ist.

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Discussion

Dieser Bericht enthält die experimentellen Details, die einen Gal3 - U1 snRNP-Komplex dokumentieren, der auf Anti-Gal3-beschichteten Kügelchen gefangen ist, kann an prä-mRNA-Substrat binden und dieser ternäre Komplex kann die Spleißaktivität zu einem U1 snRNP-depletierten NE wiederherstellen. Gal3 ist ein Mitglied einer Familie von Proteinen, die ursprünglich auf der Grundlage seiner Galactose-spezifischen Kohlenhydratbindungsaktivität isoliert wurden23 . Frühe Immunfluoreszenz- und subzelluläre Fraktionierungsstudien lieferten den ersten Hinweis auf eine Assoziation von Gal3 mit Komponenten der Spleißmaschinerie: Kolokalisierung in Kernsprenkeln mit Sm-Kernpolypeptiden von snRNPs und der Serin- und Arginin-reichen (SR) Familie von Spicingfaktoren24,25 und Sedimentation auf Cäsiumsulfatgradienten bei einer Dichte (1,3-1,35 g/ml), die denen von hnRNP und snRNP24 entspricht . Nachfolgende Depletions-Rekonstitutionsexperimente zeigten wiederum, dass Gal3 (sowie ein anderes Mitglied der Galectin-Familie, Galectin-1 (Gal1)) erforderliche, aber redundante Faktoren in zellfreien Spleißassays waren7,8.

Wenn NE über einen Glyceringradienten fraktioniert wird, ergab die Immunpräzipitation von Gradientenfraktionen mit Anti-Gal3 unterschiedliche Komplexe mit unterschiedlichen Verhältnissen verschiedener snRNAs und assoziierter Proteine, was darauf hindeutet, dass Gal3 in Abwesenheit von pre-mRNA-Spleißsubstrat mit mehreren snRNPs assoziiert ist10. Insbesondere werden Gal3 und U1 snRNP zu einem Monopartikel zusammengesetzt, das bis zum ~ 10S-Bereich des Gradienten sedimentiert (Fraktionen 3-5 eines 12% -32% Glyceringradienten). Da die Bindung von U1-snRNP an die 5'-Spleißstelle der pre-mRNA den ersten Schritt bei der Spleißosomen-Assemblierung darstellt5,26, war es möglich, dass Gal3 über seine Assoziation mit U1-snRNP Zugang zum Spleißweg erhält. Diese Vorstellung wird durch die Beobachtung gestützt, dass Gal3 als Teil des 10S Gal3-U1 snRNP-Komplexes mit einem Pre-mRNA-Substrat assoziiert werden konnte, aber nicht mit Kontroll-RNA ohne Spleißstellen, was darauf hindeutet, dass die 5'-Spleißstellenerkennung durch U1 snRNP eine Schlüsselvoraussetzung für die Montage zu einem Spleißosom war. Darüber hinaus schaffte die Vorbehandlung der Fraktionen, die das Gal3-U1-snRNP-Partikel mit Mikrokokkennuklease enthielten, die Belastung von Gal3 auf die prä-mRNA10 auf. Die Schlüsselfrage ist also, ob dieser frühe ternäre Komplex, bestehend aus Gal3, U1 snRNP und pre-mRNA, einen funktionellen E-Komplex darstellt, der dem Spleißweg zugeordnet ist, oder einen Sackgassen-H-Komplex, der nicht in den Spleißweg eintreten kann5,26. Wir haben uns dieser Frage gestellt, indem wir getestet haben, ob das Gal3 - U1 snRNP die Spleißaktivität in NE rekonstituieren kann, das an U1 snRNP erschöpft ist, mit gleichzeitigem Verlust der Spleißfähigkeit (U1ΔNE). Die Ergebnisse unserer Experimente, deren Protokoll im vorliegenden Artikel detailliert beschrieben wird, deuten darauf hin, dass Gal3 - U1 snRNP an ein prä-mRNA-Substrat bindet, um einen funktionellen E-Komplex zu bilden, und dass U1 snRNP erforderlich ist, um Gal3 in den Spleißweg zu integrieren16.

Zwei kritische Schritte innerhalb des beschriebenen experimentellen Protokolls müssen beachtet werden. Erstens fordert Schritt 3.2.7 die Entfernung des überstehenden ungebundenen Materials nach Anti-Gal3-Ausfällung der Glycerinfraktionen. Die vollständige Entfernung der Flüssigkeit aus den pelletierten Agaroseperlen erfordert, dass die Nadelspitze der Hamilton-Spritze auf den Boden der Perlen eingeführt wird. Dies muss sorgfältig durchgeführt werden, damit die Perlen die Spritzennadel nicht verstopfen oder durch Anhaften an der Nadel verloren gehen, wenn diese aus dem Schlauch gezogen wird. Zweitens ist es wichtig, dass die pelletierten Kügelchen für die Montage der Spleißreaktionen mit möglichst geringer Verzögerung verwendet werden. Die Koordination dieser beiden Schritte war entscheidend für den Erfolg des Verfahrens. In diesem Zusammenhang ist auch zu beachten, dass wir kürzlich die Rückgewinnung von Gal3-U1-snRNP-Komplexen in der Pelletfraktion verbessert haben, indem wir Protein A-Sepharose CL-4B-Kügelchen durch Protein-A-magnetische Nanopartikel in der kovalenten Kopplung des Anti-Gal3-Antikörpers an Kügelchen ersetzt haben.

Die wichtigste Schlussfolgerung stammt aus Experimenten, in denen U1ΔNE, ohne Spleißaktivität, durch das 10S Gal3 - U1 snRNP-Partikel ergänzt wird, das durch Perlen immunpräzipitiert wird, die kovalent mit Anti-Gal3-Antikörpern derivatisiert sind. Obwohl es klare Hinweise auf eine Intronentfernung gab, war die Effizienz der Exonverbindung geringer als die, die in der Reaktion beobachtet wurde, die in Abwesenheit von Kügelchen durchgeführt wurde (vergleichen Sie Bahn 6 mit Bahn 1 in Abbildung 2C). In unseren zellfreien Spleißassays werden typischerweise etwa 30% der Radioaktivität im pre-mRNA-Substrat in ligatierte Exons umgewandelt. Dieser Mangel an Exon-Ligatur könnte zurückzuführen sein auf: (a) eine nicht optimale Menge einer kritischen Komponente, entweder in U1ΔNE (Abbildung 1A) oder im Gal3 - U1 snRNP-Komplex (Abbildung 1B); oder (b) einige strukturelle Einschränkungen (z. B. Schwierigkeit, eine Konformationsänderung zu durchlaufen) des Gal3 - U1 snRNP, das während der Spleißreaktion auf den Anti-Gal3-Perlen immobilisiert wurde (Abbildung 1C).

Andere Forscher haben über die Verwendung der Festphasen-Immunselektion berichtet, um spezifische Komplexe einzufangen und die katalytische Aktivität oder eine geordnete Progression von Spleißosomstrukturen zu dokumentieren. Zum Beispiel zeigten Chiu et al., dass die Zugabe des Hefe-Spleißfaktors Cwc25 das pre-mRNA-Substrat auf einem antikörperbefangenen zusammengesetzten Spleißosom in die erste katalytische Reaktion jagen kann, wodurch die Zwischenprodukte Exon 1 und Lariat-Exon227 entstehen. Im selben Hefesystem verwendeten Krishnan et al. ein Protein A-Tag, um über biotinyliertes IgG gereinigten Bact-Spleißosomenkomplex zu Streptavidin-beschichteten Magnetperlen in einer biophysikalischen Studie des Pre-mRNA-Remodelings (Abstand zwischen der 5'-Spleißstelle und dem Verzweigungspunkt) vor dem ersten Spleißschritt zu immobilisieren28. Unser gegenwärtiger Artikel erweitert diese früheren Studien in Bezug auf die Durchführung beider Schritte der Spleißreaktion und kann daher eine Bedeutung technischer Natur haben: Dieselben Verfahren könnten auf eine beliebige Anzahl anderer Spleißfaktoren angewendet werden, die mit snRNPs assoziiert sind, um zu untersuchen, wann und wie diese Faktoren auf spleißosomale Komplexe aufladen. Die Fähigkeit, die mRNA-Produktbildung aus der Spleißreaktion zu überwachen, ist ein starker Beweis dafür, dass diese zusammengesetzten Spleißosomen tatsächlich funktionsfähig sind. Dies könnte unser Verständnis der Bildung von Spleißosomen fördern, da frühere Berichte mit proteomischen Ansätzen17 nur das Vorhandensein einiger Faktoren in einem bestimmten Komplex katalogisieren, anstatt wie die Faktoren möglicherweise auf den Komplex geladen wurden.

Eine klare Einschränkung der allgemeinen Anwendbarkeit dieser Verfahren auf andere Proteine oder snRNPs zur Bewertung ihrer Rolle beim Spleißen ist die Verfügbarkeit eines spezifischen Antikörpers, der gegen den bestimmten Faktor gerichtet ist, der seinen assoziierten Komplex effizient ausfällt. Zum Beispiel immunpräzipitatierte polyklonale Anti-Gal3-Antiseren aus einer Reihe von Kaninchen (z. B. # 24, # 49) den Gal3-U1-snRNP-Komplex aus Kernextrakt oder Glycerinfraktionen 3-5 (U1 snRNA und U1 70K Protein, die mit dem verwandten Antigen Gal3 zusammenfallen). Im Gegensatz dazu lieferten zwei kommerziell erhältliche monoklonale Antikörper, die gegen Gal3, Mac-2 und NCL-GAL3 gerichtet waren, nicht die gleichen Ergebnisse. Die Epitope von Mac-2 und NCL-GAL3 wurden der aminoterminalen Domäne des Gal3-Polypeptids29 zugeordnet und es ist möglich, dass ihre jeweiligen Epitope im Gal3-U1-snRNP-Komplex nicht zugänglich sind. Darüber hinaus sind ein Antikörper-gebundener Faktor (z. B. Gal3) und sein assoziierter Komplex (z. B. U1 snRNP) möglicherweise nicht mehr in der Lage, zusätzliche Wechselwirkungen mit der prä-mRNA oder anderen spleißosomalen Komponenten zu bilden. Dies kann auf eine physikalische Interferenz durch den Antikörper oder durch die Matrix, an die der Antikörper kovalent gekoppelt ist, zurückzuführen sein. Daher muss jedes System von Interesse von Fall zu Fall bewertet werden. Trotz dieser Einschränkungen scheint es jedoch, dass das Schema der Verwendung von Komplexen, die affinitäts- oder immunselektiert sind, auf Perlen verwendet werden, um die Spleißaktivität in Extrakten, die von einem spezifischen Spleißfaktor erschöpft sind, zu rekonstruieren, allgemein auf andere Systeme anwendbar sein kann.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch den National Science Foundation Grant MCB-0092919 und den Michigan State University Intramural Research Grant 09-CDFP-2001 (an RJP) sowie durch den National Institutes of Health Grant GM-38740 und das Michigan AgBioResearch Project MICL02455 (an JLW) unterstützt.

Das minx pre-mRNA-Substrat, das in den Spleißassays verwendet wurde, war ein freundliches Geschenk von Dr. Susan Berget (Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
anti-U1 snRNP The Binding Site Hu ENA-RNP #33471 human autoimmune serum specific for U1 snRNP
bottle top vacuum filter Fisher Scientific Corning 431153 (0.22 μm; PES 150 ml) for filtering solutions containing Tris
centrifuge International Equipment Company IEC Model PR-6 for pelletting Sepharose beads in immunoprecipitation
diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma-Aldrich 159220-5G for treatment of water used in preparation of all solutions
dimethylpimelimidate (DMP) Sigma-Aldrich 80490-5G for cross-linking antibody to Sepharose beads
electrophoresis cell BioRad Laboratories, Inc Mini-Protean II for SDS-PAGE separation of proteins
ethanolamine Sigma-Aldrich 411000-100ml for blocking after the cross-linking reaction
gel electrophoresis system Hoefer, Inc HSI SE 500 Series for separating snRNAs by gel electrophoresis
gel slab dryer BioRad Model 224 for drying gel slabs for autoradiography
Hybond ECL membrane GE Healthcare RPN3032D (0.2 μm; 30 cm x 3 m) for immunoblotting of proteins on membrane
microdialyzer (12 x 100 μl sample capacity) Pierce Microdialyzer System 100 for exchanging the buffer of nuclear extract  
microdialyzer membranes (8K cutoff) Pierce 66310 for exchanging the buffer of nuclear extract 
non-fat dry milk Spartan Stores Spartan Instant Non-fat Dry Milk
Protein A Sepharose CL-4B Millipore-Sigma GE 17-0780-01 for coupling antibody to beads
Proteinase K Millipore-Sigma P2308-5mg for stopping the splicing reaction to isolate the RNAs
RNasin Promega N2111 for inhibiting ribonuclease activity
rocker/rotator Lab Industries, Inc  Labquake Shaker 400-110 for mixing protein solutions in coupling reactions and in immunoprecipitation
Safety-Solve Research Products International Corp. No. 111177 scintillation counting cocktail for determination of radioactivity in splicing substrate
scintillation counter Beckman Instruments LS6000SC scintillation counter for determination of radioactivity 
speed vaccum concentrator Savant SVC 100H for drying ethanol-precipitated RNA pellets
Transphor electrophoresis unit Hoefer, Inc Hoefer TE Series Transphor for protein transfer from SDS-PAGE to blotting membrane

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Biochemie Pre-mRNA-Spleißen Spleißosom zellfreier Spleißassay Glyceringradientenfraktionierung U1 snRNP-Komplex Galectine
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Voss, P. G., Haudek, K. C., Patterson, R. J., Wang, J. L. Complementation of Splicing Activity by a Galectin-3 - U1 snRNP Complex on Beads. J. Vis. Exp. (166), e61990, doi:10.3791/61990 (2020).

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