Summary
在这里，我们建立了一个新的斯普拉格道利（SD）大鼠模型的优越下垂鼻窦（SSS）血栓通过螺纹栓塞方法，并验证了模型的稳定性和可靠性。
Abstract
促成脑静脉鼻窦血栓形成（CVST）自然发病的机制大多未知，在疾病过程中涉及各种无法控制的因素，导致临床研究存在很大局限性。因此，建立稳定的CVST动物模型，可以标准化各种无法控制的混淆因素，有助于规避临床研究的不足。近几十年来，已经构建了各种CVST动物模型，但基于这些模型的结果是不一致和不完整的。因此，为了进一步探索CVST的病理生理机制，有必要建立一种新型的、高度兼容的动物模型，这对CVST的诊断和治疗具有重要的现实价值和科学意义。在本研究中，通过螺纹栓塞法建立了优越的下垂鼻窦（SSS）血栓形成的新型斯普拉格-道利（SD）大鼠模型，验证了模型的稳定性和可靠性。此外，我们评估了CVST形成后大鼠脑静脉血流量的变化。SD-rat SSS-血栓形成模型是一种新型的CVST动物模型，它易于建立，最大限度地减少创伤，产生良好的稳定性，并允许精确控制缺血时间和位置。
Introduction
脑静脉鼻窦血栓（CVST）是脑静脉系统罕见的疾病，仅占中风所有病因的0.5-1.0%，但在儿童和青少年中发病率较高。在验尸过程中，CVST被查出是导致10%脑血管疾病死亡的原因2。血栓形成可能发生在颅内静脉系统的任何部分。优越的下垂鼻窦 （SSS） 是 CVST 中最常见的受影响区域之一，可能涉及多个血管。由于静脉鼻窦的狭窄或闭塞，颅内静脉回流被阻断，这通常伴随着颅内压力增加3。CVST的临床表现是复杂的，并随着时间的推移而变化：虽然症状缺乏特异性，但最常见的症状包括头痛（77.2%）、癫痫发作（42.7%）和神经缺陷（39.9%）。在严重的情况下，昏迷，甚至死亡可能发生4，5。近年来，由于医疗卫生水平和公共卫生意识的全面提高，相关危险因素的比例有所变化，创伤和感染的比例有所下降，妊娠、幼虫、口服避孕药等原因引起的CVST比例逐步上升5.
目前，CVST的发病机当时还没有得到很好的了解。为了深入探索CVST，需要进一步的病理生理学研究。然而，这些研究方法大多具有侵入性，因此难以在临床上实施。由于临床研究的诸多局限性，动物模型在基础研究和转化研究方面具有不可替代的优势。
CVST 的原因很复杂，因为它的初始发病通常无法识别，血栓形成的位置也非常多变。幸运的是，动物模型可以更好地控制这些因素。在过去的几十年里，各种CVST动物模型已经建立，每个模型都有其自身的缺点。根据不同的生产方法，大致可分为以下几个类：简单的SSS-ligation型号6、7：SSS内部注射加速器型号8：铁氯化物诱发的SSS血栓形成模型9：光化学诱发的SSS血栓模型10：和自制的栓塞闭塞SS模型11。然而，这些模型大多无法规避对动物大脑皮层的侵入性损伤，也无法准确控制缺血时间和位置。在某些模型中，血栓会自发地重新扫描：在其他模型中，SSS 将永久被遮挡。此外，复杂的手术和/或严重伤害可能会影响这些模型中随后的病理生理学发现。
在本研究中，将螺纹插头插入斯普拉格-道利（SD）大鼠的SSS中，以成功建立CVST模型，最大限度地减少损伤，实现精确可控性，并产生良好的稳定性。此外，小动物磁共振成像 （MRI） 和激光斑点血流成像相结合，以验证模型的有效性。我们评估了模型建立前后脑血流的变化，并评估了模型的稳定性，为进一步研究CVST的发生、发展和相关病理生理机制奠定了基础。
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Protocol
涉及动物学科的程序已获温州医科大学医学规范与伦理委员会批准，并符合中国关于实验室动物使用和护理的立法。
1. 准备螺纹插头、SD 大鼠和实验设备
- 使用直径为 0.28 mm 的尼龙线作为螺纹插头的主体。
注意：尼龙线的柔软度和硬度应适中。 - 用硅胶材料覆盖尼龙线的一端。螺纹塞的硅胶部分长度约为 1.2 厘米，直径约为 1.2 毫米。头端锥形，硅胶部分为圆柱形。再保留 5-7 厘米。尼龙线易于夹紧，可在手术后根据特定需要切割。
- 使用 75% 乙醇在操作前将螺纹插头浸泡 3 分钟，并在插入前用普通盐水冲洗任何残留乙醇。
- 选择12只体重在280至320克之间的雄性SD大鼠，并随机将其分成一个假组和实验组（n = 6每组）。经过一周的环境适应后，将大鼠禁食12小时，在手术前将缺水的老鼠禁食4小时。
- 准备实验所需的以下实验设备：小型动物麻醉机、脑立体毒仪、解剖显微镜、高速头骨钻头、剪刀、钳子、血管钳、针架、针线、2mL注射器、激光斑点血流成像系统和小型动物MRI扫描仪。
2. 通过螺纹栓塞构建 SD-Rat SSS-栓塞模型
- 将SD大鼠放入麻醉感应盒中，并使用小型动物麻醉机提供4%的异氟烷来诱导麻醉。此后，使用钳子确认SD大鼠的后肢和脚趾对中度捏合没有反应。
- 快速修复 SD 鼠与剃光的顶毛在大脑立体氧化装置的容易的位置。保持麻醉1.5-2.0%异氟兰（以0.5 L/min的速度），并将呼吸速率稳定在40-60呼吸/分钟。通过加热垫稳定大鼠的体温，温度为 37±0.2 °C。
- 大鼠被放置在立体毒性框架上后，应用无菌眼润滑剂，以保护角膜在麻醉期间不干燥。
- 用5%的碘与75%乙醇交替三次对大鼠头顶部的表面进行消毒。在头部中间切开一个皮肤切口（2.0厘米长），然后小心地剥去顶部筋膜和围骨，以完全暴露头骨。
- 确认前方塔内尔、后方丰塔内尔、冠状缝合、下垂缝合和鱼骨缝合的位置。
- 将冠状缝合线和鱼骨缝合线之间的区域用作血流观察区域。为了防止头骨在激光斑点血流成像期间影响观察，在观察区域将头骨变薄，直到血管清晰可见。变薄的头骨的大小应该是大约1.0厘米×1.0厘米。此步骤和以下步骤均在解剖显微镜下执行。
- 在头骨研磨过程中，使用正常温度盐水反复冲洗钻头，以避免高温灼伤大脑皮层。
- 使用高速钻头在以布雷格马为中心的 6.0 mm x 4.0 mm 骨窗内研磨头骨，以暴露布雷格马区域的 SSS。
- 在研磨过程中使用普通盐水冷却头骨。当头骨变薄时，使用钳子小心地取出剩余的骨片，以避免撕裂 SSS。
- 选择合适的螺纹插头，使用 SSS 布雷格马点作为插头点，用 2 mL 注射器针小心刺穿它，并快速将螺纹插头头插入插头点。
- 此时，螺纹插头末端与 SSS 之间的角度应约为 30-45°：然后将螺纹插头末端和 SSS 之间的角度调整到 0-10 度，然后缓慢地将 SSS 插入中心，直到头部到达鼻窦汇合的后边缘。之后，切断尾巴的多余的部分。
注意：当 SSS 被刺穿时，可能会发生快速出血。如果螺纹插头的末端不能同时快速插入插头点，请使用小纱布或棉球轻轻按下插头点，同时缓慢滑动向下小心地暴露插头点，然后快速将螺纹末端插入 SSS。插入螺纹塞后，如果插头点有出血，可以使用明胶海绵等止血材料止血。
- 此时，螺纹插头末端与 SSS 之间的角度应约为 30-45°：然后将螺纹插头末端和 SSS 之间的角度调整到 0-10 度，然后缓慢地将 SSS 插入中心，直到头部到达鼻窦汇合的后边缘。之后，切断尾巴的多余的部分。
3. SD大鼠大脑表面血流检测
- 使用激光源均匀地照亮血流观测区域。反射光由摄像机收集，并传输到计算机进行分析。使用以下参数设置为激光斑点血流成像系统：波长：λ = 785 nm;和图像曝光时间：T=10毫秒。
- 将SD-rat血流观测区集中到激光斑点血流成像系统的视野中，对脑部血流进行2分钟的连续监测。收集和处理每只SD大鼠栓塞前后的血流量数据，并获取观察区域的激光斑点血流量图。
- 用正常的盐水反复冲洗手术区域，以洗去骨屑和残留物。缝合皮肤（0#线程）和消毒与碘酚。
- 保持体温，直到大鼠在手术后醒来，然后用食物和 水在一个笼子里存放。假组无法插入。
- 数据收集完成后，执行后处理。
- 通过激光斑点血流成像系统软件提供的工具，完整选择感兴趣的区域 （ROI）。获得的值是投资回报率中的平均血流量值，以及栓塞前后的局部脑血流量值。在栓塞之前使用血流值作为基线值。
- 选择四个投资回报率，并测量每个投资回报率中脑血流量的相对变化，表示为基线值的百分比变化。
4. 检测小动物MRI的螺纹位置
- 将以下 T2 加权成像 （T2WI） 参数用于 MRI 成像系统：回声时间 （TE） = 33 毫秒， 重复时间 （TR） = 3000 ms， 兴奋次数 （NEX） = 4， 切片 = 28， 切片厚度 = 0.8 毫米， 矩阵大小 = 256*256 毫米2， 翻转角度 = 80°， 视场 （FOV） = 30*30 mm2， 扫描时间 = 6 分 24 秒：磁共振血管造影 （MRA） 参数设置如下： TE = 4.4 毫秒， TR = 12 ms， NEX = 4， 切片 = 80， 切片厚度 = 0.4 毫米， 矩阵大小 = 256*256 毫米2， 翻转角度 = 80°， FOV = 30*30 mm2， 扫描时间 = 16 分钟 23 秒 40 毫秒。
- 修复 MRI 扫描台上的动物，通过定位扫描校准大脑位置，并在确认位置后执行 T2WI 和 MRA 序列扫描。
- 在检测过程中通过动物麻醉机使用连续麻醉。然后，通过过度的五巴比妥的内皮注射，对SD大鼠实施安乐死。
- 图像采集和后处理：采集图像数据后，为了更清楚地观察SSS中螺纹插头的状态，使用伪增色方法显示大鼠大脑的T2WI图像。
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Representative Results
要通过缝合方法建立SD-rat SSS-血栓形成模型，缝合应提前准备（图1A），并准备实验所需的设备（图1B）。由于操作的微妙性，模型的准备需要在解剖显微镜下完成。主要步骤显示在图2 中。为了便于描述模型血流观测的具体细节，图 3B标记了血流观察区域、骨窗和插头点，还显示了插入 SSS （图 3C）的螺纹插头的状态。模型准备完成后，利用激光斑点血流成像来检测SD大鼠大脑表面的血流（图4A，B）。图4C显示，与中脑动脉（MCA）和毛细血管（CAPs）相比，SSS和桥静脉（BVs）的血流量显著减少。接下来，小动物 MRI 用于从水平位置（图 5A）、下垂位置 （图 5B）和日冕位置 （图 5C）检测 SSS 中螺纹插头的状态。图像显示螺纹插头就位，这证实了 SSS 的栓塞。
图1。线程栓塞和实验条件的图片。 （A） 自制螺纹栓塞的图像（a： 螺纹栓塞头，b： 螺纹栓塞体）。秤条 = 5 毫米 （B） 此实验所需的主要设备。 请单击此处查看此图的较大版本。
图2。SD-大鼠SSS-血栓形成模型的主要步骤。 （A） 用钳子夹住SD大鼠后肢的脚趾，以验证麻醉是否成功。（B） 将 SD 大鼠固定在立体氧化装置上，对头顶的表面进行消毒。（C） 切皮肤。（D） 剥去顶部筋膜和围骨，并完全暴露头骨。（E） 钻和抛光观察区和骨窗的头骨，直到血管清晰可见。（F） 小心地用钳子去除骨窗上的骨碎片，以避免撕裂 SSS。（G） 选择合适的螺纹插头。（H） 使用注射器针刺穿插头点并快速插入螺纹插头。（I） 调整螺纹插头和 SSS 之间的角度。（J） 慢慢插入缝合线。（K） 直到尖端到达鼻窦汇合的后边缘。（L） 缝合头皮。 请单击此处查看此图的较大版本。
图3。SD大鼠的观察和操作。 （A） 显示 SD 大鼠顶部头骨的解剖地标，以方便 SSS 的位置（a： 布雷格玛，b： 后布雷格玛）。（B） 红色圆形矩形区域为血流观察区，蓝色圆形矩形区域为骨窗。红色圆形区域是插头点，箭头指向优越的下垂窦。（C） 从插头点（蓝色箭头）插入 SSS 的插头状态。白色箭头指向插头的主体，而红色箭头指向螺纹头。比例栏 = 2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
图4。线程栓塞插入前后的血流比较。栓塞前和（B）SD大鼠脑血流的激光斑点血流成像。右边的蓝到红柱代表从小到大的血流量值范围。在（A），选定的投资回报率被标记 （a： SSS， b： BV， c： MCA， d： CAP）.（C） 显示相对脑血流量的条形图 （CBF）。对方差的单向分析显示，SSS 和 BV 的血流量显著下降（#P <0.001 vs. MCA 和 CAP;* P <0.001 与 MCA 和 CAP）。比例尺 = 1 毫米。请单击此处查看此图的较大版本。
图5。核磁共振检查结果。 小动物 MRI 从水平（A）、下垂（B）和日冕（C）位置显示 SSS 中的螺纹插头（由黑色箭头显示）的状态。比例栏 = 2 毫米。 请单击此处查看此图的较大版本。
| CVST 动物模型 | 局限性 |
| 简单的 SSS -连体模型 | 脑皮层损伤，永久遮挡 |
| SSS 内部注射加速器模型 | 脑皮层损伤，自发再归化，缺血时间和位置不准确 |
| 铁氯化物诱导的 SSS 血栓形成模型 | 脑皮层损伤，自发再归化 |
| 光化学诱导的SSS血栓形成模型 | 脑皮层损伤，自发再归化 |
| 自制栓塞-遮挡模型 | 脑皮层损伤，永久遮挡，复杂操作 |
表1：CVST动物模型的缺点。
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Discussion
在这项研究中，通过将自制螺纹插头插入SD大鼠的SSS，成功建立了一种新型的CVST模型。此外，激光斑点血流成像和小动物MRI相结合，监测SD大鼠栓塞前后脑部表面血流的变化，以标准化缺血时间和位置。
1989年，隆加等人逆行地将自制尼龙缝合物插入大鼠12的外骨动脉，从而制造了可逆的MCA遮挡模型。为了提高这种模式的稳定性，自13日起，已经采用了几种改进的方法。这种MCA闭塞模型能够精确的缺血时间和位置，易于再归，并已广泛应用于脑动脉中风14、15的基础研究。在本研究中，在 MCAO 模型设计的基础上，通过将自制螺纹插头插入 SSS 起始位置的中心，建立了一种新的 CVST 模型。
为了阐明CVST的致病机制，已经建立并实施了多种动物模型（表1）。简单的SSS-连体模型不能避免对动物的大脑皮层6，7的损害。铁氯化物引起的SSS-血栓形成模型也不可避免地造成损害动物的大脑皮层由于氯化铁的毒性9。作为替代模型，螺纹插头可以插入 SSS，以完全避免与大脑皮层接触，这有助于减轻任何皮质损伤。SSS内部注射加速器模型使用光化学方法诱导血栓形成，并有可能重新核化8：此模型使用自制尼龙螺纹插头在固定位置诱导可靠的栓塞。自制栓塞-闭塞模型中使用的栓塞难以建立，这增加了血管内皮细胞的损伤，不能重新归化。此型号中使用的自制螺纹插头由尼龙线和硅凝胶制成。这些材料具有灵活的质地和相对光滑的表面，可最大限度地减少材料本身在建模过程中对大脑皮层和 SSS 内皮细胞造成的损害。SD大鼠的SSS直径有各自的差异。为了排除此参数的影响，线程插头的规格是根据从 SSS 的多次测量中获得的数据和操作经验确定的。此外，这种损伤在拔出插头后很容易恢复，这为随后的 SSS 重新归化提供了可能性。
本研究成功建立了新型CVST模型，最大限度地减少了损伤，实现了精确可控性，并产生了良好的稳定性。此外，小动物MRI和激光斑点血流成像相结合，以验证模型的稳定性，并评估栓塞前后的脑血。综合起来，目前的发现和协议为进一步研究CVST的发生、发展和相关病理生理机制提供了基础。
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Disclosures
作者宣称他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
本研究由福建中医药大学高层次人才科研基金会资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2 mL syringe | Becton,Dickinson and Company | 301940 | |
| brain stereotaxic instrument | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | 68025 | |
| dissecting microscope | Wuhan SIM Opto-technology Co. | SIM BFI-HR PRO | |
| high-speed skull drill | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | 78046 | |
| laser-speckle blood-flow imaging system | Wuhan SIM Opto-technology Co. | SIM BFI-HR PRO | |
| needle holder | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | F31022-12 | |
| needle thread | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | F33303-08 | |
| scissors | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | S13029-14 | |
| silica gel | Heraeus Kulzer | 302785 | |
| small animal anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R540 | |
| small-animal MRI | Bruker Medical GmbH | Biospec 94/30 USR | |
| tweezers | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | F11029-11 | |
| vascular forceps | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | F22003-09 |
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