Summary
이 기사에서는 면역 염색 및 크로마틴 면역 침전의 필수적인 단계를 소개합니다. 이 프로토콜은 일반적으로 DNA 손상 관련 세포 프로세스를 연구하고 DNA 복구에 연루된 단백질의 모집을 시각화하고 정량화하기 위하여 이용됩니다.
Abstract
세포는 다양한 DNA 손상 제에 지속적으로 노출되어 다른 세포 반응을 유도합니다. 생화학적 및 유전적 접근을 적용하는 것은 DNA 손상의 사이트에 있는 DNA 복구 단지의 모집 그리고 조립과 관련되었던 세포 사건을 드러내는 데 필수적입니다. 지난 몇 년 동안, 몇 가지 강력한 도구는 사이트 특정 DNA 손상을 유도 하기 위해 개발 되었습니다. 더욱이, 새로운 정액 기술은 우리가 고정및 살아있는 세포를 둘 다 사용하여 단세포 분해능 수준에서 이 프로세스를 공부할 수 있게 합니다. 이러한 기술은 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 사용되었지만, 본원에서 우리는 DNA 수리 분야에서 가장 널리 사용되는 프로토콜을 제시, 형광 면역 스테인링 (IF) 및 크로마티닌 면역 침전 (ChIP), 이는 엔토뇌 기반 사이트 별 DNA 손상과 함께 DNA 의 유전 적 점유 및 DNA 의 결합을 시각화하고 정량화 할 수 있도록 DNA 수리 요소의 유전 적 점유율을 정량화 할 수 있도록 각각. 이 기술은 DNA 수리 도중 그들의 미세 조정 규칙에 필요한 그들의 번역 후 수정뿐만 아니라 손상된 게놈 궤적에 묶인 새로운 단백질을 확인하기 위하여 연구원을 위한 강력한 공구를 제공합니다.
Introduction
우리의 게놈은 다양한 DNA 손상 에이전트에 의해 끊임없이 도전되고 있습니다. 이러한 공격은 자외선 이나 조사와 같은 환경 공급원뿐만 아니라 산화 스트레스 또는 복제 오류1,2로인한 대사 부산물과 같은 내인성 소스에서 유래할 수 있다. 이러한 병변은 하나 또는 두 DNA 가닥의 무결성에 영향을 미칠 수 있으며, 생성된 오류가 지속되면 자주 전좌 및 게놈 불안정으로 이어지며 종양 발생3,4가발생할 수 있습니다. 게놈 무결성을 유지하기 위해 진화 중에 여러 수리 시스템이 개발되었습니다. DNA 손상의 특정 유형의 화학 적 및 물리적 특성에 따르면, 여러 복구 메커니즘을 활성화 할 수있다. 불일치, 기본 부위, 단일 가닥 휴식 및 8-oxoguanine(8-oxoG)은 불일치 수리 또는 기본 절제 수리 경로5,6에의해 제거될 수 있다. UV 유도 광제품에 의한 병변 및 부피가 큰 부피가 큰 유도체는 뉴클레오티드 절제 수리(NER) 또는 DNA 이중 가닥 파손 수리(DSBR) 공정7,8에의해 수리될 수 있다. NER는 전사 결합 NER(TC-NER)와 글로벌 게놈 NER(GG-NER)의 두 가지 주요 하위 경로로 구성됩니다. 세포 주기 단계에 관해서는, DNA 이중 가닥 침입 유도에 따라, 2개의 하위 통로가 활성화될 수 있습니다: 비동상화 끝 결합 (NHEJ) 및 상동성 재조합 (HR)1,9. 휴식 세포에서 지배적인 통로인 NHEJ는 모든 세포 주기 단계에서 활성화될 수 있으며, 이는 더 빠르지만 오류가 발생하기 쉬운통로(10)를나타내는 다. 한편, HR은 자매 크로마티드의 서열-상동성 검색에 기초하여 DSB를 수리하는 오류 없는 통로이며, 따라서 주로 S 및 G2 세포 주기11상에존재한다. 더욱이, 미세혼모톨로지 매개 엔드 결합(MMEJ)은 이전에 절제된 미세homologous 서열의 재구성 방법을 기반으로 앞서 언급한 것과 구별되는 또 다른 DSB 수리 메커니즘으로, 깨진 DNA 끝을 측면에 두고 있다. 따라서 MMEJ는 오류가 발생하기 쉽고 매우 돌연변이가 있는것으로 간주됩니다.12. DNA 수리 중, DSB는 DNA 손상 반응(DDR)을 유도할 수 있으며, 이는 수리13,14,15동안 세포 주기를 중단시키는 검사점 키나아제의활성화를초래한다. DDR은 병변 주위의 수리 과정의 입회기 키 플레이어의 채용 및 광범위한 확산에 대한 응답으로 활성화되어 수리 초점의 형성에 기여합니다. 이 초기 신호 캐스케이드에서 ATM(아크로바 텔란지엑시아 돌연변이) 키나제는병변(16)의주위에 Ser139(γH2AX라고 함)에서 히스톤 변종 H2AX의 인산화를 촉매하여 중추적인 역할을 한다. 이 초기 이벤트는 추가 수리 요인의 모집과 다운스트림 수리 프로세스의 개시에 대한 책임이 있습니다. 수리 초점에서 모집 된 단백질의 정확한 기능은 아직 완전히 특성화되지 않았지만, 수리 foci의 형성과 역학은 여러 실험실에서 조사되었습니다. 이러한 마커는 수리 운동학을 따르는 데 광범위하게 사용되지만 수리 과정에서 정확한 역할은 여전히 애매합니다. DNA 수리 관련 세포 과정의 중요성이 크지만 이해가 좋지 않았기 때문에 DDR을 유도하고 시각화하기 위해 지금까지 여러 가지 방법이 개발되었습니다.
원하는 유형의 DNA 손상을 유도하기 위해 다양한 방법 및 시스템이 설립되었습니다. 예를 들어, 일부 에이전트 [네오카르지노스타틴 (NCS), 플레오마이신, 블로마이신, γ 조사, UV]는 비예측 게놈 위치에서 많은 수의 무작위 DNA 브레이크를 유도할 수 있으며, 다른 사람(아시시, I-PpoI 또는 I-SceI, 레이저 스트라이프)과 같은 다른 사람(내시경)은 알려진 게놈 로시17,18,19,20,201에서DNA 절연을 유도할 수 있다. 여기에서, 우리는 포유류와 효모 세포에 있는 DDR를 공부하는 데 현재 이용된 엔도뇌리스 기지를 둔 기술에 집중합니다. 이러한 기술의 원리를 강조하는 것 외에도, 우리는 그들의 장점과 단점을 모두 강조합니다.
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Protocol
1. 특정 단백질의 면역 검출
- 세포 배양 및 실험 설정 준비
- 10% 태아 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 1% 항생제 항마이코틱 용액으로 보충된 DMEM 배양 배지의 단층층에서 U2OS 세포를 유지한다.
참고: 엔도누클로스 기반 DNA 손상 유도의 경우, 시스템 누출을 방지하기 위해 숯 처리 또는 스테로이드가 없는 매체를 사용하십시오. - 가습된 5%CO2 환경에서 37°C에서 80%의 수렴까지 세포를 성장시키고, 매 2-3일마다 배지를 갱신한다.
- 배지를 흡인하고 1x PBS로 셀을 세척합니다. 트립신-EDTA 용액으로 세포를 분리합니다. 세포가 분리되면, 세포에 배양 배지를 추가하여 트립신 활성을 중지하여 세포 현탁액을 산출한다.
- 셀 카운팅 챔버를 사용하여 셀을 계산합니다. 플레이트 2 x 104 셀/mL/웰 24웰 플레이트에 멸균 12mm 원형 커버립을 양호한 플레이트.
- 가습 5%CO2 분위기에서 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양하여 커버립에 부착할 수 있도록 한다.
- 손상된 에이전트를 배양 된 배지로 직접 파이프하여 네오카르지노스타틴 (NCS)의 10 ng /mL로 세포를 치료합니다. 15 분 동안 NCS 함유 배지로 세포를 배양 한 다음 1 x PBS로 세척하고 세포에 신선하고 보충 된 배양 배지를 추가하십시오. 그렇지 않으면,중간(22)을새로고하지 않고 엔도누리스 기반 시스템을 통해 DSB를 유도하기 위해 적절한 에이전트(즉, 4-OHT)를 사용한다.
참고: 대안적으로, 2-20 Gy23사이의 중성자 플럭스를 사용하여 30분에서 8h의 회복 시간까지 DNA 손상을 유도하기 위해 조사를 사용한다. - DNA 수리의 역학을 따르는 가습 된 5 % CO2 분위기에서 37 °C에서 1-8 h의 세포를 배양한다.
- 10% 태아 송아지 혈청, 2mM 글루타민, 1% 항생제 항마이코틱 용액으로 보충된 DMEM 배양 배지의 단층층에서 U2OS 세포를 유지한다.
- 셀 고정
참고: 300-500 μL의 솔루션/웰은 모든 세포를 적절하게 커버하기 위해 다음 단계(1.2-1.5 단계)에 사용해야 합니다. 각 배양 및 세척 단계 (항체 배양을 제외하고)는 부드러운 동요가있는 궤도 셰이커에서 수행되어야한다.- DSB 유도 및 세포의 인큐베이션에 따라 부착 된 세포에서 배지를 제거하고 1 x PBS로 한 번 세포를 씻으신다.
- 25°C에서 20분 동안 포름알데히드-PBS 용액을 4% 고정합니다.
- 세포의 투과성
- 고정 용액을 제거하고 각각 5 분 동안 1 x PBS로 셀을 세 번 세척하십시오.
- PBS를 제거하고 PBS에 용해된 0.2% 트리톤 X-100을 추가합니다. 샘플을 20분 동안 배양합니다.
- 비특이적 바인딩 사이트 차단
- 1x PBS로 셀을 세 번 씻으시면 됩니다.
- PBST(1x PBS가 0.1% Tween-20으로 보충됨)에서 희석된 5% BSA(소혈분획 V 알부민)를 가진 비특이적 결합 부위를 차단하고, 퍼메아빌화된 샘플을 최소 20분 동안 배양한다.
- 면역형광 염색
- 1% BSA-PBST 용액으로 희석된 1차 항체(즉, 안티γH2AX, 안티 DNA-PKcs)의 적정량을 첨가한다. 각 커버슬립을 희석된 γH2AX 항체의 10 μL 액적 위에 파라핀 필름에 거꾸로 놓습니다.
참고: 공존면역스테인링의 경우 동일한 1% BSA-PBST 용액에서 두 항체를 적절히 희석한다. - 4°C에서 1.5시간 동안 습도 챔버에서 샘플을 배양한다.
참고: 인큐베이션은 하룻밤 사이에 4°C에서 수행될 수도 있습니다. - 커버립을 24웰 플레이트에 다시 올려 놓고 1x PBS로 5분 동안 세 번 씻습니다.
- 1% BSA-PBST에서 희석된 이차 항체의 적당한 양을 추가합니다. 각 커버슬립을 희석된 항체의 10 μL 액적 위에 파라핀 필름에 거꾸로 놓습니다.
- 1h에 대한 4 °C에서 습도 챔버에서 샘플을 배양.
- 커버립을 24웰 플레이트에 다시 올려 놓고 1x PBS로 5분 동안 세 번 씻습니다.
- 마지막 PBS 세척 용액을 제거하기 전에 트위저와 바늘을 사용하여 커버립을 부드럽게 꺼낸 다음 장착 매체의 액적(DAPI로 보완)이 있는 유리 슬라이드에 거꾸로 놓습니다.
참고: 기포형성을 피하십시오. 마운팅 매체가 건조하면 샘플의 수축을 방지하기 위해 매니큐어로 커버립의 가장자리를 밀봉하는 것이 좋습니다.
- 1% BSA-PBST 용액으로 희석된 1차 항체(즉, 안티γH2AX, 안티 DNA-PKcs)의 적정량을 첨가한다. 각 커버슬립을 희석된 γH2AX 항체의 10 μL 액적 위에 파라핀 필름에 거꾸로 놓습니다.
2. 크로마틴 면역 침전
- 세포 수집, 교차 연결, 세포 및 핵 리시스 및 DNA 단편화
- 각 샘플에 대해 150mm 접시에 약 5 x 106 셀/mL을 배양합니다.
- 배양 배지를 제거하고 얼음차가운 1x PBS로 세포를 두 번 씻으시다.
- 1% 포름알데히드-PBS 용액으로 세포를 고정하고, 플레이트를 궤도 셰이커에 놓고, 20분 동안 부드럽게 교반합니다.
참고: 포름알데히드는 휘발성입니다. 항상 새로운 작업 솔루션을 준비합니다. 경우에 따라 포름알데히드 용액은 메탄올을 함유하여 안정화하지만, 다운스트림 반응과의 간섭을 피하기 위해 메탄올이 없는 솔루션을 사용하는 것이 좋습니다. - 125m 글리신으로 고정을 중지하고 25 °C에서 5 분 동안 부드러운 교반궤도 셰이커에 배양하십시오.
- 접시를 얼음 위에 놓고 얼음으로 차가운 1x PBS로 두 번 씻으시면 됩니다.
- 얼음 차가운 1x PBS에서 세포를 긁어 15 mL 원추형 튜브로 옮춥춥시다.
- 4°C에서 5분 동안 2,500 x g의 세포원심분리기.
- 셀 리시스 버퍼 [5mM PIPES pH 8.0, 85m KCl, 0.5% NP-40, 1x PIC(프로테아제 억제제 칵테일)] 및 10분 동안 얼음에 배양하여 2mL의 셀 리시스 버퍼에서 펠릿을 조심스럽게 흡인하고 재보종한다.
- 4°C에서 5분 동안 2,500 x g의 세포 현탁액을 원심분리합니다.
- 핵용 리시스 버퍼(50m Tris-HCl pH 8.0, 10mM EDTA pH 8.0, 0.8% SDS, 1x PIC)로 상체를 조심스럽게 폐기하고 펠릿을 30-60분 동안 얼음에 배양한다. 용양을 초음파 처리에 적합한 폴리스티렌 원내 튜브로 옮기십시오.
참고: 핵 용해 버퍼에는 SDS가 포함되어 있으므로 얼음에 침전되고 솔루션이 흰색으로 바뀝니다. 솔루션은 초음파 처리 다음 투명하게 설정해야합니다. - 300-1,000 bp의 평균 단편 크기로 DNA를 전단하기 위해 용액을 초음파 처리합니다.
참고: 적절한 초음파 처리 주기 및 조건은 셀 유형 및 초음파 처리 장비에 따라 설정해야합니다. 200 bp 보다 작은 단편은 핵-DNA 상호 작용이 중단될 수 있기 때문에 ChIP에 적합하지 않습니다.
- 교차 연결의 반전, 초음파 조각 크기의 결정
- 초음파 처리된 샘플의 100 μL을 꺼내 초음파 염색체의 조각 크기를 확인합니다. 나머지 크로마틴은 -80 °C에 저장해야합니다.
- 샘플의 각 100 μL에 0.5 mg/mL RNase A를 추가하고 RNase를 활성화하기 위해 20 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 하룻밤 사이에 65°C에서 샘플을 배양합니다.
- 다음 날, Proteinase K의 500 μg/mL과 0.5% SDS를 추가하고 샘플을 50°C에서 3시간 동안 배양합니다.
- 각 샘플에 페놀 0.5부피와 0.5부부클로로폼-이소아밀 알코올 믹스(24:1)를 첨가한다.
- 1 분 동안 소용돌이.
- 13,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 상부 수성 상면을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
- 각 샘플에 1부클로로폼 이소아밀 알코올 믹스(24:1)를 추가합니다.
- 1 분 동안 소용돌이.
- 13,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 상부 수성 상면을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
- 에탄올 96%, M Na-아세테이트 pH 5.2의 0.1권으로 2.5권 추가한다.
- -80°C에서 최소 20분 동안 배양하십시오.
- 4°C에서 10분 동안 13,000 x g의 샘플을 원심분리합니다.
- 에탄올을 제거하고 70% 에탄올의 400 μL로 펠릿을 세척합니다.
- 4°C에서 10분 동안 13,000 x g의 샘플을 원심분리합니다.
- 에탄올을 제거하고 펠릿을 공기 건조시다.
- 10 μL의 TE로 펠릿을 다시 중단합니다.
- 0.8% 아가로즈 젤로 샘플을 실행합니다. 초음파 처리 된 크로마틴 크기는 약 500 bp여야합니다.
참고: 브로모페놀 블루 프리 로딩 버퍼를 사용했는데, 이는 이 염료의 크기가 약 500bp이므로 크로마틴 조각의 적절한 검출을 방해할 수 있습니다. 대신 약 3,000bp인 자일렌-시아놀로 보완된 적재 버퍼를 사용하는 것이 좋습니다. - 크로마틴 크기가 허용되는 경우, 2.1 단계에서 냉동 크로마틴 샘플을 희석시. 3부권에서 희석 버퍼(10m Tris-HCl pH 8.0, 0.5mM EGTA pH 8.0, 1% 트리톤 X-100, 140mM NaCl, 1x PIC)에서 4°C에서 10분 동안 회전을 통해 샘플을 혼합한다.
참고: 이 단계는 크로마틴 농도의 측정을 포함하여 다운스트림 반응과의 간섭을 피하기 위해 핵 리시스 버퍼에 존재하는 SDS를 희석하는 것이 필요하다. - 분광계를 사용하여 260/280 nm에서 크로마틴 샘플의 DNA 농도를 측정합니다.
- 구슬 준비, 사전 정리 및 면역 침전
- 사전 개간 및 면역 침전 단계를 위해 구슬(양 안티래빗 또는 마우스 IgG)을 준비합니다. RIPA 버퍼 (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1 % 트리톤 X-100, 0.1 % Na-DOC, 0.1 % SDS, 150m M NaCl 및 1X PIC)로 4 °C에서 10 분 동안 두 번 구슬을 씻으시다.
- 2.3.1 단계와 동일한 RIPA 버퍼볼륨으로 구슬을 다시 일시 중지합니다.
- 4°C에서 1-2h의 회전을 통해 구슬의 4 μL을 가진 각 시료의 25-30 μg 크로마틴을 미리 치우게 한다.
참고: 각 크로마틴 샘플에 RIPA 버퍼를 최대 500μL의 최종 부피로 추가하여 샘플이 회전 하에서 제대로 섞일 수 있도록 합니다. 각 샘플 세트의 경우 NAC(항체 제어 없음) 및 TIC(총 입력 제어)에 대한 크로마틴을 꺼내는 것을 잊지 마십시오. TiC는 최대 200μL의 최종 부피만 필요합니다. - 자석으로 구슬을 침전시키고 상체를 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
- 각 크로마틴 샘플(NAC 및 TIC 제외)에 적절한 양의 항체를 추가하고 4°C에서 하룻밤 동안 회전합니다.
- 다음 날, 각 샘플 (TIC 제외)에 40 μL의 세척 구슬을 추가하고 4 ° C에서 회전, 하룻밤 인큐베이션.
- 세탁
- 저염 완충제 300μL(20m Tris-HCl pH 8.0, 150m NaCl, 2mM EDTA pH 8.0, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 1x PIC)로 한 번 4°C에서 회전하여 10분 간 세척합니다.
- 고염 버퍼 300 μL(20m Tris-HCl pH 8.0, 300mM NaCl, 2mM EDTA pH 8.0, 1% 트리톤 X-100, 0.1% SDS, 1x PIC)로 한 번 세척하여 4°C에서 회전을 통해 10분 간 세척합니다.
- LiCl 버퍼 300 μL(250m LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1mM EDTA pH 8.0, 10mM Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC)로 한 번 세척하여 4°C에서 회전을 통해 10분 간 세척합니다.
- 300 μL의 TE(10m Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA pH 8.0)로 회전을 통해 10분 간, 첫 번째 세척은 4°C에서, 두 번째 세척은 25°C에서 세척한다.
- 용출
- 용출 버퍼(1% SDS 및 100m NaHCO3)의200μL을 구슬에 넣고 65°C에서 연속 흔들림(약 400 RPM)으로 열 셰이커에 인큐베이트합니다. 200μL의 용출 버퍼에서 상체를 새로운 튜브로 옮기고 다시 엘루트 구슬로 옮김합니다. 용출액(400 μL 최종 부피)을 결합합니다.
- 각 샘플에서 200mMMM의 최종 농도에 NaCl을 추가합니다. 200 μL의 용출 버퍼로 TIC 샘플을 보완하고 NaCl도 추가합니다.
참고: 이 단계에서 TIC는 다른 샘플과 동일한 조건에서 처리해야 합니다. - 적어도 6 h에 대한 65 °C (흔들림없이)에서 샘플을 배양.
- 각 샘플에 1mL의 감기 100% 에탄올을 추가하고, 튜브를 두 번 회전하여 혼합하고, -80°C에서 하룻밤 사이에 DNA를 침전시합니다.
- 다음 날, 원심분리기는 4°C에서 13,000 x g에서 30분 동안 원심분리기를 합니다.
- 상체를 버리고 70 % EtOH로 펠릿을 씻으십시오.
- 4°C에서 10분 동안 13,000 x g의 샘플을 원심분리합니다.
- 상체를 버리고 펠릿을 건조시합니다.
- 100 μL의 TE로 펠릿을 다시 중단하고 각 샘플에 RNase A의 0.5 mg/mL을 추가합니다. RNase를 활성화하기 위해 20 분 동안 37 °C에서 배양하십시오.
- 교차 연결의 반전
- Proteinase K의 500 μg/mL과 0.5% SDS를 추가한 다음 샘플을 50°C에서 2시간 동안 배양합니다.
참고: ChIP-seq로 진행하는 경우, 하류 NGS 공정을 저해하므로 페놀 클로로폼 추출을 피하십시오. 대신, 시판되는 키트를 사용하는 것이 좋습니다 (재료의 표참조). - 각 샘플에 페놀 0.5부와 클로로폼 이소아밀 알코올 믹스(24:1)를 0.5부 더넣습니다.
- 1 분 동안 소용돌이.
- 13,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 상부 수성 상면을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
- 각 샘플에 클로로폼 이소아밀 알코올 믹스(24:1)를 1부 추가합니다.
- 1 분 동안 소용돌이.
- 13,000 x g에서 10 분 동안 원심 분리기.
- 상부 수성 상면을 새로운 미세 원심 분리기 튜브로 옮기십시오.
- Proteinase K의 500 μg/mL과 0.5% SDS를 추가한 다음 샘플을 50°C에서 2시간 동안 배양합니다.
- DNA 추출
- 에탄올 96%, M Na-아세테이트 pH 5.2의 0.1권으로 2.5권 추가한다.
- -80°C에서 최소 20분 동안 배양하십시오.
- 4°C에서 10분 동안 13,000 x g의 샘플을 원심분리합니다.
- 에탄올을 제거하고 70% 에탄올의 400 μL로 펠릿을 세척합니다.
- 4°C에서 10분 동안 13,000 x g의 샘플을 원심분리합니다.
- 에탄올을 제거하고 펠릿을 공기 건조시다.
- 50 μL의 TE로 펠릿을 다시 중단합니다.
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Representative Results
세포에서 사이트 지향 DSB 유도 수리 프로세스를 연구하는 것은 안정적이거나 일시적인 과도 성 전도를 통해 달성 될 수있다. 그러나, 안정적인 형질전환이 균일하고 안정적인 세포 집단을 보장한다는 점에 유의해야 하며, 이는 통일되고 따라서 더 신뢰할 수 있는 세포 반응을 제공합니다. 일시적인 과도의 경우, 세포 인구의 극히 비율만이 실험에 다양성을 도입하는 플라스미드를 차지하고 유지합니다. ER-I-PpoI 또는 ER-AsiSI 엔도누셀 기반 세포 시스템을 확립하려면 50% 컨실릭 세포 집단이 필요하며, 이는 엔도나클로리스를 코딩하는 플라스미드로 보다 효과적으로 연관됩니다. 형질 전환의 경우, 시판되는 트랜스페트 시약 또는 바이러스 감염 기반 방법도 사용될 수 있다. 현미경 시각화 기술이 적용되고 과도 성 과도 형질이 필요한 경우, 지시된 DSB는 ER-융합 엔도넬리스에 결합하고 핵 전좌 및 DSB 유도를 허용하는 트랜스퍼션 후 24h4H에 의해 유도될 수 있다. 가장 적합한 시간 점을 결정하기 위해 4-OHT 처리 에 이어 다른 시간 지점에서 γH2AX의 면역 형광 계 현미경 및 서부 블롯 검출을 수행할 수 있습니다. 생리학적 조건하에서, 세포당 최대 10-15γH2AX 포시를 검출할 수 있으며, 강력한 수리 포시의 형성은 엔도넬리스(또는 여기에 설명되지 않은 다양한 다른 기술(예를 들어, 레이저 미세방사선)에 의해 유발될 수 있다. 대표적인 I-PpoI 엔도누클로스는 리보소말 DNA(rDNA)에서 DSB를 유도함으로써 핵 주위의 높은 γH2AX 신호의 형성으로 이어집니다. NHEJ 또는 HR에 의해 중단을 수리하는 경우 시간이 지남에 따라 수리 foci 수가 줄어듭니다. 이러한 이유로 4-OHT 트리트먼트에 따라 0h, 30분, 1, 2, 4, 8h의 대표적인 타임포인트를 추천합니다. DNA 복구 프로세스를 추적하기 위하여는, 가장 일반적으로 이용되는 세포주는 모든 알려진 복구 통로가 이 세포에서 완전하게 작동하기 때문에, U2OS입니다. 동일한 세포에서 여러 단백질을 조사할 때, 상이한 형광파장과 접합된 항체를 도 1에도시된 바와 같이 다른 동물 종에서 발생시키는 상이한 방출 파장을 결합하여 공동 국소화를 연구할 수 있다. 그 결과, 유도할 수 없는 안정세포수를 통한 DSB의 유도는 헤마글루티닌 태그(HA)와 융합된 ER-AsiSI 제한 엔도누셀리스를 기반으로 표현된다. 독시사이클린은 HA에 대한 항체를 사용하여 추적할 수 있는 세포질에서 HA-ER-AsiSI의 발현 및 격리를 유도할 수있다(도 1.제3 컬럼, 제2 원시). 4-OHT를 가진 4h, 24h 독시사이클린 첨가 후 4h의 배양은, 엔도넬리스가 핵으로 전이되었기 때문에 많은 수의 DSB를 유도할 수있다(도 1.제3 컬럼, 제3 원시 및 제3 컬럼, 제3 원시 컬럼, 제3 원시). DSB는 γH2AX를 인식하는 항체를 사용하여 시각화될 수 있다.
도 1: 면역형광 현미경검사는 HA-ER-AsiSI를 발현하는 배양 된 세포에서 γH2AX를 검출하는 데 사용됩니다. DOX(독시사이클린) 첨가는 HA-ER-AsiSI 및 4-OHT(4-하이드록시타목시펜)(4h)의 세포질 발현을 활성화시켜 융합 단백질의 핵 전좌를 유도하여 알려진 게놈 위치에서 DSB의 유도로 이어집니다. HA(헤마글루티닌) 염색(anti-HA 항체)은 HA-ER-AsiSI 융합 단백질을 녹색으로 나타내며, 휴식의 유도는 γH2AX 염색(anti-γH2AX 항체)에 의해 적색으로 확인된다. 배율 막대는 20 μm을 나타냅니다.
손상 부위에서 수리 단백질의 공동 국소화는 동일한 DNA 병변 부위에 모집되지만 반드시 서로 상호 작용하는 것은 아닙니다. 공초점 현미경 검사법의 해상도는 약 300 nm; 휴식 부위에서 특정 수리 단백질의 결합 패턴을 결정하기 위해, 슈퍼 해상도 현미경 검사법 (STORM)은 대신 권장 24. 그러나,이 방법은 비싼 현미경 장비와 전문 연구원을 필요로한다. 대안적으로, 수리 단백질의 결합 패턴은 각각17,21의규제 방식으로 아시SI 및 I-PpoI 엔도니션을 발현할 수 있는 DIvA 또는 U2OS-pEP15 안정세포주를 사용하여 크로마틴 면역 침전증에 의해 검사될 수 있다. 4-OHT 첨가시, 두 엔도니션은 우리에게 예상 휴식 부위와 주변 게놈 부위에 궤적 특정 프라이머를 설계 할 수있는 기회를 제공하는 순서 특정 방식으로 DNA를 절단 할 수 있습니다. ChIP의 면역 침전 부에 γH2AX 항체를 적용함으로써, 우리는 다양한 조건(예: 관심있는 특정 수리 인자의 침묵 또는 억제와 같은) DNA 복구 운동학을 일시적으로 따를 수 있다( 즉, DNA-PKcs). ChIP-qPCR을 사용하여 얻은 전형적인 실험 결과는 도 2로표현된다. 그 결과, γH2AX의 측두풍농축은 I-PpoI 유도 DNA 손상에 대한 반응으로서 입증된다. 이미지의 왼쪽 부분에, 적시에 검출된 γH2AX 신호는 브레이크 부위에 도시되고, γH2AX 분포는 DSB가 유도되지 않은 대조군 유전자 영역에서 표현된다.
도 2: I-PpoI 유도 DNA 손상에 대한 응답으로 크로마틴 면역 침전증에 의해 결정된 바와 같이 γH2AX의 시간적 농축. 왼쪽, 터지는 부위에서 γH2AX 신호; 오른쪽, DSB가 유도되지 않은 대조군에서 γH2AX 분포(anti-γH2AX 항체). 상기 결과는 하나의 생물학적 실험으로부터 유래되고, 오차바는 해당 샘플 복제의 변동을 나타낸다. N=3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
DNA 수리는 비교적 최근의 연구 분야이지만, 우리의 지식은 다양한 생화학 적 및 현미경 방법의 도움으로 급속하게 확장되고 있습니다. 유전 정보를 보존하는 것은 복구 프로세스에 관련되나는 유전자에서 생기는 돌연변이가 종양 발생의 주요 원인 중 하나이기 때문에 세포에 중요하고 그러므로 DNA 복구 통로의 중요한 단계를 해명하는 것은 필수적입니다.
생화학 적 기술 (즉, 서양 얼룩, 면역 침전, 질량 분석 등)은 많은 수의 세포를 필요로하며 연구 된 수리 과정은 원하는 세포 집단의 스냅 샷을 나타냅니다. ChIP 실험을 수행하는 것은 가공, 번거롭고 DSB 수리 과정을 연구하기 위해 특정 실험을 설계할 때 고려해야 합니다. 다음 단계는 몇 가지 예입니다: (I) 세포는 제대로 lysed해야; 크로마티틴 분획(II) 크로마틴에 대한 접근성이 높을 수 있도록 별도의 세포 및 핵 용해 버퍼를 사용하여 2단계 용해 방법을 적용하는 것이 매우 좋습니다. 초음파 처리의 적절한 조건은 사전에 각 세포 유형에 최적화되어야한다 (III) 정제 된 항체의 적절한 양은 다른 회사에서 동일한 단백질에 대한 항체가 효율적인 면역 침전을위한 비 동일 특성 (IV)을 나타내기 때문에 결정되어야하며, 25-30 Ug 초기 크로마틴은 각 조건 (V)에 적절한 수정 시간을 사용해야합니다, 최적화의 적절한 시간을 최적화해야 과고착이 먼 단백질 복합체와 과소 고정을 교차 연결하여 거짓 양성 결과를 초래할 수 있기 때문에 적용된 항체에 기초하여 DNA와 원하는 단백질(VI) 사이의 적절한 교차 연결을 방지할 수 있으며, 구슬의 종류(단백질 A 또는 G)는 세척 단계에서 신중하게 결정되어야 하며, 세척 단계 동안 세척 버퍼의 순서는 철저히 유지되어야 하며, 세척 버퍼의 순서는 DNA로부터의 방출을 피하기 위해 철저히 유지되어야 한다(DNA) 추출 시, 세척 버퍼의 순서를 철저히 유지해야 한다. 페놀 추적은 추가 다운스트림 반응의 효율성을 감소하지 않도록 제대로 제거되어야 합니다. 이 방법은 복구 된 DNA의 수율을 감소시키기 때문에, 우리의 개인적인 조언은 오히려 특정 DNA 정화 키트를 사용하는 것입니다. 모든 중요 점을 제대로 해결하면 ChIP는 서로 다른 게놈 로치에서 원하는 단백질의 점유율을 위한 귀중한 데이터를 제공할 수 있으며 DNA 수리 프로세스에서 중요한 단계를 해명할 수 있습니다.
그러나, qPCR과 결합된 ChIP는 선택된 게놈 지구에서 단백질 분포를 연구하는 간접적인 접근법이며 DNA 결합 부위를 구체적으로 인식하거나 단백질의 기능을 직접 검사하는 것을 허용하지 않는다. 단백질-DNA 복합체를 포착하는 데 사용되는 모노-또는 다각성 항체는 또한 거짓 양성 데이터로 이어지는 다른 단백질과 상호 반응할 수 있으며, 따라서 이 기술에 사용되는 항체는 관심 있는 단백질에 대해 ChIP 등급 및 매우 특이적이어야 한다. 그러나 ChIP는 널리 사용되는 기술이며 이를 기반으로 한 추가 접근 방식이 개발되었으며, 이러한 ChIP-on-chip 및 ChIP-seq. 전자는 단백질 결합 부위에 대한 귀중한 정보를 제공하는 어닐링 된 서열을 더욱 증폭시키는 다양한 작은 무작위 DNA 서열로 마이크로 어레이에 면역 침전 및 정제 된 DNA 단편을 혼성화하는 데 의존합니다. 그러나 ChIP-seq는 ChIP-on-chip 및 고처리량 게놈 시퀀싱보다 높은 해상도로 단백질 DNA 복합체의 게놈 전체 매핑을 제공하기 때문에 매력적인 대체 접근법으로 부상했습니다. ChIP-seq는 유전자 조절에 대한 통찰력을 제공하고 게놈 전체25에서크로마틴 풍경을 해명하는 다양한 전사 요인의 DNA 결합 부위를 공개함으로써 DNA 수리 분야에 혁명을 일으켰습니다. 이에 따르면, DNA 수반 분야는 이러한 데이터가 암 진행과 같은 다양한 질병 및 생물학적 경로에서 중요한 역할을 하기 때문에 ChIP-seq로부터 엄청난 이익을 얻었습니다. 그럼에도 불구하고, ChIP 방법의 다양한 변형은 HaloChIP와 같이 개발되어 왔으며, 이는 관심있는 단백질에 대하여 특정 항체를 필요로 하지 않고 오히려 HaloTag와 융합된 DNA 결합 단백질을 코딩하는 서열을 사용하여, 이는 세포에 전염되고 그 이후에 교차하기 위하여, 원하는 단백질 DNA 복합체는 HaloLink 수지를 사용하여 포획될 수 있다. 그러나, 이 기술은 과발현에 의존하며, 잘못된 해석된데이터(26)를초래할 수 있는 원하는 단백질의 내인성 수준이 아니다.
더욱이, 현미경 기술은 단일 세포 수준에서조차 DNA 손상 복구의 현면 추적에 관하여 귀중한 정보를 제공합니다. 특정 수리 단백질에 대해 제기 된 항체의 급속한 개선은 NER및 DSBR 하위 경로의 메커니즘뿐만 아니라 번역 후 조절에 대한 깊은 이해를 이끌어 냈습니다. 현미경 필드는 뉴클레오소피 수준에서 DNA 손상 유도 세포 과정의 시각화를 가능하게 하는 초해상도 현미경 검사법과 같은 고해상도 기술에 의해 혁명을 일으켰으며, 단백질 공동국소화(24)의정확한 매핑을 보장한다. 그러나, 검사속도가 발산될 수 있으므로 실험 중에 세포 혈통의 분산을 고려해야 하며, 이는 결과를 해석하기 어렵게 만들 수 있다. 형광 영상 방법론의 급속한 진화와 실험 설정의 의도적인 설계를 고려할 때, 단일 세포 수준에서 단일 단백질 해상도에서 DNA 손상 유발 세포 및 분자 반응을 조사할 수 있는 소중한 기회가 완벽에 도달하고 있다.
결론적으로, 초해상도 현미경 검사법과 단세포 염기서열 분석 방법론의 조합은 DNA 수리 필드에 대한 우리의 이해를 크게 향상시킬 수 있습니다.
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Disclosures
없음
Acknowledgments
이 연구는 국가 연구 개발 및 혁신 사무소 보조금 GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, 헝가리 과학 BO/27/20의 자노스 볼라이 연구 장학금, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO 단기 펠로우십 8513, 템퍼스 재단 8513.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
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