Summary
この記事では免疫染色とクロマチン免疫沈降の重要なステップを紹介します。これらのプロトコルは、DNA損傷関連の細胞プロセスを研究し、DNA修復に関与するタンパク質の採用を視覚化し、定量化するために一般的に使用されます。
Abstract
細胞は様々なDNA損傷剤に継続的に曝され、異なる細胞応答を誘導する。生化学的および遺伝的アプローチを適用することは、DNA損傷部位におけるDNA修復複合体の募集および組み立てに関連する細胞事象を明らかにする上で不可欠である。ここ数年、部位特異的なDNA損傷を誘発するための強力なツールが開発されました。さらに、新しい精液技術により、固定細胞と生細胞の両方を用いて、単一細胞分解能レベルでこれらのプロセスを研究することができます。これらの技術は様々な生物学的プロセスの研究に使用されてきたが、本明細書では、エンドヌクレアーゼベースのサイト特異的DNA損傷と組み合わせて、DNA修復の分野で最も広く使用されているプロトコルを提示し、指示された方法でDNA修復因子のゲノム占有率を視覚化し、定量化することを可能にする それぞれ。これらの技術は、損傷したゲノム遺伝子座に結合した新しいタンパク質を同定するための強力なツールと、DNA修復中の微調整調節に必要な翻訳後の改変を同定するための強力なツールを提供する。
Introduction
私たちのゲノムは、様々なDNA損傷剤によって絶えず挑戦されています。これらの攻撃は、紫外線や照射などの環境源、ならびに酸化ストレスまたは複製エラーによって引き起こされる代謝副産物などの内因性源から派生することができる1,2。これらの病変は、一方または両方のDNA鎖の完全性に影響を及ぼし、かつ、発生したエラーが持続する場合、転座やゲノム不安定性を頻繁に引き起こし、腫瘍形成3、4を生じる可能性がある。ゲノムの完全性を維持するために、進化の間に複数の修復システムが開発されました。特定の種類のDNA損傷の化学的および物理的特性に従って、複数の修復メカニズムを活性化することができる。不一致は、基本的な部位、一本鎖の破断、及び8-オキソグアニン(8-oxoG)は、ミスマッチ修復または塩基切除修復経路5,6によって除去することができる。UV誘導光産物および嵩高い付加物によって引き起こされる病変は、ヌクレオチド切除修復(NER)またはDNA二本鎖破断修復(DSBR)プロセス7、8によって修復することができる。NERは、転写結合型NER(TC-NER)およびグローバルゲノムNER(GG-NER)の2つの主要なサブ経路から構成されています。細胞周期相に関しては、DNA二重鎖破断誘導に続いて、2つのサブ経路を活性化することができる:非相同端接合(NHEJ)および相同組換え(HR)1,9。静止細胞における支配的な経路であるNHEJは、すべての細胞周期段階で活性化することができ、より速いがエラーが起こりやすい経路10を表す。一方、HRは、エラーのない経路であり、姉妹クロマチドの配列相同性検索に基づいてDSBが修復され、したがって主にSおよびG2細胞周期段階11に存在する。さらに、マイクロホモロジー媒介末結合(MMEJ)は、前述のものとは異なる別のDSB修復機構であり、壊れたDNA末端に隣接する以前に切除された微ホモホノラス配列のKU70/80およびRAD51独立した再結合の方法に基づく。したがって、MMEJはエラーが起こりやすいと考えられ、非常に変異性の高い12.DNA修復中に、DSBはDNA損傷応答(DDR)を誘導し、修復13、14、15の間に細胞周期を停止するチェックポイントキナーゼを活性化する。DDRは、病変の周りの修復プロセスのイニシエーターの主要プレーヤーの採用と広範な普及に対する応答として活性化され、修復焦点の形成に寄与する。この初期のシグナル伝達カスケードにおいて、ATM(運動失調毛血管拡張症変異体)キナーゼキナーゼは、病変16の周囲のSer139(γH2AXと呼ばれる)でヒストン変異体H2AXのリン酸化を触媒することによって極めて重要な役割を果たす。この初期のイベントは、追加の修復要因の募集と下流の修復プロセスの開始を担当します。修復焦点での採用タンパク質の正確な機能はまだ完全に特徴付けられていないが、修復病巣の形成とダイナミクスは、いくつかの研究所によって調査されている。これらのマーカーは、修復キネティクスに従うために広く使用されていますが、修復プロセス中の正確な役割は依然として不可解です。DNA修復関連の細胞プロセスの理解が非常に重要でありながら、DDRを誘導し、可視化するためにこれまでにいくつかの方法が開発されてきました。
所望のDNA損傷を誘発するために、様々な方法やシステムが確立されています。例えば、一部の薬剤(ネオカルジノスタチン(NCS)、フェレオマイシン、 ブレオマイシン、γ照射、UV]は、非予測的なゲノム位置で多数のランダムDNA切断を誘発し、他の(AsiSI、I-PpoIまたはI-SceI、ならびにレーザーストライピングなどのエンドヌクレアーゼ)は、既知のゲノム座17、18、19、20、21でDNA切断を誘発することができる。ここでは、哺乳類および酵母細胞におけるDDRの研究に現在用いられているエンドヌクレアーゼベースの技術に焦点を当てる。これらの技術の原理を強調する以外に、我々は彼らの長所と短所の両方を強調する。
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Protocol
1. 特定タンパク質の免疫検出
- 細胞培養の調製と実験のセットアップ
- 10%の胎児の子牛血清、2 mMグルタミンおよび1%の抗生物質抗抗薬溶液を添加したDMEM培地中の単層のU2OS細胞を維持する。
注: エンドヌクレアーゼベースのDNA損傷誘導の場合は、システムの漏れを避けるために、炭処理またはステロイドフリーの媒体を使用してください。 - 加湿した5%CO2 環境で、37°Cで80%の合流まで成長させ、2〜3日ごとに培地を再生します。
- 培地を吸引し、1x PBSで細胞を洗浄します。トリプシン-EDTA溶液で細胞を取り外します。細胞が剥離すると、細胞に培地を添加してトリプシン活性を停止し、細胞懸濁液を生じる。
- 細胞計数チャンバーを使用してセルをカウントします。24ウェルプレートに2 x 10個の4 セル/mL/wellをプレートし、各ウェルに無菌12mmの丸いカバーリップを付けます。
- 加湿した5%CO2雰囲気中の37°Cで24時間細胞をインキュベートし、カバーリップに付着させます。
- 細胞を10ng/mLのネオカルジノスタチン(NCS)で、有害物質を培養培地に直接ピペット化して治療する。NCS含有培地で細胞を15分間インキュベートし、1x PBSで洗浄し、新鮮な補充された培養培地を細胞に加えます。それ以外の場合は、適切なエージェント(すなわち、4-OHT)を使用して、培地22をリフレッシュすることなく、エンドヌクレアーゼベースのシステムを介してDBを誘導する。
注:あるいは、2-20 Gy23の間で中性子フラックスを使用して、30分から8時間の回復時間までの範囲のDNA損傷を誘発するために照射を使用します。 - 加湿した5%CO2雰囲気中で37°Cで1〜8時間細胞をインキュベートし、DNA修復の動態に従う。
- 10%の胎児の子牛血清、2 mMグルタミンおよび1%の抗生物質抗抗薬溶液を添加したDMEM培地中の単層のU2OS細胞を維持する。
- 細胞の固定
注:300-500 μLの溶液/ウェルは、すべての細胞を適切にカバーするために、次の手順(ステップ1.2-1.5)で使用する必要があります。各インキュベーションと洗浄ステップ(抗体インキュベーションを除く)は、穏やかな攪拌を伴う軌道シェーカー上で行われるべきである。- DSB誘導および細胞のインキュベーションに続いて、取り付けられた細胞から培地を取り除き、1倍PBSで細胞を1回洗浄する。
- 25°Cで20分間4%ホルムアルデヒド-PBS溶液で細胞を固定します。
- 細胞の透過性
- 固定液を取り出し、1x PBSで細胞を3回洗浄し、それぞれ5分間洗浄します。
- PBSを取り出し、PBSに溶解した0.2%トリトンX-100を加えます。サンプルを20分間インキュベートします。
- 非特異的なバインド サイトのブロック
- 1倍PBSで細胞を3回洗います。
- PBST(1x PBSは0.1%Tween-20を補充)で希釈した5%BSA(ウシ血清フラクションVアルブミン)を有する非特異的結合部位をブロックし、少なくとも20分間透過サンプルをインキュベートする。
- 免疫蛍光染色
- 1%BSA-PBST溶液に希釈した一次抗体(すなわち、抗γH2AX、抗DNA-PKcs)の適切な量を加える。各カバースリップを、希釈した抗γH2AX抗体の10 μL液滴の上にパラフィンフィルムの上に逆さまに置きます。
注:同一1%BSA-PBST溶液中の両抗体を適宜希釈して共免疫染色した場合。 - 4°Cで1.5時間湿度チャンバーにサンプルをインキュベートします。
注:インキュベーションは、一晩4°Cで行うこともできます。 - カバースリップを24ウェルプレートに横に戻し、1x PBSで5分間3回洗います。
- 1%BSA-PBSTで希釈した二次抗体の適切な量を加えます。各カバースリップを、希釈した抗体の10 μL液滴の上にパラフィンフィルムの上に逆さまに置きます。
- 4 °Cの湿度チャンバーにサンプルを1時間インキュベートします。
- カバースリップを24ウェルプレートに横に戻し、1x PBSで5分間3回洗います。
- 最後のPBS洗浄液を取り外す前に、ピンシーザーと針を使用してカバースリップをそっと取り出し、取り付け媒体の液滴(DAPIを補った)でガラススライドに逆さまに置きます。
注意:気泡の形成を避けてください。取り付け媒体が乾燥するとき、サンプルの縮れを防ぐためにマニキュアでカバーリップの端を密封することを推奨します。
- 1%BSA-PBST溶液に希釈した一次抗体(すなわち、抗γH2AX、抗DNA-PKcs)の適切な量を加える。各カバースリップを、希釈した抗γH2AX抗体の10 μL液滴の上にパラフィンフィルムの上に逆さまに置きます。
2. クロマチン免疫沈降
- 細胞の収集、架橋、細胞および核のリシス、およびDNAの断片化
- 各サンプルに対して約5 x 106 細胞/mLを150mm皿に培養する。
- 培養液を取り出し、氷冷1x PBSで細胞を2回洗浄する。
- 1%ホルムアルデヒド-PBS溶液で細胞を固定し、プレートを軌道シェーカーの上に置き、20分間静かに攪拌します。
注意:ホルムアルデヒドは揮発性です。常に新しい作業ソリューションを準備します。ホルムアルデヒド溶液にはメタノールが含まれて安定する場合もありますが、下流反応との干渉を避けるためにメタノールフリー溶液を使用することをお客様が適しています。 - 125 mMグリシンで固定を停止し、25°Cで5分間穏やかな攪拌で軌道シェーカーにインキュベートします。
- プレートを氷の上に置き、氷冷1x PBSで2回洗います。
- 氷冷1x PBSで細胞をこすり、15 mL円錐形のチューブに移します。
- 4°Cで5分間2,500xgで細胞を遠心分離する。
- 上清を慎重に吸引し、ペレットを2mLの細胞ライシスバッファーに再懸濁し[5 mM PIPES pH 8.0,85 mM KCl,0.5%NP-40,1x PIC(プロテアーゼ阻害剤カクテル)]を氷上で10分間インキュベートします。
- 4°Cで5分間2,500xgで細胞懸濁液を遠心分離する。
- 慎重に上清を捨て、核リシスバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、10 mM EDTA pH 8.0、0.8%SDS、1x PIC)でペレットを500-1,500 μLに再懸濁し、氷上で30〜60分間インキュベートします。超音波処理に適したポリスチレンの円錐管にリゼートを移します。
注:核溶解バッファーにはSDSが含まれているため、氷上で沈殿し、溶液が白くなります。ソリューションは、超音波処理に続いて透明に変える必要があります。 - 平均フラグメントサイズ300-1,000bpにDNAを剪断するために、ライセートを超音波処理する。
注:適切な超音波サイクルと条件は、セルの種類と超音波処理装置に応じて設定する必要があります。200bpより小さい断片は、ヌクレオソームとDNA相互作用が破壊され得るので、ChIPには適さない。
- 架橋の反転、超音波処理されたフラグメントサイズの決定
- 超音波処理されたサンプルの100 μLを取り出して、超音波クロマチンのフラグメントサイズを確認します。残りのクロマチンは−80°Cで保存する必要があります。
- サンプルの各100 μLに0.5 mg/mL RNase Aを加え、37°Cで20分間インキュベートしてRNaseを活性化します。
- サンプルを一晩65°Cでインキュベートします。
- 翌日、500 μg/mL のプロテアーゼ K と 0.5% SDS を加え、50 °C で 3 時間インキュベートします。
- 各サンプルに0.5容量のフェノールと0.5ボリュームクロロホルム-イソアミルアルコールミックス(24:1)を加えます。
- ボルテックス 1分間
- 13,000 x g で10分間の遠心分離機。
- 上部水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 各サンプルにクロロホルム-イソアミルアルコールミックス(24:1)を1巻加えます。
- ボルテックス 1分間
- 13,000 x g で10分間の遠心分離機。
- 上部水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 2.5容量の96%エタノールと0.1容量の3 M Na-Acetate pH 5.2を加えます。
- −80 °Cで20分以上インキュベートしてください。
- サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
- エタノールを取り除き、ペレットを400μLの70%エタノールで洗います。
- サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
- エタノールを取り出し、ペレットを乾燥させます。
- TEの10 μLでペレットを再懸濁します。
- 0.8%アガロースゲルでサンプルを実行します。超音波クロマチンのサイズは、約500 bpでなければなりません。
注:この色素のサイズはクロマチンフラグメントの適切な検出を妨げることができる約500 bpであるため、ブロモフェノールブルーフリーローディングバッファを使用してください。代わりに、約3,000 bpであるキシレン-シアノールと相補するローディングバッファを使用することをお勧めします。 - クロマチンサイズが許容可能な場合は、ステップ2.1から冷凍クロマチンサンプルを希釈します。希釈バッファー(10 mMトリス-HCl pH 8.0、0.5 mM EGTA pH 8.0、1%トリトンX-100、140 mM NaCl、1x PIC)の3巻で、4°Cで10分間回転してサンプルを混合します。
注:このステップは、クロマチン濃度の測定を含む下流反応との干渉を避けるために、核溶解バッファー内に存在するSDSを希釈するために必要です。 - 分光光度計を用いて260/280nmのクロマチン試料のDNA濃度を測定します。
- ビーズの調製、事前清算、免疫沈降
- ビーズ(羊の抗ウサギまたはマウスIgG)を事前クリアおよび免疫沈降ステップ用に準備します。リパバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA pH 8.0、1%トリトンX-100、0.1%Na-DOC、0.1%SDS、150 mM NaCl、1X PIC)でビーズを4°Cで10分間2回洗浄します。
- ステップ 2.3.1 と同じボリュームの RIPA バッファ内のビーズを再中断します。
- 各サンプルの25~30μgクロマチンを4μLの前に、4°Cで1〜2時間回転させる。
注:各クロマチンサンプルに、最大500 μLの最終ボリュームにRIPAバッファを追加し、回転の下でサンプルを適切に混合します。NAC(抗体コントロールなし)とTIC(トータルインプットコントロール)のクロマチンを各サンプルセットの場合に取り出すことを忘れないでください。TICは最大200μLの最終ボリュームしか必要としません。 - ビーズを磁石で沈殿させ、上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 適切な量の抗体を各クロマチン試料(NACおよびTICを除く)に加え、4°Cで一晩回転させます。
- 翌日、洗浄ビーズ40μLを各サンプル(TICを除く)に加え、4°Cで回転して一晩インキュベートします。
- 洗浄
- 低塩バッファーの300 μL(20 mMトリス-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8.0、1%トリトンX-100、0.1%SDS、1x PIC)で10分間、4°Cで回転して10分間洗浄します。
- 高塩バッファーの300 μL(20 mMトリス-HCl pH 8.0、300 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8.0、1%トリトンX-100、0.1%SDS、1x PIC)で10分間、4°Cで回転して10分間洗浄します。
- LiClバッファーの300 μL(250 mM LiCl、1%NP-40、1%Na-DOC、1 mM EDTA pH 8.0、10 mM Tris-HCl pH 8.0、1x PIC)で1回、4°Cで10分間回転します。
- 300 μL の TE(10 mM Tris-HCl pH 8.0、1 mM EDTA pH 8.0)を回転で 10 分間、4 °C で最初の洗浄、2 回目の洗浄を 2 回 2 回行います。
- 溶出
- 溶出バッファー (1% SDS および 100 mM NaHCO3)の 200 μL をビーズに加え、サーモシェーカーで 65 °C で連続振動(約 400 RPM)で 15 分間インキュベートします。上清を新しいチューブに移し、溶出バッファーの200 μLで再びビーズを溶出します。溶出液(400 μL最終容積)を組み合わせます。
- NaClを各サンプルに200 mMの最終濃度に加えます。200 μL の溶出バッファーで TIC サンプルを補い、NaCl を加えます。
注: このステップから、TIC は他のサンプルと同じ条件で処理する必要があります。 - サンプルを65°C(振盪せずに)で6時間以上インキュベートする。
- 各サンプルに1mLの冷たい100%エタノールを加え、チューブを2回回転させて混合し、−80°CでDNAを一晩沈殿させます。
- 翌日、遠心分離機は4°Cで13,000×gで30分間。
- 上清を捨て、ペレットを70%EtOHで洗います。
- サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
- 上清を捨て、ペレットを乾燥させます。
- TEの100 μLでペレットを再懸濁し、各サンプルにRNase Aの0.5 mg/mLを加えます。37°Cで20分間インキュベートし、RNaseを活性化します。
- 架橋の反転
- 500 μg/mL のプロテアーゼ K と 0.5% SDS を加え、50 °C でサンプルを 2 時間インキュベートします。
注意:ChIP-seqに進む場合は、下流NGSプロセスを阻害するため、フェノール-クロロホルム抽出は避けてください。代わりに、市販のキットを使用することをお勧めします( 資料一覧を参照)。 - 各サンプルに0.5容量のフェノールと0.5ボリュームのクロロホルム-イソアミルアルコールミックス(24:1)を加えます。
- ボルテックス 1分間
- 13,000 x g で10分間の遠心分離機。
- 上部水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 各サンプルにクロロホルム-イソアミルアルコールミックス(24:1)を1巻加えます。
- ボルテックス 1分間
- 13,000 x g で10分間の遠心分離機。
- 上部水相を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
- 500 μg/mL のプロテアーゼ K と 0.5% SDS を加え、50 °C でサンプルを 2 時間インキュベートします。
- DNA抽出
- 2.5容量の96%エタノールと0.1容量の3 M Na-Acetate pH 5.2を加えます。
- −80 °Cで20分以上インキュベートしてください。
- サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
- エタノールを取り除き、ペレットを400μLの70%エタノールで洗います。
- サンプルを13,000xgで4°Cで10分間遠心分離します。
- エタノールを取り出し、ペレットを乾燥させます。
- TEの50 μLにペレットを再懸濁します。
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Representative Results
細胞内の部位に誘導されたDSBによる修復プロセスの研究は、安定または一時的なトランスフェクションを介して達成することができる。しかし、安定したトランスフェクションは均質な細胞集団を保証し、統一され、より信頼性の高い細胞応答を与える。一過性トランスフェクションの場合、細胞集団のごく一部のみがプラスミドを占め、実験に多様性を導入します。ER-I-PpoIまたはER-AsiSIエンドヌクレアーゼベースの細胞系を確立するには、50%のコンフルエント細胞集団が必要であり、これはエンドヌクレアーゼをコードするプラスミドでより効果的にトランスフェクトされる。トランスフェクションの場合、市販のトランスフェクション試薬またはウイルス感染ベースの方法も使用できる。顕微鏡可視化技術を適用し、過渡的トランスフェクションが必要な場合、トランスフェクション後24時間に4-OHT添加によって指示されたDSBを誘導することができ、ER融合型エンドヌクレアーゼに結合し、核転位およびDSB誘導を可能にする。最も適切な時点を決定するために、4-OHT治療後の異なる時点でγH2AXの免疫蛍光ベースの顕微鏡およびウェスタンブロット検出を行うことができる。生理学的条件下では、細胞当たり最大10〜15γH2AX病巣を検出することができ、そして強力な修復病巣の形成は、エンドヌクレアーゼ(またはここで議論されていない様々な他の技術、例えば、レーザーマイクロ照射)によって引き起こされる。典型的なI-PpoIエンドヌクレアーゼは、リボソームDNA(rDNA)でDSBを誘導することによって、核の周りに上昇したγH2AXシグナルの形成につながります。休憩がNHEJまたはHRによって修復された場合、修理病巣の数は時間の経過とともに減少します。このため、4-OHT治療に続く0時間、30分、1、2、4、8時間の代表的なタイムポイントが推奨される。DNA修復プロセスを追跡するために、最も一般的に使用される細胞株はU2OSであり、すべての既知の修復経路はこれらの細胞で完全に機能します。同じ細胞内のいくつかのタンパク質を調べた場合、 図1に示すように、異なる蛍光体と異なる発光波長を有する異なる蛍光体と共役する抗体を組み合わせることにより、共局在化を検討することができる。その中で、誘導可能な安定した細胞株を介したDSBの誘導は、ヘマグルチニンタグ(HA)と融合したER-AsiSI制限エンドヌクレアーゼに基づいていると表される。ドキシサイクリンは、HAに対する抗体を用いて追跡することができる細胞質におけるHA-ER-AsiSIの発現および隔離を誘導することができる(図1.第3列、第2生)。4-OHTで4時間のインキュベーション、ドキシサイクリン添加後24時間、エンドヌクレアーゼが核に転位されて以来、多数のDSBを誘導することができる(図1.第3列、第3の未加工および第2カラム、第3生)。DSBは、γH2AXを認識する抗体を用いて可視化することができる。
図1:HA-ER-AsiSIを発現する培養細胞におけるγH2AXの検出に免疫蛍光顕微鏡を用いた。DOX(ドキシサイクリン)添加は、HA-ER-AsiSIおよび4-OHT(4-ヒドロキシタモキシフェン)(4h)の細胞質発現を活性化し、融合タンパク質の核転位を誘導し、既知のゲノム位置でのDSBの誘導につながる。HA(ヘマグルチニン)染色(抗HA抗体)は、HA-ER-AsiSI融合タンパク質を緑色で表し、γH2AX染色(抗γH2AX抗体)で破断の誘導が確認されています。スケールバーは20 μmを表します。
損傷部位における修復タンパク質の共局在化は、それらが同じDNA病変部位にリクルートされていることを示しているが、必ずしも互いに相互作用するとは限らない。共焦点顕微鏡の分解能は約300nmです。ブレーク部位での特異的修復タンパク質の結合パターンを決定するために、超解像顕微鏡(STORM)が推奨される24.しかし、この方法は高価な顕微鏡機器と専門家の研究者を必要とします。あるいは、修復タンパク質の結合パターンは、DIvAまたはU2OS-pEP15安定細胞株を用いたクロマチン免疫沈降法によって調べることができ、これは、それぞれ17,21の調節された方法でAsiSIおよびI-PpoIエンドヌクレアーゼを発現することができる。4-OHT添加により、両方のエンドヌクレアーゼは、配列固有の方法でDNAを切断することができ、予想される破断部位とその周辺のゲノム領域に軌跡特異的なプライマーを設計する機会を提供します。ChIPの免疫沈降部分にγH2AX抗体を適用することにより、異なる条件(特定の修復因子のサイレンシングまたは阻害、すなわちDNA-Pccs)に対するDNA修復動態を時間的に追従することができます。ChIP-qPCRを用いて得られる典型的な実験結果を図2に示す。その中で、γH2AXの時間的な濃縮がI-PpoI誘導DNA損傷に対する応答として実証される。画像の左側には、適時に検出されたγH2AXシグナルが右側に現れ、その後の部分では、そのγH2AX分布が、DSBが誘導されていない制御遺伝子領域で表される。
図2:I-PpoI誘導DNA損傷に応答したクロマチン免疫沈降法により求められるγH2AXの時間的濃縮 左, ブレークサイトでγH2AX信号;右、DSBが誘導されなかった対照領域におけるγH2AX分布(抗γH2AX抗体)。表された結果は1つの生物学的実験から導き出され、誤差範囲は対応するサンプル複製の変動を示す。N=3。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
DNA修復は比較的最近の研究分野ですが、様々な生化学的・顕微鏡的手法を用いて、私たちの知見は急速に広がっています。遺伝子の修復過程に関与する遺伝子に起こる変異は、腫瘍形成の主要な原因の一つであり、したがってDNA修復経路の重要なステップを解明することが不可欠であるため、遺伝情報の保存は細胞にとって極めて重要である。
生化学的手法(すなわち、ウェスタンブロット、免疫沈降、質量分析など)は、多数の細胞を必要とし、研究された修復プロセスは所望の細胞集団のスナップショットを表す。ChIP実験を行うことは、DSB修復のプロセスを研究するために特定の実験を設計する際に、面倒で面倒で多くの考慮事項を考慮する必要があります。次の手順は、例を示します: (I) セルは適切に lysed する必要があります。クロマチン分画(II)クロマチンへのアクセス性を高めるために、細胞溶解と核溶解バッファを別々に使用して2段階溶解法を適用することを強くお勧めします。超音波処理の適切な条件は、各細胞タイプに最適化する必要があります (III) 精製された抗体の適切な量は、異なる企業からの同じタンパク質に対する抗体が効率的な免疫沈降のために非同一の特性(IV)を示すので、25-30 ug初期クロマチンは、各条件(V)の適切な固定時間を最適化する必要があります 過剰固定は遠くのタンパク質複合体を架橋することによって偽陽性の結果をもたらす可能性があり、下置は適用された抗体に基づいてDNAと所望のタンパク質(VI)との間の適切な架橋を防ぐことができるので、ビーズの種類(プロテインAまたはG)は洗浄工程中に慎重に決定されるべきであり、洗浄バッファーの順序は、DNA(VIII)からの抗体の放出を避けるために十分に保たれるべきである フェノールのトレースは、さらなる下流反応の効率を低下させないために適切に除去する必要があります。この方法は回収されたDNAの収量を減らすので、私たちの個人的なアドバイスは、むしろ特定のDNA精製キットを使用することです。すべての重要なポイントが適切に対処されると、ChIPは異なるゲノムの場所で所望のタンパク質の占有のための貴重なデータを提供し、DNA修復プロセスの重要なステップを解明することができます。
しかし、qPCRと組み合わせたChIPは、選択されたゲノム領域におけるタンパク質分布を研究するための間接的なアプローチであり、DNA結合部位を特異的に認識したり、タンパク質の機能を直接調べたりすることを許さない。タンパク質-DNA複合体を捕捉するために使用されるモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体は、偽陽性データにつながる他のタンパク質と交差反応することもできるため、この技術で使用される抗体は、対象となるタンパク質に対してChIPグレードで高度に特異的であるべきである。しかし、ChIPは広く使用されている技術であり、これに基づくさらなるアプローチが開発されている、ChIPオンチップやChIP-seqなど。前者は、タンパク質結合部位に関する貴重な情報を提供するアニール配列をさらに増幅する多種多様な小さなランダムDNA配列を持つマイクロアレイ上の免疫沈降および精製されたDNA断片をハイブリダイズすることに依存している。しかし、ChIP-seqは、ChIPオンチップおよびハイスループットゲノムシーケンシングよりも高い分解能を持つタンパク質-DNA複合体のゲノム全体のマッピングを提供するため、魅力的な代替アプローチとして登場しています。ChIP-seqは、遺伝子調節に関する洞察を提供し、ゲノムワイドスケール25でクロマチンの景観を解明する様々な転写因子のDNA結合部位を開示することによってDNA修復の分野に革命を起こした。これによると、これらのデータは癌の進行などの様々な疾患および生物学的経路において重要な役割を果たすため、DNA修復の分野はChIP-seqから非常に有益である。それにもかかわらず、目的のタンパク質に対して特異的抗体を必要とせず、細胞にトランスフェクトされ、その後架橋するHaloTagと融合したDNA結合タンパク質をコードする配列を使用するHaloChIP法などの様々な改変が開発されており、所望のタンパク質DNA複合体はHaloLink樹脂を使用して捕捉することができる。しかし、この技術は過剰発現に依存しており、望ましいタンパク質の内因性レベルではなく、誤ってデータを解釈する可能性がある26.
さらに、顕微鏡技術は、単一細胞レベルであっても、DNA損傷修復の時間的追跡に関する貴重な情報を提供します。特異的な修復タンパク質に対して発生する抗体の急速な改善により、NERおよびDSBRサブ経路のメカニズム、並進後の調節の理解が深まりました。顕微鏡分野は、DNA損傷誘発細胞プロセスをヌクレオソームレベルで可視化し、タンパク質共局在24の正確なマッピングを確保することを可能にする超解像顕微鏡などの高解像度技術によって革命化されている。しかし、修復の速度が発散する可能性があり、結果を解釈することが困難になる可能性があるため、細胞系統の分散を実験中に考慮する必要があります。蛍光イメージング方法論の急速な進化と実験セットアップの意図的な設計を考えると、単一細胞レベルで単一のタンパク質分解能でDNA損傷による細胞および分子応答を調査する貴重な機会が完成に向かっています。
結論として、超解像顕微鏡と単一細胞シーケンシング方法論の組み合わせは、DNA修復分野の理解を大幅に向上させることができます。
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Disclosures
何一つ
Acknowledgments
この研究は、国立研究開発・イノベーション事務所の助成金GINOP-2.3.2-15-00020、GINOP-2.3.2-15-2016-00036、GINOP-2.2.1-15-2017-00052によって資金提供されました。 EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009,NKFI-FK 132080,ハンガリー科学アカデミーBO/27/20,ÚNKP-20-5-SZTE-265,EMBO短期フェローシップ8513,テンタス財団
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-OHT | Sigma Aldrich | H7904 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized | Sigma Aldrich | A5955 | |
| Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody | Abcam | ab26350 | |
| Bovine Serum Fraction V albumin | Biosera | PM-T1725 | |
| TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer | Thermo Fisher Scientific | 10482035 | |
| DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine | Lonza | 12-707F | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG | Invitrogen | 11202D | |
| Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | 11204D | |
| EDTA | Sigma Aldrich | E6758 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Ethanol | Molar Chemicals | 02910-101-340 | |
| Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved | Gibco | ECS0180L | |
| Formaldehyde 37% solution free from acid | Sigma Aldrich | 1.03999 | |
| GlutaMAX™ Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | 50046 | |
| IPure kit v2 | Diagenode | C03010015 | |
| Isoamyl alcohol | Sigma Aldrich | W205702 | |
| LiCl | Sigma Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S5886 | |
| Na-DOC | Sigma Aldrich | D6750 | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761 | |
| Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus | Sigma Aldrich | N9162 | |
| NP-40 | Sigma Aldrich | I8896 | |
| PBS Powder without Ca2+, Mg2+ | Sigma Aldrich | L182-50-BC | |
| Phenol | Sigma Aldrich | P4557 | |
| PIPES | Sigma Aldrich | P1851 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Molar Chemicals | 09400-203-190 | |
| KCl | Sigma Aldrich | P5405 | |
| ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36935 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set I | Roche | 11873580001 | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | P2308 | |
| P-S2056 DNAPKcs antibody | Abcam | ab18192 | |
| RNase A | Roche | 10109169001 | |
| CH3COONa | Sigma Aldrich | S2889 | |
| SDS | Sigma Aldrich | L3771 | |
| Tris Acetate-EDTA buffer | Sigma Aldrich | T6025 | |
| Tris-HCl | Sigma Aldrich | 91228 | |
| TRITON X-100 | Molar Chemicals | 09370-006-340 | |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | T4799 | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 |
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