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Biology

एंडोन्यूक्लियज़-आधारित साइट-विशिष्ट डीएनए क्षति की कल्पना और मात्रा निर्धारित करना

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख इम्यूनोस्टेपिंग और क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन के आवश्यक चरणों का परिचय देता है। इन प्रोटोकॉल आमतौर पर डीएनए क्षति से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं का अध्ययन करने और कल्पना और डीएनए की मरंमत में फंसा प्रोटीन की भर्ती की मात्रा के लिए उपयोग किया जाता है ।

Abstract

कोशिकाओं को लगातार विभिन्न डीएनए हानिकारक एजेंटों के संपर्क में हैं, विभिन्न सेलुलर प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करते हैं। जैव रासायनिक और आनुवंशिक दृष्टिकोण लागू करने की भर्ती और डीएनए क्षति की साइट पर डीएनए मरम्मत परिसरों की विधानसभा के साथ जुड़े सेलुलर घटनाओं का खुलासा करने में आवश्यक है । पिछले कुछ वर्षों में, साइट-विशिष्ट डीएनए क्षति को प्रेरित करने के लिए कई शक्तिशाली उपकरण विकसित किए गए हैं। इसके अलावा, उपन्यास मौलिक तकनीकें हमें निश्चित और जीवित कोशिकाओं दोनों का उपयोग करके एकल-कोशिका संकल्प स्तर पर इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने की अनुमति देती हैं। यद्यपि इन तकनीकों का उपयोग विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया गया है, इसके बाद हम डीएनए मरम्मत, फ्लोरेसेंस इम्यूनोस्टेपिंग (आईएफ) और क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन (सीआईपी) के क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं, जो एंडोक्यूक्लिज-आधारित साइट-विशिष्ट डीएनए क्षति के संयोजन में निर्देशित और विनियमित फैशन में डीएनए मरम्मत कारकों की जीनोमो अधिभोग की कल्पना करना और मात्रा निर्धारित करना संभव बनाते हैं। क्रमशः। ये तकनीकें शोधकर्ताओं को क्षतिग्रस्त जीनोमिक लोकस से बंधे उपन्यास प्रोटीन की पहचान करने के साथ-साथ डीएनए मरम्मत के दौरान उनके ठीक धुन नियमन के लिए आवश्यक उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों की पहचान करने के लिए शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती हैं ।

Introduction

हमारे जीनोम को विभिन्न डीएनए हानिकारक एजेंटों द्वारा लगातार चुनौती दी जा रही है । ये हमले पर्यावरणीय स्रोतों से प्राप्त हो सकते हैं, जैसे यूवी प्रकाश या विकिरण, साथ ही अंतर्जात स्रोतों से, जैसे मेटाबोलिक बाय-उत्पाद ऑक्सीडेटिव तनाव या प्रतिकृति त्रुटियों के कारण1,2। ये घाव या तो एक या दोनों डीएनए किस्में की अखंडता को प्रभावित कर सकते हैं, और यदि उत्पन्न त्रुटियां लगातार हो जाती हैं, तो यह अक्सर ट्रांसलोकेशन और जीनोम अस्थिरता की ओर ले जाती है, जिसके परिणामस्वरूप ट्यूमरजीनेसिस3,4हो सकता है। जीनोम अखंडता को बनाए रखने के लिए, विकास के दौरान कई मरम्मत प्रणाली विकसित की गई हैं। डीएनए क्षति के विशिष्ट प्रकार के रासायनिक और भौतिक गुणों के अनुसार, कई मरम्मत तंत्र सक्रिय किया जा सकता है । बेमेल, ऑबेसिक साइटें, सिंगल-स्ट्रैंड ब्रेक, और 8-ऑक्सोगुइन (8-ऑक्सोग) को बेमेल मरम्मत या बेस-एक्सिशन रिपेयर पाथवे5,6द्वारा हटाया जा सकता है। यूवी-प्रेरित फोटोप्रोडक्ट्स और भारी-भरकम एडडक्ट्स के कारण होने वाले घावों की मरम्मत या तो न्यूक्लियोटाइड-एक्सिशन रिपेयर (एनईआर) या डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक रिपेयर (डीएसबीआर) प्रक्रिया7,8द्वारा की जा सकती है। एनईआर में दो मुख्य उप-रास्ते होते हैं: ट्रांसक्रिप्शन-युग्मित एनईआर (टीसी-एनईआर) और वैश्विक जीनोमिक एनईआर (जीजी-एनईआर)। कोशिका चक्र चरण के बारे में, डीएनए डबल-स्ट्रैंड ब्रेक इंडक्शन के बाद, दो उप-मार्गों को सक्रिय किया जा सकता है: गैर-मुताबिक़ अंत में शामिल होना (एनएचईजे) और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (एचआर)1,9। एनएचईजे, जो आराम कोशिकाओं में प्रमुख मार्ग है, सभी सेल चक्र चरणों में सक्रिय किया जा सकता है, जो एक तेज लेकिन त्रुटि-प्रवण मार्ग10का प्रतिनिधित्व करता है। दूसरी ओर, मानव संसाधन एक त्रुटि मुक्त मार्ग है, जिसमें डीएसबी की मरम्मत बहन क्रोमेटिड्स की अनुक्रम-होमोलॉजी खोज के आधार पर की जाती है, इसलिए यह मुख्य रूप से एस और जी-2 सेल चक्र चरणों11में मौजूद है। इसके अलावा, माइक्रोहोमोलॉजी-मध्यस्थता अंत में शामिल होने (MMEJ) एक और DSB मरम्मत तंत्र है, जो उपरोक्त लोगों से अलग है, जो एक KU70/80-और RAD51-स्वतंत्र तरीके से पहले से पुनः प्राप्त माइक्रोहोमोलॉगस दृश्यों के पुनः बंधन के आधार पर टूटा हुआ डीएनए समाप्त होता है । इसलिए, एमएमईजे को त्रुटि-प्रवण और अत्यधिक उत्परिवर्तनीय12माना जाता है। डीएनए मरम्मत के दौरान, डीएसबी डीएनए क्षति प्रतिक्रिया (डीडीआर) को प्रेरित कर सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप चेकपॉइंट किनासे की सक्रियता होती है जोमरम्मत13,14, 15के दौरान कोशिका चक्र कोरोकतीहै। डीडीआर को भर्ती और घावों के आसपास मरम्मत प्रक्रिया के सर्जक प्रमुख खिलाड़ियों के व्यापक प्रसार के जवाब के रूप में सक्रिय किया जाता है, जो मरम्मत फोकस के गठन में योगदान देता है। इस प्रारंभिक सिग्नलिंग झरना में, एटीएम (एटैक्सिया तेलंगिएसिया म्यूटेटेड) किनेज़ घाव16के आसपास सेर139 (जिसे γH2AX के रूप में संदर्भित) में हिस्टोन संस्करण एच2एक्स के फॉस्फोरिलेशन को उत्प्रेरित करके एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। यह प्रारंभिक घटना अतिरिक्त मरम्मत कारकों की भर्ती और डाउनस्ट्रीम मरम्मत प्रक्रियाओं की शुरुआत के लिए जिम्मेदार है। हालांकि मरम्मत फोकस में भर्ती प्रोटीन के सटीक कार्य को अभी तक पूरी तरह से विशेषता नहीं दी गई है, लेकिन मरम्मत फोसी के गठन और गतिशीलता की कई प्रयोगशालाओं द्वारा जांच की गई है। इन मार्कर बड़े पैमाने पर मरम्मत गतिज का पालन करने के लिए उपयोग किया जाता है, लेकिन मरम्मत प्रक्रिया के दौरान उनकी सटीक भूमिका मायावी बनी हुई है। डीएनए मरम्मत से संबंधित सेलुलर प्रक्रियाओं की बहुत महत्व अभी तक खराब समझ के कारण, डीडीआर को प्रेरित करने और कल्पना करने के लिए अब तक कई तरीके विकसित किए गए हैं।

वांछित प्रकार के डीएनए क्षति को प्रेरित करने के लिए विभिन्न तरीकों और प्रणालियों की स्थापना की गई है । उदाहरण के लिए, कुछ एजेंटों [जैसे नियोकार्ज़िनोस्टैटिन (एनसीएस), फ्लेमोमाइसिन, ब्लेओमाइसिन, γ-विकिरण, यूवी] गैर-भविष्य कहनेवाला जीनोमिक पदों पर बड़ी संख्या में यादृच्छिक डीएनए ब्रेक को प्रेरित कर सकता है, जबकि अन्य (एंडोन्यूक्लिस, जैसे एएसआईएसआई, आई-पीपीओआई या आई-टीसीआई, साथ ही लेजर स्ट्रिपिंग) ज्ञात जीनोमिक लोकी17,18,19,20, 21पर डीएनए ब्रेक को प्रेरित कर सकते हैं। यहां, हम वर्तमान में स्तनधारी और खमीर कोशिकाओं में डीडीआर का अध्ययन करने के लिए उपयोग की जाने वाली एंडोक्यूलेज-आधारित तकनीकों पर ध्यान केंद्रित करते हैं। इन तकनीकों के सिद्धांतों को उजागर करने के अलावा, हम उनके फायदे और नुकसान दोनों पर जोर देते हैं।

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Protocol

1. विशिष्ट प्रोटीन का इम्यूनोडेटेक्शन

  1. सेल कल्चर और प्रायोगिक सेटअप की तैयारी
    1. डीएमईएम संस्कृति माध्यम में मोनोलेयर्स में U2OS कोशिकाओं को बनाए रखें 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 mM ग्लूटामाइन, और 1% एंटीबायोटिक-एंटीमाइकोटिक समाधान के साथ पूरक।
      नोट: एंडोक्यूलीज-आधारित डीएनए क्षति प्रेरण के लिए, सिस्टम लीक होने से बचने के लिए चारकोल-उपचारित या स्टेरॉयड-मुक्त माध्यम का उपयोग करें।
    2. 80% की मजबूती तक 37 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रीकृत 5% सीओ2 पर्यावरण में कोशिकाओं को बढ़ाएं, हर 2-3 दिनों में माध्यम का नवीनीकरण करें।
    3. माध्यम को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को 1x पीबीएस से धोएं। ट्रिप्सिन-ईडीटीए समाधान के साथ अलग कोशिकाएं। जब कोशिकाएं अलग हो जाती हैं, तो कोशिकाओं में संस्कृति माध्यम जोड़कर ट्राइप्सिन गतिविधि को रोकें, एक कोशिका निलंबन पैदा करें।
    4. एक सेल गिनती कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती। प्लेट 2 x 104 कोशिकाओं/एमएल/अच्छी तरह से एक 24 अच्छी तरह से थाली पर, बाँझ 12 मिमी दौर कवरस्लिप के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से ।
    5. एक आर्द्र 5% सीओ 2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर24 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाओं को कवरस्लिप पर लगाव की अनुमति देने के लिए।
    6. कोशिकाओं को नियोकार्ज़िनोस्टाइन (एनसीएस) के 10 एनजी/एमएल के साथ सीधे हानिकारक एजेंट को सुसंस्कृत माध्यम में पिपिंग करके इलाज करें । 15 मिनट के लिए एनसीएस युक्त माध्यम के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें, फिर उन्हें 1x पीबीएस से धोएं और कोशिकाओं में ताजा, पूरक संस्कृति माध्यम जोड़ें। अन्यथा, मध्यम 22 को ताज़ा किए बिना एंडोक्यूलीज-आधारित प्रणालियों के माध्यम से डीएसबी को प्रेरित करने के लिए उपयुक्त एजेंट(यानी,4-ओएचटी) का उपयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, डीएनए क्षति को प्रेरित करने के लिए विकिरण का उपयोग करें, 2-20 Gy 23 के बीच न्यूट्रॉन प्रवाह का उपयोग करके वसूली समय के30मिनट से लेकर 8 घंटे तक ।
    7. डीएनए मरम्मत के काइनेटिक्स का पालन करने के लिए एक आर्द्र 5% सीओ2 वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1-8 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाएं।
  2. कोशिकाओं का निर्धारण
    नोट: समाधान के 300-500 μL/अच्छी तरह से सभी कोशिकाओं को पर्याप्त रूप से कवर करने के लिए निम्नलिखित चरणों (चरण 1.2-1.5) में इस्तेमाल किया जाना चाहिए । प्रत्येक इनक्यूबेशन और धोने के कदम (एंटीबॉडी इनक्यूबेशन को छोड़कर) कोमल आंदोलन के साथ एक कक्षीय शेखर पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
    1. डीएसबी प्रेरण और कोशिकाओं के इनक्यूबेशन के बाद, संलग्न कोशिकाओं से माध्यम को हटा दें और 1x पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें।
    2. 25 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 4% फॉर्मलडिहाइड-पीबीएस समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
  3. कोशिकाओं का पारयीकरण
    1. फिक्सिंग समाधान निकालें और 5 मिनट प्रत्येक के लिए 1x PBS के साथ तीन बार कोशिकाओं को धोएं।
    2. पीबीएस निकालें और पीबीएस में भंग 0.2% ट्राइटन एक्स-100 जोड़ें। नमूनों को 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करना
    1. कोशिकाओं को 1x पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
    2. पीबीएसटी (1x पीबीएस 0.1% ट्वीन-20 के साथ पूरक) में पतला 5% बीएसए (गोजातीय सीरम फ्रैक्शन वी एल्बुमिन) के साथ गैर-विशिष्ट बाध्यकारी साइटों को अवरुद्ध करें, और कम से कम 20 मिनट के लिए परमीबिलाइज्ड नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला
    1. 1% बीएसए-पीबीएसटी समाधान में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी (यानी, एंटी-γH2AX, एंटी-डीएनए-पीकेएस) की उचित मात्रा जोड़ें। पतला विरोधी γH2AX एंटीबॉडी की एक 10 μL बूंद पर एक पैराफिन फिल्म पर प्रत्येक कवर उल्टा रखें ।
      नोट: एक ही 1% बीएसए-पीबीएसटी समाधान में दोनों एंटीबॉडी को उचित रूप से पतला करने के मामले में।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 घंटे के लिए एक आर्द्रता कक्ष में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इनक्यूबेशन भी रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रदर्शन किया जा सकता है।
    3. कवरस्लिप को 24-वेल प्लेट में वापस रखें और 1x पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    4. 1% बीएसए-पीबीएसएटी में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी की उचित मात्रा जोड़ें। पतला एंटीबॉडी की एक 10 μL बूंद पर एक पैराफिन फिल्म पर प्रत्येक कवर उल्टा रखें।
    5. 1 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आर्द्रता कक्ष में नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    6. कवरस्लिप को 24-वेल प्लेट में वापस रखें और 1x पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए तीन बार धोएं।
    7. पिछले PBS धोने के समाधान को हटाने से पहले, धीरे से एक चिमटी और सुई का उपयोग कर कवरस्लिप बाहर ले और फिर उन्हें बढ़ते माध्यम की बूंदों के साथ कांच स्लाइड पर उल्टा जगह (DAPI के साथ पूरक) ।
      नोट: हवा के बुलबुले के गठन से बचें। जब बढ़ते मध्यम सूख जाते हैं, तो नमूनों के सूखने से रोकने के लिए नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप के किनारों को सील करने की सिफारिश की जाती है।

2. क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन

  1. सेल संग्रह, क्रॉसलिंकिंग, सेल और न्यूक्लियर लाइसिस, और डीएनए विखंडन
    1. संस्कृति लगभग 5 x 106 कोशिकाओं/एमएल प्रत्येक नमूने के लिए एक १५० मिमी पकवान में ।
    2. संस्कृति माध्यम निकालें और कोशिकाओं को दो बार बर्फ से ठंडा 1x पीबीएस के साथ धोएं।
    3. 1% फॉर्मलडिहाइड-पीबीएस समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें, प्लेटों को एक कक्षीय शेखर पर रखें, और 20 मिनट के लिए धीरे से आंदोलन करें।
      नोट: फॉर्मलडिहाइड अस्थिर है; हमेशा एक नए सिरे से काम कर समाधान तैयार करते हैं। कुछ मामलों में, फॉर्मलडिहाइड समाधान में इसे स्थिर करने के लिए मेथनॉल होता है, लेकिन डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं के हस्तक्षेप से बचने के लिए मेथनॉल-मुक्त समाधान का उपयोग करना बेहतर होता है।
    4. 125 m ग्लाइसिन के साथ निर्धारण बंद करो और 25 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ एक कक्षीय शेखर पर इनक्यूबेट।
    5. प्लेटों को बर्फ पर रखें और बर्फ से ठंडे 1x पीबीएस के साथ दो बार धोएं।
    6. बर्फ-ठंड 1x पीबीएस में कोशिकाओं को परिमार्जन करें और उन्हें 15 एमएल शंकु ट्यूबों में स्थानांतरित करें।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर कोशिकाओं को सेंट्रलाइज करें।
    8. सावधानी से सुपरनेट को एस्पिरेट करें और सेल लाइसिस बफर [5 m M पाइप पीएच 8.0, 85 mM KCl, 0.5% एनपी-40, 1x पीआईसी (प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल) के 2 मिलीलन में गोली को फिर से रखें और 10 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
    9. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 2,500 x ग्राम पर सेल निलंबन सेंट्रलाइज करें।
    10. सुपरनैंट को सावधानी से त्यागें और 500-1,500 माइक्रोन में गोली को पुन: र्घ्य दें परमाणु लाइसिस बफर (50 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.0, 10 एमएम ईडीएएच 8.0, 0.8% एसडीएस, 1x पीआईसी) और 30-60 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें। lysate को एक पॉलीस्टीरीन शंकु नली में स्थानांतरित करें जो सोनीफिकेशन के लिए उपयुक्त है।
      नोट: चूंकि परमाणु लाइसिस बफर में एसडीएस होता है, इसलिए यह बर्फ पर उपजी होगी, और समाधान सफेद हो जाएगा। समाधान सोनीशन के बाद पारदर्शी हो जाना चाहिए।
    11. 300-1000 बीपी के औसत टुकड़े आकार के लिए डीएनए कतरनी के लिए lysate lysate ।
      नोट: उपयुक्त सोनीशन चक्र और शर्तों सेल प्रकार और सोनीशन उपकरण के अनुसार सेट किया जाना चाहिए। 200 बीपी से छोटे टुकड़े ChIP के लिए उपयुक्त नहीं हैं, क्योंकि न्यूकोसोम-डीएनए इंटरैक्शन बाधित हो सकता है।
  2. क्रॉसलिंकिंग का उलटना, सोनिकेटेड टुकड़ा आकार का निर्धारण
    1. सोनिकेटेड क्रोमेटिन के टुकड़े आकार को सत्यापित करने के लिए सोनिकेटेड नमूने के 100 माइक्रोन को बाहर निकालें। शेष क्रोमेटिन को −80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जाना चाहिए।
    2. नमूने के प्रत्येक 100 माइक्रोन में 0.5 मिलीग्राम/एमएल आरएनएज़ ए जोड़ें और आरएनएसई को सक्रिय करने के लिए उन्हें 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    3. रात भर 65 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    4. अगले दिन, 500 माइक्रोग्राम/एमएल प्रोटीनेज के और 0.5% एसडीएस जोड़ें, और 3 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    5. प्रत्येक नमूने में फिनोल की 0.5 मात्रा और 0.5 वॉल्यूम क्लोरोफॉर्म-आइसोअमिल अल्कोहल मिक्स (24:1) जोड़ें।
    6. 1 मिनट के लिए भंवर।
    7. 10 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    8. ऊपरी जलीय चरण को एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    9. प्रत्येक नमूने में 1 वॉल्यूम क्लोरोफॉर्म-आइसोअमिल अल्कोहल मिक्स (24:1) जोड़ें।
    10. 1 मिनट के लिए भंवर।
    11. 10 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    12. ऊपरी जलीय चरण को एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    13. 96% इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम और 3 एम एनए-एसीटेट पीएच 5.2 की 0.1 वॉल्यूम जोड़ें।
    14. −80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    15. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 एक्स ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
    16. इथेनॉल निकालें और 70% इथेनॉल के 400 माइक्रोन के साथ गोली धोएं।
    17. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 एक्स ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
    18. इथेनॉल निकालें और हवा गोली सूखी।
    19. टे के 10 माइक्रोल में गोली को फिर से खर्च करें।
    20. 0.8% एगर उठे जेल पर नमूने चलाएं। सोनिकेटेड क्रोमेटिन का आकार लगभग 500 बीपी होना चाहिए।
      नोट: ब्रोमोफेनॉल ब्लू-फ्री लोडिंग बफर का उपयोग करें क्योंकि इस डाई का आकार लगभग 500 बीपी है, जो क्रोमेटिन टुकड़ों का उचित पता लगाने को परेशान कर सकता है। इसके बजाय, जाइलीन-साइनोल के साथ पूरित लोडिंग बफर का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है, जो लगभग 3,000 बीपी है।
    21. यदि क्रोमेटिन का आकार स्वीकार्य है, तो जमे हुए क्रोमेटिन नमूनों को चरण 2.1 से पतला करें। कमजोर पड़ने बफर के 3 खंडों में (10 m Tris-HCl पीएच 8.0, 0.5 m EGTA पीएच 8.0, 1% ट्राइटन एक्स-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) और 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए रोटेशन के माध्यम से नमूनों को मिलाएं।
      नोट: यह कदम परमाणु लाइसिस बफर में मौजूद एसडीएस को कमजोर करने के लिए आवश्यक है ताकि क्रोमेटिन एकाग्रता की माप सहित डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं के साथ हस्तक्षेप से बचा जा सके ।
    22. स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके 260/280 एनएम पर क्रोमेटिन नमूनों की डीएनए एकाग्रता को मापें।
  3. मोतियों की तैयारी, पूर्व समाशोधन, और इम्यूनोप्रिपिटेशन
    1. पूर्व समाशोधन और इम्यूनोप्रिपिपिटेशन चरणों के लिए मोती (भेड़ विरोधी खरगोश या माउस आईजीजी) तैयार करें। रिपा बफर (50 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएम ईडीएएच 8.0, 1% ट्राइटन एक्स-100, 0.1% ना-डीओसी, 0.1% एसडी, 150 मीटर एनएसीएल और 1X पीआईसी) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए दो बार मोतियों को धोएं।
    2. कदम 2.3.1 में के रूप में RIPA बफर की एक ही मात्रा में मोती को फिर से खर्च करें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1-2 घंटे के लिए रोटेशन के माध्यम से मोतियों के 4 माइक्रोन के साथ प्रत्येक नमूने के पूर्व-स्पष्ट 25-30 माइक्रोग्राम क्रोमेटिन।
      नोट: नमूनों को रोटेशन के तहत ठीक से मिलाने के लिए अंतिम मात्रा के 500 माइक्रोन तक प्रत्येक क्रोमेटिन नमूने में रिपा बफर जोड़ें। प्रत्येक नमूना सेट के मामले में एनएसी (नो एंटीबॉडी कंट्रोल) और TIC (टोटल इनपुट कंट्रोल) के लिए क्रोमेटिन लेना न भूलें। TICs केवल 200 μL तक की अंतिम मात्रा की आवश्यकता होती है।
    4. मोतियों को चुंबक के साथ तेज करें और सुपरनेट को एक नई माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    5. प्रत्येक क्रोमेटिन नमूने (एनएसी और TIC को छोड़कर) में एंटीबॉडी की उचित मात्रा जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर घुमाएं।
    6. अगले दिन, प्रत्येक नमूने (TIC को छोड़कर) में धोए गए मोतियों के 40 माइक्रोन जोड़ें और उन्हें रात भर इनक्यूबेट करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर घूर्णन करें।
  4. धुलाई
    1. 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के माध्यम से 10 मिनट के लिए कम नमक बफर (20 एमएम ट्रिस-एचसीएल पीएच 8.0, 150 mM NaCl, 2 m EDTA pH 8.0, 1% ट्राइटन एक्स-100, 0.1% एसडी, 1x पीआईसी) के साथ एक बार धोएं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के माध्यम से 10 मिनट के लिए उच्च नमक बफर (20 m Tris-HCl पीएच 8.0, 300 mM NaCl, 2 m EDTA pH 8.0, 1% ट्राइटन एक्स-100, 0.1% एसडी, 1x पीआईसी) के साथ एक बार धोएं।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के माध्यम से 10 मिनट के लिए एलआईसीएल बफर (250 mM LiCl, 1% एनपी-40, 1% एनए-डीओसी, 1 m EDTA पीएच 8.0, 10 mm Tris-HCl pH 8.0, 1x PIC) के 300 माइक्रोन के साथ एक बार धो लें।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर पहले धोने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर पहले धोने के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर, और दूसरा धोने के लिए 300 माइक्रोन के साथ दो बार धोएं ते (10 m Tris-HCl पीएच 8.0, 1 m EDTA pH 8.0) रोटेशन के माध्यम से 10 मिनट के लिए।
  5. एल्यूशन
    1. एलयूशन बफर (1% एसडीएस और 100 एमएम एनएएचसीओ3)के 200 माइक्रोन को मोतियों में जोड़ें और लगातार झटकों (लगभग 400 आरपीएम) के साथ 15 मिनट के लिए थर्मो-शेकर में 65 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। एक नई ट्यूब और elution बफर के 200 μL में फिर से एल्यूट मोती के लिए सुपरनैंट स्थानांतरित करें। एलुट्स (400 माइक्रोन अंतिम मात्रा) को मिलाएं।
    2. प्रत्येक नमूने में 200 mm की अंतिम एकाग्रता के लिए NaCl जोड़ें। एल्यूशन बफर के 200 माइक्रोन के साथ TIC नमूनों को पूरक करें और एनएसीएल को भी जोड़ें।
      नोट: इस कदम से, TIC अन्य नमूनों के रूप में एक ही शर्तों के तहत संभाला जाना चाहिए.
    3. कम से कम 6 घंटे के लिए 65 डिग्री सेल्सियस (बिना मिलाने के बिना) पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
    4. प्रत्येक नमूने में 1 मिलील ठंड 100% इथेनॉल जोड़ें, ट्यूबों को दो बार मिलाने के लिए घुमाएं, और डीएनए को रातोंरात −80 डिग्री सेल्सियस पर घटाएं।
    5. अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर 13,000 x ग्राम पर 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
    6. सुपरनेट को त्यागें और 70% एटोह के साथ गोली धोएं।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 एक्स ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
    8. सुपरनेट को त्यागें और हवा छर्रों को सुखा लें।
    9. टे के 100 माइक्रोन में छर्रों को फिर से रीसुस्ल करें और प्रत्येक नमूने में आरएनएसई ए के 0.5 मिलीग्राम/एमएल जोड़ें। आरएनएएस को सक्रिय करने के लिए 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  6. क्रॉसलिंकिंग का उलटफेर
    1. इसमें 500 माइक्रोग्राम/एमएल प्रोटीनेज के और 0.5% एसडीएस जोड़ें फिर 2 घंटे के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
      नोट: यदि ChIP-seq के लिए आगे बढ़ने, फिनॉल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण से बचें, क्योंकि यह डाउनस्ट्रीम NGS प्रक्रिया को रोकता है । इसके बजाय, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करने की सिफारिश की जाती है।
    2. प्रत्येक नमूने में फिनोल की 0.5 मात्रा और क्लोरोफॉर्म-आइसोअमिल अल्कोहल मिश्रण (24:1) की 0.5 मात्रा जोड़ें।
    3. 1 मिनट के लिए भंवर।
    4. 10 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    5. ऊपरी जलीय चरण को एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    6. प्रत्येक नमूने में क्लोरोफॉर्म-आइसोअमिल अल्कोहल मिश्रण (24:1) की 1 मात्रा जोड़ें।
    7. 1 मिनट के लिए भंवर।
    8. 10 मिनट के लिए 13,000 x ग्राम पर सेंट्रलाइज।
    9. ऊपरी जलीय चरण को एक नए माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  7. डीएनए निष्कर्षण
    1. 96% इथेनॉल के 2.5 वॉल्यूम और 3 एम एनए-एसीटेट पीएच 5.2 की 0.1 वॉल्यूम जोड़ें।
    2. −80 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 एक्स ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
    4. इथेनॉल निकालें और 70% इथेनॉल के 400 माइक्रोन के साथ गोली धोएं।
    5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 13,000 एक्स ग्राम पर नमूनों को सेंट्रलाइज करें।
    6. इथेनॉल निकालें और हवा गोली सूखी।
    7. टे के 50 माइक्रोल में गोली को फिर से रीसुस्ल करें।

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Representative Results

कोशिकाओं में साइट-निर्देशित डीएसबी-प्रेरित मरम्मत प्रक्रियाओं का अध्ययन स्थिर या क्षणिक ट्रांसफैक्शन के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि स्थिर ट्रांसफैक्शन एक समरूप सेल आबादी सुनिश्चित करता है, जो एक एकीकृत और इस प्रकार अधिक विश्वसनीय सेलुलर प्रतिक्रिया देता है। क्षणिक ट्रांसफेक्शन के मामले में, सेल आबादी का केवल एक छोटा सा हिस्सा लेता है और प्लाज्मिड को बनाए रखता है, जो प्रयोग में विविधता का परिचय देता है। ईआर-आई-पीपीओआई या ईआर-एएसआईएसआई एंडोक्यूलेस-आधारित सेल सिस्टम की स्थापना के लिए 50% कॉन्फ्लोटिक सेल आबादी की आवश्यकता होती है, जो एंडोक्यूलीज को एन्कोडिंग प्लाज्मिड्स से अधिक प्रभावी रूप से संक्रमित होती है। ट्रांसफेक्शन के लिए, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध ट्रांसफेक्शन रीजेंट्स या वायरल संक्रमण आधारित तरीकों का भी उपयोग किया जा सकता है। यदि एक सूक्ष्म दृश्य तकनीक को लागू किया जाना है और क्षणिक ट्रांसफैक्शन की आवश्यकता है, तो निर्देशित डीएसबी को ट्रांसफेक्शन के बाद 4-OHT इसके अलावा 24 घंटे से प्रेरित किया जा सकता है, जो ईआर-फ्यूज्ड एंडोक्यूक्लिस से बांधता है और परमाणु स्थानांतरण और डीएसबी प्रेरण की अनुमति देता है। सबसे उपयुक्त समय-अंक निर्धारित करने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस-आधारित माइक्रोस्कोपी और 4-ओएचटी उपचार के बाद विभिन्न समय-बिंदुओं पर γH2AX का पश्चिमी दाग का पता लगाने का प्रदर्शन किया जा सकता है। शारीरिक परिस्थितियों में, प्रति कोशिका अधिकतम 10-15 γH2AX फोसी का पता लगाया जा सकता है, और मजबूत मरम्मत फोसी का गठन एंडोन्यूक्लियस (या विभिन्न अन्य तकनीकों जैसे, लेजर माइक्रोइराडिएशन) द्वारा ट्रिगर किया जा सकता है। एक विशिष्ट आई-पीपीओआई एंडो न्यूक्लियज़ राइबोसोमल डीएनए (आरडीएनए) में डीएसबी को प्रेरित करके नाभिक के चारों ओर ऊंचा γH2AX संकेतों के गठन की ओर जाता है। यदि एनएचईजे या एचआर द्वारा ब्रेक की मरम्मत की जाती है, तो समय के साथ मरम्मत फोसी की संख्या कम हो जाती है। इस कारण से, 4-ओएचटी उपचार के बाद 0 घंटे, 30 मिनट, 1, 2, 4 और 8 घंटे पर प्रतिनिधि समय-अंक की सिफारिश की जाती है। डीएनए मरम्मत प्रक्रियाओं को ट्रैक करने के लिए, सबसे अधिक उपयोग की जाने वाली सेल लाइन U2OS है, क्योंकि इन कोशिकाओं में सभी ज्ञात मरम्मत मार्ग पूरी तरह से कार्यात्मक हैं। एक ही कोशिकाओं में कई प्रोटीन की जांच करते समय, विभिन्न पशु प्रजातियों में उठाए गए विभिन्न उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य के साथ विभिन्न फ्लोरोफोरस के साथ संयुग्मित एंटीबॉडी के संयोजन से सह-स्थानीयकरण का अध्ययन किया जा सकता है जैसा कि चित्र 1में दिखाया गया है। उसमें, एक अकुशल स्थिर सेल लाइन के माध्यम से डीएसबी के प्रेरण का प्रतिनिधित्व किया जाता है जो ईआर-एएसआईएसआई प्रतिबंध एंडोक्यूक्लेस पर आधारित है जो हेमाग्लुटिनिन टैग (एचए) के साथ जुड़ा हुआ है। Doxycycline साइटोप्लाज्म में एचए-ईआर-एएसआईएसआई की अभिव्यक्ति और ज़ब्ती को प्रेरित कर सकता है जिसे एचए(चित्रा 1. तीसराकॉलम, दूसरा कच्चा) के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके ट्रैक किया जा सकता है। 4-OHT के साथ 4 घंटे के लिए इनक्यूबेशन, डॉक्सीसाइक्लिन इसके अलावा के बाद 24 घंटे, DSBs की उच्च संख्या को प्रेरित कर सकते हैं क्योंकि एंडोन्यूक्लियस को नाभिक में स्थानांतरित कर दिया गया है(चित्रा 1. तीसरा कॉलम, तीसरा कच्चा और दूसरा कॉलम, तीसरा कच्चा)। डीएसबी को γH2AX को पहचानने वाले एंटीबॉडी का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है।

Figure 1
चित्रा 1:इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी का उपयोग एचए-ईआर-एएसआईएसआई को व्यक्त करने वाली सुसंस्कृत कोशिकाओं में γH2AX का पता लगाने के लिए किया जाता है। डॉक्स (डॉक्सीसाइक्लिन) इसके अलावा एचए-ईआर-एएसआईएसआई की साइटोप्लाज्मिक अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है और 4-ओएचटी (4-हाइड्रोक्सीटामोक्सिफेन) (4 एच) फ्यूजन प्रोटीन के परमाणु स्थानांतरण को प्रेरित करता है, जिससे ज्ञात जीनोमिक पदों पर डीएसबी का शामिल होना पड़ता है। एचए (हेमाग्लुटिनिन) धुंधला (एंटी-एचए एंटीबॉडी) हरे रंग में एचए-ईआर-एएसआईएसआई फ्यूजन प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है, और ब्रेक का प्रेरण लाल रंग में γH2AX धुंधला (एंटी-γH2AX एंटीबॉडी) द्वारा सत्यापित किया जाता है। स्केल बार 20 माइक्रोन का प्रतिनिधित्व करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

क्षति स्थल पर मरम्मत प्रोटीन का सह-स्थानीयकरण इंगित करता है कि उन्हें एक ही डीएनए घाव साइट पर भर्ती किया जाता है, लेकिन वे जरूरी नहीं कि एक दूसरे के साथ बातचीत करें। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी का संकल्प लगभग 300 एनएम है; ब्रेक साइट पर विशिष्ट मरम्मत प्रोटीन के बाध्यकारी पैटर्न निर्धारित करने के लिए, सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी (स्टॉर्म) के बजाय 24की सिफारिश की है . हालांकि, इस विधि के लिए महंगे सूक्ष्म उपकरण और एक विशेषज्ञ शोधकर्ता की आवश्यकता होती है। वैकल्पिक रूप से, मरम्मत प्रोटीन के बाध्यकारी पैटर्न की जांच डीवीए या यू2ओएस-पीईपी15 स्थिर सेल लाइनों का उपयोग करके क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन द्वारा की जा सकती है, जो क्रमशः17, 21,विनियमित फैशन में एएसआईएसआई और आई-पीपीओआई एंडोन्यूक्लिस को व्यक्त कर सकती है। 4-OHT इसके अलावा, दोनों एंडो न्यूक्लियस डीएनए को एक अनुक्रम विशिष्ट तरीके से काट सकते हैं जो हमें अपेक्षित ब्रेक साइटों और उनके आसपास के जीनोमिक क्षेत्रों के लिए लोकस विशिष्ट प्राइमर डिजाइन करने का अवसर प्रदान करता है। सीआईपी के इम्यूनोप्रिपिटेशन पार्ट में एंटीबॉडी γH2AX लगाने से, हम विभिन्न स्थितियों (जैसे कि ब्याज के कुछ मरम्मत कारकों, यानी डीएनए-पीकेसीएस) पर डीएनए मरम्मत काइनेटिक्स का अस्थायी रूप से पालन कर सकते हैं। चपीपी-क्यूपीसीआर का उपयोग करके प्राप्त एक विशिष्ट प्रयोगात्मक परिणाम चित्र 2में दर्शाया गया है। उसमें, γH2AX के लौकिक संवर्धन मैं-PpoI प्रेरित डीएनए क्षति के लिए एक प्रतिक्रिया के रूप में प्रदर्शन किया है । छवि के बाएं हिस्से पर, समय पर पता चला γH2AX संकेत तोड़ने साइट पर दिखाया गया है, जबकि सही भाग पर, γH2AX वितरण एक नियंत्रण जीन क्षेत्र है जिस पर DSBs प्रेरित नहीं किया गया है पर प्रतिनिधित्व किया है ।

Figure 2
चित्र 2:आई-पीपीओआई-प्रेरित डीएनए क्षति के जवाब में क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिपिटेशन द्वारा निर्धारित γH2AX का लौकिक संवर्धन। बाएं, γH2AX को तोड़ने स्थल पर संकेत; ठीक है, एक नियंत्रण क्षेत्र में γH2AX वितरण जहां DSBs प्रेरित नहीं थे (विरोधी γH2AX एंटीबॉडी) । प्रतिनिधित्व परिणाम एक जैविक प्रयोग से प्राप्त होते हैं, और त्रुटि सलाखों के इसी नमूना प्रतिकृति की विविधताओं का संकेत मिलता है । एन = 3। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

हालांकि डीएनए की मरम्मत एक अपेक्षाकृत हाल ही में अनुसंधान क्षेत्र है, हमारे ज्ञान तेजी से विभिन्न जैव रासायनिक और सूक्ष्म तरीकों की मदद से विस्तार हो रहा है। आनुवंशिक जानकारी को संरक्षित करना कोशिकाओं के लिए महत्वपूर्ण है क्योंकि मरम्मत प्रक्रियाओं में शामिल जीन में होने वाले उत्परिवर्तन ट्यूमरजीनेसिस के प्रमुख कारणों में से हैं और इसलिए डीएनए मरम्मत मार्गों के प्रमुख चरणों को स्पष्ट करना आवश्यक है।

जैव रासायनिक तकनीक (यानी, पश्चिमी दाग, इम्यूनोप्रिपिपिटेशन, मास-स्पेक्ट्रोमेट्री, आदि) को बड़ी संख्या में कोशिकाओं की आवश्यकता होती है और अध्ययन की गई मरम्मत प्रक्रियाएं वांछित कोशिका आबादी के स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करती हैं। प्रदर्शन ChIP प्रयोगों परिश्रम, परेशानी और कई विचारों को ध्यान में रखा जाना है जब विशिष्ट प्रयोग डिजाइन करने के लिए डीएसबी की मरंमत की प्रक्रिया का अध्ययन किया है । निम्नलिखित चरण कुछ उदाहरण हैं: (I) कोशिकाओं को ठीक से lysed किया जाना चाहिए; क्रोमेटिन अंश (II) क्रोमेटिन तक उच्च पहुंच सुनिश्चित करने के लिए अलग-अलग सेल और न्यूक्लियर लाइसिस बफर का उपयोग करके दो-चरण लाइसेशन विधि लागू करने की अत्यधिक सिफारिश की जाती है; सोनीशन की उचित शर्तों को प्रत्येक सेल प्रकार के लिए पहले से अनुकूलित किया जाना चाहिए (III) शुद्ध एंटीबॉडी की उचित मात्रा निर्धारित की जानी चाहिए क्योंकि विभिन्न कंपनियों से एक ही प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी कुशल इम्यूनोप्रिपिपिटेशन के लिए गैर-समान विशेषताओं (IV) का प्रदर्शन करते हैं, 25-30 यूजी प्रारंभिक क्रोमेटिन का उपयोग प्रत्येक स्थिति में किया जाना चाहिए (V) निर्धारण के उचित समय को अनुकूलित किया जाना चाहिए के रूप में overfixation पार से झूठी सकारात्मक परिणाम में परिणाम कर सकते है दूर प्रोटीन परिसरों और underfixation डीएनए और वांछित प्रोटीन (छठी) के बीच उचित पार जोड़ने को रोका जा सकता है लागू एंटीबॉडी के आधार पर, मोती के प्रकार (प्रोटीन ए या जी) ध्यान से निर्धारित किया जाना चाहिए (सातवीं) धोने के कदम के दौरान, धोने बफ़र्स के आदेश अच्छी तरह से रखा जाना चाहिए मोतियों से एंटीबॉडी की रिहाई से बचने के लिए () आगे डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं की दक्षता को कम करने से बचने के लिए फिनोल निशान को ठीक से समाप्त किया जाना चाहिए। चूंकि यह विधि बरामद डीएनए की उपज को कम करती है, इसलिए हमारी व्यक्तिगत सलाह विशिष्ट डीएनए-शुद्धिकरण किट का उपयोग करना है। जब सभी महत्वपूर्ण बिंदुओं को ठीक से संबोधित किया गया है, तो ChIP विभिन्न जीनोमिक लोकी पर वांछित प्रोटीन की अधिभोग के लिए मूल्यवान डेटा प्रदान कर सकता है और डीएनए मरम्मत प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण कदम ों को सुलझा सकता है।

हालांकि, क्यूपीसीआर के साथ संयुक्त सीआईपी चयनित जीनोमिक क्षेत्रों में प्रोटीन वितरण का अध्ययन करने के लिए एक अप्रत्यक्ष दृष्टिकोण है और विशेष रूप से डीएनए बाध्यकारी साइट को पहचानने या सीधे प्रोटीन के कार्य की जांच करने की अनुमति नहीं देता है। प्रोटीन-डीएनए परिसरों को पकड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले मोनो-या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी अन्य प्रोटीन के साथ भी क्रॉस-प्रतिक्रिया कर सकते हैं जिससे झूठे-सकारात्मक डेटा होते हैं और इसलिए, इस तकनीक में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी चिप-ग्रेड और ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ अत्यधिक विशिष्ट होने चाहिए। हालांकि, सीआईपी एक व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है और इसके आधार पर आगे के दृष्टिकोण विकसित किए गए हैं, जैसे कि सीआईपी-ऑन-चिप और सीआईपी-एसईक्यू। पूर्व एक छोटे यादृच्छिक डीएनए दृश्यों की एक बड़ी विविधता के साथ एक माइक्रोएरे पर इम्यूनोप्रिपिटेटेड और शुद्ध डीएनए टुकड़ों को संकरित करने पर निर्भर करता है जो प्रोटीन बाध्यकारी साइटों के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करने वाले एनील्ड दृश्यों को और बढ़ाता है। हालांकि, ChIP-seq एक आकर्षक वैकल्पिक दृष्टिकोण के रूप में उभरा है क्योंकि यह चिप-ऑन-चिप और उच्च थ्रूपुट जीनोम अनुक्रमण की तुलना में उच्च संकल्प के साथ प्रोटीन-डीएनए परिसरों की जीनोम-व्यापी मानचित्रण प्रदान करता है । ChIP-seq ने जीन विनियमन में अंतर्दृष्टि प्रदान करने और जीनोम-वाइड स्केल25में क्रोमेटिन परिदृश्य को खोलना विभिन्न प्रतिलेखन कारकों के डीएनए बाध्यकारी स्थलों का खुलासा करके डीएनए मरम्मत के क्षेत्र में क्रांतिकारी बदलाव किया है । इसके अनुसार, डीएनए मरम्मत के क्षेत्र को ChIP-seq से काफी फायदा हुआ है क्योंकि ये डेटा कैंसर की प्रगति जैसे विभिन्न रोगों और जैविक रास्तों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । फिर भी, चैआईपी विधि के विभिन्न संशोधनों को हेलोकिप जैसे विकसित किया गया है, जिन्हें ब्याज के प्रोटीन के खिलाफ विशिष्ट एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं होती है बल्कि हेलोटैग के साथ जुड़े डीएनए-बाध्यकारी प्रोटीन को एन्कोडिंग करने वाले दृश्यों का उपयोग करता है, जो कोशिकाओं से संक्रमित होते हैं और बाद में क्रॉसलिंकिंग के लिए, वांछित प्रोटीन-डीएनए परिसरों को हल्लोलिंक रेसिन का उपयोग करके कैप्चर किया जा सकता है। हालांकि, यह तकनीक अतिव्यक्तता पर निर्भर करती है न कि वांछित प्रोटीन के अंतर्जात स्तर पर जिसके परिणामस्वरूप डेटा26की गलत व्याख्या की जा सकती है ।

इसके अलावा, सूक्ष्म तकनीक डीएनए क्षति की मरम्मत के स्थानिक ट्रैकिंग के बारे में मूल्यवान जानकारी प्रदान करती है, यहां तक कि एकल-कोशिका स्तर में भी। विशिष्ट मरम्मत प्रोटीन के खिलाफ उठाए गए एंटीबॉडी के तेजी से सुधार के कारण एनईआर और डीएसबीआर उप-मार्गों के तंत्र के साथ-साथ उनके पोस्ट-ट्रांसलेशनल नियमन की गहरी समझ हुई है । सूक्ष्म क्षेत्र को उच्च-रिज़ॉल्यूशन तकनीकों द्वारा क्रांति दी गई है, जैसे सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी, जो न्यूकोसोमल स्तर पर डीएनए क्षति-प्रेरित सेलुलर प्रक्रियाओं के दृश्य की अनुमति देता है, साथ ही प्रोटीन सह-स्थानीयकरण24की सटीक मानचित्रण सुनिश्चित करता है। हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि प्रयोग के दौरान सेल वंश में भिन्नता पर विचार किया जाना चाहिए क्योंकि मरम्मत की दर हट सकती है, जिससे परिणामों की व्याख्या करना मुश्किल हो सकता है। फ्लोरेसेंस इमेजिंग पद्धति के तेजी से विकास और प्रयोगात्मक सेटअप के जानबूझकर डिजाइन को ध्यान में रखते हुए, एक एकल कोशिका स्तर में एक प्रोटीन संकल्प पर डीएनए क्षति प्रेरित सेलुलर और आणविक प्रतिक्रियाओं की जांच करने का एक अनमोल अवसर पूर्णता के लिए अपने रास्ते पर है ।

अंत में, सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी और एकल-कोशिका अनुक्रमण पद्धति के संयोजन से डीएनए मरम्मत क्षेत्र के बारे में हमारी समझ में काफी सुधार हो सकता है।

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Disclosures

कोई नहीं

Acknowledgments

इस शोध को राष्ट्रीय अनुसंधान, विकास और नवाचार कार्यालय अनुदान GINOP-2.3.2-15-2016-00020 द्वारा वित्त पोषित किया गया था, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, हंगरी एकेडमी ऑफ साइंसेज बो/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO अल्पकालिक फैलोशिप ८५१३, और टेम्पस फाउंडेशन के János Bolyai अनुसंधान छात्रवृत्ति ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

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जीव विज्ञान अंक 174 डीएनए मरम्मत क्रोमेटिन इम्यूनोप्रिपिटेशन फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी साइट-विशिष्ट डीएसबी इम्यूनोसैटिंग
एंडोन्यूक्लियज़-आधारित साइट-विशिष्ट डीएनए क्षति की कल्पना और मात्रा निर्धारित करना
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Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

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