Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Dit artikel introduceert essentiële stappen van immunostaining en chromatine immunoprecipitatie. Deze protocollen worden vaak gebruikt om DNA-schadegerelateerde cellulaire processen te bestuderen en om de rekrutering van eiwitten die betrokken zijn bij DNA-reparatie te visualiseren en te kwantificeren.

Abstract

Cellen worden continu blootgesteld aan verschillende DNA-schadelijke stoffen, waardoor verschillende cellulaire reacties worden afgeleid. Het toepassen van biochemische en genetische benaderingen is essentieel bij het onthullen van cellulaire gebeurtenissen die verband houden met de rekrutering en assemblage van DNA-reparatiecomplexen op de plaats van DNA-schade. In de afgelopen jaren zijn verschillende krachtige tools ontwikkeld om plaatsspecifieke DNA-schade te veroorzaken. Bovendien stellen nieuwe baanbrekende technieken ons in staat om deze processen op het niveau van de resolutie van één cel te bestuderen met behulp van zowel vaste als levende cellen. Hoewel deze technieken zijn gebruikt om verschillende biologische processen te bestuderen, presenteren we hierin de meest gebruikte protocollen op het gebied van DNA-reparatie, Fluorescentie Immunostaining (IF) en Chromatine Immunoprecipitatie (ChIP), die in combinatie met endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade het mogelijk maken om de genomische bezetting van DNA-reparatiefactoren op een gerichte en gereguleerde manier te visualiseren en te kwantificeren, respectievelijk. Deze technieken bieden krachtige instrumenten voor de onderzoekers om nieuwe eiwitten te identificeren die gebonden zijn aan de beschadigde genomische locus, evenals hun post-translationele modificaties die nodig zijn voor hun fine-tune regulatie tijdens DNA-reparatie.

Introduction

Ons genoom wordt voortdurend uitgedaagd door verschillende DNA-schadelijke stoffen. Deze aanvallen kunnen afkomstig zijn van omgevingsbronnen, zoals UV-licht of bestraling, evenals van endogene bronnen, zoals metabolische bijproducten veroorzaakt door oxidatieve stress of replicatiefouten1,2. Deze laesies kunnen de integriteit van een of beide DNA-strengen beïnvloeden, en als de gegenereerde fouten persistent worden, leidt dit vaak tot translocaties en genoominstabiliteit, wat kan leiden tot tumorigenese3,4. Om de genoomintegriteit te behouden, zijn tijdens de evolutie meerdere reparatiesystemen ontwikkeld. Afhankelijk van de chemische en fysische eigenschappen van specifieke soorten DNA-schade kunnen meerdere reparatiemechanismen worden geactiveerd. Mismatches, abasische sites, single-streng breaks, en 8-oxoguanine (8-oxoG) kan worden verwijderd door mismatch reparatie of base-excisie reparatie pad5,6. Laesies veroorzaakt door UV-geïnduceerde fotoproducten en omvangrijke adducten kunnen worden hersteld door nucleotide-excisiereparatie (NER) of DNA-dubbelstrengsbreukreparatie (DSBR) proces7,8. NER bestaat uit twee hoofdsubtrajecten: transcriptiegekoppelde NER (TC-NER) en global genomic NER (GG-NER). Wat de celcyclusfase betreft, kunnen na DNA-dubbelstrengs breukinductie twee subroutes worden geactiveerd: niet-homologe eindvoeging (NHEJ) en homologe recombinatie (HR)1,9. NHEJ, de dominante route in rustcellen, kan in alle celcyclusfasen worden geactiveerd, wat een snellere maar foutgevoelige route10vertegenwoordigt. Aan de andere kant is HR een foutloos traject, waarbij de DSB's worden gerepareerd op basis van sequence-homology search van de zusterchromatiden, daarom is het voornamelijk aanwezig in S- en G2-celcyclusfasen11. Bovendien is microhomologie-gemedieerde eindvoeging (MMEJ) een ander DSB-reparatiemechanisme, onderscheiden van de bovengenoemde, gebaseerd op een KU70/80- en RAD51-onafhankelijke manier om eerder gereseceerde microhomologe sequenties die de gebroken DNA-uiteinden flankeren, opnieuw te ligeren. Daarom wordt MMEJ beschouwd als foutgevoelig en zeer mutageen12. Tijdens DNA-reparatie kunnen DSB's de DNA-schaderespons (DDR) induceren, wat resulteert in de activering van checkpointkinases die de celcyclus stoppen tijdens reparatie13,14,15. De DDR wordt geactiveerd als reactie op de werving en uitgebreide verspreiding van belangrijke initiatorspelers van het reparatieproces rond de laesies, wat bijdraagt aan de vorming van een reparatiefocus. In deze vroege signaleringscascade speelt de ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) kinase een cruciale rol door de fosforylering van de histonvariant H2AX bij Ser139 (aangeduid als γH2AX) rond de laesie16te katalyseren. Deze vroege gebeurtenis is verantwoordelijk voor de werving van aanvullende reparatiefactoren en het starten van downstream reparatieprocessen. Hoewel de exacte functie van de gerekruteerde eiwitten bij de reparatiefocus nog niet volledig is gekarakteriseerd, zijn de vorming en de dynamiek van reparatie foci onderzocht door verschillende laboratoria. Deze markers worden veel gebruikt om de reparatiekinetiek te volgen, maar hun precieze rol tijdens het reparatieproces blijft ongrijpbaar. Vanwege het grote belang en toch een slecht begrip van DNA-reparatiegerelateerde cellulaire processen, zijn er tot nu toe verschillende methoden ontwikkeld om de DDR te induceren en te visualiseren.

Er zijn verschillende methoden en systemen opgezet om het gewenste type DNA-schade op te wekken. Sommige middelen [zoals neocarzinostatine (NCS), fleomycine, bleomycine, γ-bestraling, UV] kunnen bijvoorbeeld grote aantallen willekeurige DNA-breuken induceren op niet-voorspellende genomische posities, terwijl andere (endonucleases, zoals AsiSI, I-PpoI of I-SceI, evenals laserstriping) DNA-breuken kunnen induceren bij bekendegenomische loci17,18 , 19,20. Hier richten we ons op de op endonuclease gebaseerde technieken die momenteel worden gebruikt om de DDR in zoogdier- en gistcellen te bestuderen. Afgezien van het benadrukken van de principes van deze technieken, benadrukken we zowel hun voor- als nadelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immunodetection van specifieke eiwitten

  1. Voorbereiding van celkweek en experimentele opstelling
    1. Onderhoud U2OS-cellen in monolagen in DMEM-kweekmedium aangevuld met 10% foetale kalfsserum, 2 mM glutamine en 1% antibiotica-antimycotische oplossing.
      OPMERKING: Gebruik voor op endonuclease gebaseerde DNA-schade inductie met houtskool of een steroïdvrij medium om systeemlekken te voorkomen.
    2. Kweek cellen in een bevochtigde 5% CO2-omgeving bij 37 °C tot 80% samenvloeiing, waarbij het medium elke 2-3 dagen wordt vernieuwd.
    3. Aspireer het medium en was de cellen met 1x PBS. Maak cellen los met trypsine-EDTA-oplossing. Wanneer de cellen losraken, stopt u de trypsineactiviteit door kweekmedium aan de cellen toe te voegen, wat een celsuspensie oplevert.
    4. Tel de cellen met behulp van een celtelkamer. Plaat 2 x 104 cellen/ml/put op een 24-put plaat, met steriele 12 mm ronde afdeklips in elke put.
    5. Incubeer cellen gedurende 24 uur bij 37 °C in een bevochtigde CO2-atmosfeer van 5% om bevestiging op de afdeklips mogelijk te maken.
    6. Behandel de cellen met 10 ng/ml neocarzinostatine (NCS) door het schadelijke middel rechtstreeks naar het gekweekte medium te leiden. Incubeer de cellen gedurende 15 minuten met het NCS-bevattende medium, was ze vervolgens met 1x PBS en voeg vers, aangevuld kweekmedium toe aan de cellen. Gebruik anders geschikt middel (d.w.z. 4-OHT) om DSB's via endonuclease-gebaseerde systemen te induceren zonder het medium te vernieuwen22.
      OPMERKING: U kunt ook bestraling gebruiken om DNA-schade te veroorzaken, variërend van 30 minuten tot 8 uur hersteltijd door neutronenflux tussen 2-20 Gy23te gebruiken.
    7. Incubeer cellen gedurende 1-8 uur bij 37 °C in een bevochtigde CO2-atmosfeer van 5% om de kinetiek van DNA-reparatie te volgen.
  2. Fixatie van cellen
    OPMERKING: 300-500 μL oplossingen/put moet in de volgende stappen (stappen 1.2-1.5) worden gebruikt om alle cellen adequaat te bedekken. Elke incubatie- en wasstap (behalve de antilichaamincubering) moet worden uitgevoerd op een orbitale shaker met zachte agitatie.
    1. Na DSB-inductie en incubatie van cellen, verwijder het medium uit de aangesloten cellen en was de cellen eenmaal met 1x PBS.
    2. Fix cellen met 4% formaldehyde-PBS oplossing gedurende 20 min bij 25 °C.
  3. Permeabilisatie van cellen
    1. Verwijder de bevestigingsoplossing en was de cellen driemaal met 1x PBS gedurende elk 5 minuten.
    2. Verwijder de PBS en voeg 0,2% Triton X-100 opgelost in PBS toe. Incubeer de monsters gedurende 20 minuten.
  4. Blokkering van niet-specifieke bindingssites
    1. Was de cellen drie keer met 1x PBS.
    2. Blokkeer niet-specifieke bindingsplaatsen met 5% BSA (Bovine Serum Fraction V albumine) verdund in PBST (1x PBS aangevuld met 0,1% Tween-20) en incubeer de permeabiliseerde monsters gedurende ten minste 20 minuten.
  5. Immunofluorescentiekleuring
    1. Voeg de juiste hoeveelheid primair antilichaam (d.w.z. anti-γH2AX, anti-DNA-PC's) verdund in 1% BSA-PBST-oplossing toe. Plaats elke afdeklip ondersteboven op een paraffinefilm over een druppel van 10 μL van het verdunde anti-γH2AX-antilichaam.
      OPMERKING: In geval van co-immunostaining op de juiste manier verdunnen beide antilichamen in dezelfde 1% BSA-PBST-oplossing.
    2. Incubeer de monsters in een vochtigheidskamer gedurende 1,5 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Incubatie kan ook 's nachts bij 4 °C worden uitgevoerd.
    3. Plaats de afdeklips terug met de zijkant naar boven in de 24-put plaat en was drie keer gedurende 5 minuten met 1x PBS.
    4. Voeg de juiste hoeveelheid secundair antilichaam verdund toe in 1% BSA-PBST. Plaats elke afdeklip ondersteboven op een paraffinefilm over een druppel van 10 μL van het verdunde antilichaam.
    5. Incubeer de monsters gedurende 1 uur in een vochtigheidskamer bij 4 °C.
    6. Plaats de afdeklips terug met de zijkant naar boven in de 24-put plaat en was drie keer gedurende 5 minuten met 1x PBS.
    7. Voordat u de laatste PBS-wasoplossing verwijdert, haalt u de afdeklipjes voorzichtig eruit met een pincet en naald en plaatst u ze vervolgens ondersteboven op glazen dia's met druppeltjes montagemedium (aangevuld met DAPI).
      OPMERKING: Vermijd de vorming van luchtbellen. Wanneer het montagemedium droogt, wordt aanbevolen om de randen van de afdeklips af te dichten met nagellak om verschrompeling van de monsters te voorkomen.

2. Chromatine immunoprecipitatie

  1. Celverzameling, crosslinking, cel- en kernlysis en DNA-fragmentatie
    1. Kweek ongeveer 5 x 106 cellen/ml in een schaal van 150 mm voor elk monster.
    2. Verwijder het kweekmedium en was de cellen twee keer met ijskoud 1x PBS.
    3. Bevestig de cellen met 1% formaldehyde-PBS-oplossing, plaats de platen op een orbitale shaker en roer zachtjes gedurende 20 minuten.
      OPMERKING: Formaldehyde is vluchtig; bereid altijd een nieuwe werkoplossing voor. In sommige gevallen bevat de formaldehyde-oplossing methanol om het te stabiliseren, maar het is beter om een methanolvrije oplossing te gebruiken om interferentie met downstreamreacties te voorkomen.
    4. Stop de fixatie met 125 mM glycine en incubeer op een orbitale shaker met zachte agitatie gedurende 5 minuten bij 25 °C.
    5. Leg de platen op ijs en was twee keer met ijskoud 1x PBS.
    6. Schraap de cellen in ijskoude 1x PBS en breng ze over in 15 ml conische buizen.
    7. Centrifugeer de cellen bij 2.500 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
    8. Aspireer voorzichtig het supernatant en resuspendeer de pellet in 2 ml cellysisbuffer [5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (proteaseremmercocktail)] en incubeer gedurende 10 minuten op ijs.
    9. Centrifugeer de celsuspensie bij 2.500 x g gedurende 5 min bij 4 °C.
    10. Gooi het supernatant voorzichtig weg en resuspendeer de pellet in 500-1.500 μL nucleaire lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) en incubeer gedurende 30-60 minuten op ijs. Breng het lysaat over in een polystyreen conische buis die geschikt is voor sonicatie.
      OPMERKING: Omdat de nucleaire lysisbuffer SDS bevat, zal deze neerslaan op ijs en zal de oplossing wit worden. De oplossing moet transparant worden na sonicatie.
    11. Soniceer het lysaat om DNA te scheren tot een gemiddelde fragmentgrootte van 300-1.000 bp.
      OPMERKING: De juiste sonicatiecycli en -omstandigheden moeten worden ingesteld op basis van het celtype en de sonicatieapparatuur. Fragmenten kleiner dan 200 bp zijn niet geschikt voor ChIP, omdat de nucleosoom-DNA interacties verstoord kunnen worden.
  2. Omkering van crosslinking, bepaling van gesoniceerde fragmentgroottes
    1. Haal 100 μL van het gesoniceerde monster eruit om de fragmentgrootte van het gesoniceerde chromatine te verifiëren. De resterende chromatine moet bij −80 °C worden bewaard.
    2. Voeg 0,5 mg/ml RNase A toe aan elke 100 μL van het monster en incubeer ze gedurende 20 minuten bij 37 °C om de RNase te activeren.
    3. Incubeer de monsters 's nachts bij 65 °C.
    4. Voeg de volgende dag 500 μg/ml Proteïnase K en 0,5% SDS toe en incubeer de monsters gedurende 3 uur bij 50 °C.
    5. Voeg 0,5 volume fenol en 0,5 volume chloroform-isoamylalcoholmix (24:1) toe aan elk monster.
    6. Vortex gedurende 1 min.
    7. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 13.000 x g.
    8. Breng de bovenste waterfase over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
    9. Voeg 1 volume chloroform-isoamylalcoholmix (24:1) toe aan elk monster.
    10. Vortex gedurende 1 min.
    11. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 13.000 x g.
    12. Breng de bovenste waterfase over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
    13. Voeg 2,5 volumen 96% ethanol en 0,1 volume 3 M Na-Acetaat pH 5,2 toe.
    14. Incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij −80 °C.
    15. Centrifugeer de monsters bij 13.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
    16. Verwijder de ethanol en was de pellet met 400 μL 70% ethanol.
    17. Centrifugeer de monsters bij 13.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
    18. Verwijder de ethanol en droog de pellet aan de lucht.
    19. Resuspend de pellet in 10 μL TE.
    20. Voer de monsters uit op een 0,8% agarose gel. De gesoniceerde chromatinegrootte moet ongeveer 500 bp zijn.
      OPMERKING: Gebruik bromoffenol blauwvrije laadbuffer omdat de grootte van deze kleurstof ongeveer 500 bp is, wat de juiste detectie van chromatinefragmenten kan verstoren. In plaats daarvan wordt aanbevolen om een laadbuffer te gebruiken, aangevuld met xyleen-cyanole, wat ongeveer 3.000 bp is.
    21. Als de chromatinegrootte acceptabel is, verdun dan de bevroren chromatinemonsters uit stap 2.1. in 3 volumes verdunningsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) en meng de monsters gedurende 10 minuten bij 4 °C via rotatie.
      OPMERKING: Deze stap is nodig om de SDS in de nucleaire lysisbuffer te verdunnen om interferentie met downstreamreacties te voorkomen, inclusief het meten van de chromatineconcentratie.
    22. Meet de DNA-concentratie van de chromatinemonsters bij 260/280 nm met behulp van een spectrofotometer.
  3. Bereiding van kralen, pre-clearing en immunoprecipitatie
    1. Bereid kralen (schapen anti-konijn of muis IgG) voor de pre-clearing en immunoprecipitatie stappen. Was kralen tweemaal gedurende 10 minuten op 4 °C met RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA pH 8.0, 1% Triton X-100, 0.1% Na-DOC, 0.1% SDS, 150 mM NaCl en 1X PIC).
    2. Resuspend de kralen in hetzelfde volume RIPA buffer als in stap 2.3.1.
    3. 25-30 μg chromatine van elk monster vooraf wissen met 4 μL van de kralen via rotatie gedurende 1-2 uur bij 4 °C.
      OPMERKING: Voeg RIPA-buffer toe aan elk chromatinemonster tot 500 μL eindvolume om de monsters goed te laten mengen tijdens rotatie. Vergeet niet chromatine voor NAC (No Antibody Control) en TIC (Total Input Control) te nemen in het geval van elke sample set. TICs vereisen slechts een eindvolume van maximaal 200 μL.
    4. Zet de kralen neer met een magneet en breng het supernatant over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
    5. Voeg de juiste hoeveelheid antilichaam toe aan elk chromatinemonster (behalve NAC en TIC) en roteer 's nachts bij 4 °C.
    6. Voeg de volgende dag 40 μL gewassen kralen toe aan elk monster (behalve TIC) en incubeer ze 's nachts, draaiend bij 4 °C.
  4. Was
    1. Was eenmaal met 300 μL low salt buffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) gedurende 10 minuten via rotatie bij 4 °C.
    2. Was eenmaal met 300 μL hoge zoutbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) gedurende 10 minuten via rotatie bij 4 °C.
    3. Was eenmaal met 300 μL LiCl buffer (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) gedurende 10 minuten via rotatie bij 4 °C.
    4. Was tweemaal met 300 μL TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) gedurende 10 minuten via rotatie, voor de eerste wasbeurt bij 4 °C en de tweede wasbeurt bij 25 °C.
  5. Elutie
    1. Voeg 200 μL van de elutiebuffer (1% SDS en 100 mM NaHCO3) toe aan de kralen en incubeer bij 65 °C in een thermoschudder gedurende 15 minuten met continu schudden (ca. 400 RPM). Breng het supernatant opnieuw over naar een nieuwe tube en elute kralen in 200 μL Elution buffer. Combineer eluaten (400 μL eindvolume).
    2. Voeg NaCl toe aan een eindconcentratie van 200 mM in elk monster. Vul de TIC-monsters aan met 200 μL Elutiebuffer en voeg ook NaCl toe.
      OPMERKING: Vanaf deze stap moet TIC onder dezelfde omstandigheden worden behandeld als de andere monsters.
    3. Incubeer de monsters gedurende ten minste 6 uur bij 65 °C (zonder te schudden).
    4. Voeg 1 ml koude 100% ethanol toe aan elk monster, draai de buizen twee keer om te mengen en stort DNA 's nachts neer bij −80 °C.
    5. De volgende dag centrifugeer gedurende 30 min bij 13.000 x g bij 4 °C.
    6. Gooi het supernatant weg en was de pellet met 70% EtOH.
    7. Centrifugeer de monsters bij 13.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
    8. Gooi het supernatant weg en droog de pellets aan de lucht.
    9. Resuspendeer de pellets in 100 μL TE en voeg 0,5 mg/ml RNase A toe aan elk monster. Incubeer gedurende 20 minuten bij 37 °C om de RNase te activeren.
  6. Omkering van crosslinking
    1. Voeg 500 μg/ml Proteïnase K en 0,5% SDS toe en incubeer de monsters vervolgens bij 50 °C gedurende 2 uur.
      OPMERKING: Als u doorgaat naar ChIP-seq, vermijd dan fenol-chloroformextractie, omdat dit het downstream NGS-proces remt. In plaats daarvan wordt aanbevolen om een in de handel verkrijgde kit te gebruiken (zie tabel met materialen).
    2. Voeg 0,5 volume fenol en 0,5 volume chloroform-isoamylalcoholmix (24:1) toe aan elk monster.
    3. Vortex gedurende 1 min.
    4. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 13.000 x g.
    5. Breng de bovenste waterfase over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
    6. Voeg 1 volume chloroform-isoamylalcoholmix (24:1) toe aan elk monster.
    7. Vortex gedurende 1 min.
    8. Centrifugeer gedurende 10 minuten op 13.000 x g.
    9. Breng de bovenste waterfase over naar een nieuwe microcentrifugebuis.
  7. DNA-extractie
    1. Voeg 2,5 volumen 96% ethanol en 0,1 volume 3 M Na-Acetaat pH 5,2 toe.
    2. Incubeer gedurende ten minste 20 minuten bij −80 °C.
    3. Centrifugeer de monsters bij 13.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
    4. Verwijder de ethanol en was de pellet met 400 μL 70% ethanol.
    5. Centrifugeer de monsters bij 13.000 x g gedurende 10 min bij 4 °C.
    6. Verwijder de ethanol en droog de pellet aan de lucht.
    7. Resuspend de pellet in 50 μL TE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het bestuderen van site-gestuurde DSB-geïnduceerde reparatieprocessen in cellen kan worden bereikt via stabiele of voorbijgaande transfectie. Er moet echter worden opgemerkt dat stabiele transfectie zorgt voor een homogene celpopulatie, die een uniforme en dus betrouwbaardere cellulaire respons geeft. In het geval van transfectie neemt slechts een klein deel van de celpopulatie het plasmide op en handhaaft het, wat diversiteit in het experiment introduceert. Voor het opzetten van ER-I-PpoI- of ER-AsiSI-endonuclease-gebaseerde celsystemen is een 50% samenvloeiende celpopulatie vereist, die effectiever wordt getransfecteerd met plasmiden die coderen voor het endonuclease. Voor transfectie kunnen ook in de handel verkrijgde transfectiereagentia of virale infectiegebaseerde methoden worden gebruikt. Als een microscopische visualisatietechniek moet worden toegepast en transfectie nodig is, kunnen de gerichte DSB's worden geïnduceerd door 4-OHT-toevoeging 24 uur na transfectie, die zich bindt aan de ER-gefuseerde endonucleases en de nucleaire translocatie en DSB-inductie mogelijk maakt. Om de meest geschikte tijdspunten te bepalen, kunnen immunofluorescentiegebaseerde microscopie en westelijke vlekdetectie van γH2AX op verschillende tijdstippen na behandeling met 4 OHT worden uitgevoerd. Onder fysiologische omstandigheden kan maximaal 10-15 γH2AX foci per cel worden gedetecteerd en kan de vorming van sterke reparatie-foci worden geactiveerd door endonucleases (of verschillende andere technieken die hier niet worden besproken, bijvoorbeeld lasermicroirradiatie). Een typisch I-PpoI-endonuclease leidt tot de vorming van verhoogde γH2AX-signalen rond de nucleolus door DSB's op te wekken bij ribosomale DNA (rDNA). Als de breuken worden gerepareerd door NHEJ of HR, neemt het aantal reparatie-foci in de loop van de tijd af. Om deze reden worden representatieve tijdspunten om 0 uur, 30 minuten, 1, 2, 4 en 8 uur na 4-OHT-behandelingen aanbevolen. Om DNA-reparatieprocessen te volgen, is de meest gebruikte cellijn U2OS, omdat alle bekende reparatieroutes volledig functioneel zijn in deze cellen. Bij het onderzoeken van verschillende eiwitten in dezelfde cellen kan colokalisatie worden bestudeerd door antilichamen geconjugeerd met verschillende fluoroforen te combineren met verschillende emissiegolflengten die bij verschillende diersoorten worden verhoogd, zoals weergegeven in figuur 1. Daarin wordt de inductie van DSB's via een inductieve stabiele cellijn weergegeven, die is gebaseerd op de ER-AsiSI-beperking endonuclease gefuseerd met hemagglutininetag (HA). Doxycycline kan de expressie en vastlegging van HA-ER-AsiSI in het cytoplasma induceren, dat kan worden gevolgd met behulp van een antilichaam tegen HA(figuur 1. derde kolom, tweede ruwe). Incubatie gedurende 4 uur met 4-OHT, 24 uur na toevoeging van doxycycline, kan een hoog aantal DSB's veroorzaken, omdat het endonuclease is omgezet naar de kern(figuur 1. derde kolom, derde ruwe en tweede kolom, derde ruw). DSB's kunnen worden gevisualiseerd met behulp van een antilichaam dat γH2AX herkent.

Figure 1
Figuur 1: Immunofluorescentiemicroscopie wordt gebruikt om γH2AX te detecteren in gekweekte cellen die HA-ER-AsiSI uitdrukken. DOX (doxycycline) toevoeging activeert de cytoplasmatische expressie van HA-ER-AsiSI en 4-OHT (4-hydroxytamoxifen) (4 uur) induceert de nucleaire translocatie van het fusie-eiwit, wat leidt tot de inductie van DSB's op bekende genomische posities. HA (hemagglutinine) kleuring (anti-HA antilichaam) vertegenwoordigt het HA-ER-AsiSI fusie-eiwit in groen, en de inductie van breuken wordt geverifieerd door γH2AX-kleuring (anti-γH2AX-antilichaam) in rood. Schaalbalken vertegenwoordigen 20 μm. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Colokalisatie van reparatie-eiwitten op de schadeplaats geeft aan dat ze naar dezelfde DNA-laesieplaats worden gerekruteerd, maar ze communiceren niet noodzakelijkerwijs met elkaar. De resolutie van de confocale microscopie is ongeveer 300 nm; om het bindingspatroon van specifieke reparatie-eiwitten op de breekplaats te bepalen, wordt in plaats daarvan superresolutiemicroscopie (STORM) aanbevolen 24. Deze methode vereist echter dure microscopische apparatuur en een deskundige onderzoeker. Als alternatief kan het bindingspatroon van de reparatie-eiwitten worden onderzocht door chromatine immunoprecipitatie met behulp van DIvA of U2OS-pEP15 stabiele cellijnen, die AsiSI en I-PpoI endonucleases op een gereguleerde manier kunnen uitdrukken, respectievelijk17,21. Bij 4-OHT toevoeging kunnen beide endonucleases het DNA op een sequentiespecifieke manier snijden, wat ons de mogelijkheid biedt om locus specifieke primers te ontwerpen voor de verwachte breekplaatsen en hun omliggende genomische regio's. Door γH2AX-antilichaam toe te passen in het immunoprecipitatiegedeelte van de ChIP, kunnen we de DNA-reparatiekinetiek tijdelijk volgen onder verschillende omstandigheden (zoals het uitschakeling of remmen van bepaalde reparatiefactoren van belang, d.w.z. DNA-pc's). Een typisch experimenteel resultaat verkregen met ChIP-qPCR wordt weergegeven in figuur 2. Daarin wordt de temporele verrijking van γH2AX aangetoond als een reactie op I-PpoI-geïnduceerde DNA-schade. Aan de linkerkant van de afbeelding wordt het tijdig gedetecteerde γH2AX-signaal weergegeven op de breekplaats, terwijl op het rechterdeel de γH2AX-verdeling wordt weergegeven in een controlegengebied waar DSB's niet zijn geïnduceerd.

Figure 2
Figuur 2: Tijdelijke verrijking van γH2AX zoals bepaald door chromatine immunoprecipitatie als reactie op I-PpoI-geïnduceerde DNA-schade. Links, γH2AX signaal op de breekplaats; juist, γH2AX-distributie in een controlegebied waar geen DSB's werden geïnduceerd (anti-γH2AX-antilichaam). De weergegeven resultaten zijn afgeleid van één biologisch experiment en foutbalken geven de variaties van de overeenkomstige monster repliceert aan. N=3. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoewel DNA-reparatie een relatief recent onderzoeksveld is, breidt onze kennis zich snel uit met behulp van verschillende biochemische en microscopische methoden. Het behoud van genetische informatie is cruciaal voor cellen, omdat mutaties in genen die betrokken zijn bij reparatieprocessen een van de belangrijkste oorzaken van tumorigenese zijn en daarom is het ophelderen van de belangrijkste stappen van DNA-reparatieroutes essentieel.

Biochemische technieken (d.w.z. westerse vlek, immunoprecipitatie, massaspectrometrie, enz.) vereisen een groot aantal cellen en de bestudeerde reparatieprocessen vertegenwoordigen een momentopname van de gewenste celpopulatie. Het uitvoeren van ChIP-experimenten is arbeidsintensief, lastig en er moet rekening worden gehouden met veel overwegingen bij het ontwerpen van specifieke experimenten om het proces van DSB-reparatie te bestuderen. De volgende stappen zijn enkele voorbeelden: (I) cellen moeten goed worden gelyseerd; het wordt ten zeerste aanbevolen om een lysatiemethode in twee stappen toe te passen met behulp van een afzonderlijke cel- en nucleaire lysisbuffer om een betere toegankelijkheid van de chromatinefractie (II) te garanderen, chromatine mag niet over- of ondersonicated zijn; de passende sonicatieomstandigheden moeten vooraf worden geoptimaliseerd voor elk celtype (III) de juiste hoeveelheid gezuiverd antilichaam moet worden bepaald, aangezien antilichamen tegen hetzelfde eiwit van verschillende bedrijven niet-identieke kenmerken vertonen (IV) voor de efficiënte immunoprecipitatie, 25-30 ug initiële chromatine moet worden gebruikt in elke toestand (V) het juiste tijdstip van fixatie moet worden geoptimaliseerd; omdat overfixatie kan leiden tot vals-positieve resultaten door de verre eiwitcomplexen met elkaar te verbinden en onderfixatie de juiste kruiskoppeling tussen DNA en het gewenste eiwit (VI) op basis van het aangebrachte antilichaam kan voorkomen, moet het type kralen (eiwit A of G) zorgvuldig worden bepaald (VII) tijdens wasstappen, moet de volgorde van de wasbuffers grondig worden bewaard om te voorkomen dat het antilichaam uit de kralen (VIII) tijdens DNA-extractie vrijkomt, fenolsporen moeten naar behoren worden geëlimineerd om te voorkomen dat de efficiëntie van de verdere downstreamreacties afneemt. Omdat deze methode de opbrengst van teruggewonnen DNA vermindert, is ons persoonlijke advies om liever een specifieke DNA-zuiveringskit te gebruiken. Wanneer alle kritieke punten goed zijn aangepakt, kan ChIP waardevolle gegevens leveren voor de bezetting van het gewenste eiwit op verschillende genomische loci en kritieke stappen in DNA-reparatieprocessen ontrafelen.

ChIP in combinatie met qPCR is echter een indirecte benadering om de eiwitverdeling in geselecteerde genomische regio's te bestuderen en maakt het niet mogelijk om de DNA-bindingsplaats specifiek te herkennen of de functie van het eiwit direct te onderzoeken. Mono- of polyklonale antilichamen die worden gebruikt om de eiwit-DNA-complexen op te vangen, kunnen ook kruisreactief zijn met andere eiwitten, wat leidt tot vals-positieve gegevens en daarom moeten de antilichamen die in deze techniek worden gebruikt ChIP-klasse zijn en zeer specifiek zijn tegen het eiwit van belang. ChIP is echter een veelgebruikte techniek en op basis hiervan zijn verdere benaderingen ontwikkeld, zoals ChIP-on-chip en ChIP-seq. De eerste vertrouwt op het hybridiseren van de immunoprecipitated en gezuiverde DNA-fragmenten op een microarray met een grote verscheidenheid aan kleine willekeurige DNA-sequenties die de gegloeide sequenties verder versterken en waardevolle informatie bieden over eiwitbindende locaties. ChIP-seq is echter naar voren gekomen als een aantrekkelijke alternatieve aanpak, omdat het genoombrede mapping van eiwit-DNA-complexen met een hogere resolutie biedt dan ChIP-on-chip en genoomsequencing met hoge doorvoer. ChIP-seq heeft een revolutie teweeggebracht op het gebied van DNA-reparatie door DNA-bindingssites van verschillende transcriptiefactoren bekend te maken die inzicht geven in de genregulatie en chromatinelandschappen ontrafelen in een genoombrede schaal25. Volgens dit heeft het gebied van DNA-reparatie enorm geprofiteerd van ChIP-seq, omdat deze gegevens een cruciale rol spelen bij verschillende ziekten en biologische routes, zoals kankerprogressie. Niettemin zijn verschillende modificaties van de ChIP-methode ontwikkeld, zoals HaloChIP, die geen specifiek antilichaam tegen het eiwit van belang vereist, maar eerder sequenties gebruikt die coderen voor DNA-bindende eiwitten die zijn gefuseerd met HaloTag, die worden getransfecteerd naar cellen en vervolgens worden gekruist, de gewenste eiwit-DNA-complexen kunnen worden vastgelegd met behulp van HaloLink Resin. Deze techniek is echter gebaseerd op overexpressie en niet op het endogene niveau van de gewenste eiwitten, wat kan leiden tot verkeerd geïnterpreteerde gegevens26.

Bovendien bieden microscopische technieken waardevolle informatie over het spatiotemporale volgen van DNA-schadeherstel, zelfs op een enkelcellig niveau. De snelle verbetering van antilichamen tegen specifieke reparatie-eiwitten heeft geleid tot een dieper begrip van het mechanisme van NER- en DSBR-subroutes, evenals hun post-translationele regulatie. Het microscopische veld is gerevolutioneerd door technieken met hoge resolutie, zoals superresolutiemicroscopie, die de visualisatie van DNA-schade-geïnduceerde cellulaire processen op nucleosomale niveau mogelijk maakt, en zorgt voor een nauwkeurige mapping van eiwitcolokalisatie24. Er moet echter worden opgemerkt dat de variantie in cellijnen tijdens het experiment moet worden overwogen, omdat de snelheid van de reparatie kan verschillen, wat de resultaten moeilijk te interpreteren kan maken. Gezien de snelle evolutie van fluorescentiebeeldvormingsmethodologie en het doelbewuste ontwerp van de experimentele opstelling, is een kostbare kans om de DNA-schade-geïnduceerde cellulaire en moleculaire reacties op één eiwitresolutie op een enkelcellig niveau te onderzoeken, op weg naar perfectie.

Concluderend kan de combinatie van superresolutiemicroscopie en eencellige sequencingmethodologie ons begrip van het DNA-reparatieveld aanzienlijk verbeteren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen

Acknowledgments

Dit onderzoek werd gefinancierd door het Nationaal Bureau voor Onderzoek, Ontwikkeling en Innovatie ginop-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, de János Bolyai Research Scholarship van de Hongaarse Academie van Wetenschappen BO/27/20, ÚNKP-20-5-S

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Tags

Biologie DNA reparatie chromatine immunoprecipitatie fluorescerende microscopie site-specifieke DSB's immunostaining
Visualiseren en kwantificeren van endonuclease-gebaseerde site-specifieke DNA-schade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter