Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisere og kvantifisere Endonuclease-basert stedsspesifikk DNA-skade

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikkelen introduserer viktige trinn for immunstaining og kromatinimmunoprecipitation. Disse protokollene brukes ofte til å studere DNA-skaderelaterte cellulære prosesser og for å visualisere og kvantifisere rekrutteringen av proteiner som er involvert i DNA-reparasjon.

Abstract

Celler blir kontinuerlig utsatt for ulike DNA-skadelige midler, noe som induserer forskjellige cellulære responser. Bruk av biokjemiske og genetiske tilnærminger er avgjørende for å avdekke cellulære hendelser knyttet til rekruttering og montering av DNA-reparasjonskomplekser på stedet for DNA-skade. I løpet av de siste årene har flere kraftige verktøy blitt utviklet for å indusere stedsspesifikk DNA-skade. Videre tillater nye seminalteknikker oss å studere disse prosessene på encellet oppløsningsnivå ved hjelp av både faste og levende celler. Selv om disse teknikkene har blitt brukt til å studere ulike biologiske prosesser, presenterer vi heri de mest brukte protokollene innen DNA-reparasjon, Fluorescence Immunostaining (IF) og Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), som i kombinasjon med endonuclease-basert stedsspesifikk DNA-skade gjør det mulig å visualisere og kvantifisere det genomiske belegget til DNA-reparasjonsfaktorer på en rettet og regulert måte, henholdsvis. Disse teknikkene gir kraftige verktøy for forskerne å identifisere nye proteiner bundet til det skadede genomiske locus samt deres post-translasjonelle modifikasjoner som er nødvendige for deres finjustering under DNA-reparasjon.

Introduction

Genomet vårt blir stadig utfordret av ulike DNA-skadelige midler. Disse overgrepene kan komme fra miljøkilder, for eksempel UV-lys eller bestråling, samt fra endogene kilder, for eksempel metabolske biprodukter forårsaket av oksidativt stress eller replikeringsfeil1,2. Disse lesjonene kan påvirke integriteten til enten en eller begge DNA-tråder, og hvis de genererte feilene blir vedvarende, fører det ofte til translokasjoner og genom ustabilitet, noe som kan føre til tumorigenesis3,4. For å opprettholde genomintegriteten er det utviklet flere reparasjonssystemer under evolusjonen. I henhold til de kjemiske og fysiske egenskapene til bestemte typer DNA-skade, kan flere reparasjonsmekanismer aktiveres. Uoverensstemmelser, abasiske steder, pauser med én tråd og 8-oksoguanin (8-oksenG) kan fjernes enten ved reparasjon av avvik eller reparasjonsbane for grunnavgift5,6. Lesjoner forårsaket av UV-induserte fotoprodukter og store addukter kan repareres enten ved nukleotid-eksisjonsreparasjon (NER) eller DNA dobbel-strand pause reparasjon (DSBR) prosess7,8. NER består av to hovedunderveier: transkripsjonskobling NER (TC-NER) og global genomisk NER (GG-NER). Når det gjelder cellesyklusfasen, etter DNA-bruddinduksjon med dobbel tråd, kan to underveier aktiveres: ikke-homolog endekobling (NHEJ) og homolog rekombinasjon (HR)1,9. NHEJ, som er den dominerende banen i hvileceller, kan aktiveres i alle cellesyklusfaser, som representerer en raskere, men feilutsatt bane10. På den annen side er HR en feilfri vei, der DSB-ene repareres basert på sekvens-homologisøk av søsterkromotider, derfor er den hovedsakelig til stede i S- og G2-cellesyklusfaser11. Videre er mikrohomologimediert end joining (MMEJ) en annen DSB-reparasjonsmekanisme, forskjellig fra de nevnte, basert på en KU70/80- og RAD51-uavhengig måte å re-ligation av tidligere resected mikrohomologe sekvenser flankerer de ødelagte DNA-endene. Derfor anses MMEJ å være feilutsatt og svært mutagene12. Under DNA-reparasjon kan DSBer indusere DNA-skaderesponsen (DDR), noe som resulterer i aktivering av sjekkpunktkinaser som stopper cellesyklusen under reparasjon13,14,15. DDR aktiveres som et svar på rekruttering og omfattende spredning av initiator nøkkelspillere i reparasjonsprosessen rundt lesjonene, noe som bidrar til dannelsen av et reparasjonsfokus. I denne tidlige signalkaskaden spiller minibanken (Ataxia Telangiectasia Mutated) kinase en sentral rolle ved å katalysere fosforyleringen av histonevarianten H2AX på Ser139 (referert til som γH2AX) rundt lesjonen16. Denne tidlige hendelsen er ansvarlig for rekruttering av ytterligere reparasjonsfaktorer og oppstart av nedstrøms reparasjonsprosesser. Selv om den eksakte funksjonen til de rekrutterte proteinene ved reparasjonsfokuset ennå ikke er fullt karakterisert, har formasjonen og dynamikken i reparasjonsfokus blitt undersøkt av flere laboratorier. Disse markørene brukes mye til å følge reparasjonskinetikken, men deres nøyaktige rolle under reparasjonsprosessen forblir unnvikende. På grunn av den store betydningen, men likevel dårlig forståelse av DNA-reparasjonsrelaterte cellulære prosesser, har flere metoder blitt utviklet så langt for å indusere og visualisere DDR.

Ulike metoder og systemer er etablert for å indusere ønsket type DNA-skade. For eksempel kan noen midler [som neocarzinostatin (NCS), farromycin, bleomycin, γ-bestråling, UV] kan indusere et stort antall tilfeldige DNA-pauser ved ikke-prediktive genomiske posisjoner, mens andre (endonucleases, som AsiSI, I-PpoI eller I-SceI, samt laser striping) kan indusere DNA-pauser ved kjent genomisk loci17,18,19,20,21. Her fokuserer vi på de endonuclease-baserte teknikkene som for tiden brukes til å studere DDR i pattedyr og gjærceller. Bortsett fra å fremheve prinsippene for disse teknikkene, legger vi vekt på både deres fordeler og ulemper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immunodeteksjon av spesifikke proteiner

  1. Utarbeidelse av cellekultur og eksperimentelt oppsett
    1. Vedlikehold U2OS-celler i monolayers i DMEM kulturmedium supplert med 10% fosterkalvserum, 2 mM glutamin og 1% antibiotika-antimykotisk løsning.
      MERK: For endonukleasebasert DNA-skadeinduksjon, bruk kullbehandlet eller steroidfritt medium for å unngå systemlekkasje.
    2. Vokse celler i et fuktet 5% CO2-miljø ved 37 °C til 80 % samløp, og fornye medium hver 2-3.
    3. Aspirer mediet og vask cellene med 1x PBS. Koble fra celler med Trypsin-EDTA-løsning. Når cellene løsner, stopper du trypsinaktiviteten ved å legge til kulturmedium i cellene, noe som gir en celleoppheng.
    4. Tell cellene ved hjelp av et celletellingskammer. Plate 2 x 104 celler/ml/brønn på en 24-brønns plate, med sterile 12 mm runde deksler i hver brønn.
    5. Inkuber celler i 24 timer ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2-atmosfære for å tillate festing på dekslene.
    6. Behandle cellene med 10 ng/ml neocarzinostatin (NCS) ved å direkte pipettere det skadelige middelet til det dyrkede mediet. Inkuber cellene med det NCS-inneholdende mediet i 15 minutter, vask dem deretter med 1x PBS og tilsett ferskt, supplert kulturmedium til cellene. Ellers bruker du riktig agent (dvs. 4-OHT) for å indusere DSBer via endonuclease-baserte systemer uten å oppdatere mediet22.
      MERK: Alternativt kan du bruke bestråling for å indusere DNA-skade, alt fra 30 min opp til 8 timers restitusjonstid ved å bruke nøytronfluks mellom 2-20 Gy23.
    7. Inkuber celler i 1-8 timer ved 37 °C i en fuktet 5 % CO2-atmosfære for å følge kinetikken til DNA-reparasjon.
  2. Fiksering av celler
    MERK: 300-500 μL løsninger/brønn bør brukes i følgende trinn (trinn 1.2-1.5) for å dekke alle celler tilstrekkelig. Hvert inkubasjons- og vasketrinn (unntatt antistoffinkubasjonen) skal utføres på en orbital shaker med mild agitasjon.
    1. Etter DSB-induksjon og inkubasjon av celler, fjern mediet fra de vedlagte cellene og vask cellene en gang med 1x PBS.
    2. Fest celler med 4% formaldehyd-PBS-oppløsning i 20 min ved 25 °C.
  3. Permeabilisering av celler
    1. Fjern festeløsningen og vask cellene tre ganger med 1x PBS i 5 minutter hver.
    2. Fjern PBS og tilsett 0,2 % Triton X-100 oppløst i PBS. Inkuber prøvene i 20 min.
  4. Blokkering av ikke-spesifikke bindingsområder
    1. Vask cellene tre ganger med 1x PBS.
    2. Blokker ikke-spesifikke bindingssteder med 5% BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) fortynnet i PBST (1x PBS supplert med 0,1% Tween-20), og inkuber de permeabiliserte prøvene i minst 20 minutter.
  5. Immunfluorescensfarging
    1. Tilsett riktig mengde primært antistoff (dvs. anti-γH2AX, anti-DNA-PKcs) fortynnet i 1% BSA-PBST-løsning. Plasser hvert deksle opp ned på en parafinfilm over en 10 μL dråpe av det fortynnede anti-γH2AX antistoffet.
      MERK: Ved samtidig immunisering fortynnes begge antistoffene i samme 1 % BSA-PBST-oppløsning.
    2. Inkuber prøvene i et fuktighetskammer i 1,5 timer ved 4 °C.
      MERK: Inkubasjon kan også utføres ved 4 °C over natten.
    3. Plasser dekslene tilbake i 24-brønnsplaten og vask tre ganger i 5 minutter med 1x PBS.
    4. Tilsett riktig mengde sekundært antistoff fortynnet i 1% BSA-PBST. Plasser hvert deksle opp ned på en parafinfilm over en 10 μL dråpe av det fortynnede antistoffet.
    5. Inkuber prøvene i et fuktighetskammer ved 4 °C i 1 time.
    6. Plasser dekslene tilbake i 24-brønnsplaten og vask tre ganger i 5 minutter med 1x PBS.
    7. Før du fjerner den siste PBS-vaskeløsningen, må du forsiktig ta ut dekslene med en pinsett og nål og deretter plassere dem opp ned på glasssklier med dråper monteringsmedium (supplert med DAPI).
      MERK: Unngå dannelse av luftbobler. Når monteringsmediet tørker, anbefales det å forsegle kantene på dekslene med neglelakk for å forhindre skrumping av prøvene.

2. Kromatin immunoprecipitation

  1. Cellesamling, krysskobling, celle- og kjernelys og DNA-fragmentering
    1. Kultur ca 5 x 106 celler / ml i en 150 mm tallerken for hver prøve.
    2. Fjern kulturmediet og vask cellene to ganger med iskald 1x PBS.
    3. Fest cellene med 1% formaldehyd-PBS-løsning, plasser platene på en orbital shaker, og rør forsiktig i 20 minutter.
      MERK: Formaldehyd er flyktig; Lag alltid en ny arbeidsløsning. I noen tilfeller inneholder formaldehydløsningen metanol for å stabilisere den, men det er bedre å bruke en metanolfri løsning for å unngå forstyrrelser i nedstrømsreaksjoner.
    4. Stopp fikseringen med 125 mM glycin og inkuber på en orbital shaker med mild agitasjon i 5 minutter ved 25 °C.
    5. Plasser platene på isen og vask to ganger med iskald 1x PBS.
    6. Skrap cellene i iskald 1x PBS og overfør dem til 15 ml koniske rør.
    7. Sentrifuger cellene ved 2500 x g i 5 min ved 4 °C.
    8. Aspirer forsiktig den supernatante og resuspend pellet i 2 ml cellelysbuffer [5 mM PIPES pH 8,0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (protease inhibitor cocktail)] og inkuber på is i 10 minutter.
    9. Sentrifuger cellefjæringen ved 2500 x g i 5 min ved 4 °C.
    10. Kast forsiktig den supernatante og resuspend pellet i 500-1500 μL kjernefysisk lysisbuffer (50 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM EDTA pH 8.0, 0.8% SDS, 1x PIC) og inkubere på is i 30-60 min. Overfør lysatet til et konisk polystyrenrør egnet for sonikering.
      MERK: Siden kjernelysbufferen inneholder SDS, vil den utløses på is, og løsningen blir hvit. Løsningen skal bli gjennomsiktig etter sonikering.
    11. Soniker lysatet for å skjære DNA til en gjennomsnittlig fragmentstørrelse på 300-1000 bp.
      MERK: De aktuelle sonikeringssyklusene og betingelsene bør stilles inn i henhold til celletype og sonikeringsutstyr. Fragmenter mindre enn 200 bp er ikke egnet for ChIP, fordi nukleosom-DNA-interaksjonene kan forstyrres.
  2. Reversering av krysskobling, bestemmelse av sonikerte fragmentstørrelser
    1. Ta ut 100 μL av den sonikerte prøven for å bekrefte fragmentstørrelsen på det sonikerte kromatinet. Det gjenværende kromatinet skal oppbevares ved -80 °C.
    2. Tilsett 0,5 mg/ml RNase A i hver 100 μL av prøven og inkuber dem ved 37 °C i 20 minutter for å aktivere RNase.
    3. Inkuber prøvene ved 65 °C over natten.
    4. Neste dag legger du til 500 μg/ml Proteinase K og 0,5% SDS, og inkuberer prøvene ved 50 °C i 3 timer.
    5. Tilsett 0,5 volum fenol og 0,5 volum kloroform-isoamylalkoholblanding (24:1) i hver prøve.
    6. Virvel i 1 min.
    7. Sentrifuge ved 13.000 x g i 10 min.
    8. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt mikrosenterrør.
    9. Tilsett 1 volum kloroform-isoamylalkoholblanding (24:1) i hver prøve.
    10. Virvel i 1 min.
    11. Sentrifuge ved 13.000 x g i 10 min.
    12. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt mikrosenterrør.
    13. Tilsett 2,5 volumer med 96 % etanol og 0,1 volum 3 M Na-Acetat pH 5,2.
    14. Inkuber i minst 20 min ved −80 °C.
    15. Sentrifuger prøvene ved 13 000 x g i 10 min ved 4 °C.
    16. Fjern etanol og vask pelletsen med 400 μL 70% etanol.
    17. Sentrifuger prøvene ved 13 000 x g i 10 min ved 4 °C.
    18. Fjern etanol og luft tørk pelletsen.
    19. Resuspend pellet i 10 μL TE.
    20. Kjør prøvene på en 0,8% agarose gel. Den sonikerte kromatinstørrelsen skal være rundt 500 bp.
      MERK: Bruk bromofenol blåfri lastebuffer fordi størrelsen på dette fargestoffet er ca. 500 bp, noe som kan forstyrre riktig deteksjon av kromatinfragmenter. I stedet anbefales det å bruke lastebuffer supplert med xylen-cyanol, som er omtrent 3000 bp.
    21. Hvis kromatinstørrelsen er akseptabel, fortynn de frosne kromatinprøvene fra trinn 2.1. i 3 volumer av fortynningsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) og bland prøvene via rotasjon i 10 minutter ved 4 °C.
      MERK: Dette trinnet er nødvendig for å fortynne SDS som finnes i kjernelysbufferen for å unngå interferens med nedstrømsreaksjoner, inkludert måling av kromatinkonsentrasjon.
    22. Mål DNA-konsentrasjonen av kromatinprøvene ved 260/280 nm ved hjelp av et spektrofotometer.
  3. Fremstilling av perler, pre-clearing og immunoprecipitation
    1. Forbered perler (sau anti-kanin eller mus IgG) for pre-clearing og immunoprecipitation trinn. Vask perler to ganger i 10 minutter ved 4 °C med RIPA-buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1 % Triton X-100, 0,1 % Na-DOC, 0,1 % SDS, 150 mM NaCl og 1X PIC).
    2. Bruk perlene på nytt i samme volum RIPA-buffer som i trinn 2.3.1.
    3. Forklar 25-30 μg kromatin av hver prøve med 4 μL perler via rotasjon i 1-2 timer ved 4 °C.
      MERK: Tilsett RIPA-buffer i hver kromatinprøve på opptil 500 μL endelig volum for å la prøvene blandes riktig under rotasjon. Ikke glem å ta ut kromatin for NAC (No Antibody Control) og TIC (Total Input Control) i tilfelle av hvert prøvesett. TICer krever bare et endelig volum på opptil 200 μL.
    4. Utfell perlene med en magnet og overfør supernatanten til et nytt mikrosenterrør.
    5. Tilsett riktig mengde antistoff i hver kromatinprøve (unntatt NAC og TIC) og roter over natten ved 4 °C.
    6. Neste dag legger du til 40 μL vaskede perler til hver prøve (unntatt TIC) og inkuberer dem over natten, roterer ved 4 °C.
  4. Klesvask
    1. Vask en gang med 300 μL lav saltbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) i 10 minutter via rotasjon ved 4 °C.
    2. Vask én gang med 300 μL høysaltbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1 % Triton X-100, 0,1 % SDS, 1x PIC) i 10 minutter via rotasjon ved 4 °C.
    3. Vask én gang med 300 μL LiCl-buffer (250 mM LiCl, 1 % NP-40, 1 % Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) i 10 minutter via rotasjon ved 4 °C.
    4. Vask to ganger med 300 μL TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) i 10 minutter via rotasjon, for den første vasken ved 4 °C, og den andre vasken ved 25 °C.
  5. Elution
    1. Tilsett 200 μL av elutionbufferen (1% SDS og 100 mM NaHCO3) til perlene og inkuber ved 65 °C i en termo shaker i 15 minutter med kontinuerlig risting (ca. 400 RPM). Overfør supernatanten til et nytt rør og elute perler igjen i 200 μL Elution buffer. Kombiner eluates (400 μL sluttvolum).
    2. Legg NaCl til en endelig konsentrasjon på 200 mM i hver prøve. Suppler TIC-prøvene med 200 μL Elution-buffer og legg til NaCl også.
      MERK: Fra dette trinnet skal TIC håndteres under de samme forholdene som de andre prøvene.
    3. Inkuber prøvene ved 65 °C (uten risting) i minst 6 timer.
    4. Tilsett 1 ml kaldt 100% etanol i hver prøve, roter rørene to ganger for å blande, og utfell DNA over natten ved -80 °C.
    5. Neste dag, sentrifuge i 30 min ved 13,000 x g ved 4 °C.
    6. Kast supernatanten og vask pelletsen med 70% EtOH.
    7. Sentrifuger prøvene ved 13 000 x g i 10 min ved 4 °C.
    8. Kast supernatanten og lufttørk pelletsene.
    9. Resuspend pellets i 100 μL TE og tilsett 0,5 mg/ml RNase A i hver prøve. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter for å aktivere RNase.
  6. Tilbakeføring av krysskobling
    1. Tilsett 500 μg/ml Proteinase K og 0,5% SDS og inkuber deretter prøvene ved 50 °C i 2 timer.
      MERK: Hvis du går videre til ChIP-seq, unngå fenol-kloroform ekstraksjon, da det hemmer nedstrøms NGS-prosessen. I stedet anbefales det å bruke et kommersielt tilgjengelig sett (se Materialfortegnelse).
    2. Tilsett 0,5 volum fenol og 0,5 volum kloroform-isoamylalkoholblanding (24:1) i hver prøve.
    3. Virvel i 1 min.
    4. Sentrifuge ved 13.000 x g i 10 min.
    5. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt mikrosenterrør.
    6. Tilsett 1 volum kloroform-isoamylalkoholblanding (24:1) i hver prøve.
    7. Virvel i 1 min.
    8. Sentrifuge ved 13.000 x g i 10 min.
    9. Overfør den øvre vandige fasen til et nytt mikrosenterrør.
  7. DNA-ekstraksjon
    1. Tilsett 2,5 volumer med 96 % etanol og 0,1 volum 3 M Na-Acetat pH 5,2.
    2. Inkuber i minst 20 min ved −80 °C.
    3. Sentrifuger prøvene ved 13 000 x g i 10 min ved 4 °C.
    4. Fjern etanol og vask pelletsen med 400 μL 70% etanol.
    5. Sentrifuger prøvene ved 13 000 x g i 10 min ved 4 °C.
    6. Fjern etanol og luft tørk pelletsen.
    7. Resuspend pellet i 50 μL TE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Studier av stedsstyrte DSB-induserte reparasjonsprosesser i celler kan oppnås via enten stabil eller forbigående transfeksjon. Det skal imidlertid bemerkes at stabil transfeksjon sikrer en homogen cellepopulasjon, noe som gir en enhetlig og dermed mer pålitelig cellulær respons. Ved forbigående transfeksjon tar bare en liten andel av cellepopulasjonen opp og opprettholder plasmidet, noe som introduserer mangfold i eksperimentet. Etablering av ER-I-PpoI eller ER-AsiSI endonuclease-baserte cellesystemer krever en 50% konfluent cellepopulasjon, som er mer effektivt transfektert med plasmider som koder endonuklease. For transfeksjon kan også kommersielt tilgjengelige transfeksjonsreagenser eller virusinfeksjonsbaserte metoder brukes. Hvis en mikroskopisk visualiseringsteknikk skal påføres og forbigående transfeksjon er nødvendig, kan de rettede DSB-ene induseres ved 4-OHT tillegg 24 h etter transfeksjon, som binder seg til er-smeltet endonucleases og tillater kjernefysisk translokasjon og DSB-induksjon. For å bestemme de mest hensiktsmessige tidspunktene kan immunfluorescensbasert mikroskopi og vestlig flekkdeteksjon av γH2AX på forskjellige tidspunkter etter 4-OHT-behandling utføres. Under fysiologiske forhold kan maksimalt 10-15 γH2AX foci per celle påvises, og dannelsen av sterke reparasjonsfokus kan utløses av endonucleaser (eller forskjellige andre teknikker som ikke er diskutert her, for eksempel lasermikroirradiering). En typisk I-PpoI-endonuklease fører til dannelse av forhøyede γH2AX-signaler rundt kjernen ved å indusere DSBer ved ribosomalt DNA (rDNA). Hvis pausene repareres av NHEJ eller HR, reduseres antall reparasjonsfokus over tid. Av denne grunn anbefales representative tidspunkter ved 0 t, 30 min, 1, 2, 4 og 8 timer etter 4-OHT-behandlinger. For å spore DNA-reparasjonsprosesser er den mest brukte cellelinjen U2OS, da alle kjente reparasjonsveier er fullt funksjonelle i disse cellene. Når du undersøker flere proteiner i de samme cellene, kan samlokalisering studeres ved å kombinere antistoffer konjugert med forskjellige fluoroforer med forskjellige utslippsbølgelengder oppdratt i forskjellige dyrearter som vist i figur 1. Der er induksjonen av DSB-er via en uduselig stabil cellelinje representert som er basert på ER-AsiSI-begrensningen endonuclease smeltet sammen med hemagglutinin tag (HA). Doxycyklin kan indusere uttrykket og beslagleggelsen av HA-ER-AsiSI i cytoplasma som kan spores ved hjelp av et antistoff mot HA (Figur 1. tredje kolonne, andre rå). Inkubasjon i 4 timer med 4-OHT, 24 timer etter doxycyklin addisjon, kan indusere høyt antall DSBer siden endonuclease har blitt omfordelt til kjernen (Figur 1. tredje kolonne, tredje rå og andre kolonne, tredje rå). DSBer kan visualiseres ved hjelp av et antistoff som gjenkjenner γH2AX.

Figure 1
Figur 1: Mikroskopi med immunfluorescens brukes til å påvise γH2AX i dyrkede celler som uttrykker HA-ER-AsiSI. DOX (doxycyklin) tillegg aktiverer det cytoplasmatiske uttrykket ha-ER-AsiSI og 4-OHT (4-hydroxytamoxifen) (4 h) induserer kjernefysisk translokasjon av fusjonsproteinet, noe som fører til induksjon av DSBer ved kjente genomiske posisjoner. HA (hemagglutinin) farging (anti-HA antistoff) representerer HA-ER-AsiSI fusjonsproteinet i grønt, og induksjon av pauser er verifisert av γH2AX farging (anti-γH2AX antistoff) i rødt. Skalastenger representerer 20 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Samlokalisering av reparasjonsproteiner på skadestedet indikerer at de rekrutteres til samme DNA-lesjonssted, men de samhandler ikke nødvendigvis med hverandre. Oppløsningen av den konfektmikroskopien er ca. 300 nm; For å bestemme bindingsmønsteret til spesifikke reparasjonsproteiner på pausestedet, anbefales superoppløsningsmikroskopi (STORM) i stedet 24. Denne metoden krever imidlertid dyrt mikroskopisk utstyr og en ekspertforsker. Alternativt kan bindingsmønsteret til reparasjonsproteinene undersøkes ved kromatinimmunoprecipitation ved hjelp av DIvA eller U2OS-pEP15 stabile cellelinjer, som kan uttrykke AsiSI og I-PpoI endonucleases på en regulert måte, henholdsvis17,21. Ved 4-OHT-tillegg kan begge endonucleases kutte DNA-et på en sekvensspesifikk måte som gir oss muligheten til å designe locus spesifikke primere til de forventede pausestedene og deres omkringliggende genomiske regioner. Ved å bruke γH2AX-antistoff i immundechiffreringsdelen av ChIP, kan vi temporally følge DNA-reparasjonskinetikken på forskjellige forhold (for eksempel silencing eller hemming av visse reparasjonsfaktorer av interesse, dvs. DNA-PKcs). Et typisk eksperimentelt resultat oppnådd ved hjelp av ChIP-qPCR er representert i figur 2. Der er den tidsmessige berikelsen av γH2AX demonstrert som et svar på I-PpoI-indusert DNA-skade. På venstre del av bildet vises det rettidig oppdagede γH2AX-signalet på pausestedet mens γH2AX-fordelingen på høyre side er representert i et kontrollgenområde der DSBer ikke er indusert.

Figure 2
Figur 2: Temporal berikelse av γH2AX som bestemt av kromatinimmunoprecipitation som svar på I-PpoI-indusert DNA-skade. Venstre, γH2AX-signal på pausestedet; høyre, γH2AX-distribusjon i et kontrollområde der DSBer ikke ble indusert (anti-γH2AX antistoff). De representerte resultatene er avledet fra ett biologisk eksperiment, og feilfelt indikerer variasjonene av de tilsvarende prøvereplene. N=3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om DNA-reparasjon er et relativt nylig forskningsfelt, utvides kunnskapen vår raskt ved hjelp av ulike biokjemiske og mikroskopiske metoder. Bevaring av genetisk informasjon er avgjørende for celler siden mutasjoner som forekommer i gener involvert i reparasjonsprosesser er blant de ledende årsakene til tumorigenesis og derfor er det viktig å belyse de viktigste trinnene i DNA-reparasjonsveier.

Biokjemiske teknikker (dvs. vestlig blot, immunoprecipitation, massespektrometri, etc.) krever et stort antall celler, og de studerte reparasjonsprosessene representerer et øyeblikksbilde av ønsket cellepopulasjon. Å utføre ChIP-eksperimenter er arbeidende, plagsomt og mange hensyn må tas i betraktning når du designer spesifikt eksperiment for å studere prosessen med DSB-reparasjon. Følgende trinn er noen eksempler: (I) celler skal være riktig lysed; det anbefales på det sterkeste å bruke en to-trinns lysasjonsmetode ved å bruke separat celle- og kjernelysbuffer for å sikre høyere tilgjengelighet til kromatinfraksjonen (II) kromatin bør ikke over- eller undersonikeres; de riktige forholdene for sonikering bør optimaliseres til hver celletype på forhånd (III) den aktuelle mengden renset antistoff bør bestemmes siden antistoffer mot samme protein fra forskjellige selskaper viser ikke-identiske egenskaper (IV) for effektiv immunoprecipitation, 25-30 ug innledende kromatin bør brukes i hver tilstand (V) riktig tidspunkt for fiksering bør optimaliseres, som overfixasjon kan resultere i falske positive resultater ved krysskobling av de fjerne proteinkompleksene og underfixasjonen kan forhindre riktig krysskobling mellom DNA og ønsket protein (VI) basert på det påførte antistoffet, bør typen perler (protein A eller G) nøye bestemmes (VII) under vasketrinn, rekkefølgen på vaskebufferne bør holdes grundig for å unngå frigjøring av antistoffet fra perlene (VIII) under DNA-utvinning, fenolspor bør elimineres riktig for å unngå å redusere effektiviteten til de videre nedstrømsreaksjonene. Siden denne metoden reduserer utbyttet av gjenvunnet DNA, er vårt personlige råd å heller bruke spesifikt DNA-rensesett. Når alle kritiske punkter er riktig adressert, kan ChIP gi verdifulle data for belegget til ønsket protein ved forskjellige genomiske loci og kan avdekke kritiske trinn i DNA-reparasjonsprosesser.

ChIP kombinert med qPCR er imidlertid en indirekte tilnærming for å studere proteinfordelingen ved utvalgte genomiske regioner og tillater ikke å spesifikt gjenkjenne DNA-bindingsstedet eller direkte undersøke funksjonen til proteinet. Mono- eller polyklonale antistoffer som brukes til å fange protein-DNA-kompleksene, kan også kryssreagere med andre proteiner som fører til falske positive data, og derfor bør antistoffene som brukes i denne teknikken være ChIP-klasse og svært spesifikke mot proteinet av interesse. ChIP er imidlertid en mye brukt teknikk og videre tilnærminger basert på dette har blitt utviklet, for eksempel ChIP-on-chip og ChIP-seq. Den førstnevnte er avhengig av å hybridisere de immunoprecipitated og rensede DNA-fragmentene på en mikroarray med et stort utvalg av små tilfeldige DNA-sekvenser som ytterligere forsterker de glødede sekvensene som gir verdifull informasjon om proteinbindingssteder. ChIP-seq har imidlertid fremstått som en attraktiv alternativ tilnærming siden den gir genomomfattende kartlegging av protein-DNA-komplekser med høyere oppløsning enn ChIP-on-chip og genomsekvensering med høy gjennomstrømning. ChIP-seq har revolusjonert DNA-reparasjonsfeltet ved å avsløre DNA-bindende steder av ulike transkripsjonsfaktorer som gir innsikt i genreguleringen og unravelling kromatinlandskap i en genom-bred skala25. Ifølge dette har feltet DNA-reparasjon enormt tjent på ChIP-seq siden disse dataene spiller en avgjørende rolle i ulike sykdommer og biologiske veier, for eksempel kreftprogresjon. Ikke desto mindre har ulike modifikasjoner av ChIP-metoden blitt utviklet som HaloChIP, som ikke krever spesifikt antistoff mot proteinet av interesse, men heller bruker sekvenser som koder DNA-bindende proteiner smeltet sammen med HaloTag, som transfekeres til celler og deretter krysskobling, de ønskede protein-DNA-kompleksene kan fanges ved hjelp av HaloLink Resin. Denne teknikken er imidlertid avhengig av overekspression og ikke det endogene nivået av de ønskede proteinene som kan resultere i feiltolkede data26.

Videre gir mikroskopiske teknikker verdifull informasjon om den romlige sporingen av DNA-skadereparasjon, selv på et enkeltcellet nivå. Den raske forbedringen av antistoffer reist mot spesifikke reparasjonsproteiner har ført til en dypere forståelse av mekanismen til NER- og DSBR-underveier, samt deres postoversettelsesregulering. Det mikroskopiske feltet har blitt revolusjonert av høyoppløselige teknikker, for eksempel superoppløselig mikroskopi, som gjør det mulig å visualisere DNA-skadeinduserte cellulære prosesser på nukleosomalt nivå, samt sikre nøyaktig kartlegging av proteinkolokalisering24. Det skal imidlertid bemerkes at variansen i celleavstamninger må vurderes under eksperimentet, da reparasjonshastigheten kan avvike, noe som kan gjøre resultatene vanskelige å tolke. Tatt i betraktning den raske utviklingen av fluorescensavbildningsmetodikk og den bevisste utformingen av det eksperimentelle oppsettet, er en dyrebar mulighet til å undersøke DNA-skadeinduserte cellulære og molekylære responser på et enkelt proteinoppløsning på et enkeltcellenivå på vei til perfeksjon.

Til slutt kan kombinasjonen av superoppløsningsmikroskopi og encellet sekvenseringsmetodikk forbedre vår forståelse av DNA-reparasjonsfeltet betydelig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Denne forskningen ble finansiert av National Research, Development and Innovation Office grant GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080 János Bolyai Research Scholarship fra det ungarske vitenskapsakademiet BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBOs kortsiktige stipend 8513 og Tempus Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Tags

Biologi utgave 174 DNA-reparasjon kromatinimmunoprecipitation fluorescerende mikroskopi stedsspesifikke DSBer immundempende
Visualisere og kvantifisere Endonuclease-basert stedsspesifikk DNA-skade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter