Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Visualisering og kvantificering af endonuklease-baseret stedsspecifik DNA-skade

Published: August 21, 2021 doi: 10.3791/62175
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Institute of Pathology, Faculty of Medicine, University of Szeged
* These authors contributed equally

Summary

Denne artikel introducerer væsentlige trin i immunostaining og chromatin immunoprecipitation. Disse protokoller bruges ofte til at studere DNA-skaderelaterede cellulære processer og til at visualisere og kvantificere rekrutteringen af proteiner, der er impliceret i DNA-reparation.

Abstract

Celler udsættes løbende for forskellige DNA-skadelige stoffer, hvilket fremkalder forskellige cellulære reaktioner. Anvendelse af biokemiske og genetiske tilgange er afgørende for at afsløre cellulære hændelser i forbindelse med rekruttering og samling af DNA-reparationskomplekser på stedet for DNA-skade. I de sidste par år er der udviklet flere kraftfulde værktøjer til at fremkalde stedsspecifik DNA-skade. Desuden giver nye skelsættende teknikker os mulighed for at studere disse processer på enkeltcelleopløsningsniveau ved hjælp af både faste og levende celler. Selv om disse teknikker er blevet brugt til at studere forskellige biologiske processer, præsenterer vi heri de mest anvendte protokoller inden for DNA-reparation, Fluorescens Immunostaining (IF) og Chromatin Immunoprecipitation (ChIP), som i kombination med endonuklease-baseret stedsspecifik DNA-skade gør det muligt at visualisere og kvantificere den genomiske belægning af DNA-reparationsfaktorer på en målrettet og reguleret måde, henholdsvis. Disse teknikker giver forskerne effektive værktøjer til at identificere nye proteiner bundet til den beskadigede genomiske locus samt deres postoversættelsesændringer, der er nødvendige for deres finjusteringsregulering under DNA-reparation.

Introduction

Vores genom bliver konstant udfordret af forskellige DNA-skadelige stoffer. Disse angreb kan stamme fra miljømæssige kilder, såsom UV-lys eller bestråling, samt fra endogene kilder, såsom metaboliske biprodukter forårsaget af oxidativ stress eller replikationsfejl1,2. Disse læsioner kan påvirke integriteten af enten en eller begge DNA-strenge, og hvis de genererede fejl bliver vedvarende, fører det ofte til translokationer og genom ustabilitet, hvilket kan resultere i tumorigenese3,4. For at opretholde genomintegriteten er der udviklet flere reparationssystemer under udviklingen. Ifølge de kemiske og fysiske egenskaber af specifikke typer DNA-skader kan flere reparationsmekanismer aktiveres. Uoverensstemmelser, abasic steder, single-strand pauser, og 8-oxoguanine (8-oxoG) kan fjernes enten ved mismatch reparation eller base-excision reparation vej5,6. Læsioner forårsaget af UV-inducerede fotoprodukter og voluminøse addukter kan repareres enten ved nukleotid-excision reparation (NER) eller DNA dobbelt-streng break repair (DSBR) proces7,8. NER består af to hovedunderveje: transskriptionskoblet NER (TC-NER) og global genomisk NER (GG-NER). Med hensyn til cellecyklusfasen kan to underveje efter induktion af DNA-dobbeltstrengsbrud aktiveres: ikke-homolog endeføjning (NHEJ) og homolog rekombination (HR)1,9. NHEJ, som er den dominerende vej i hvileceller, kan aktiveres i alle cellecyklusfaser, hvilket repræsenterer en hurtigere, men fejlbehæftet vej10. På den anden side er HR en fejlfri vej, hvor DSB'erne repareres baseret på sekvens-homologi søgning af søsterkromatiderne, derfor er den hovedsageligt til stede i S- og G2-cellecyklusfaser11. Desuden er mikrohomologimedieret endeføjning (MMEJ) en anden DSB-reparationsmekanisme, der adskiller sig fra de førnævnte, baseret på en KU70/80- og RAD51-uafhængig måde at re-ligation af tidligere resected mikrohomologe sekvenser flankerende de ødelagte DNA-ender. MMEJ anses derfor for at være fejlbehæftet og meget mutagen12. Under DNA reparation, DSBs kan fremkalde DNA-skader respons (DDR), hvilket resulterer i aktivering af checkpoint kinases at standse cellecyklussen under reparation13,14,15. DDR aktiveres som en reaktion på rekrutteringen og den omfattende spredning af initiativtagerens nøgleaktører i reparationsprocessen omkring læsionerne, hvilket bidrager til dannelsen af et reparationsfokus. I denne tidlige signalering kaskade, ATM (Ataxia Telangiectasia Muteret) kinase spiller en central rolle ved at katalysere fosforylering af histone variant H2AX på Ser139 (benævnt γH2AX) omkring læsion16. Denne tidlige begivenhed er ansvarlig for rekruttering af yderligere reparationsfaktorer og påbegyndelse af downstream-reparationsprocesser. Selv om den nøjagtige funktion af de rekrutterede proteiner ved reparationsfokus endnu ikke er fuldt karakteriseret, er dannelsen og dynamikken i reparation foci blevet undersøgt af flere laboratorier. Disse markører bruges i vid udstrækning til at følge reparationskinetik, men deres præcise rolle under reparationsprocessen forbliver flygtig. På grund af den store betydning, men dårlig forståelse af DNA reparation-relaterede cellulære processer, flere metoder er blevet udviklet hidtil at fremkalde og visualisere DDR.

Forskellige metoder og systemer er blevet etableret for at fremkalde den ønskede type DNA-skade. For eksempel, nogle agenter [såsom neocarzinostatin (NCS), phleomycin, bleomycin, γ-bestråling, UV] kan fremkalde et stort antal tilfældige DNA-brud på ikke-prædiktive genomiske positioner, mens andre (endonukleaser, såsom AsiSI, I-PpoI eller I-SceI, samt laserstribe) kan fremkalde DNA-brud på kendte genomiske loci17,18,19,20,21. Her fokuserer vi på de endonuklease-baserede teknikker, der i øjeblikket bruges til at studere DDR i pattedyrs- og gærceller. Bortset fra at fremhæve principperne for disse teknikker, understreger vi både deres fordele og ulemper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Immunodetection af specifikke proteiner

  1. Forberedelse af cellekultur og eksperimentel opsætning
    1. Vedligehold U2OS-celler i monolag i DMEM-dyrkningsmedie suppleret med 10% føtal kalveserum, 2 mM glutamin og 1% antibiotisk antimykotisk opløsning.
      BEMÆRK: For endonuklease-baserede DNA-skader induktion, bruge trækul-behandlet eller steroid-fri medium for at undgå systemet leakiness.
    2. Vokse celler i et befugtet 5% CO2 miljø ved 37 °C indtil 80% sammenløb, forny medium hver 2-3 dage.
    3. Indsug mediet og vask cellerne med 1x PBS. Fjern celler med Trypsin-EDTA-opløsning. Når cellerne løsner sig, skal du stoppe trypsinaktiviteten ved at tilføje kulturmedie til cellerne, hvilket giver en celleophæng.
    4. Tæl cellerne ved hjælp af et celleoptællingskammer. Plade 2 x 104 celler/mL/brønd på en 24-brønds plade, med sterile 12 mm runde coverlips i hver brønd.
    5. Inkuber celler i 24 timer ved 37 °C i en befugtet 5% CO2-atmosfære for at tillade fastgørelse på dækslerne.
    6. Cellerne behandles med 10 ng/mL neocarzinostatin (NCS) ved direkte at pipettere skademidlet til det dyrkede medium. Inkuber cellerne med NCS-holdige medium i 15 min, derefter vaske dem med 1x PBS og tilsæt friske, suppleret kultur medium til cellerne. Ellers skal du bruge passende middel (dvs. 4-OHT) til at fremkalde DSB'er via endonuklease-baserede systemer uden at opdatere mediet22.
      BEMÆRK: Alternativt kan du bruge bestråling til at fremkalde DNA-skader, der spænder fra 30 min op til 8 timers restitutionstid ved hjælp af neutronflux mellem 2-20 Gy23.
    7. Inkuber celler i 1-8 timer ved 37 °C i en befugtet 5% CO2-atmosfære for at følge dna-reparationens kinetik.
  2. Fiksering af celler
    BEMÆRK: 300-500 μL opløsninger/brønd bør anvendes i følgende trin (trin 1.2-1.5) til at dække alle celler tilstrækkeligt. Hvert inkubations- og vasketrin (undtagen antistofinkubationen) skal udføres på en orbital shaker med blid omrøring.
    1. Efter DSB induktion og inkubation af celler, fjern mediet fra de vedhæftede celler og vask cellerne en gang med 1x PBS.
    2. Der fikseres celler med 4% formaldehyd-PBS-opløsning i 20 min ved 25 °C.
  3. Gennemtrængning af celler
    1. Fastgøringsopløsningen fjernes, og cellerne vaskes tre gange med 1x PBS i 5 min hver.
    2. Fjern PBS og tilsæt 0,2% Triton X-100 opløst i PBS. Inkuber prøverne i 20 min.
  4. Blokering af ikke-specifikke bindingswebsteder
    1. Vask cellerne tre gange med 1x PBS.
    2. Bloker ikke-specifikke bindingssteder med 5% BSA (Bovine Serum Fraction V albumin) fortyndet i PBST (1x PBS suppleret med 0,1% Tween-20), og inkuber de gennemtrængede prøver i mindst 20 min.
  5. Farvning af immunfluorescens
    1. Tilsæt den korrekte mængde primær antistof (dvs. anti-γH2AX, anti-DNA-PKcs) fortyndet i 1% BSA-PBST-opløsning. Placer hver coverlip på hovedet på en paraffinfilm over en 10 μL dråbe af det fortyndede anti-γH2AX antistof.
      BEMÆRK: I tilfælde af co-immunostaining fortyndes passende begge antistoffer i samme 1% BSA-PBST-opløsning.
    2. Prøverne inkuberes i et fugtighedskammer i 1,5 timer ved 4 °C.
      BEMÆRK: Inkubationen kan også udføres ved 4 °C natten over.
    3. Placer coverslips tilbage at være side op i 24-brønd plade og vask tre gange i 5 min med 1x PBS.
    4. Tilsæt den korrekte mængde sekundært antistof fortyndet i 1% BSA-PBST. Placer hver coverlip på hovedet på en paraffinfilm over en 10 μL dråbe af det fortyndede antistof.
    5. Prøverne inkuberes i et fugtighedskammer ved 4 °C i 1 time.
    6. Placer coverslips tilbage at være side op i 24-brønd plade og vask tre gange i 5 min med 1x PBS.
    7. Før du fjerner den sidste PBS-vaskeopløsning, skal du forsigtigt fjerne coverslips ved hjælp af en pincet og nål og derefter placere dem på hovedet på glasrutsjebaner med dråber af monteringsmedium (suppleret med DAPI).
      BEMÆRK: Undgå dannelse af luftbobler. Når monteringsmediet tørrer, anbefales det at forsegle kanterne af coverslips med neglelak for at forhindre indskredning af prøverne.

2. Chromatin immunoprecipitation

  1. Celleindsamling, krydsning, celle- og nuklear lysis og DNA-fragmentering
    1. Kultur ca. 5 x 106 celler/mL i en skål på 150 mm for hver prøve.
    2. Fjern dyrkningsmediet og vask cellerne to gange med iskold 1x PBS.
    3. Ret cellerne med 1% formaldehyd-PBS opløsning, læg pladerne på en orbital shaker, og omrør forsigtigt i 20 min.
      BEMÆRK: Formaldehyd er flygtigt; altid forberede en frisk arbejdsløsning. I nogle tilfælde indeholder formaldehydopløsningen methanol for at stabilisere den, men det er bedre at bruge en methanolfri opløsning for at undgå interferens med downstream-reaktioner.
    4. Ophæv fikseringen med 125 mM glycin og inkuber på en orbital shaker med let omrøring i 5 minutter ved 25 °C.
    5. Placer pladerne på is og vask to gange med iskold 1x PBS.
    6. Skrab cellerne i iskold 1x PBS og overfør dem til 15 mL koniske rør.
    7. Cellerne centrifuges ved 2.500 x g i 5 min ved 4 °C.
    8. Aspirer forsigtigt supernatanten og genbrug pelleten i 2 mL celle lysis buffer [5 mM PIPES pH 8.0, 85 mM KCl, 0,5% NP-40, 1x PIC (protease inhibitor cocktail)] og inkuber på is i 10 min.
    9. Celleaffjedringen centrifuges ved 2.500 x g i 5 min ved 4 °C.
    10. Forsigtigt kassere supernatant og genbruge pellet i 500-1.500 μL af nukleare lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA pH 8,0, 0,8% SDS, 1x PIC) og inkubere på is i 30-60 min. Lysatet overføres til et polystyrenkonisk rør, der er egnet til sonikering.
      BEMÆRK: Da den nukleare lysis buffer indeholder SDS, vil den bundfældes på is, og opløsningen bliver hvid. Opløsningen skal vende gennemsigtig efter sonikering.
    11. Sonicate lysatet til at forskyde DNA til en gennemsnitlig fragmentstørrelse på 300-1.000 bp.
      BEMÆRK: De relevante sonikeringscyklusser og -betingelser skal indstilles i henhold til celletypen og sonikeringsudstyret. Fragmenter mindre end 200 bp er ikke egnet til ChIP, fordi nukleosome-DNA-interaktioner kan forstyrres.
  2. Vending af krydsning, bestemmelse af soniske fragmentstørrelser
    1. Der udtages 100 μL af den sonikerede prøve for at kontrollere fragmentstørrelsen af den sonikerede kromatin. Den resterende kromatine skal opbevares ved −80 °C.
    2. Der tilsættes 0,5 mg/mL RNase A til hver 100 μL af prøven, og de inkuberes ved 37 °C i 20 minutter for at aktivere RNase.
    3. Prøverne inkuberes ved 65 °C natten over.
    4. Den næste dag tilsættes 500 μg/mL Proteinase K og 0,5% SDS, og prøverne inkuberes ved 50 °C i 3 timer.
    5. Der tilsættes 0,5 volumen phenol og 0,5 volumen chloroform-isoamylalkoholblanding (24:1) til hver prøve.
    6. Vortex i 1 min.
    7. Centrifuge ved 13.000 x g i 10 min.
    8. Overfør den øverste vandige fase til et nyt mikrocentrifugerør.
    9. Der tilsættes 1 volumen chloroform-isoamylalkoholblanding (24:1) til hver prøve.
    10. Vortex i 1 min.
    11. Centrifuge ved 13.000 x g i 10 min.
    12. Overfør den øverste vandige fase til et nyt mikrocentrifugerør.
    13. Der tilsættes 2,5 volumener 96% ethanol og 0,1 volumen på 3 M Na-Acetat pH 5.2.
    14. Inkuber i mindst 20 min. ved −80 °C.
    15. Prøverne centrifugeres ved 13.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    16. Ethanolen fjernes, og pelletlen vaskes med 400 μL 70% ethanol.
    17. Prøverne centrifugeres ved 13.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    18. Fjern ethanol og lufttørre pellet.
    19. Opsnudt pelletpen i 10 μL TE.
    20. Kør prøverne på en 0,8% agarose gel. Den sonikerede chromatin størrelse bør være omkring 500 bp.
      BEMÆRK: Brug bromophenol blåfri lastebuffer, fordi størrelsen af dette farvestof er ca. 500 bp, hvilket kan forstyrre korrekt påvisning af kromatinfragmenter. I stedet anbefales det at bruge læssebuffer suppleret med xylen-cyanole, som er ca. 3.000 bp.
    21. Hvis chromatinstørrelsen er acceptabel, fortyndes de frosne chromatinprøver fra trin 2.1. i 3 mængder fortyndingsbuffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EGTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 140 mM NaCl, 1x PIC) og bland prøverne via rotation i 10 min ved 4 °C.
      BEMÆRK: Dette trin er nødvendigt for at fortynde SDS'en i den nukleare lysisbuffer for at undgå interferens med downstream-reaktioner, herunder måling af chromatinkoncentrationen.
    22. DNA-koncentrationen af chromatinprøverne måles ved 260/280 nm ved hjælp af et spektrofotometer.
  3. Forberedelse af perler, præclearing og immunoprecipitation
    1. Forbered perler (får anti-kanin eller mus IgG) for pre-clearing og immunoprecipitation trin. Vaskeperler to gange i 10 minutter ved 4 °C med RIPA buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% Na-DOC, 0,1% SDS, 150 mM NaCl og 1X PIC).
    2. Ophæld perlerne i samme mængde RIPA-buffer som i trin 2.3.1.
    3. Forklar 25-30 μgchromatin af hver prøve med 4 μL af perlerne via rotation i 1-2 timer ved 4 °C.
      BEMÆRK: Der tilsættes RIPA-buffer til hver kromatinprøve på op til 500 μL det endelige volumen for at lade prøverne blandes korrekt under rotation. Glem ikke at udtage kromatin til NAC (Ingen antistofkontrol) og TIC (Total Input Control) for hvert prøvesæt. TIC kræver kun et endeligt volumen på op til 200 μL.
    4. Bundfælde perlerne med en magnet og overføre supernatanten til et nyt mikrocentrifugerør.
    5. Der tilsættes en passende mængde antistof til hver kromatineprøve (undtagen NAC og TIC) og roteres natten over ved 4 °C.
    6. Næste dag tilsættes 40 μL vaskede perler til hver prøve (undtagen TIC) og inkuberes natten over og roterer ved 4 °C.
  4. Vask
    1. Vask én gang med 300 μL lavsaltbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) i 10 min. via rotation ved 4 °C.
    2. Vask én gang med 300 μL højsaltbuffer (20 mM Tris-HCl pH 8,0, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8,0, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 1x PIC) i 10 min via rotation ved 4 °C.
    3. Vask én gang med 300 μL LiCl buffer (250 mM LiCl, 1% NP-40, 1% Na-DOC, 1 mM EDTA pH 8,0, 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1x PIC) i 10 min via rotation ved 4 °C.
    4. Der vaskes to gange med 300 μL TE (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM EDTA pH 8,0) i 10 min. via rotation, til første vask ved 4 °C og den anden vask ved 25 °C.
  5. Eluering
    1. Der tilsættes 200 μL elueringsbuffer (1% SDS og 100 mM NaHCO3)til perlerne og inkuberes ved 65 °C i en termo-shaker i 15 minutter med kontinuerlig omrystning (ca. 400 RPM). Supernatanten overføres til et nyt rør og eluteperler igen i 200 μL Elution-buffer. Kombiner eluater (400 μL slutvolumen).
    2. NaCl til en endelig koncentration på 200 mM i hver prøve. Suppler TIC prøverne med 200 μL Elution buffer og tilsæt Også NaCl.
      BEMÆRK: Fra dette trin skal TIC håndteres på samme betingelser som de andre prøver.
    3. Prøverne inkuberes ved 65 °C (uden omrystning) i mindst 6 timer.
    4. Der tilsættes 1 mL kold 100% ethanol til hver prøve, rørene roteres to gange for at blande dem, og DNA udfældes natten over ved −80 °C.
    5. Den næste dag, centrifuge i 30 min ved 13.000 x g ved 4 °C.
    6. Kassér supernatanten og vask pelleten med 70% EtOH.
    7. Prøverne centrifugeres ved 13.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    8. Kassér supernatant og lufttørre pellets.
    9. Pellets opbrugtes igen i 100 μL TE, og der tilsættes 0,5 mg/mL RNase A til hver prøve. Inkuber ved 37 °C i 20 minutter for at aktivere RNase.
  6. Tilbageførsel af krydslinking
    1. Der tilsættes 500 μg/mL Proteinase K og 0,5% SDS, og prøverne inkuberes derefter ved 50 °C i 2 timer.
      BEMÆRK: Hvis du fortsætter til ChIP-seq, skal du undgå phenol-chloroformekstraktion, da det hæmmer downstream-NGS-processen. I stedet anbefales det at bruge et kommercielt tilgængeligt sæt (se Materialeoversigt).
    2. Der tilsættes 0,5 volumen phenol og 0,5 volumen chloroform-isoamylalkoholblanding (24:1) til hver prøve.
    3. Vortex i 1 min.
    4. Centrifuge ved 13.000 x g i 10 min.
    5. Overfør den øverste vandige fase til et nyt mikrocentrifugerør.
    6. Der tilsættes 1 volumen chloroform-isoamylalkoholblanding (24:1) til hver prøve.
    7. Vortex i 1 min.
    8. Centrifuge ved 13.000 x g i 10 min.
    9. Overfør den øverste vandige fase til et nyt mikrocentrifugerør.
  7. DNA-ekstraktion
    1. Der tilsættes 2,5 volumener 96% ethanol og 0,1 volumen på 3 M Na-Acetat pH 5.2.
    2. Inkuber i mindst 20 min. ved −80 °C.
    3. Prøverne centrifugeres ved 13.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    4. Ethanolen fjernes, og pelletlen vaskes med 400 μL 70% ethanol.
    5. Prøverne centrifugeres ved 13.000 x g i 10 min ved 4 °C.
    6. Fjern ethanol og lufttørre pellet.
    7. Genbrug pellet i 50 μL TE.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Undersøgelse af site-rettet DSB-induceret reparation processer i celler kan opnås via enten stabil eller forbigående transfekt. Det skal dog bemærkes, at stabil transfekt sikrer en homogen cellepopulation, hvilket giver en samlet og dermed mere pålidelig cellulær respons. I tilfælde af forbigående transfekt optager kun en lille del af cellepopulationen og opretholder plasmidet, hvilket introducerer mangfoldighed i eksperimentet. Etablering af ER-I-PpoI eller ER-AsiSI endonuklease-baserede cellesystemer kræver en 50% sammenflydende cellepopulation, som mere effektivt transfected med plasmider kodning endonuclease. Til transfekt kan kommercielt tilgængelige transfektreagenser eller virusinfektionsbaserede metoder også anvendes. Hvis der skal anvendes en mikroskopisk visualiseringsteknik, og der kræves forbigående transfekt, kan de styrede DSB'er induceres ved 4-OHT-tilsætning 24 timer efter transinfektion, som binder sig til de ER-fusionerede endonukleaser og tillader nuklear translokation og DSB-induktion. For at bestemme de mest hensigtsmæssige tidspunkter kan immunfluorescensbaseret mikroskopi og vestlig skampletdetektering af γH2AX på forskellige tidspunkter efter 4-OHT-behandling udføres. Under fysiologiske forhold kan der maksimalt påvises 10-15 γH2AX foci pr. celle, og dannelsen af stærke reparationsfoci kan udløses af endonukleaser (eller forskellige andre teknikker, der ikke diskuteres her, f.eks. lasermikroirradiation). En typisk I-PpoI endonuclease fører til dannelsen af forhøjede γH2AX signaler omkring kernen ved at fremkalde DSBs på ribosomal DNA (rDNA). Hvis pauserne repareres af NHEJ eller HR, falder antallet af reparationsfoci over tid. Derfor anbefales repræsentative tidspunkter ved 0 timer, 30 min,1, 2, 4 og 8 timer efter 4-OHT-behandlinger. For at spore DNA-reparationsprocesser er den mest anvendte cellelinje U2OS, da alle kendte reparationsveje er fuldt funktionelle i disse celler. Ved undersøgelse af flere proteiner i de samme celler kan samlokalisering undersøges ved at kombinere antistoffer, der er konjugeret med forskellige fluorophorer med forskellige emissionsbølgelængder opdrættet i forskellige dyrearter som vist i figur 1. Deri er induktionen af DSB'er via en indukbel stabil cellelinje repræsenteret, som er baseret på ER-AsiSI-begrænsningsindførelsen fusioneret med hemagglutinin-tag (HA). Doxycyclin kan fremkalde udtrykket og bindingen af HA-ER-AsiSI i cytoplasmaet, som kan spores ved hjælp af et antistof mod HA (Figur 1. tredje kolonne, anden rå). Inkubation i 4 timer med 4-OHT, 24 timer efter doxycyclintilsætning, kan fremkalde et stort antal DSB'er, da endonukleasen er blevet omfordelt til kernen(figur 1. tredje kolonne, tredje rå og anden kolonne, tredje rå). DSB'er kan visualiseres ved hjælp af et antistof, der genkender γH2AX.

Figure 1
Figur 1: Immunfluorescensmikroskopi anvendes til påvisning af γH2AX i dyrkede celler, der udtrykker HA-ER-AsiSI. DOX-tilsætning (doxycyclin) aktiverer det cytoplasmiske udtryk for HA-ER-AsiSI og 4-OHT (4-hydroxytamoxifen) (4 h) fremkalder den nukleare translokation af fusionsproteinet, hvilket fører til induktion af DSB'er på kendte genomiske positioner. HA (hemagglutinin) farvning (anti-HA antistof) repræsenterer HA-ER-AsiSI fusionsprotein i grønt, og induktion af pauser verificeres ved γH2AX farvning (anti-γH2AX antistof) i rødt. Skalalinjer repræsenterer 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Samlokalisering af reparationsproteiner på skadestedet indikerer, at de rekrutteres til det samme DNA-læsionssted, men de interagerer ikke nødvendigvis med hinanden. Opløsningen af konfokal mikroskopi er ca. 300 nm; for at bestemme bindingsmønsteret for specifikke reparationsproteiner på pausestedet anbefales superopløsningsmikroskopi (STORM) i stedet 24. Denne metode kræver dog dyrt mikroskopisk udstyr og en ekspertforsker. Alternativt kan reparationsproteinernes bindingsmønster undersøges ved chromatin immunoprecipitation ved hjælp af DIvA- eller U2OS-pEP15-stabile cellelinjer, som kan udtrykke AsiSI- og I-PpoI-endonukleaser på en reguleret måde, henholdsvis17,21. Ved 4-OHT-tilføjelse kan begge endonukleaser skære DNA'et på en sekvensspecifik måde, der giver os mulighed for at designe locus specifikke primere til de forventede pausesteder og deres omkringliggende genomiske regioner. Ved at anvende γH2AX antistof i immunoprecipitationsdelen af ChIP kan vi tempoært følge DNA-reparationskinetik på forskellige forhold (såsom lyddæmpning eller hæmning af visse reparationsfaktorer af interesse, dvs. DNA-PKcs). Et typisk eksperimentelt resultat opnået ved hjælp af ChIP-qPCR er repræsenteret i figur 2. Deri påvises den tidsmæssige berigelse af γH2AX som en reaktion på I-PpoI-induceret DNA-skade. I venstre del af billedet vises det rettidigt fundne γH2AX-signal på pausestedet, mens γH2AX-fordelingen på højre side er repræsenteret i et kontrolgenområde, hvor DSB'er ikke er induceret.

Figure 2
Figur 2:Tidsmæssig berigelse af γH2AX som bestemt ved chromatin immunoprecipitation som reaktion på I-PpoI-induceret DNA-skade. Venstre, γH2AX signal på pausestedet; γH2AX-distribution i et kontrolområde, hvor DSB'er ikke blev induceret (anti-γH2AX-antistof). De repræsenterede resultater er afledt af et biologisk eksperiment, og fejllinjer angiver variationerne i de tilsvarende prøves replikater. N=3. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selvom DNA-reparation er et relativt nyt forskningsfelt, udvides vores viden hurtigt ved hjælp af forskellige biokemiske og mikroskopiske metoder. Bevarelse af genetisk information er afgørende for celler, da mutationer, der forekommer i gener, der er involveret i reparationsprocesser, er blandt de førende årsager til tumorigenese, og derfor er det vigtigt at belyse de vigtigste trin i DNA-reparationsveje.

Biokemiske teknikker (dvs. vestlige blot, immunoprecipitation, massespektrometri osv.) kræver et stort antal celler, og de undersøgte reparationsprocesser repræsenterer et øjebliksbillede af den ønskede cellepopulation. Udførelse af ChIP-eksperimenter er besværligt, og der skal tages hensyn til mange overvejelser, når man designer et specifikt eksperiment for at undersøge processen med DSB-reparation. Følgende trin er nogle eksempler: (I) celler skal lyses korrekt; det anbefales på det kraftigste at anvende en totrins lysationsmetode ved hjælp af separat celle- og nuklear lysisbuffer for at sikre højere adgang til chromatinfraktionen (II) chromatin bør ikke over- eller undersoniske de relevante sonikeringsbetingelser bør optimeres til hver celletype på forhånd (III) den passende mængde renset antistof, da antistoffer mod det samme protein fra forskellige virksomheder udviser ikke-identiske egenskaber (IV) for effektiv immunoprecipitation, bør der anvendes 25-30 ug indledende chromatin i hver tilstand (V) det rette tidspunkt for fiksering bør optimeres da overfixation kan resultere i falske positive resultater ved at krydskoble de fjerne proteinkomplekser, og underføring kan forhindre, at der er en korrekt krydsled mellem DNA og det ønskede protein (VI) baseret på det påførte antistof, bør typen af perler (protein A eller G) bestemmes omhyggeligt (VII) under vasketrinnene, rækkefølgen af vaskebufferne bør holdes grundigt for at undgå frigivelse af antistoffet fra perlerne (VIII) under DNA-ekstraktionen phenolspor bør fjernes korrekt for at undgå at reducere effektiviteten af de videre downstream-reaktioner. Da denne metode reducerer udbyttet af genvundet DNA, er vores personlige råd snarere at bruge specifikt DNA-rensningssæt. Når alle kritiske punkter er blevet korrekt behandlet, kan ChIP levere værdifulde data til belægningen af det ønskede protein på forskellige genomiske loci og kan optrævle kritiske trin i DNA-reparationsprocesser.

ChIP kombineret med qPCR er imidlertid en indirekte tilgang til undersøgelse af proteinfordelingen i udvalgte genomiske regioner og tillader ikke specifikt at genkende DNA-bindingsstedet eller direkte undersøge proteinets funktion. Mono- eller polyklonale antistoffer, der anvendes til at fange protein-DNA-komplekserne, kan også krydsreagere med andre proteiner, der fører til falsk-positive data, og derfor bør de antistoffer, der anvendes i denne teknik, være ChIP-grade og meget specifikke mod det protein af interesse. ChIP er imidlertid en udbredt teknik, og der er udviklet yderligere tilgange baseret på dette, såsom ChIP-on-chip og ChIP-seq. Førstnævnte er afhængig af hybridisering af de immunoprecipiterede og rensede DNA-fragmenter på en mikroarray med et stort udvalg af små tilfældige DNA-sekvenser, som yderligere forstærker de udglødede sekvenser, der giver værdifuld information om proteinbindingssteder. ChIP-seq har imidlertid vist sig at være en attraktiv alternativ tilgang, da den giver genomdækkende kortlægning af protein-DNA-komplekser med højere opløsning end ChIP-on-chip og genomsekvensering med høj gennemløb. ChIP-seq har revolutioneret området for DNA-reparation ved at afsløre DNA-bindingssteder for forskellige transskriptionsfaktorer, der giver indsigt i genreguleringen og optrævler kromatinlandskaber i en genom-dækkende skala25. Ifølge dette har området for DNA-reparation enormt nydt godt af ChIP-seq, da disse data spiller en afgørende rolle i forskellige sygdomme og biologiske veje, såsom kræft progression. Ikke desto mindre er der udviklet forskellige ændringer af ChIP-metoden, såsom HaloChIP, som ikke kræver specifikt antistof mod det pågældende protein, men snarere bruger sekvenser, der kodper DNA-bindende proteiner fusioneret med HaloTag, som transfected til celler og efterfølgende til crosslinking, de ønskede protein-DNA-komplekser kan fanges ved hjælp af HaloLink Harpiks. Denne teknik er imidlertid afhængig af overekspression og ikke det endogene niveau af de ønskede proteiner, hvilket kan resultere i fejlfortolket data26.

Desuden giver mikroskopiske teknikker værdifuld information om den spatiotemporale sporing af DNA-skadesreparation, selv i et enkeltcellet niveau. Den hurtige forbedring af antistoffer, der er rejst mod specifikke reparationsproteiner, har ført til en dybere forståelse af MEKANISMEN for NER- og DSBR-delveje samt deres regulering efter oversættelsen. Det mikroskopiske felt er blevet revolutioneret af højopløsningsteknikker, såsom superopløsningsmikroskopi, som gør det muligt at visualisere DNA-skadefremkaldte cellulære processer på det nukleosomale niveau samt sikre nøjagtig kortlægning af proteinkolokalisering24. Det skal dog bemærkes, at variansen i celleafstændringer skal overvejes under eksperimentet, da reparationshastigheden kan afvige, hvilket kan gøre resultaterne vanskelige at fortolke. I betragtning af den hurtige udvikling af fluorescensbilleddannelsesmetoden og det bevidste design af det eksperimentelle setup er en værdifuld mulighed for at undersøge de DNA-skadefremkaldte cellulære og molekylære reaktioner ved en enkelt proteinopløsning på et enkeltcelleniveau på vej til perfektion.

Afslutningsvis kan kombinationen af superopløsningsmikroskopi og enkeltcellesekvenseringsmetode forbedre vores forståelse af DNA-reparationsfeltet betydeligt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen

Acknowledgments

Denne forskning blev finansieret af Det Nationale Forsknings-, Udviklings- og Innovationskontors tilskud GINOP-2.3.2-15-2016-00020, GINOP-2.3.2-15-2016-00036, GINOP-2.2.1-15-2017-00052, EFOP 3.6.3-VEKOP-16-2017-00009, NKFI-FK 132080, János Bolyai-forskningsstipendatet fra det ungarske videnskabsakademi BO/27/20, ÚNKP-20-5-SZTE-265, EMBO's kortfristede stipendium 8513 og Tempus-fonden.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-OHT Sigma Aldrich H7904
Agarose Lonza 50004
Antibiotic-Antimycotic Solution (100×), Stabilized Sigma Aldrich A5955
Anti-gamma H2A.X (phospho S139) antibody Abcam ab26350
Bovine Serum Fraction V albumin Biosera PM-T1725
TrackIt™ Cyan/Yellow Loading Buffer Thermo Fisher Scientific 10482035
DMEM with 1.0 g/L Glucose, without L-Glutamine Lonza 12-707F
Doxycycline Sigma Aldrich D9891
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Mouse IgG Invitrogen 11202D
Dynabeads™ M-280 Sheep Anti-Rabbit IgG Invitrogen 11204D
EDTA Sigma Aldrich E6758
EGTA Sigma Aldrich E3889
Ethanol Molar Chemicals 02910-101-340
Fetal Bovine Serum (South America Origin), EU-approved Gibco ECS0180L
Formaldehyde 37% solution free from acid Sigma Aldrich 1.03999
GlutaMAX™ Supplement Thermo Fisher Scientific 35050038
Glycine Sigma Aldrich 50046
IPure kit v2 Diagenode C03010015
Isoamyl alcohol Sigma Aldrich W205702
LiCl Sigma Aldrich L9650
NaCl Sigma Aldrich S5886
Na-DOC Sigma Aldrich D6750
NaHCO3 Sigma Aldrich S5761
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus Sigma Aldrich N9162
NP-40 Sigma Aldrich I8896
PBS Powder without Ca2+, Mg2+ Sigma Aldrich L182-50-BC
Phenol Sigma Aldrich P4557
PIPES Sigma Aldrich P1851
Polysorbate 20 (Tween 20) Molar Chemicals 09400-203-190
KCl Sigma Aldrich P5405
ProLong™ Gold Antifade Mountant with DAPI Thermo Fisher Scientific P36935
Protease Inhibitor Cocktail Set I Roche 11873580001
Proteinase K Sigma Aldrich P2308
P-S2056 DNAPKcs antibody Abcam ab18192
RNase A Roche 10109169001
CH3COONa Sigma Aldrich S2889
SDS Sigma Aldrich L3771
Tris Acetate-EDTA buffer Sigma Aldrich T6025
Tris-HCl Sigma Aldrich 91228
TRITON X-100 Molar Chemicals 09370-006-340
Trypsin from porcine pancreas Sigma Aldrich T4799
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Ubiquitylation-Mediated Fine-Tuning of DNA Double-Strand Break Repair. Cancers (Basel). 12 (6), (2020).
  2. Borsos, B. N., Majoros, H., Pankotai, T. Emerging Roles of Post-Translational Modifications in Nucleotide Excision Repair. Cells. 9 (6), (2020).
  3. Stephens, P. J., et al. The landscape of cancer genes and mutational processes in breast cancer. Nature. 486 (7403), 400-404 (2012).
  4. Turnbull, C., et al. Gene-gene interactions in breast cancer susceptibility. Human Molecular Genetics. 21 (4), 958-962 (2012).
  5. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (48), 18877-18882 (2008).
  6. Jiricny, J. The multifaceted mismatch-repair system. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (5), 335-346 (2006).
  7. Hanawalt, P. C., Spivak, G. Transcription-coupled DNA repair: two decades of progress and surprises. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 9 (12), 958-970 (2008).
  8. Kanaar, R., Wyman, C., Rothstein, R. Quality control of DNA break metabolism: in the 'end', it's a good thing. EMBO Journal. 27 (4), 581-588 (2008).
  9. Lemaitre, C., et al. Nuclear position dictates DNA repair pathway choice. Genes & Development. 28 (22), 2450-2463 (2014).
  10. Lieber, M. R. The mechanism of double-strand DNA break repair by the nonhomologous DNA end-joining pathway. Annual Review of Biochemistry. 79, 181-211 (2010).
  11. Lambert, S., Lopez, B. S. Characterization of mammalian RAD51 double strand break repair using non-lethal dominant-negative forms. EMBO Journal. 19 (12), 3090-3099 (2000).
  12. Xu, S., et al. p300-mediated acetylation of histone demethylase JMJD1A prevents its degradation by ubiquitin ligase STUB1 and enhances its activity in prostate cancer. Cancer Research. , (2020).
  13. Kastan, M. B., Bartek, J. Cell-cycle checkpoints and cancer. Nature. 432 (7015), 316-323 (2004).
  14. Roy, R., Chun, J., Powell, S. N. BRCA1 and BRCA2: different roles in a common pathway of genome protection. Nature Reviews Cancer. 12 (1), 68-78 (2011).
  15. Krenning, L., vanden Berg, J., Medema, R. H. Life or Death after a Break: What Determines the Choice. Molecular Cell. 76 (2), 346-358 (2019).
  16. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 5858-5868 (1998).
  17. Caron, P., et al. WWP2 ubiquitylates RNA polymerase II for DNA-PK-dependent transcription arrest and repair at DNA breaks. Genes & Development. 33 (11-12), 684-704 (2019).
  18. Caron, P., et al. Cohesin protects genes against gammaH2AX Induced by DNA double-strand breaks. PLoS Genetics. 8 (1), 1002460 (2012).
  19. Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites. Nature Protocols. 3 (5), 915-922 (2008).
  20. Paques, F., Duchateau, P. Meganucleases and DNA double-strand break-induced recombination: perspectives for gene therapy. Current Gene Therapy. 7 (1), 49-66 (2007).
  21. Pankotai, T., Bonhomme, C., Chen, D., Soutoglou, E. DNAPKcs-dependent arrest of RNA polymerase II transcription in the presence of DNA breaks. Nature Structural & Molecular Biology. 19 (3), 276-282 (2012).
  22. Iacovoni, J. S., et al. High-resolution profiling of gammaH2AX around DNA double strand breaks in the mammalian genome. EMBO Journal. 29 (8), 1446-1457 (2010).
  23. Poinsignon, C., et al. Phosphorylation of Artemis following irradiation-induced DNA damage. European Journal of Immunology. 34 (11), 3146-3155 (2004).
  24. Varga, D., Majoros, H., Ujfaludi, Z., Erdelyi, M., Pankotai, T. Quantification of DNA damage induced repair focus formation via super-resolution dSTORM localization microscopy. Nanoscale. 11 (30), 14226-14236 (2019).
  25. Kim, J. A., Kruhlak, M., Dotiwala, F., Nussenzweig, A., Haber, J. E. Heterochromatin is refractory to gamma-H2AX modification in yeast and mammals. Journal of Cell Biology. 178 (2), 209-218 (2007).
  26. Daniels, D. L., Urh, M. Isolation of intracellular protein--DNA complexes using HaloCHIP, an antibody-free alternative to chromatin immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology. 977, 111-124 (2013).

Tags

Biologi Problem 174 DNA-reparation chromatin immunoprecipitation fluorescerende mikroskopi stedsspecifikke DSB'er immunostaining
Visualisering og kvantificering af endonuklease-baseret stedsspecifik DNA-skade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos,… More

Pantazi, V., Berzsenyi, I., Borsos, B. N., Pankotai, T. Visualizing and Quantifying Endonuclease-Based Site-Specific DNA Damage. J. Vis. Exp. (174), e62175, doi:10.3791/62175 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter