Summary
Este trabalho resume as etapas no desenvolvimento de ensaios diferentes para a detecção de SARS-CoV-2 usando um sistema ddPCR de duas cores. As etapas são elaboradas e notas foram incluídas sobre como melhorar os ensaios e o desempenho do experimento. Estes ensaios podem ser usados para aplicações SARS-CoV-2 RT-ddPCR.
Abstract
O diagnóstico da pandemia SARS-CoV-2 em curso é uma prioridade para todos os países em todo o mundo. Atualmente, o PCR quantitativo de transcrição reversa (RT-qPCR) é o padrão ouro para o diagnóstico de SARS-CoV-2, pois nenhuma solução permanente está disponível. Por mais eficaz que essa técnica possa ser, pesquisas têm surgido mostrando suas limitações na detecção e diagnóstico, principalmente quando se trata de alvos pouco abundantes. Em contraste, o PCR digital de gotículas (ddPCR), uma tecnologia emergente recente com vantagens superiores sobre o qPCR, mostrou superar os desafios do RT-qPCR no diagnóstico de SARS-CoV-2 a partir de amostras alvo pouco abundantes. Prospectivamente, neste artigo, os recursos do RT-ddPCR são expandidos ainda mais, mostrando etapas sobre como desenvolver ensaios simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex usando um sistema de detecção de duas cores. Usando primers e sondas que visam locais específicos do genoma do SARS-CoV-2 (N, ORF1ab, RPP30 e RBD2), o desenvolvimento destes ensaios mostra-se possível. Além disso, protocolos detalhados passo a passo, notas e sugestões sobre como melhorar o fluxo de trabalho de ensaios e analisar dados são fornecidos. A adaptação desse fluxo de trabalho em trabalhos futuros garantirá que o número máximo de destinos possa ser detectado de forma sensível em uma pequena amostra, melhorando significativamente o custo e a taxa de transferência da amostra.
Introduction
A reação em cadeia da polimerase (PCR), uma técnica bem reconhecida, passou por diversas transformações desde seu advento para se tornar uma poderosa técnica capaz de fornecer respostas à pesquisa de ácidos nucleicos. Essas transformações têm sido um constante aprimoramento da antiga técnica. Essas transformações podem ser resumidas em três gerações1. A primeira geração é a PCR convencional que se baseia na eletroforese em gel para quantificar e detectar alvos amplificados. A segunda geração é a PCR quantitativa em tempo real (qPCR) que pode detectar amostras em tempo real e contar com uma curva padrão para quantificar diretamente os alvos em uma amostra. A terceira geração, PCR digital (dPCR), pode realizar tanto a detecção quanto a quantificação absoluta de alvos de ácidos nucleicos sem a necessidade de uma curva padrão. A dPCR também foi melhorada a partir de câmaras de reação sendo separadas pelos poços de uma parede em emulsões de óleo, água e produtos químicos estabilizantes dentro do mesmo poço, como visto na PCR digital baseada em gotículas2. Na PCR digital de gotículas (ddPCR), uma amostra é particionada em milhares de gotículas de tamanho nanolitro contendo alvos individuais que serão posteriormente quantificados usando a estatística de Poisson 2,3,4. Esta técnica confere à ddPCR uma vantagem na quantificação de alvos pouco abundantes quando comparada com as outras gerações de PCR.
Recentemente, múltiplas aplicações têm destacado a superioridade da ddPCR sobre a qPCR comumente usada na detecção e quantificação de alvos pouco abundantes 1,5,6. O SARS-CoV-2 não é exceção a essas aplicações 7,8,9,10,11,12. Desde o surto do SARS-CoV-2, os cientistas têm trabalhado em todas as frentes para encontrar soluções sobre como diagnosticar o vírus e detectá-lo de forma eficiente. O padrão-ouro atual ainda continua sendo o qPCR13. No entanto, o RT-ddPCR mostrou-se mais preciso na detecção de alvos SARS-CoV-2 pouco abundantes de amostras ambientais e clínicas quando comparado ao RT-qPCR 7,8,9,10,11,12. A maioria dos trabalhos publicados sobre o ddPCR SARS-CoV-2 depende de ensaios simplex com os multiplex, dependendo dos ensaios comerciais. Portanto, mais deve ser feito para explicar como desenvolver ensaios multiplex RT-dPCR para detecção de SARS-CoV-2.
Em um projeto de ensaio adequado, a multiplexação pode ser usada para economizar custos, aumentar a taxa de transferência da amostra e maximizar o número de alvos que podem ser detectados sensivelmente em uma pequena amostra. Ao multiplexar com ddPCR, deve-se levar em conta quantos fluoróforos podem ser detectados em um determinado sistema. Algumas plataformas ddPCR podem suportar até três canais, enquanto outras suportam apenas dois canais. Assim, na multiplexação com dois canais, deve-se utilizar diferentes abordagens, incluindo a multiplexação de ordem superior para detectar mais de dois alvos14,15,16. Neste trabalho, um sistema de detecção ddPCR de duas cores é usado para mostrar etapas sobre como desenvolver diferentes ensaios de RT-ddPCR de SARS-CoV-2 que podem ser adaptados para diferentes aplicações de pesquisa.
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Protocol
Declaração ética
O Instituto de Virologia de Wuhan (WHIOV) está entre os laboratórios e institutos aprovados pelo CDC da China da cidade de Wuhan para conduzir pesquisas sobre o SARS-CoV-2 e detectar COVID-19 a partir de amostras clínicas. A pesquisa sobre o desenvolvimento de novas técnicas de diagnóstico para COVID-19 usando amostras clínicas também foi aprovada pelo comitê de ética do Instituto de Virologia de Wuhan (2020FCA001).
1. Fluxo de trabalho de processamento de amostras (Figura 1A)
NOTA: Ao longo do protocolo, é importante usar salas separadas com pipetas dedicadas para manuseio de amostras (extração e armazenamento), preparação e armazenamento de reagentes/mastermix, preparação de mistura de reação (amostra mais mastermix) e detecção, para evitar contaminação cruzada. Os ensaios a serem desenvolvidos podem ser utilizados na detecção de amostras clínicas ou amostras de pesquisa. Todas as amostras devem ser tratadas como se pudessem transmitir agentes infecciosos, mesmo quando se utilizam procedimentos laboratoriais seguros. As etapas de processamento das amostras devem ser feitas em um laboratório de nível de biossegurança 2 (BSL-2), seguindo regras rígidas de BSL-2, incluindo o uso de equipamentos de proteção individual (EPIs) apropriados.
- Inativação de amostra
- Leve 1 mL de amostra de SARS-CoV-2 para um laboratório BSL-2. Amostras inactivadas pelo calor a 65 °C durante 30 min.
NOTA: As amostras podem vir de várias fontes, portanto, deve-se certificar-se de que o volume a ser inativado é suficiente para garantir a extração subsequente de RNA. A maioria dos kits de extração requer um pequeno volume de amostra de até 200 μL, portanto, um volume de amostra de cerca de 1 mL seria suficiente para a inativação. Surfactantes, kits e tampões de lise também podem ser usados para inativação direta e extração de RNA de acordo com o próprio SOP do laboratório. - Leve as amostras para um gabinete de biossegurança (BSC) e deixe-as repousar à temperatura ambiente por 10 minutos para permitir que os aerossóis potenciais se instalem. Conservar as amostras a 4 °C durante 24 h se não forem imediatamente transformadas.
Observação : nenhum contêiner específico é necessário para o armazenamento de amostras. As amostras podem ser armazenadas nos tubos ou recipientes utilizados durante a inativação. Para este trabalho, a maioria das amostras foi armazenada em tubos de meio de transporte viral (VTM) ou tubos de 1,5 mL.
- Leve 1 mL de amostra de SARS-CoV-2 para um laboratório BSL-2. Amostras inactivadas pelo calor a 65 °C durante 30 min.
- Extração de RNA
NOTA: Muitos instrumentos de extração de RNA e kits com protocolos específicos estão disponíveis para uso pronto. Aqui, um procedimento automatizado seguindo as instruções do fabricante é apresentado.- Retire a placa de orifício de poço de 96 profundidades pré-preenchida; inverta suavemente de cabeça para baixo para misturar as contas magnéticas. Após a mistura, agite suavemente a placa em uma superfície plana para concentrar o reagente e as esferas magnéticas que podem estar na parede até o fundo da placa.
- Rasgue cuidadosamente a película de vedação da folha de alumínio para evitar a vibração da placa e o derramamento de líquido. Adicionar 20 μL de proteinase K e 200 μL da amostra por poço nas fileiras 2 e 8 da placa de 96 poços. Em seguida, coloque a placa de 96 poços na base do instrumento de extração automática de ácido nucleico de 32 canais.
Observação : execute o programa no computador dentro de 1 h depois de adicionar o exemplo. - Insira a manga da barra magnética no slot do cartão do instrumento de extração automática de ácido nucleico de 32 canais. Selecione o programa GF-FM502T5-TR"1"GF-FM502T5YH (versão rápida) e execute-o.
- Após a conclusão da extração, retirar as amostras de ácido nucleico nas linhas 6 e 12 (cerca de 100 μL/amostra) e distribuir em uma placa limpa de 96 poços livre de nucleases. Conservar as amostras a 4 °C durante 24 h até à utilização ou a -20 °C durante mais tempo.
NOTA: Recomenda-se usar uma pipeta multicanal de 100 μL para transferir amostras para uma nova placa de 100-200 μL, pois ela pode corresponder diretamente às colunas da placa de amostra.
- Geração de cDNA
NOTA: Para amostras armazenadas por um longo tempo, evite vários ciclos de congelamento/descongelamento. Realize a geração de cDNA usando um kit de cDNA seguindo as instruções do fabricante.- Em um tubo de PCR de 100 ou 200 μL colocado sobre gelo/bloco de resfriamento, adicione 2 μL de mistura mestre de 5x RT (por exemplo, Perfect Real Time), 5 μL de RNA da amostra e 3 μL de ddH2O livre de RNase por reação (volume total de 10 μL).
- Coloque o tubo de PCR em um termociclador regulado para funcionar a 37 °C por 15 min (transcrição reversa), 85 °C por 5 s (inativação térmica da transcriptase reversa) e 4 °C por um tempo infinito.
NOTA: Processar as amostras imediatamente, ou armazenar a 4 °C por até 24 h até o uso ou a -20 °C por até 6 meses.
2. Otimização do ensaio ddPCR e fluxo de trabalho
OBS: Otimizar os ensaios antes/depois da leitura das gotículas. Dependendo dos resultados, eles podem ser otimizados em qualquer ponto do trabalho para alcançar melhores resultados. Abaixo estão alguns fatores comuns a serem considerados ao otimizar experimentos de ddPCR.
- Validar os primers e sondas ddPCR (Tabela 1).
NOTA: Os primers ORF1ab e N foram adaptados do China CDC17, o gene de controle endógeno humano (RPP30) de Lu et al.18 e o RBD2 de Nyaruaba et al.13. Todos os primers e sondas, exceto RBD2, já haviam sido testados e otimizadospor ddPCR 7,8,18. - Execute os controles de amostra de teste ddPCR compreendendo um controle positivo (uma amostra com todos os quatro alvos), No Template Control (NTC; Água livre de nucleases ou amostra sem alvos) e extração/controle negativo (ácido nucleico total extraído de uma célula humana cultivada não infecciosa ou amostras agrupadas de voluntários de saúde).
NOTA: Amostras de controle padrão com cópias conhecidas de genes-alvo são preferidas. No entanto, na ausência de padrões, use as amostras disponíveis para definir seus controles ou matriz amostral. Execute os controles junto com amostras de teste. - Optimizar a temperatura de recozimento (Figura 2D) inserindo um gradiente de temperatura de 55 °C a 65 °C na etapa de recozimento da PCR (passo 3.2).
NOTA: A otimização da temperatura de recozimento ajuda a encontrar a melhor temperatura onde a separação de gotículas é máxima (fácil identificação do alvo) com chuva mínima. Após a obtenção dos resultados, reduza a faixa de temperatura para melhor otimização, por exemplo, 55 °C a 60 °C. - Otimize as concentrações do primer e da sonda. Se a separação ótima entre gotículas positivas e negativas não for alcançada nos ensaios, variar as concentrações do primer (300-900 nM) e/ou da sonda (100-400 nM).
NOTA: A redução das concentrações de primer/sonda resulta em uma menor amplitude da gotícula alvo e o aumento também aumenta a amplitude do alvo. Isso pode ser útil na multiplexação baseada em amplitude. - Testar a sensibilidade analítica considerando diferentes parâmetros, incluindo limite de branco (LoB), limite de detecção (LoD), especificidade e sensibilidade usando amostras padrão e teste, conforme preferido.
3. fluxo de trabalho ddPCR (Figura 1B) e desenvolvimento do ensaio (Tabela 2)
NOTA: Como outros sistemas de detecção de ddPCR, esse fluxo de trabalho também consiste em quatro etapas (Figura 1B), incluindo preparação da mistura de reação, geração de gotículas, amplificação de PCR e leitura de gotículas.
- Preparação da mistura de reação
NOTA: Prepare todos os ensaios em uma sala limpa separada e dentro de um BSC. Observe as precauções padrão, incluindo o uso de luvas limpas, pipetas limpas, água livre de nucleases e desinfetantes. Alíquotas reagentes em tubos separados e armazenar a -20 oC para evitar ciclos repetidos de congelamento. Preparar ensaios conforme mostrado na Tabela 2. As soluções-mãe de primer e sonda devem ser armazenadas em altas concentrações de 100 μM. As soluções de trabalho podem ser armazenadas em alíquotas de 20-40 μM (diluídas em água livre de nucleases).- Etapas comuns em todos os ensaios
NOTA: Antes de preparar os ensaios, calcule o volume total de mastermix necessário com base no número de amostras. Aqui, cada volume de componente do mastermix foi multiplicado por 1,05 para contabilizar eventuais erros de pipetagem.- Descongelar e equilibrar materiais de reação à temperatura ambiente. Vórtice os componentes das reações brevemente (30 s) para garantir a homogeneidade, e centrifugar brevemente para coletar o conteúdo no fundo do tubo.
- Preparar uma mistura de primer-sonda (PP) por ensaio, misturando volumes de reação específicos, conforme detalhado na Tabela 2 , das soluções de trabalho.
- Preparar o mastermix misturando 11 μL (1x) de 2x supermix ddPCR para sondas (sem dUTP), mistura de PP (dependendo do ensaio como mostrado na Tabela 2 da solução de trabalho) e água livre de nuclease para um volume final de 19,8 μL por poço. Distribua o mastermix nos poços de uma placa ddPCR de 96 poços livre de nuclease com base no número de amostras.
NOTA: Para a placa de amostra, certifique-se de que todos os 8 poços em uma coluna tenham a solução. Se apenas alguns poços forem usados, por exemplo, 5 amostras, preencha os outros 3 poços com 22 μL de água livre de nuclease ou tampão de controle cada. - Para obter o volume final da mistura de reação (22 μL), adicione 2,2 μL de amostra de cDNA por poço contendo mastermix. Sele a placa com um selador de placa PCR descartável.
NOTA: Execute as adições de amostra na sala designada. Inclua os controles, ou seja, positivo, NTC e extração. Além disso, se as amostras de RNA forem de baixa concentração, reduza o volume de água no mastermix e aumente o volume da amostra de acordo com até 5,5 uL. - Uma vez que a mistura de reação é distribuída por poço, vórtice brevemente (15-30 s), e centrífuga (10-15 s) para coletar o conteúdo no fundo da placa. Prossiga para a geração de gotículas.
- Etapas comuns em todos os ensaios
- Geração automatizada de gotículas (Figura 1 Suplementar)
NOTA: Diferentes geradores de gotículas podem ser usados; no entanto, este estudo foi realizado com um gerador automático de gotículas (AutoDG). Para evitar a contaminação do amplicon, certifique-se de que o gerador de gotículas e os leitores tenham espaço dedicado em áreas separadas. Ao carregar consumíveis, recomenda-se iniciar o carregamento a partir da parte de trás do instrumento trabalhando em direção à frente para evitar mover as mãos sobre os consumíveis para evitar contaminação cruzada.- Obtenha todos os consumíveis necessários para configurar o AutoDG, incluindo óleo AutoDG para sondas, cartuchos DG32, ponteiras de pipeta, bloco de resfriamento, placa de amostra, placa de gotícula (nova placa ddPCR limpa) e uma lixeira.
- Na tela sensível ao toque AutoDG, toque em Configurar placa de amostra e selecione as colunas onde as amostras estão localizadas na placa de amostra e pressione OK.
NOTA: A tela ficará amarela indicando LOAD onde os consumíveis devem ser carregados. - Abra a porta AutoDG e carregue os consumíveis em seus respectivos lugares.
NOTA: Os respectivos locais onde os consumíveis devem ser carregados terão um indicador amarelo que mais tarde ficará verde se os consumíveis forem carregados. Isso é semelhante à tela sensível ao toque. - Carregue a placa de amostra e a placa geradora de gotículas.
NOTA: A placa geradora de gotículas deve ser colocada no bloco de resfriamento. Certifique-se de que o bloco de resfriamento é roxo (pronto para usar) e não rosa (deve ser mantido em um freezer até que a cor volte a ficar roxa). - Feche a porta AutoDG, verifique se a tela está verde (consumíveis carregados) e selecione/verifique se o tipo de óleo é Óleo para Sondas antes de pressionar Iniciar geração de gotículas.
- Aguarde as gotículas serem geradas. Abra a porta assim que a tela mostrar Droplets Ready e remova a placa que contém as gotículas.
- Sele a placa com um selo de folha perfurável usando um selador de placa ajustado para funcionar a 185 oC por 5 s. Prossiga para a amplificação por PCR.
NOTA: A amplificação por PCR deve ser iniciada dentro de 30 minutos após a geração de gotículas.
- Amplificação por PCR
- Insira a placa de gotícula selada em um termociclador de poço de 96 profundidades, ajuste o volume da amostra para 40 μL e a temperatura da tampa para 105 °C.
- A PCR amplifica as gotículas usando o programa: 95 °C por 10 min (ativação enzimática), 40 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s e 1 min de aneio/extensão a 57 °C, desativação enzimática a 98 °C por 10 min e etapa de manutenção a 4 °C indefinidamente. Após a PCR, leia as gotículas ou armazene a 4 °C por até 24 h.
NOTA: Use uma taxa de rampa de 2 °C /s em todas as etapas, pois as taxas de rampa podem diferir para cicladores térmicos diferentes. Segure a placa durante pelo menos 30 minutos a 4 °C para permitir a estabilização das gotículas antes de ler as gotículas.
- Leitura de gotículas
- Transfira a placa de 96 poços ciclada termicamente para um leitor de gotículas e, em um computador conectado ao leitor de gotículas, abra/inicie o software que a acompanha.
- No modo de configuração, selecione Novo e clique duas vezes em qualquer poço para abrir a caixa de diálogo Editor de Poços . Selecione os poços a serem lidos e escolha Experimento: ABS, Supermix: ddPCR Supermix para Sondas (sem dUTP), Alvo 1 Tipo: Ch1 Desconhecido, Alvo 2 Tipo: Ch2 Desconhecido.
Observação : negativo, em branco, NTC ou positivo pode ser selecionado no menu suspenso do tipo 1/2 de destino para as amostras de controle. - Atribua os nomes de destino ou de amostra com base no layout da chapa e selecione Aplicar. Quando terminar, selecione OK e salve o modelo criado. Clique em Executar e, quando solicitado, escolha a cor certa (FAM/HEX).
Observação : preparar o sistema antes de executar é recomendado antes da primeira execução do dia. Além disso, verifique se todas as luzes do leitor estão verdes e, se não, siga o aplicativo recomendado no status da dica de ferramenta. - Após a conclusão da aquisição de dados, remova a placa do leitor. Analise os dados conforme necessário.
NOTA: Como os resultados preliminares podem ser vistos na tela, a execução das amostras positivas nos primeiros poços pode ser usada para verificação de qualidade em tempo real.
4. Análise dos dados (Figuras Complementares 2 e 3)
- Verifique os dados de todos os poços para o número total de gotículas. Se a contagem de gotículas for de <10.000, descarte os resultados e repita o ensaio. Estabeleça um ponto de corte para aceitar resultados positivos e negativos. Por exemplo, uma contagem de gotículas de até 3 ou mais gotículas positivas pode ser considerada como o ponto de corte para resultados positivos.
NOTA: Os dados para todos os ensaios, incluindo ensaios simplex, duplex, triplex probe mix e quadruplex são gerados usando o software que o acompanha. No entanto, este software só é adequado para ensaios simplex e duplex. Para ensaios multiplex de alta ordem (>3 alvos), um software externo é necessário. - Ensaios Simplex e duplex
NOTA: O software externo também pode analisar dados simplex e duplex. No entanto, usar o software que acompanha é mais fácil para esses ensaios, portanto, usado neste artigo.- Clique duas vezes no arquivo .qlp a ser analisado para abri-lo e selecione Analisar.
- Use as ferramentas de limiar na Amplitude 1D e na Amplitude 2D para distinguir entre gotículas positivas e negativas para cada poço no canal correto. As amostras NTC e controle positivo podem ser usadas como orientação para a definição do limiar.
NOTA: Os resultados do FAM são vistos no canal 1 enquanto o HEX/VIC no canal 2. - Após a definição do limite, os resultados podem ser exportados como um arquivo .csv e posteriormente analisados no Excel ou gravados lendo diretamente na janela de resultados.
- Mistura de sonda triplex (Figura 2 Suplementar) e ensaios quadruplex (Figura 2 Suplementar)
NOTA: Antes de analisar a mistura de sonda triplex e o ensaio quadruplex faça o download do software externo. Consulte os requisitos mínimos do sistema antes de instalar.- Abra o arquivo .qlp clicando com o botão direito sobre ele e escolhendo Abrir com o software externo, ou abrindo o software externo e clicando na opção Procurar para localizar o arquivo .qlp em sua pasta, ou simplesmente arrastando o arquivo .qlp e soltando-o no software externo já aberto.
- Na guia editor de placas, selecione os poços a serem analisados no lado direito da guia.
- Para a mistura de sonda triplex, selecione Quantificação direta (DQ) como tipo de experimento, selecione Triplex de mistura de sonda como informações de ensaio e insira os nomes de destino de acordo e, em seguida, clique em Aplicar.
- Para quadruplex, selecione Quantificação Direta (DQ) como tipo de experimento, selecione Multiplex de Amplitude como informações de ensaio e insira os nomes de destino de acordo e, em seguida, clique em Aplicar.
- No lado esquerdo da guia Amplitude 2D, use as Ferramentas de Gráfico para atribuir cores específicas a diferentes clusters de destino seguindo as sugestões pop-up da janela Selecionar para Atribuir Cluster .
Observação : modo de cluster preferencial pode ser aplicado com base na preferência dos usuários. - Depois que as cores de destino forem atribuídas, os dados de quantificação poderão ser lidos na janela Dados do poço no canto inferior direito. Exporte dados para Excel/csv para análise adicional usando o ícone de barra tripla no canto superior direito da tabela de dados do poço.
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Representative Results
Em um estudo de prova de conceito, o desempenho analítico dos ensaios multiplex foi testado em amostras clínicas e de pesquisa19. O desempenho dos ensaios multiplex foi superior ao de um RT-PCR19. Como um baixo número de gotículas pode indicar um problema durante a geração de gotículas, neste artigo um ponto de corte de 10.000 gotículas por poço foi definido com base em dados empíricos.
Uma boa separação entre gotículas positivas e negativas com mínima interferência da chuva pode ajudar na análise dos dados. Assim, em um bom experimento, a otimização dos ensaios é fundamental19. Como visto nos resultados da análise do gradiente de temperatura na Figura 2D, altas temperaturas de anelamento (por exemplo, 65 °C) não puderam distinguir claramente gotículas positivas de gotículas negativas quando um ensaio duplex (N (FAM) e RPP30 (HEX)) foi executado. No entanto, com a diminuição da temperatura de anelo, a separação ótima entre gotículas positivas e negativas foi alcançada. A temperatura de 57 °C foi considerada ótima. Isso também pode ser observado em outrosensaios19.
Usando um sistema de detecção RT-ddPCR de duas cores (FAM/HEX), é possível detectar um (Figura 2A, B), dois (Figura 2C), três (Figura 3A) e quatro (Figura 3B) alvos SARS-CoV-2 em uma única amostra. Durante a análise dos dados, o software que acompanha a leitura de gotículas só pode analisar ensaios simplex e duplex, como mostra a Figura 2. Isso significa que, para ensaios multiplex de ordem superior (alvos >3), um software externo deve ser usado para análise dos dados, como mostrado nas Figuras 3, S2 e S3. É importante notar também que o software externo também pode ser usado para analisar dados simplex e duplex. Para dados simplex e duplex, a análise é bastante simples, pois os alvos são separados como gotículas positivas ou negativas em seus respectivos canais, como mostrado na Figura 2. Uma amostra de NTC pode ajudar na localização de gotículas negativas que, por sua vez, podem ajudar a definir limites para a análise de dados, como mostrado na Figura 2A. Para o ensaio duplex, a análise pode ser feita em canais individuais (Figura 2B i,ii) ou na Amplitude 2D (Figura 2B iii).
Para ensaios multiplex de ordem superior, a análise de dados não é simples e a atenção deve ser focada na atribuição de gotículas. Depois de instalar o software externo, selecione os poços a serem analisados, selecione o tipo de experimento apropriado e atribua clusters de destino com base no tipo de experimento, conforme mostrado nas Figuras S2 e S3. O pop da janela Selecionar para atribuir cluster orientará um sobre como atribuir clusters nos ensaios multiplex mais altos. Use as ferramentas do gráfico para atribuir até 8 clusters de gotículas para o ensaio de mistura de sonda triplex (Figura 3A) e até 16 clusters de gotículas para o ensaio baseado em amplitude quadruplex (Figura 3B).
Após a atribuição de clusters e limiares, os dados de quantificação para cada alvo na forma de cópias/μL podem ser lidos na janela de dados do poço no canto inferior direito do software externo. Esses dados podem ser usados para estimar o número de cópias de alvos na amostra inicial. Por exemplo, se 2,2 μL da amostra foi usado em um volume final de 22 μL, e o software registrou 30,5 cópias/μL para ORF1ab, havia 30,5 x 22 = 671 cópias de ORF1ab na mistura de PCR. A mistura continha 2,2 μL da amostra original, portanto, havia 671 cópias de ORF1ab na amostra inicial e 671/2,2 = 305 cópias/μL de ORF1ab na amostra original. Este método pode ser usado para estimar a concentração de cada alvo em todos os ensaios.
| Alvo | Sequência 5' a 3' | Corante(s) de sonda | Comprimento do produto (bp) | Ref | |
| ORF1ab | Encaminhar | MCCCGTGGGTT TTACACTTAA |
5'- FAM e BHQ1-3' 5'- HEX e BHQ1-3' |
119 | [16] |
| Inverter | ACGATTGTGCAT CAGCTGA |
||||
| Sondar | CCGTCTGCGGT ATGTGGAAAGG TTATGG |
||||
| N | Encaminhar | GGGGAACTTCTC CTGCTAGAAT |
5'- FAM e BHQ1-3' 5'- HEX e BHQ1-3' |
99 | [16] |
| Inverter | CAGACATTTTGC TCTCAAGCTG |
||||
| Sondar | TTGCTGCTGCT TGACAGATT |
||||
| RPP30 | Encaminhar | AGTGCATGCTTA TCTCTGACAG |
5'- HEX e BHQ1-3' | 87 | [8] |
| Inverter | GCAGGGCTATAG ACAAGTTCA |
||||
| Sondar | TTTCCTGTGAAG GCG ATTGACCGA |
||||
| RBD2 | Encaminhar | CTCAAGTGTCT GTGGATCACG |
5'- FAM e BHQ1-3' | 121 | [17] |
| Inverter | CCTGTGCCTGT TAAACCATTG |
||||
| Sondar | ACAGCATCAGT AGTGTCAGCAA TGTCTC |
||||
Tabela 1: Sequências do primer e da sonda usadas para desenvolver os diferentes ensaios SARS-CoV-2.
| Concentração final de primer-probe por ensaio em nMa | |||||
| Alvo | Cartilha/sonda | Simplexb | Duplexc | Sonda triplex mixd | Amplitude do Fourplexe |
| ORF1ab | ORF1ab F | 800 | |||
| ORF1ab R | 800 | ||||
| ORF1ab FAM | |||||
| ORF1ab HEXADECIMAL | 250 | ||||
| N | N F | 800 | 800 | 800 | |
| N R | 800 | 800 | 800 | ||
| N FAM | 250 | 125 | 250 | ||
| N HEXADECIMAL | 125 | ||||
| RPP30 | RPP30 F | 800 | 800 | 800 | 800 |
| RPP30 R | 800 | 800 | 800 | 800 | |
| RPP30 FAM | |||||
| RPP30 HEXADECIMAL | 250 | 250 | 250 | 125 | |
| RBD2 | RBD2 F | 800 | 800 | 800 | |
| RBD2 R | 800 | 800 | 800 | ||
| RBD2 FAM | 250 | 250 | 125 | ||
| RBD2 HEXADECIMAL | |||||
| a Em todos os ensaios, os alvos podem ser trocados com base na preferência dos usuários. Os alvos utilizados são para fins de demonstração deste experimento. | |||||
| b Apenas um alvo pode ser detectado por vez no ensaio simplex no canal FAM ou HEX. O RBD2 é usado para demonstrar os resultados do canal FAM enquanto o RPP30 é usado para o canal HEX. | |||||
| c Dois alvos podem ser detectados de cada vez no ensaio duplex no canal FAM e HEX. | |||||
| d Três alvos podem ser detectados usando ambos os canais, ou seja, o alvo 1 será detectado em FAM (concentração de sonda 1×), alvo dois em HEX (concentração de sonda de 1×) e alvo 3 em ambos os canais (uma mistura de concentratinas de sonda HEX 0,5× e 0,5× FAM para constituir o 1× final). | |||||
| e Dois alvos são detectados em cada canal (FAM e HEX) com concentração de sonda de 1× e O.5× em cada canal. | |||||
Tabela 2: Concentração final dos diferentes pares de primers e sondas por ensaio.
Figura 1: Processamento da amostra e fluxo de trabalho de PCR digital de gotículas. (A) O fluxo de trabalho de processamento de amostras inclui coleta e transporte de amostras para uma instalação BSL-2, inativação, extração e geração de cDNA. (B) O fluxo de trabalho de PCR digital de gotículas começa com a preparação do mastermix, carregando o mastermix em uma placa ddPCR e adicionando amostra(s), gerando gotículas, amplificando alvos dentro de gotículas por PCR e, finalmente, lendo as gotículas amplificadas usando um leitor de gotículas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados do ensaio Simplex e duplex, incluindo otimização da temperatura de recozimento . (A) Resultados do ensaio Simplex quando um único alvo (RBD2) foi marcado com FAM. (B) Resultados do ensaio Simplex quando um único alvo (RPP30) foi marcado como HEX. (C) Resultado do ensaio duplex de dois alvos em 1D e 2D (iii) Canais após N (i) ter sido marcado com FAM e RPP30 (ii) marcado com HEX. (D) Resultados do gradiente de temperatura de recozimento (65 °C a 55 °C) de um ensaio duplex marcado com ORF1ab (FAM) e RPP30 (HEX). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Resultados do ensaio multiplex baseado em mistura de sonda triplex e amplitude quádrupla. (A) Resultados do ensaio de mistura de sonda triplex quando três alvos foram marcados com as seguintes razões FAM:HEX; RBD2 (1:0), N (0,5:0,5) e RPP30 (0:1). (B) Resultados do ensaio baseado em amplitude quádrupla após quatro alvos serem marcados com as seguintes razões FAM:HEX; RBD2(0.5:0), N (1:0), RPP30 (0:0.5) e ORF1ab (0:1). 1 e 0,5 são concentrações de sonda 250 nM e 125 nM, respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura suplementar 1: Geração de gotículas utilizando gerador automatizado de gotículas. (A) Consumíveis necessários para configurar o AutoDG. (B) Na tela sensível ao toque AutoDG, toque em Configurar placa de amostra e selecione as colunas onde as amostras estão localizadas na placa de amostra e pressione OK. (C) Uma vez selecionada, a tela fica amarela indicando onde os consumíveis devem ser carregados. (D) Abra a porta AutoDG e carregue os consumíveis nos respectivos locais. Carregue consumíveis da parte de trás trabalhando em direção à frente. Certifique-se de que cada vez que um consumível é adicionado, a luz passa de amarela para verde nesse local. (E) Certifique-se de que o tipo de óleo utilizado é óleo para sondas. (F) Feche a porta AutoDG e certifique-se de que todos os reagentes estão configurados, verificando se o ecrã tátil AutoDG está verde. (G) Pressione START Droplet Generation para gerar gotículas. (H) Após a geração da gotícula, abra o AutoDG e remova a placa da gotícula. (I) Selar a placa de gotícula usando um selo térmico de folha perfurável. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 2: Etapas da análise dos resultados do ensaio multiplex ddPCR baseado em amplitude utilizando um software externo. (A) Instale o software externo em um computador. (B) Abra o arquivo .qlp clicando com o botão direito do mouse nele e escolhendo Abrir com o software externo instalado ou abrindo o software externo e clicando na opção Procurar para localizar o arquivo em sua pasta. Como alternativa, pode-se arrastar o arquivo .qlp e soltá-lo no software externo aberto para abri-lo. (C) Uma vez aberto, no lado direito da guia Editor de placas , escolha triplex de mistura de sonda no menu suspenso e atribua as informações de destino de acordo, e clique em Aplicar. (D) No lado esquerdo da guia Amplitude 2D, use as Ferramentas de Gráfico para atribuir cores específicas a diferentes alvos para detecção e quantificação. Uma vez que os alvos do cluster de gotículas são identificados, os resultados da quantificação podem ser vistos na janela Dados do poço na mesma guia de amplitude 2D. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura Suplementar 3: Etapas da análise dos resultados do ensaio ddPCR multiplex baseado em amplitude utilizando um software externo. (A) Instale o software externo em um computador. (B) Abra o arquivo .qlp clicando com o botão direito do mouse nele e escolhendo Abrir com o software externo instalado, ou abrindo o software externo e clicando na opção Procurar para localizar o arquivo em sua pasta. Como alternativa, pode-se arrastar o arquivo .qlp e soltá-lo no software externo já aberto para abri-lo. (C) Uma vez aberto, no lado direito da guia Editor de placas , escolha amplitude multiplex no menu suspenso e atribua as informações de destino de acordo, e clique em Aplicar. (D) No lado esquerdo da guia Amplitude 2D, use as Ferramentas de Gráfico para atribuir cores específicas a diferentes alvos para detecção e quantificação. Uma vez que os alvos do cluster de gotículas são identificados, os resultados da quantificação podem ser vistos na janela Dados do poço na mesma guia de amplitude 2D. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
Poucos recursos estão disponíveis sobre como desenvolver ensaios RT-ddPCR para detecção de SARS-CoV-2. Embora não sejam usadas neste artigo, amostras padrão com cópias conhecidas podem ser usadas para desenvolver e otimizar ensaios. Neste trabalho, no entanto, as amostras de SARS-CoV-2 cultivadas em pilhas Vero-E6 foram cravadas em um fundo do RNA genomic humano e usadas como amostras padrão para desenvolver os ensaios. Sequências adequadas de primers e sondas são essenciais no desenvolvimento de ensaios. Uma vez que a maioria dos trabalhos preliminares sobre SARS-CoV-2 RT-ddPCR usou o primer do CDC da China e sondas visando os genes ORF1ab e N, eles os encontraram aptos para serem incluídos neste trabalho 7,8,9,10,11. A especificidade analítica e a sensibilidade desses primers também foram comparadas por ddPCR no trabalho anterior7. Os primers RBD2 e a sonda13 foram desenvolvidos internamente e considerados adequados para RT-ddPCR. Uma vez que os ensaios podem ser usados para diferentes aplicações, incluindo diagnóstico, o gene humano específico da proteína ribonuclease P subunidade p30 (RPP30) foi incluído em todos os ensaios multiplex. Esses genes podem ser usados como controle endógeno humano para experimentos diagnósticos. No entanto, no caso de amostragem ambiental ou outras pesquisas que não precisam do gene de referência humano, pode-se alternar esse alvo com outro alvo do SARS-CoV-2.
Em todos os ensaios, é importante incluir controles para validar ensaios e dados experimentais. Esses controles podem incluir: NTC (água livre de nucleases como amostra) para ajudar na definição de limiares e localização de aglomerados de gotículas negativas; controle positivo (amostra com todos os alvos do SARS-CoV-2, incluindo o gene de referência humano) para avaliar a falha do reagente, a integridade do primer e da sonda e a detecção/localização substancial da transcrição reversa de alvos de gotículas positivos; e controles de extração (amostras humanas agrupadas de voluntários saudáveis ou ácido nucleico total extraído de uma célula humana cultivada não infecciosa) para detectar falha ou sucesso na etapa de extração.
A maioria dos sistemas ddPCR, incluindo o sistema QX200, tem uma faixa dinâmica estreita de 1 a 120.000 cópias/reação de 20 μL. Ao detectar amostras desconhecidas, a concentração-alvo na amostra inicial é muitas vezes desconhecida e isso pode representar desafios ao quantificar amostras altamente concentradas. Para superar isso, recomenda-se que, ao quantificar amostras suspeitas de conter grandes quantidades de moléculas-alvo (como cultura celular), se planeje reduzir a amostra inicial de acordo. No caso em que o número de cópia/genoma alvo é desconhecido, deve-se determinar a quantidade inicial ideal através de uma série de quatro dez vezes a diluição em série de cada amostra no intervalo digital esperado. Ao avaliar esses quatro pontos, garante-se que um dos pontos de dados esteja dentro da faixa digital ideal.
O uso de primer alto e baixa concentração de sonda é um perquisite da maioria dos experimentos de ddPCR simplex e duplex. Essa diferença de concentração aumenta a distância de separação da amplitude entre os agrupamentos de gotículas positivas e negativas, facilitando a análise dos dados. No entanto, ao desenvolver ensaios multiplex de ordem superior, mudanças nessas concentrações podem levar a mudanças na posição dos alvos positivos das gotículas, como mostrado nas Figuras 3 e 4. Como resultado, uma opção de otimização do ensaio além da temperatura de recozimento seria alterar a concentração do primer alvo ou da sonda para distinguir gotículas. Esse fenômeno já foi utilizado e explicado anteriormente14,15,16.
Apesar do desempenho do ensaio, este trabalho é um fluxo de trabalho RT-ddPCR em duas etapas. A etapa extra de transcrição reversa antes da ddPCR, dá espaço para a contaminação das amostras. No entanto, se forem utilizadas técnicas cuidadosas e adequadas de manipulação de amostras, isso não será um problema. Positivamente, o DNA é conhecido por ser mais estável que o RNA. A conversão de RNA em cDNA pode prolongar a vida de prateleira da amostra durante o armazenamento em comparação com o RNA. Um experimento RT-ddPCR de duas etapas também é mais barato do que um experimento RT-ddPCR de uma etapa.
Em comparação com o RT-qPCR, o RT-ddPCR é caro. Assim, considerações devem ser levadas em consideração ao realizar o RT-ddPCR. Por exemplo, durante o diagnóstico, pode-se usar RT-ddPCR no caso em que suas amostras têm alvos pouco abundantes. No entanto, existe a possibilidade de que os custos dos instrumentos e reagentes de dPCR caiam em breve, e a técnica seja adaptada em muitos laboratórios, como acontecia no passado com PCR e qPCR regulares. Por isso, é importante definir protocolos como este para usuários atuais e futuros da dPCR. Em conclusão, os ensaios desenvolvidos dão espaço para que os usuários em potencial variem os alvos com base em suas aplicações. A multiplexação garantirá que se possa detectar eficientemente muitos alvos dentro de uma única amostra em uma única reação. Até agora, este pode ser o primeiro protocolo que dá um detalhe completo sobre como usar o sistema AutoDG, incluindo o software externo na detecção do SARS-CoV-2. Mais trabalho na otimização do ensaio ainda precisa ser feito para alcançar uma melhor separação no ensaio quadruplex . O uso de padrões também ajudará a melhorar os ensaios desenvolvidos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos a revelar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi financiada pelo Megaprojeto de Controle de Doenças Infecciosas do Ministério da Saúde da China, número de concessão 2017ZX10302301-005 e Centro de Pesquisa Conjunta Sino-África, número de concessão SAJC201605.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 32-channel fully automatic nucleic acid extractor Purifier 32 | Genfine Biotech | FHT101-32 | Automated extractor for RNA |
| AutoDG Oil for Probes | BioRad | 12003017 | QX200 AutoDG consumable |
| ddPCR 96-Well Plates | BioRad | 12003185 | |
| ddPCR Supermix for Probes (No dUTP) | BioRad | 1863024 | Making ddPCR assay mastermix |
| DG32 AutoDG Cartridges | BioRad | 1864108 | QX200 AutoDG consumable |
| Electronic thermostatic water bath pot | Beijing Changfeng Instrument and Meter Company | XMTD-8000 | Heat inactivation of samples |
| FineMag Rapid Bead Virus DNA/RNA Extraction Kit | Genfine Biotech | FMY502T5 | Magnetic bead extraction of inactivated RNA samples |
| Pierceable Foil Heat Seals | BioRad | 1814040 | |
| Pipet Tips for the AutoDG | BioRad | 1864120 | QX200 AutoDG consumable |
| Pipet Tip Waste Bins for the AutoDG | BioRad | 1864125 | QX200 AutoDG consumable |
| PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) | TaKaRa | RR036A | cDNA generation |
| PX1 PCR Plate Sealer | BioRad | 1814000 | Seal the droplet plate from AutoDG |
| QuantaSoft 1.7 Software | BioRad | 10026368 | Data acquisition and analysis |
| QuantaSoft Analysis Pro 1.0 | BioRad | N/A | Data analysis |
| QX200 Automated Droplet Gererator (AutoDG) | BioRad | 1864101 | QX200 AutoDG consumable |
| QX200 Droplet Reader | BioRad | 1864003 | Droplet reading and data acquisition |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | Droplet target amplification (PCR) and cDNA generation |
References
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