Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

استخدام زراعة الأعضاء من نوع Trowell لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية للأسنان

Published: July 8, 2021 doi: 10.3791/62462
Automatic Translation
*1,2, *1
1Research Program in Developmental Biology, Institute of Biotechnology, University of Helsinki, 2Department of Oral and Maxillofacial diseases, Faculty of Medicine, University of Helsinki
* These authors contributed equally

Summary

تم استخدام طريقة زراعة الأعضاء من نوع Trowell لكشف شبكات الإشارات المعقدة التي تحكم نمو الأسنان ، ومؤخرا ، لدراسة التنظيم الذي ينطوي عليه الخلايا الجذعية لقاطعة الفأر التي تنمو باستمرار. تسهل النماذج الحيوانية الفلورية وطرق التصوير الحي التحليلات المتعمقة للخلايا الجذعية للأسنان وبيئتها المكروية المتخصصة.

Abstract

يعتمد نمو الأعضاء ووظيفتها وتجديدها على الخلايا الجذعية ، والتي تتواجد داخل مساحات تشريحية منفصلة تسمى منافذ الخلايا الجذعية. توفر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة. توجد الخلايا الجذعية الخاصة بالأنسجة الظهارية للقاطعة في الطرف القريب من السن في مكان يسمى حلقة عنق الرحم. أنها توفر تدفقا مستمرا للخلايا لموازنة التآكل المستمر لطرف السن ذاتي الشحذ. يظهر هنا بروتوكول مفصل لعزل وثقافة الطرف القريب من قاطعة الفأر التي تضم الخلايا الجذعية ومكانتها. هذا هو بروتوكول زراعة الأعضاء المعدل من نوع Trowell الذي يتيح زراعة قطع الأنسجة في المختبر (explants) ، بالإضافة إلى شرائح الأنسجة السميكة في واجهة السائل / الهواء على مرشح مدعوم بشبكة معدنية. يتيح بروتوكول زراعة الأعضاء الموصوف هنا التلاعب بالأنسجة غير الممكنة في الجسم الحي ، وعندما يقترن باستخدام مراسل (مراسلين) فلوري ، فإنه يوفر منصة لتحديد وتتبع مجموعات الخلايا المنفصلة في الأنسجة الحية بمرور الوقت ، بما في ذلك الخلايا الجذعية. يمكن اختبار الجزيئات التنظيمية المختلفة والمركبات الدوائية في هذا النظام لتأثيرها على الخلايا الجذعية ومنافذها. يوفر هذا في النهاية أداة قيمة لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية وصيانتها.

Introduction

تنمو قواطع الفأر باستمرار بسبب الحفاظ مدى الحياة على الخلايا الجذعية (SC) التي تدعم الإنتاج المستمر لمكونات الأسنان. وتشمل هذه SCs الظهارية ، التي تولد الأرومات المينائية المنتجة للمينا ، والخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) ، التي تولد الأرومات السنية المنتجة للعاج ، من بين خلايا أخرى1. تم تحديد SCs الظهارية في القواطع المتنامية باستمرار في البداية على أنها خلايا تحتفظ بالتسمية 2,3 ومنذ ذلك الحين ثبت أنها تعبر عن عدد من جينات الجذعية المعروفة ، بما في ذلك Sox24. تشترك هذه الخلايا في سمات مشتركة مع SCs الظهارية في الأعضاء الأخرى وتتواجد داخل مكانة SC تسمى حلقة عنق الرحم الموجودة على الجانب الشفوي من القاطعة. المكانة هي كيان ديناميكي يتكون من خلايا ومصفوفة خارج الخلية تتحكم في نشاط SC5. أظهرت دراسات تتبع النسب أن Sox2+ SCs الظهارية يمكنها تجديد المقصورة الظهارية بأكملها من السن وأنها ضرورية لتشكيل الأسنان المتتالية 6,7. يتم تجنيد MSCs ذات إمكانات إصلاح العاج أو التجدد إلى حد كبير من خارج العضو من خلال الأوعية الدموية والأعصاب8،9،10،11 ، وبالتالي ، توفير نموذج مناسب لدراسة التوظيف والهجرة والإسكان لسكان MSC.

إن دراسة SCs في الجسم الحي ليست ممكنة دائما ، لأن العديد من التلاعب الجيني و / أو الدوائي يمكن أن يؤثر على توازن الأعضاء و / أو يكون له عواقب مميتة. لذلك ، توفر زراعة الأعضاء أداة ممتازة لدراسة تنظيم SCs ومنافذها في المختبر. تم تطوير نظام زراعة الأعضاء الذي يستخدم شبكة معدنية في البداية بواسطة Trowell12 لدراسة تطور الأعضاء وتم تعديله بواسطة Saxen13 لدراسة الإشارات الاستقرائية في تطور الكلى. منذ ذلك الحين ، تم تطبيق هذه الطريقة في المختبر لزراعة كل أو جزء من العضو بنجاح في مجالات مختلفة. في مجال تطور الأسنان ، تم استخدام هذه الطريقة على نطاق واسع لدراسة التفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأسنان14 وتشكيل الأسنان المتتالية15. أظهر عمل مختبر Thesleff فائدة هذا النظام للتحليل الزمني لنمو الأسنان وتكوينها ، لتحليل تأثير الجزيئات المختلفة وعوامل النمو على نمو الأسنان ، وللتصوير الحي بفاصل زمني لتطور الأسنان16,17. في الآونة الأخيرة ، تم استخدام هذه الطريقة لدراسة تنظيم SCs القاطعة ومكانتها18،19 ، والتي تم وصفها بالتفصيل هنا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

يتضمن هذا البروتوكول استخدام الحيوانات وقد تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجان الأخلاقية المعنية باستخدام الحيوانات ورعايتها ومرفق الحيوانات في جامعة هلسنكي.

1. إعداد طبق ثقافة الجهاز

  1. تنفيذ جميع الإجراءات في غطاء التدفق الصفحي. نظف أسطح العمل بنسبة 70٪ من الإيثانول واستخدم أدوات وحلول الزجاج المعقم. تعقيم المقص والمعدات المعدنية الأخرى في معقم حبة زجاجية.
  2. قم بإعداد المرشحات المخزنة عادة في 70٪ من الإيثانول عن طريق غسلها ثلاث مرات في 1x PBS لإزالة الإيثانول (الشكل 1). قطع المرشحات إلى قطع مستطيلة (3 × 3-5 × 5 مم).
    ملاحظة: يمكن تخزين قطع الفلتر المغسولة لعدة أيام في 1x PBS عند 4 درجات مئوية.
  3. تحضير وسط الاستزراع (1: 1 DMEM: F12 مكمل ب 1٪ [v / v] 200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide في 0.85٪ NaCl ، 10٪ [v / v] FBS ، 150 ميكروغرام / مل حمض الأسكوربيك ، و 0.2٪ [v / v] البنسلين [10000 وحدة دولية / مل] والستربتومايسين [10000 ميكروغرام / مل]). يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
  4. ضع الشبكات المعدنية مقاس 30 مم (مع فتحات قطرها 1-2 مم تتيح تصوير الأنسجة) في طبق بتري 35 مم. أضف وسائط كافية للوصول إلى سطح الشبكة دون إنتاج فقاعات هواء. قم بتسخين طبق الاستزراع المحضر مسبقا عند 37 درجة مئوية حتى يتم عزل الأنسجة وجاهزة للثقافة (في حاضنة قياسية بها 5٪ CO2 و 90٪ -95٪ رطوبة).

2. تشريح القاطعة وعزل النهاية القريبة

  1. التضحية بالحيوانات باتباع بروتوكول رعاية الحيوان المعتمد.
  2. قطع رأس الماوس وتشريح الفك السفلي. للقيام بذلك ، قم أولا بإزالة الجلد لفضح الفك السفلي وقطع عضلات المفصل لفصله عن الفك العلوي وبقية الرأس.
  3. بمجرد عزل الفك السفلي ، قم بإزالة اللسان وأكبر قدر ممكن من الأنسجة الرخوة.
  4. جمع كل الفك السفلي والاحتفاظ بها في طبق بتري يحتوي على PBS على الجليد ، لأن هذا يعزز صلاحية الأنسجة.
  5. انقل أحد الفك السفلي إلى طبق بتري زجاجي واستخدم إبر تحت الجلد يمكن التخلص منها 20/26 جم لتشريح القاطعة تحت المجهر المجسم. تقسيم الفك السفلي في خط الوسط ، وقطع من خلال الارتفاق . نظف الأنسجة الرخوة والعضلية بعيدا عن سطح العظام للحصول على تصور أفضل.
    ملاحظة: طبق بتري الزجاجي ضروري ، لأن هذا لن يضعف الإبر.
  6. الفك السفلي الذي يتم الحصول عليه من الحيوانات التي تقل أعمارها عن 10 أيام أكثر ليونة وهشاشة ، لذلك ، استخدم إبر تحت الجلد 20/26 جم يمكن التخلص منها لفتح كل نصف من الفك السفلي طوليا لفضح السن القاطع. بالنسبة للفئران التي يزيد عمرها عن 10 أيام ، استخدم الملقط للإمساك بالفك السفلي وكسر العظم لكشف السن.
  7. افصل القاطعة برفق عن العظم المحيط واقطع الطرف القريب الذي يحتوي على حلقة عنق الرحم.
  8. قطع الطرف القريب وإزالة المينا المعدنية ومصفوفة العاج.
  9. احتفظ بالنهايات القريبة المجمعة في برنامج تلفزيوني دولبيكو على الجليد حتى تصبح جاهزة للاستزراع.

3. الثقافة

  1. ضع بعناية مستطيل مرشح على الجزء العلوي من الشبكة في طبق ثقافة تم تسخينه مسبقا.
  2. استخدم مجهرا مجسما لتوجيه قطع الأنسجة بشكل صحيح.
  3. ضعه في حاضنة قياسية عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 و 90٪ -95٪ رطوبة.
  4. قم بتغيير الوسيط كل يوم واستبدله بوسط جديد ، وتجنب بعناية تكوين فقاعات الهواء. راقب نمو الأنسجة وقم بالتصوير يوميا باستخدام كاميرا متصلة بالمجهر المجسم.

4. إضافة عوامل قابلة للذوبان في الثقافة

  1. استكمل وسط الاستزراع بعوامل قابلة للذوبان وجزيئات ذات أهمية لدراسة تأثيرها على تنظيم SCs.
    ملاحظة: يعتمد بروتوكول الإدارة لأي جزيء (عوامل النمو ، جزيئات الإشارات ، الأجسام المضادة المانعة ، المركبات الدوائية مثل المثبطات أو المنشطات ، النواقل ، إلخ) على عمر النصف والذوبان. تحدد هذه المعلمات أيضا عنصر التحكم المناسب الذي سيتم استخدامه.

5. التحليلات الجزيئية والنسيجية

  1. إزالة وسط الثقافة.
  2. أضف بعناية الميثانول المثلج البارد إلى الأنسجة لمنع الانفصال عن المرشحات.
  3. اترك الميثانول لمدة 5 دقائق.
  4. نقل المرشحات التي تحمل الأنسجة إلى أنابيب أخذ العينات.
  5. ثبت النباتات الخارجية في 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 10-24 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  6. المضي قدما في البروتوكولات المعمول بها للمعالجة النسيجية (البارافين ، المجمدة ، إلخ) أو البقع المناعية.

6. ثقافة شرائح الأنسجة

ملاحظة: هناك العديد من الاختلافات في هذا البروتوكول ، والتي تكون جميعها ناجحة بنفس القدر وهي مسألة اختيار شخصي ، اعتمادا على سرعة ومهارة المستخدم. تشير هذه إلى المخزن المؤقت المستخدم لجمع والحفاظ على صلاحية الأنسجة. لهذا الغرض ، يمكن استخدام Krebs buffer ، PBS المكمل ب 2٪ من الجلوكوز والمضادات الحيوية ، أو PBS. إذا تم استخدام المخزن المؤقت Krebs ، فيجب أن يتم ذلك قبل يوم واحد والاحتفاظ به عند 4 درجات مئوية.

  1. قبل التجربة ، قم بإعداد 4٪ -5٪ أغاروز منخفض نقطة انصهار عن طريق إذابة 2-2.5 جم من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار في 50 مل من الجلوكوز المغلي 2٪ / PBS ، وبعد ذلك يجب وضع المحلول في حمام مائي 45 درجة مئوية.
  2. قم بإعداد الاهتزاز ، واغسله بنسبة 70٪ من الإيثانول ، واملأه بجلوكوز 2٪ / PBS بارد مع المضادات الحيوية (100 وحدة / مل بنسلين ، 100 مجم / مل ستربتومايسين).
  3. قم بتشريح الأطراف القريبة من القاطعة واجمعها في الجلوكوز البارد 2٪ / PBS المكمل بالمضادات الحيوية.
  4. ضع نهاية واحدة قريبة من القاطعة في القالب الذي يحتوي على 4٪ -5٪ من الأغاروز منخفض نقطة الانصهار. تحت المجهر المجسم ، قم بتوجيه القطعة في الاتجاه المطلوب واتركها على الجليد حتى تصلب الأغاروز.
  5. تقليم كتلة agarose تصلب ووضعها في vibratome. قطع شرائح سميكة (150-300 ميكرومتر).
  6. اجمع الشرائح في طبق بتري يحتوي على جلوكوز مثلج 2٪ / PBS مكمل بالمضادات الحيوية.
  7. استخدم ملعقة لنقل الشرائح السميكة على مستطيل مرشح يوضع على الشبكة التي تم تسخينها مسبقا كما في القسم 1.3.
  8. احتضان الشرائح السميكة في الحاضنة والمضي قدما في التصوير (الشكل 2).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توجد SCs الظهارية في مكان يسمى حلقة عنق الرحم ، والذي يقع في الطرف القريب من القاطعة (الشكل 3 أ). حلقات عنق الرحم هي هياكل متميزة شكليا تتكون من ظهارة المينا الداخلية والخارجية التي تغلف الشبكة النجمية ، وهي نواة من الخلايا الظهارية المرتبة بشكل فضفاض (الشكل 3 ب ، ج). هناك حلقتان عنق الرحم في كل قاطعة (الشكل 3 أ) ، لكن حلقة عنق الرحم الشفوية فقط تحتوي على SCs. يتم توطين SCs الظهارية في الشبكة النجمية وظهارة المينا المجاورة عند طرف حلقة عنق الرحم20,21. إنها تولد ذرية تتميز بتعبير Sfrp5 ، والتي تتمايز إلى خلايا تضخيم عبور تكاثرية للغاية تنتج خلايا مختلفة ، بما في ذلك الأرومات المينائية التي تفرز المينا 2,7. يمكن تلخيص تمايز الأرومة المينائية عن SCs في نظام زراعة الأعضاء الموصوف هنا2.

في السنوات الأخيرة ، أصبحت الفئران المراسلة التي يكون فيها بروتين الفلورسنت (مثل GFP) تحت سيطرة عناصر تنظيمية جينية محددة أداة مستخدمة على نطاق واسع لتحديد وعزل الخلايا من الأنسجة المختلفة ومتابعة مصير الخلية وتطور النسب في الجسم الحي وفي المختبر22,23. يعد استخدام هذه النماذج الحيوانية مفيدا لتحليل تأثير الجزيئات التنظيمية المختلفة ، حيث يمكن استخدام كثافة ونمط تعبير المراسل الفلوري كقراءة لنشاط الجينات الداخلية ، أو كمراسل لحالة الانتشار (أي نموذج فأر مراسل Fucci).

يتيح نموذج فأر المراسل المعدل وراثيا Sox2-GFP24 ، حيث يكون تعبير GFP (EGFP) المحسن تحت سيطرة جزء 5.5 كيلو بايت من العنصر التنظيمي المنبع لمروج Sox2 ، تحديد وتصور الخلايا الجذعية الظهارية القاطعة المعبرة عن Sox2 (الشكل 4A-C). يمكن أن يكون توليد الفئران التي تحمل العديد من أجهزة الإبلاغ الفلورية مفيدا لتحديد أكثر من مجموعة خلية واحدة. على سبيل المثال ، في حلقات عنق الرحم من Sox2-GFP ؛ يمكن تحديد الخلايا الجذعية للحيوانات المعدلة وراثيا Fucci-mKO (GFP + ، الأخضر ، الشكل 4D) والخلايا غير التكاثرية (Fucci-mKO + ، الأحمر ، الشكل 4D). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن استخدام تعبير Sox2-GFP كمراسل عند تحليل تأثير الجزيئات المختلفة. تؤثر إضافة منشط إشارات Wnt / β-catenin BIO سلبا على الخلايا الجذعية المعبرة عن Sox2 وبالتالي تعبير GFP (الشكل 4E).

Figure 1
الشكل 1: تحضير غرفة الثقافة . (أ) اغسل الفلتر في 1x PBS. ب: قطع المرشح إلى قطع مستطيلة. (ج) تحضير الوسائط في الغطاء وسحبها عبر الشبكة. تجنب تشكيل فقاعة الهواء. (د) قم بتسخين طبق الاستزراع المحضر مسبقا عند 37 درجة مئوية قبل إضافة الأنسجة على مرشح موضوع على الشبكة. (ه) تمثيل كاريكاتوري لغرفة الثقافة. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 2
الشكل 2: زراعة شرائح الأنسجة. تم تشريح النهاية القريبة لقاطعة الفأر بعد الولادة لمدة يومين (2PN) وتقسيمها بواسطة الاهتزاز. تم استزراع شرائح (بسمك 150 ميكرومتر) ولوحظ تكوين الأنسجة الصلبة (الأسهم) بعد زراعة لمدة 6 أيام. مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 3
الشكل 3: حلقة عنق الرحم. (أ) النهاية القريبة من الحلقات العنقية التي تحتوي على القاطعة (المحددة بخط أسود متقطع) واللسانية (المحددة بخط رمادي متقطع). ب: المقطع النسيجي من حلقة عنق الرحم الشفوية، الذي يمثل مكانا مناسبا للخلايا الجذعية الطلائية. (ج) تمثيل كرتوني لحلقة عنق الرحم الشفوية ومكوناتها. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Figure 4
الشكل 4: استخدام نماذج فأر مراسل الفلورسنت في نظام زراعة الأعضاء . (أ) برايتفيلد، (ب) فلورسنت، (ج) صورة تراكب للنهاية القريبة من القاطعة معزولة من فئران Sox2-GFP بعد الولادة لمدة يومين. (د) تعبير Sox2-GFP وFucci-mKO في الطرف القريب من القاطعة المعزولة عن Sox2-GFP بعد الولادة لمدة يومين ؛ فئران فوتشي مكو. (ه) تأثير BIO على الخلايا الجذعية التي تعبر عن Sox2-GFP ومكانة الخلايا الجذعية (حلقة عنق الرحم ، محددة بخط أصفر متقطع). مقياس 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم استخدام زراعة الأعضاء في المختبر على نطاق واسع لدراسة الإمكانات الاستقرائية والتفاعلات الظهارية الوسيطة التي تحكم نمو الأعضاء والتشكل. أظهر مختبر Thesleff كيفية تكييف تعديل Saxén لثقافة الأعضاء من نوع Trowell واستخدامها لدراسة تطور الأسنان14. جعلت الظروف والتطورات القابلة للتكرار في مراسلي الفلورسنت هذه طريقة مفيدة لمراقبة تشكل الأسنان ومجموعات الخلايا المتميزة بداخلها. وصفت هذه الورقة كيفية تطبيق هذا البروتوكول لدراسة الخلايا الجذعية الظهارية والبيئة المكروية التي تعيش فيها.

تم وصف تقنية لعزل الطرف القريب من القاطعة التي تحتوي على مكانة SC من الجراء بعد الولادة ومن الحيوانات الأكبر سنا هنا. يعتمد نجاح هذه الطريقة على وقت العزل (الذي يؤثر بشكل مباشر على صلاحية الأنسجة) وعلى القدرة على عزل نهاية قريبة غير تالفة بحلقة عنق الرحم الشفوية السليمة. هذا يمثل تحديا خاصا في الحيوانات الأكبر سنا ذات العظام المعدنية. يوضح البروتوكول كيفية استخدام القوة الميكانيكية الخاضعة للرقابة لكسر العظم المعدني وعزل الأنسجة الرخوة السليمة تماما والقابلة للحياة في وقت أقصر بكثير مقارنة بالبروتوكولات المنشورة الأخرى25. بمجرد عزلها ، يمكن زراعة الأنسجة في المختبر ، إما ككل أو كشريحة سميكة. عيب طريقة تقطيع الأنسجة السميكة هو أن جزءا فقط من حلقة عنق الرحم موجود في كل شريحة. وبالتالي ، لا يمكن الحصول على جزء متطابق بشكل متكرر من حلقة عنق الرحم في أقسام مختلفة. توفر زراعة الأعضاء طريقة سهلة وقابلة للتكرار لدراسة الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم SCs ومكانتها بمرور الوقت. ومع ذلك ، هناك قيود على فترة الاستزراع الإجمالية ، ويرجع ذلك أساسا إلى الفقدان التدريجي لللحمة المتوسطة بعد 3-4 أيام الأولى من الثقافة.

يمكن أيضا معالجة الأنسجة المعزولة بشكل أكبر للحصول على تعليق خلية واحدة مخصب في SCs الظهارية القاطعة26. يتيح الفصل الأنزيمي لحلقة عنق الرحم عن بقية الطرف القريب واستخدام مراسلات فلورية محددة تحليلات أكثر تفصيلا للحمض النووي الريبوزي المرسال والبروتين (مثل qPCR ، تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية) ورؤية أكبر لمجموعات خلايا معينة داخل مكانة.

توفر الزراعة في المختبر منصة مناسبة لفحص مختلف التلاعبات الجينية والدوائية لتأثيرها التنظيمي على SCs الظهارية للأسنان ومنافذها. تجدر الإشارة إلى أن نجاح العلاجات الدوائية يعتمد على خصائص الجزيئات المختبرة ، مثل عمر النصف ، والذوبان ، والاستقرار الأيضي ، والجرعة ، وسمية الخلية. بالاقتران مع مراسل الفلورسنت ، يمكن تعيين التأثير التنظيمي لمجموعة خلايا معينة داخل الأنسجة ، وبالتالي توفير أداة قوية للكشف عن الآليات الجزيئية والخلوية التي تنظم SCs الظهارية للأسنان ومكانتها.

باستخدام فئران مراسلة فلورية محددة ، من الممكن تحديد ومتابعة مجموعات خلايا معينة داخل الأنسجة الحية بمرور الوقت. في الآونة الأخيرة ، ثبت أنه يمكن استخدام ثقافة الأعضاء في المختبر للتصوير الحي لنمو الأسنان16. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تصوير سلوك الخلية خلال فترة زمنية قصيرة باستخدام الثقافة المختبرية لشرائح الأنسجة السميكة7. كما هو موضح سابقا ، لا يمكن تصوير سوى جزء من مكانة SC وتكون مدة التصوير قصيرة. من الناحية المثالية ، يجب تصوير مكانة SC بأكملها. ومع ذلك ، فإن التصوير بفاصل زمني 4D لهذا الهيكل يمثل تحديا ، ويرجع ذلك أساسا إلى سمك مكانه وقيود طرق التصوير المتاحة حاليا. ومع ذلك ، فإن التقدم المستمر في تكنولوجيا التصوير يعد بمستقبل مثير في كشف السلوكيات الخلوية التي تشكل مكانة SC القاطعة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذه الدراسة من قبل مؤسسة جين وآتوس إركو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-mL plastic syringes
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles Terumo
DMEM Gibco 61965-026
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline Gibco 14287
Extra Fine Bonn Scissors F.S.T. 14084-08
F-12 Gibco 31765-027
FBS South American (CE) LifeTechn. 10270106 divide in aliquotes, store at -20°C
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer Simon Keller Ltd 4AJ-6285884
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) Gibco 35050-038
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter MerckMillipore VCTP02500 Store in 70% ethanol at room temperature.
L-Ascobic Acid Sigma A4544-25g diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C
Low melting agarose TopVision R0801
Metal grids Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes.
Micro forceps Medicon 07.60.03
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. Gibco 15140-148
Petri dishes, Soda-Lime glass DWK Life Sciences 9170442
Petridish 35 mm, with vent Duran 237554008
Petridish 90 mm, no vent classic Thermo Fisher 101RT/C
Small scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
  2. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  3. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  4. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  5. Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
  6. Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
  7. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  8. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  9. Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
  10. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  11. Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
  12. Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
  13. Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
  14. Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
  15. Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
  16. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  17. Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
  18. Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
  19. Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
  20. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  21. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
  22. Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
  23. Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
  24. D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
  25. Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
  26. Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).

Tags

علم الأحياء التنموي ، العدد 173 ، زراعة الأعضاء ، الأسنان ، قاطعة الفأر ، حلقة عنق الرحم ، الخلايا الجذعية الظهارية ، مكانة الخلايا الجذعية ، نماذج مراسل الفلورسنت
استخدام زراعة الأعضاء من نوع Trowell لدراسة تنظيم الخلايا الجذعية للأسنان
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Juuri, E., Balic, A. Use of… More

Juuri, E., Balic, A. Use of Trowell-Type Organ Culture to Study Regulation of Dental Stem Cells. J. Vis. Exp. (173), e62462, doi:10.3791/62462 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter