Summary
Trowell 형 장기 배양 방법은 치아 발달을 제어하는 복잡한 신호 네트워크를 밝히고 최근에는 지속적으로 성장하는 마우스 앞니의 줄기 세포와 관련된 조절을 연구하는 데 사용되었습니다. 형광 리포터 동물 모델과 라이브 이미징 방법은 치과 줄기 세포와 특정 틈새 미세 환경에 대한 심층 분석을 용이하게합니다.
Abstract
장기 발달, 기능 및 재생은 줄기 세포 틈새라고하는 별개의 해부학 적 공간 내에있는 줄기 세포에 의존합니다. 지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 조직 특이적 줄기 세포를 연구하기 위한 우수한 모델을 제공합니다. 앞니의 상피 조직 특이 적 줄기 세포는 자궁 경부 루프라고하는 틈새에서 치아의 근위 끝에 있습니다. 그들은 치아의 자체 날카롭게하는 팁의 지속적인 마모를 상쇄하기 위해 세포의 지속적인 유입을 제공합니다. 여기에 제시된 것은 줄기 세포와 그 틈새를 수용하는 마우스 앞니의 근위 말단의 분리 및 배양에 대한 자세한 프로토콜입니다. 이것은 금속 격자로 지지되는 필터의 액체/공기 계면에 있는 두꺼운 조직 조각뿐만 아니라 조직 조각(체외이식편)의 체외 배양을 가능하게 하는 수정된 Trowell 유형 장기 배양 프로토콜입니다. 여기에 설명된 장기 배양 프로토콜은 생체 내에서 불가능한 조직 조작을 가능하게 하며, 형광 리포터의 사용과 결합하면 줄기 세포를 포함하여 시간이 지남에 따라 살아있는 조직에서 개별 세포 집단을 식별하고 추적할 수 있는 플랫폼을 제공합니다. 다양한 조절 분자 및 약리학 적 화합물이이 시스템에서 줄기 세포 및 그 틈새에 미치는 영향을 테스트 할 수 있습니다. 이것은 궁극적으로 줄기 세포 조절 및 유지를 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다.
Introduction
마우스 앞니는 치아 구성 요소의 끊임없는 생산을 지원하는 줄기 세포 (SC)의 평생 보존으로 인해 지속적으로 성장합니다. 여기에는 법랑질 생성 흑색 모세포를 생성하는 상피 SC와 다른 세포중에서 상아질 생성 치모 세포를 생성하는 중간엽 줄기 세포(MSC)가 포함됩니다1. 지속적으로 성장하는 앞니의 상피 SC는 처음에는 표지 유지 세포 2,3으로 확인되었으며 이후 Sox24를 포함한 여러 잘 알려진 줄기 유전자를 발현하는 것으로 나타났습니다. 이 세포는 다른 기관의 상피 SC와 공통된 특징을 공유하며 앞니의 순음쪽에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 SC 틈새 내에 있습니다. 틈새는 SC 활성을 조절하는 세포와 세포외 기질로 구성된 동적 실체입니다5. 계통 추적 연구에 따르면 Sox2+ 상피 SC는 치아의 전체 상피 구획을 재생할 수 있으며 연속적인치아 형성에 중요합니다6,7. 상아질 회복 또는 재생 잠재력을 가진 MSC는 혈관 및 신경 8,9,10,11을 통해 기관 외부에서 주로 모집되므로 MSC 인구의 모집, 이동 및 주거를 연구하는 데 적합한 모델을 제공합니다.
생체 내에서 SC를 연구하는 것은 많은 유전 적 및 / 또는 약리학 적 조작이 장기 항상성에 영향을 미치거나 치명적인 결과를 초래할 수 있기 때문에 항상 가능한 것은 아닙니다. 따라서 장기 배양은 SC의 조절과 그 틈새를 시험관 내에서 연구하는 훌륭한 도구를 제공합니다. 금속 격자를 사용하는 장기 배양 시스템은 처음에 장기 발달을 연구하기 위해 Trowell12에 의해 개발되었으며 신장 발달에서 유도 신호를 연구하기 위해 Saxen13에 의해 추가로 수정되었습니다. 그 이후로, 장기의 전체 또는 일부를 배양하는이 시험관 내 방법은 다른 분야에서 성공적으로 적용되었습니다. 치아 발달 분야에서이 방법은 치아 발달14 및 연속 치아 형성15을 제어하는 상피-중간 엽 상호 작용을 연구하는 데 널리 사용되었습니다. Thesleff 실험실의 연구는 치아 성장 및 형태 형성의 시간적 분석, 치아 성장에 대한 다양한 분자 및 성장 인자의 영향 분석, 치아 발달의 시간 경과 라이브 이미징을 위해이 시스템의 유용성을 입증했습니다16,17. 보다 최근에이 방법은 앞니 SC 및 그 틈새18,19의 조절을 연구하는 데 활용되었으며, 이는 여기에 자세히 설명되어 있습니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
이 프로토콜은 동물의 사용을 포함하며 모든 절차는 헬싱키 대학의 동물 사용 및 관리에 관한 윤리위원회 및 동물 시설의 승인을 받았습니다.
1. 장기 배양 접시의 준비
- 층류 후드에서 모든 절차를 수행하십시오. 70 % 에탄올로 작업 표면을 청소하고 고압 멸균 유리기구와 용액을 사용하십시오. 유리 구슬 살균기에서 가위 및 기타 금속 장비를 소독하십시오.
- 일반적으로 70% 에탄올에 보관된 필터를 1x PBS로 3회 세척하여 에탄올을 제거하여 준비합니다(그림 1). 필터를 직사각형 조각 (3 x 3-5 x 5 mm)으로 자릅니다.
알림: 세척된 필터 조각은 4°C에서 1x PBS에 며칠 동안 보관할 수 있습니다. - 배양 배지를 준비합니다(0.85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150μg/mL 아스코르브산, 0.2%[v/v] 페니실린[10,000 I.U./mL] 및 스트렙토마이신[10,000 μg/mL]에 1% [v/v] 200mM L-알라닐-L-글루타민 디펩타이드가 보충된 1:1 DMEM:F12). 4 °C에서 보관하십시오.
- 30mm 금속 격자(조직 이미징을 가능하게 하는 직경 1-2mm 구멍 포함)를 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 기포가 생성되지 않고 그리드 표면에 도달하기에 충분한 용지를 추가합니다. 조직이 분리되고 배양 준비가 될 때까지 준비된 배양 접시를 37 ° C에서 예열합니다 (5 % CO2 및 90 % -95 % 습도의 표준 인큐베이터에서).
2. 앞니 박리 및 근위부의 분리
- 승인된 동물 관리 프로토콜에 따라 동물을 희생하십시오.
- 마우스를 참수하고 하악을 해부하십시오. 이렇게하려면 먼저 피부를 제거하여 하악을 노출시키고 교근을 절단하여 상악과 나머지 머리에서 분리하십시오.
- 하악골이 분리되면 혀와 가능한 한 많은 연조직을 제거하십시오.
- 모든 하악골을 모아서 얼음 위에 PBS가 들어있는 페트리 접시에 보관하면 조직의 생존력이 향상됩니다.
- 하악골 하나를 유리 페트리 접시에 옮기고 일회용 20/26G 피하 주사 바늘을 사용하여 실체 현미경으로 절치를 해부합니다. 정중선에서 하악골을 갈라 symphysis를 절단합니다. 더 나은 시각화를 위해 뼈 표면에서 연조직과 근육 조직을 청소하십시오.
알림: 유리 페트리 접시는 바늘을 무디게하지 않으므로 필수적입니다. - 10 일 미만의 동물에서 얻은 하악골은 부드럽고 깨지기 쉽기 때문에 일회용 20/26G 피하 주사 바늘을 사용하여 하악의 각 절반을 세로로 열어 앞니를 노출시킵니다. 10 일 이상 된 마우스의 경우 핀셋을 사용하여 하악을 잡고 뼈를 부러 뜨려 치아를 노출시킵니다.
- 주변 뼈에서 절치를 부드럽게 분리하고 자궁 경부 루프가있는 근위 끝을 잘라냅니다.
- 근위 끝을 자르고 광물화 된 법랑질과 상아질 매트릭스를 제거하십시오.
- 배양 준비가 될 때까지 Dulbecco의 PBS에서 수집 된 근위 끝을 얼음 위에 보관하십시오.
3. 문화
- 예열 된 배양 접시의 그리드 상단에 필터 사각형을 조심스럽게 놓습니다.
- 실체 현미경을 사용하여 조직 조각의 방향을 올바르게 지정합니다.
- 5 % CO2 및 90 % -95 % 습도의 37 ° C에서 표준 인큐베이터에 넣습니다.
- 격일로 매체를 교체하고 기포 형성을 조심스럽게 피하면서 신선한 매체로 교체하십시오. 조직 성장을 모니터링하고 실체 현미경에 부착된 카메라를 사용하여 매일 사진을 찍습니다.
4. 문화에 용해성 요소 추가
- SC 조절에 미치는 영향을 연구하기 위해 가용성 인자와 관심 분자로 배양 배지를 보충합니다.
참고: 모든 분자(성장 인자, 신호 전달 분자, 차단 항체, 억제제 또는 활성제와 같은 약리학적 화합물, 벡터 등)에 대한 투여 프로토콜은 반감기와 용해도에 따라 다릅니다. 이러한 매개 변수는 사용할 적절한 컨트롤도 결정합니다.
5. 분자 및 조직학적 분석
- 배양 배지를 제거합니다.
- 필터에서 분리되지 않도록 얼음처럼 차가운 메탄올을 조직에 조심스럽게 첨가하십시오.
- 메탄올을 5 분 동안 그대로 두십시오.
- 조직 외식편을 운반하는 필터를 샘플링 튜브로 옮깁니다.
- 체외이식편을 PBS 중 4% 파라포름알데히드로 4°C에서 10-24시간 동안 고정합니다.
- 조직 학적 처리 (파라핀, 냉동 등) 또는 면역 염색을위한 확립 된 프로토콜을 진행하십시오.
6. 조직 조각의 배양
참고: 이 프로토콜에는 몇 가지 변형이 있으며, 모두 똑같이 성공적이며 사용자의 속도와 기술에 따라 개인적인 선택의 문제입니다. 이들은 조직 생존력을 수집하고 유지하는 데 사용되는 완충액을 나타냅니다. 이를 위해, 크렙스 완충액, 2% 글루코스 및 항생제가 보충된 PBS, 또는 PBS가 사용될 수 있다. Krebs 완충액을 사용하는 경우 1 일 전에 만들어 4 ° C에서 보관해야합니다.
- 실험 전에 끓는 2% 포도당/PBS 50mL에 저융점 아가로스 2-2.5g을 용해시켜 4%-5% 저융점 아가로스를 준비한 후 용액을 45°C 수조에 넣어야 합니다.
- 비브라톰을 설치하고 70% 에탄올로 씻은 다음 항생제(100U/mL 페니실린, 100mg/mL 스트렙토마이신)가 보충된 얼음처럼 차가운 2% 포도당/PBS로 채웁니다.
- 앞니의 근위 끝을 해부하고 항생제가 보충 된 얼음처럼 차가운 2 % 포도당 / PBS에 모으십시오.
- 4%-5% 저융점 아가로스가 포함된 금형에 앞니의 한쪽 근위 끝을 놓습니다. 실체 현미경으로 조각을 원하는 방향으로 향하게하고 아가 로스가 굳을 수 있도록 얼음 위에 두십시오.
- 경화 된 아가 로스 블록을 다듬어 비브라 톰에 넣으십시오. 두꺼운 조각 (150-300 μm)을 자릅니다.
- 항생제가 보충 된 얼음처럼 차가운 2 % 포도당 / PBS가 들어있는 페트리 접시에 조각을 모으십시오.
- 주걱을 사용하여 섹션 1.3과 같이 준비된 예열 된 그리드에 배치 된 필터 사각형에 두꺼운 슬라이스를 전송합니다.
- 인큐베이터에서 두꺼운 조각을 배양하고 이미징을 진행합니다 (그림 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
상피 SC는 절치의 근위 끝에 위치한 자궁 경부 루프라고하는 틈새에 있습니다 (그림 3A). 자궁 경부 루프는 느슨하게 배열 된 상피 세포의 핵심 인 별 모양의 세망을 감싸는 내부 및 외부 법랑질 상피로 구성된 형태 학적으로 구별되는 구조입니다 (그림 3B, C). 각 절치에는 두 개의 자궁 경부 루프가 있지만 (그림 3A) 순순 자궁 경부 루프 만 SC를 포함합니다. 상피 SC는 성상 세망과 자궁 경부 루프(20,21)의 끝에있는 인접한 법랑질 상피에 국한된다. 이들은 Sfrp5 발현을 특징으로 하는 자손을 생성하며, 이는 에나멜 분비 아멜로모세포 2,7을 포함한 다양한 세포를 생성하는 고도로 증식성 전이 증폭 세포로 분화합니다. SCs로부터의 아멜로모세포 분화는 여기2에 설명된 장기 배양 시스템에서 요약될 수 있다.
최근 몇 년 동안, 형광 단백질(GFP와 같은)이 특정 유전자 조절 요소의 제어 하에 있는 리포터 마우스는 다양한 조직에서 세포를 식별 및 분리하고 생체 내 및 시험관 내에서 세포 운명 및 계통 진행을 추적하기 위해 널리 사용되는 도구가 되었습니다 22,23. 이러한 동물 모델의 사용은 형광 리포터 발현의 강도 및 패턴이 내인성 유전자 활성의 판독 또는 증식 상태의 리포터(즉, Fucci 리포터 마우스 모델)로서 사용될 수 있기 때문에 다양한 조절 분자의 효과를 분석하는 데 유리하다.
향상된 GFP(EGFP) 발현이 Sox2 프로모터의 상류 조절 요소의 5.5kb 단편의 제어 하에 있는 Sox2-GFP 형질전환 리포터 마우스 모델24는 Sox2 발현 앞니 상피 줄기 세포의 식별 및 시각화를 가능하게 합니다(그림 4A-C). 여러 형광 리포터를 운반하는 마우스의 생성은 하나 이상의 세포 집단의 확인에 유용할 수 있습니다. 예를 들어, Sox2-GFP의 자궁 경부 루프에서; Fucci-mKO 형질전환 동물 줄기세포(GFP+, 녹색, 그림 4D)와 비증식성 세포(Fucci-mKO+, 빨간색, 그림 4D)를 확인할 수 있습니다. 또한, Sox2-GFP 발현은 다양한 분자의 효과를 분석할 때 리포터로 사용될 수 있다. Wnt/β-카테닌 신호 전달제 BIO를 첨가하면 Sox2 발현 줄기세포와 결과적으로 GFP 발현에 부정적인 영향을 미칩니다(그림 4E).
그림 1: 배양 챔버의 준비 . (A) 필터를 1x PBS로 세척한다. (B) 필터를 직사각형 조각으로 자릅니다. (C) 후드에 미디어를 준비하고 그리드를 통해 배관합니다. 기포 형성을 피하십시오. (d) 그리드 상에 놓인 필터 상에 조직 체외이식편을 추가하기 전에 미리 준비된 배양 접시를 37°C에서 예열한다. (E) 문화실의 만화 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 조직 조각 배양. 출생 후 2일(2PN) 마우스 앞니의 근위 끝을 해부하고 비브라톰으로 절편했습니다. 절편(두께 150μm)을 배양하고 6일 배양 후 경조직 형성(화살표)을 관찰하였다. 스케일 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 경 추 루프. (A) 절치 포함 순순(검은색 점선으로 윤곽선으로 윤곽선) 및 설측(회색 점선으로 윤곽선으로 윤곽선) 경추 루프의 근위 끝. (B) 상피 줄기 세포의 틈새를 나타내는 순순 자궁 경부 루프의 조직 학적 부분. (C) 순음 자궁 경부 루프와 그 구성 요소의 만화 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 장기 배양 시스템에서 형광 리포터 마우스 모델 사용 . (A) 명시야, (B) 형광등, (C) 출생 후 2일 Sox2-GFP 마우스에서 분리된 앞니의 근위부 말단의 오버레이 이미지. (d) 출생 후 2일째 Sox2-GFP로부터 단리된 앞니의 근위 말단에서의 Sox2-GFP 및 Fucci-mKO 발현; 푸치-mKO 마우스. (E) Sox2-GFP를 발현하는 줄기 세포 및 줄기 세포 틈새 (자궁 경부 루프, 노란색 점선으로 윤곽선). 스케일 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
체외 장기 배양은 장기 성장 및 형태 형성을 제어하는 유도 잠재력 및 상피-중간엽 상호 작용을 연구하는 데 광범위하게 사용되었습니다. Thesleff 실험실은 Trowell 유형 장기 배양의 Saxén 변형을 적용하고 치아 발달을 연구하는 데 사용하는 방법을 보여주었습니다14. 형광 리포터의 재현 가능한 조건과 발전으로 인해 치아 형태 형성과 그 안의 뚜렷한 세포 집단을 모니터링하는 데 유용한 방법이 되었습니다. 이 논문은이 프로토콜을 적용하여 상피 줄기 세포와 그들이 거주하는 미세 환경을 연구하는 방법을 설명했습니다.
출생 후 새끼와 나이든 동물로부터 SC 틈새를 포함하는 앞니의 근위 끝을 분리하는 기술이 여기에 설명되어 있습니다. 이 방법의 성공 여부는 격리 시간 (조직 생존력에 직접적인 영향을 미침)과 손상되지 않은 음순 자궁 경부 루프로 손상되지 않은 근위 끝을 분리하는 능력에 달려 있습니다. 이것은 광물 화 된 뼈가있는 나이든 동물에서 특히 어렵습니다. 프로토콜은 제어된 기계적 힘을 사용하여 광물화된 뼈를 파괴하고 다른 공개된 프로토콜과 비교할 때 상당히 짧은 시간에 완전히 손상되지 않고 생존 가능한 연조직을 분리하는 방법을 보여줍니다(25). 일단 분리되면, 조직은 전체적으로 또는 두꺼운 조각으로 시험 관 내에서 배양 될 수 있습니다. 두꺼운 조직 슬라이스 방법의 단점은 각 슬라이스에 자궁 경부 루프의 일부만 존재한다는 것입니다. 따라서 다른 섹션에서 자궁 경부 루프의 재현 가능하게 동일한 부분을 얻는 것은 불가능합니다. 장기 배양은 시간이 지남에 따라 SC와 그 틈새를 조절하는 분자 및 세포 메커니즘을 연구하는 쉽고 재현 가능한 방법을 제공합니다. 그러나 전체 배양 기간에는 주로 배양 초기 3-4일 후에 중간엽이 점진적으로 손실되기 때문에 한계가 있습니다.
단리된 조직은 또한 추가로 처리되어 절치 상피 SCs26에 풍부한 단일 세포 현탁액을 수득할 수 있다. 자궁 경부 루프를 근위 말단의 나머지 부분과 효소 적으로 분리하고 특정 형광 리포터를 사용하면 더 자세한 mRNA 및 단백질 분석 (예 : qPCR, 단일 세포 RNA 시퀀싱)과 틈새 내의 특정 세포 집단에 대한 더 큰 통찰력을 얻을 수 있습니다.
시험관 내 배양은 치아 상피 SC 및 그 틈새에 대한 조절 효과에 대한 다양한 유전 및 약리학적 조작을 스크리닝하기 위한 적합한 플랫폼을 제공합니다. 약리학 적 치료의 성공 여부는 반감기, 용해도, 대사 안정성, 투여 량 및 세포 독성과 같은 시험 된 분자의 특성에 달려 있음에 유의해야합니다. 형광 리포터와 함께 조절 효과를 조직 내의 특정 세포 집단에 할당할 수 있으므로 치아 상피 SC와 그 틈새를 조절하는 분자 및 세포 메커니즘을 밝힐 수 있는 강력한 도구를 제공합니다.
특정 형광 리포터 마우스를 사용하면 시간이 지남에 따라 살아있는 조직 내에서 특정 세포 집단을 식별하고 추적 할 수 있습니다. 최근에, 시험관내 장기 배양이 치아 발달의 라이브 이미징에 사용될 수 있음이 입증되었다16. 또한, 세포 거동은 두꺼운 조직 절편의 시험관내 배양을 사용하여 단기간에 걸쳐 이미지화될 수 있다(7). 앞서 지적한 바와 같이, SC 틈새의 일부만 이미징될 수 있고, 이미징 지속 시간은 짧다. 이상적으로는 전체 SC 틈새 시장을 이미지화해야 합니다. 그러나 이 구조의 4D 타임랩스 이미징은 주로 틈새 시장의 두께와 현재 사용 가능한 이미징 방법의 한계로 인해 어렵습니다. 그럼에도 불구하고 이미징 기술의 지속적인 발전은 앞니 SC 틈새 시장을 구성하는 세포 행동을 밝히는 흥미 진진한 미래를 약속합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 Jane and Aatos Erkko Foundation의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
