Summary
Die Trowell-Typ-Organkulturmethode wurde verwendet, um komplexe Signalnetzwerke zu entschlüsseln, die die Zahnentwicklung steuern, und in jüngerer Zeit zur Untersuchung der Regulation von Stammzellen des kontinuierlich wachsenden Mausschneidezahns. Fluoreszenzreporter-Tiermodelle und Live-Imaging-Verfahren ermöglichen eingehende Analysen von dentalen Stammzellen und ihrer spezifischen Nischenmikroumgebung.
Abstract
Organentwicklung, -funktion und -regeneration hängen von Stammzellen ab, die sich in diskreten anatomischen Räumen befinden, die als Stammzellnischen bezeichnet werden. Der kontinuierlich wachsende Mausschneidezahn bietet ein hervorragendes Modell, um gewebespezifische Stammzellen zu untersuchen. Die epithelgewebespezifischen Stammzellen des Schneidezahns befinden sich am proximalen Ende des Zahnes in einer Nische, der sogenannten Zervixschleife. Sie sorgen für einen kontinuierlichen Zellzustrom, um den ständigen Abrieb der selbstschärfenden Zahnspitze auszugleichen. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die Isolierung und Kultur des proximalen Endes des Mausschneidezahns vorgestellt, in dem sich Stammzellen und ihre Nische befinden. Dies ist ein modifiziertes Organkulturprotokoll vom Typ Trowell, das die In-vitro-Kultur von Gewebestücken (Explantaten) sowie der dicken Gewebescheiben an der Flüssig-Luft-Grenzfläche auf einem Filter ermöglicht, der von einem Metallgitter unterstützt wird. Das hier beschriebene Organkulturprotokoll ermöglicht Gewebemanipulationen, die in vivo nicht durchführbar sind, und in Kombination mit der Verwendung eines fluoreszierenden Reporters bietet es eine Plattform für die Identifizierung und Verfolgung diskreter Zellpopulationen in lebenden Geweben im Laufe der Zeit , einschließlich Stammzellen. Verschiedene regulatorische Moleküle und pharmakologische Verbindungen können in diesem System auf ihre Wirkung auf Stammzellen und deren Nischen getestet werden. Dies ist letztendlich ein wertvolles Werkzeug, um die Regulation und Aufrechterhaltung von Stammzellen zu untersuchen.
Introduction
Mausschneidezähne wachsen kontinuierlich aufgrund der lebenslangen Erhaltung der Stammzellen (SC), die die unaufhörliche Produktion von Zahnkomponenten unterstützen. Dazu gehören epitheliale SCs, die unter anderem schmelzproduzierende Ameloblasten erzeugen, und mesenchymale Stammzellen (MSCs), die Dentin produzierende Odontoblasten erzeugen1. Die epithelialen SCs in den kontinuierlich wachsenden Schneidezähnen wurden zunächst als markierungserhaltende Zellen2,3 identifiziert und es wurde seitdem gezeigt, dass sie eine Reihe bekannter Stammnessgene, einschließlich Sox24, exprimieren. Diese Zellen teilen gemeinsame Merkmale mit epithelialen SCs in anderen Organen und befinden sich in der SC-Nische, die als zervikale Schleife auf der labialen Seite des Schneidezahns bezeichnet wird. Die Nische ist eine dynamische Einheit, die aus Zellen und extrazellulärer Matrix besteht, die die SC-Aktivitätsteuern 5. Studien zur Linienverfolgung haben gezeigt, dass Sox2+ epitheliale SCs das gesamte Epithelkompartiment des Zahnes regenerieren können und dass sie für die Sukzessionszahnbildung entscheidend sind 6,7. MSCs mit reparativem oder regenerativem Dentinpotenzial werden größtenteils von außerhalb des Organs über Blutgefäße und Nerven 8,9,10,11 rekrutiert und bieten daher ein geeignetes Modell zur Untersuchung der Rekrutierung, Migration und Unterbringung der MSC-Population.
Die Untersuchung von SCs in vivo ist nicht immer möglich, da viele der genetischen und/oder pharmakologischen Manipulationen die Organhomöostase beeinträchtigen und/oder tödliche Folgen haben können. Daher bietet die Organkultur ein hervorragendes Werkzeug, um die Regulation von SCs und ihren Nischen in vitro zu untersuchen. Das Organkultursystem, das ein Metallgitter verwendet, wurde ursprünglich von Trowell12 entwickelt, um die Organentwicklung zu untersuchen, und wurde von Saxen13 weiter modifiziert, um induktive Signale in der Nierenentwicklung zu untersuchen. Seitdem wird diese In-vitro-Methode zur Kultivierung des gesamten oder eines Teils des Organs in verschiedenen Bereichen erfolgreich angewendet. Im Bereich der Zahnentwicklung wurde diese Methode häufig verwendet, um die epithelial-mesenchymalen Wechselwirkungen zu untersuchen, die die Zahnentwicklung14 und die Sukzessionszahnbildung15 steuern. Die Arbeit des Thesleff-Labors hat den Nutzen dieses Systems für die zeitliche Analyse des Zahnwachstums und der Morphogenese, für die Analyse der Wirkung verschiedener Moleküle und Wachstumsfaktoren auf das Zahnwachstum und für die Zeitraffer-Live-Bildgebung der Zahnentwicklung gezeigt16,17. In jüngerer Zeit wurde diese Methode verwendet, um die Regulation von Schneidezahn-SCs und ihrer Nische18,19 zu untersuchen, die hier ausführlich beschrieben wird.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieses Protokoll beinhaltet die Verwendung von Tieren und alle Verfahren wurden von den Ethikkommissionen für die Verwendung und Pflege von Tieren und der Tiereinrichtung der Universität Helsinki genehmigt.
1. Zubereitung der Organkulturschale
- Führen Sie alle Verfahren in einer Laminar-Flow-Haube durch. Reinigen Sie Arbeitsflächen mit 70% Ethanol und verwenden Sie Instrumente und Lösungen aus autoklaviertem Glas. Sterilisieren Sie Scheren und andere Metallgeräte in einem Glasperlensterilisator.
- Bereiten Sie Filter vor, die normalerweise in 70% Ethanol gelagert werden, indem Sie sie dreimal in 1x PBS waschen, um Ethanol zu entfernen (Abbildung 1). Filter in rechteckige Stücke schneiden (3 x 3-5 x 5 mm).
HINWEIS: Gewaschene Filterstücke können mehrere Tage in 1x PBS bei 4 °C gelagert werden. - Das Kulturmedium wird vorbereitet (1:1 DMEM:F12 ergänzt mit 1% [v/v] 200 mM L-Alanyl-L-glutamin-Dipeptid in 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml Ascorbinsäure und 0,2% [v/v] Penicillin [10.000 I.U./ml] und Streptomycin [10.000 μg/ml]). Bei 4 °C lagern.
- Legen Sie die 30 mm Metallgitter (mit Löchern mit 1-2 mm Durchmesser, die die Gewebebildgebung ermöglichen) in eine 35 mm große Petrischale. Fügen Sie genügend Medien hinzu, um die Gitteroberfläche zu erreichen, ohne Luftblasen zu erzeugen. Die vorbereitete Kulturschale bei 37 °C vorwärmen, bis das Gewebe isoliert und kulturbereit ist (in einem Standard-Inkubator mit 5%CO2 und 90%-95% Feuchtigkeit).
2. Inzistordissektion und Isolierung des proximalen Endes
- Opfern Sie die Tiere nach einem genehmigten Tierpflegeprotokoll.
- Enthaupte die Maus und seziere den Unterkiefer. Entfernen Sie dazu zuerst die Haut, um den Unterkiefer freizulegen, und schneiden Sie durch die Massetermuskeln, um sie vom Oberkiefer und dem Rest des Kopfes zu trennen.
- Sobald der Unterkiefer isoliert ist, entfernen Sie die Zunge und so viel Weichgewebe wie möglich.
- Sammeln Sie alle Unterkiefer und bewahren Sie sie in einer Petrischale auf, die PBS auf Eis enthält, da dies die Lebensfähigkeit des Gewebes verbessert.
- Bringen Sie einen Unterkiefer in eine Glas-Petrischale und verwenden Sie Einweg-20/26 G Injektionsnadeln, um den Schneidezahn unter einem Stereomikroskop zu sezieren. Teilen Sie den Unterkiefer an der Mittellinie und schneiden Sie durch die Symphyse. Reinigen Sie das Weich- und Muskelgewebe von der Knochenoberfläche weg, um eine bessere Visualisierung zu ermöglichen.
HINWEIS: Eine Glas-Petrischale ist unerlässlich, da dies die Nadeln nicht abstumpft. - Unterkiefer von Tieren, die jünger als 10 Tage sind, sind weicher und zerbrechlicher, daher verwenden Sie Einweg-20/26 G-Injektionsnadeln, um jede Hälfte des Unterkiefers längs zu öffnen, um den Schneidezahn freizulegen. Verwenden Sie bei Mäusen, die älter als 10 Tage sind, eine Pinzette, um den Unterkiefer zu greifen und den Knochen zu brechen, um den Zahn freizulegen.
- Lösen Sie den Schneidezahn vorsichtig vom umgebenden Knochen und schneiden Sie das proximale Ende ab, das die Zervixschlinge enthält.
- Schneiden Sie das proximale Ende ab und entfernen Sie den mineralisierten Zahnschmelz und die Dentinmatrix.
- Bewahren Sie die gesammelten proximalen Enden in Dulbeccos PBS auf Eis, bis sie für die Kultur bereit sind.
3. Kultur
- Platzieren Sie vorsichtig ein Filterrechteck auf der Oberseite eines Gitters in einer vorgewärmten Kulturschale.
- Verwenden Sie ein Stereomikroskop, um die Gewebestücke richtig auszurichten.
- In einen Standard-Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 und 90%-95% Luftfeuchtigkeit geben.
- Wechseln Sie das Medium jeden zweiten Tag und ersetzen Sie es durch frisches Medium, wobei die Bildung von Luftblasen sorgfältig vermieden wird. Überwachen Sie das Gewebewachstum und fotografieren Sie täglich mit einer Kamera, die am Stereomikroskop befestigt ist.
4. Hinzufügen löslicher Faktoren zur Kultur
- Ergänzen Sie das Kulturmedium mit löslichen Faktoren und Molekülen von Interesse, um ihre Wirkung auf die Regulation von SCs zu untersuchen.
HINWEIS: Das Verabreichungsprotokoll für jedes Molekül (Wachstumsfaktoren, Signalmoleküle, blockierende Antikörper, pharmakologische Verbindungen wie Inhibitoren oder Aktivatoren, Vektoren usw.) hängt von seiner Halbwertszeit und Löslichkeit ab. Diese Parameter bestimmen auch die geeignete Steuerung.
5. Molekulare und histologische Analysen
- Entfernen Sie das Kulturmedium.
- Fügen Sie vorsichtig eiskaltes Methanol zu den Geweben hinzu, um ein Ablösen von den Filtern zu verhindern.
- Methanol 5 min einwirken lassen.
- Transferfilter, die Gewebeexplantate transportieren, in Probenahmeröhrchen.
- Die Explantate in 4% Paraformaldehyd in PBS für 10-24 h bei 4 °C fixieren.
- Fahren Sie mit etablierten Protokollen für die histologische Verarbeitung (Paraffin, gefroren usw.) oder Immunfärbungen fort.
6. Kultur von Gewebeschnitten
HINWEIS: Es gibt mehrere Variationen dieses Protokolls, die alle gleichermaßen erfolgreich sind und eine Frage der persönlichen Wahl sind, abhängig von der Geschwindigkeit und den Fähigkeiten des Benutzers. Diese beziehen sich auf den Puffer, der verwendet wird, um die Lebensfähigkeit des Gewebes zu sammeln und zu erhalten. Zu diesem Zweck können Krebspuffer, PBS ergänzt mit 2% Glukose und Antibiotika oder PBS verwendet werden. Wenn Krebspuffer verwendet wird, sollte er 1 Tag im Voraus hergestellt und bei 4 ° C gehalten werden.
- Vor dem Versuch 4%-5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt vorbereiten, indem 2-2,5 g Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt in 50 ml siedender 2% Glucose/PBS gelöst werden, wonach die Lösung in ein 45 °C warmes Wasserbad gegeben werden sollte.
- Vibratom aufstellen, mit 70% Ethanol waschen und mit eiskaltem 2% Glukose / PBS füllen, ergänzt mit Antibiotika (100 U / ml Penicillin, 100 mg / ml Streptomycin).
- Sezieren Sie die proximalen Enden des Schneidezahns und sammeln Sie sie in der eiskalten 2% Glukose / PBS ergänzt mit Antibiotika.
- Legen Sie ein proximales Ende des Schneidezahns in die Form, die 4% -5% Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt enthält. Richten Sie das Stück unter einem Stereomikroskop in die gewünschte Richtung aus und lassen Sie es auf Eis, damit die Agarose aushärten kann.
- Schneiden Sie den gehärteten Agaroseblock ab und legen Sie ihn in den Vibratom. Dicke Scheiben schneiden (150-300 μm).
- Sammeln Sie die Scheiben in einer Petrischale mit eiskalter 2% Glukose / PBS, ergänzt mit Antibiotika.
- Die dicken Scheiben werden mit einem Spatel auf ein Filterrechteck übertragen, das auf dem gemäß Abschnitt 1.3 vorbereiteten vorgewärmten Gitter platziert ist.
- Inkubieren Sie die dicken Scheiben im Inkubator und fahren Sie mit der Bildgebung fort (Abbildung 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Die epithelialen SCs befinden sich in einer Nische, die als zervikale Schleife bezeichnet wird und sich am proximalen Ende des Schneidezahns befindet (Abbildung 3A). Zervikale Schleifen sind morphologisch unterschiedliche Strukturen, die aus innerem und äußerem Schmelzepithel bestehen und das Sternretikulum, einen Kern locker angeordneter Epithelzellen, umhüllen (Abbildung 3B,C). Es gibt zwei zervikale Schleifen in jedem Schneidezahn (Abbildung 3A), aber nur die labiale Zervixschleife enthält SCs. Die epithelialen SCs sind auf das Sternretikulum und das benachbarte Schmelzepithel an der Spitze der zervikalen Schleife20,21 lokalisiert. Sie erzeugen Nachkommen, die durch Sfrp5-Expression gekennzeichnet sind, die sich in hochproliferative transitamplifizierende Zellen differenzieren, die verschiedene Zellen produzieren, einschließlich Schmelz-sekretierender Ameloblasten 2,7. Die Ameloblastendifferenzierung von SCs kann in dem hier beschriebenen Organkultursystem rekapituliertwerden 2.
In den letzten Jahren sind Reportermäuse, bei denen ein fluoreszierendes Protein (wie GFP) unter der Kontrolle spezifischer genregulatorischer Elemente steht, zu einem weit verbreiteten Werkzeug geworden, um Zellen aus verschiedenen Geweben zu identifizieren und zu isolieren und Zellschicksal und Abstammungsprogression in vivo und in vitro zu verfolgen 22,23. Die Verwendung dieser Tiermodelle ist vorteilhaft für die Analyse der Wirkung verschiedener regulatorischer Moleküle, da die Intensität und das Muster der fluoreszierenden Reporterexpression als Auslesen der endogenen Genaktivität oder als Reporter des Proliferationsstatus (dh Fucci-Reportermausmodell) verwendet werden können.
Das transgene Reportermausmodell24 Sox2-GFP, bei dem die verstärkte GFP (EGFP)-Expression unter der Kontrolle eines 5,5 kb großen Fragments des vorgeschalteten regulatorischen Elements des Sox2-Promotors steht, ermöglicht die Identifizierung und Visualisierung von Sox2-exprimierenden Schneidepithelstammzellen (Abbildung 4A-C). Die Erzeugung von Mäusen, die mehrere fluoreszierende Reporter tragen, kann für die Identifizierung von mehr als einer Zellpopulation nützlich sein. Zum Beispiel in zervikalen Schleifen von Sox2-GFP; Fucci-mKO transgene tierische Stammzellen (GFP+, grün, Abbildung 4D) und nicht-proliferative Zellen (Fucci-mKO+, rot, Abbildung 4D) können identifiziert werden. Darüber hinaus kann die Sox2-GFP-Expression als Reporter bei der Analyse der Wirkung verschiedener Moleküle verwendet werden. Die Zugabe des Wnt/β-Catenin-Signalaktivators BIO wirkt sich negativ auf Sox2-exprimierende Stammzellen und folglich auf die GFP-Expression aus (Abbildung 4E).
Abbildung 1: Vorbereitung der Kulturkammer . (A) Waschen Sie den Filter in 1x PBS. (B) Schneiden Sie den Filter in rechteckige Stücke. (C) Bereiten Sie die Medien in der Haube vor und leiten Sie sie durch das Gitter. Vermeiden Sie die Bildung von Luftblasen. (D) Die vorbereitete Kulturschale bei 37 °C vorwärmen, bevor Gewebeexplantate auf einen auf dem Rost platzierten Filter gegeben werden. (E) Karikaturendarstellung der Kulturkammer. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Kultivierung von Gewebeschnitten. Das proximale Ende eines 2-tägig-postnatalen (2PN) Mausschneidezahns wurde seziert und durch Vibratom geschnitten. Nach einer 6-tägigen Kultur wurden Scheiben (150 μm dick) kultiviert und Hartgewebebildung (Pfeile) beobachtet. Skala 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 3: Zervikale Schleife . (A) Proximales Ende der schneidezahnhaltigen Labialschleife (umrandet durch eine schwarz gestrichelte Linie) und lingualen (durch grau gestrichelte Linie umrandet) Halsschleife. (B) Histologischer Schnitt der labialen Zervixschleife, die eine Nische für epitheliale Stammzellen darstellt. (C) Karikaturdarstellung der labialen Zervixschleife und ihrer Komponenten. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 4: Verwendung von fluoreszierenden Reportermausmodellen in einem Organkultursystem . (A) Hellfeld-, (B) fluoreszierendes und (C) Überlagerungsbild des proximalen Endes des Schneidezahns, isoliert aus 2-tägigen postnatalen Sox2-GFP-Mäusen. (D) Sox2-GFP- und Fucci-mKO-Expression im proximalen Ende des Schneidezahns, isoliert aus 2-tägigem postnatalem Sox2-GFP; Fucci-mKO Mäuse. (E) Wirkung von BIO auf die Stammzellen, die Sox2-GFP exprimieren, und die Stammzellnische (zervikale Schleife, umrandet durch gelbe gestrichelte Linie). Skala 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In-vitro-Organkultur wurde ausgiebig verwendet, um induktives Potenzial und epithelial-mesenchymale Wechselwirkungen zu untersuchen, die das Organwachstum und die Morphogenese steuern. Das Thesleff-Labor hat gezeigt, wie die Saxén-Modifikation der Organkultur vom Trowell-Typ angepasst und zur Untersuchung der Zahnentwicklung verwendet werden kann14. Die reproduzierbaren Bedingungen und Fortschritte bei fluoreszierenden Reportern haben dies zu einer nützlichen Methode zur Überwachung der Zahnmorphogenese und der verschiedenen Zellpopulationen darin gemacht. Dieses Papier beschrieb, wie dieses Protokoll angewendet werden kann, um epitheliale Stammzellen und die Mikroumgebung, in der sie sich befinden, zu untersuchen.
Eine Technik zur Isolierung des proximalen Endes des Schneidezahns, die die SC-Nische von postnatalen Welpen und von älteren Tieren enthält, wurde hier beschrieben. Der Erfolg dieser Methode hängt von der Isolationszeit ab (die sich direkt auf die Lebensfähigkeit des Gewebes auswirkt) und von der Fähigkeit, ein unbeschädigtes proximales Ende mit einer intakten labialen Zervixschlinge zu isolieren. Dies ist besonders bei älteren Tieren mit mineralisiertem Knochen eine Herausforderung. Das Protokoll zeigt, wie kontrollierte mechanische Kraft verwendet werden kann, um den mineralisierten Knochen zu brechen und vollständig intaktes und lebensfähiges Weichgewebe in einer signifikant kürzeren Zeit im Vergleich zu anderen veröffentlichten Protokollen zu isolieren25. Nach der Isolierung kann das Gewebe in vitro kultiviert werden, entweder als Ganzes oder als dicke Scheibe. Der Nachteil der Dickgewebeschneidemethode ist, dass in jeder Scheibe nur ein Teil der Zervixschlinge vorhanden ist; Somit ist es nicht möglich, einen reproduzierbar identischen Teil der Halsschleife in verschiedenen Abschnitten zu erhalten. Die Organkultur bietet eine einfache und reproduzierbare Methode, um die molekularen und zellulären Mechanismen zu untersuchen, die SCs und ihre Nische im Laufe der Zeit regulieren. Es gibt jedoch Einschränkungen für die Gesamtkulturperiode, hauptsächlich aufgrund des fortschreitenden Verlusts von Mesenchym nach den ersten 3-4 Tagen der Kultur.
Das isolierte Gewebe kann auch weiterverarbeitet werden, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, die mit Schneidezahnepithel-SCs26 angereichert ist. Die enzymatische Trennung der zervikalen Schleife vom Rest des proximalen Endes und die Verwendung spezifischer fluoreszierender Reporter ermöglicht detailliertere mRNA- und Proteinanalysen (wie qPCR, Einzelzell-RNA-Sequenzierung) und einen besseren Einblick in spezifische Zellpopulationen innerhalb der Nische.
Die In-vitro-Kultur bietet eine geeignete Plattform, um verschiedene genetische und pharmakologische Manipulationen auf ihre regulatorische Wirkung auf Zahnepithel-SCs und ihre Nischen zu untersuchen. Es sollte beachtet werden, dass der Erfolg der pharmakologischen Behandlungen von den Eigenschaften der getesteten Moleküle abhängt, wie Halbwertszeit, Löslichkeit, metabolische Stabilität, Dosierung und Zelltoxizität. In Kombination mit einem fluoreszierenden Reporter kann der regulatorische Effekt einer bestimmten Zellpopulation innerhalb eines Gewebes zugeordnet werden und bietet so ein leistungsfähiges Werkzeug, um die molekularen und zellulären Mechanismen aufzudecken, die Zahnepithel-SCs und ihre Nische regulieren.
Mit der Verwendung spezifischer fluoreszierender Reportermäuse ist es möglich, bestimmte Zellpopulationen innerhalb von lebendem Gewebe im Laufe der Zeit zu identifizieren und zu verfolgen. Kürzlich wurde gezeigt, dass In-vitro-Organkultur für die Live-Bildgebung der Zahnentwicklung verwendet werden kann16. Darüber hinaus kann das Zellverhalten über einen kurzen Zeitraum mittels In-vitro-Kultur von dicken Gewebeschnitten abgebildet werden7. Wie bereits erwähnt, kann nur ein Teil der SC-Nische abgebildet werden und die Bilddauer ist kurz. Idealerweise sollte die gesamte SC-Nische abgebildet werden. Die 4D-Zeitrafferaufnahme dieser Struktur ist jedoch eine Herausforderung, hauptsächlich aufgrund der Dicke der Nische und der Einschränkungen der derzeit verfügbaren Bildgebungsmethoden. Nichtsdestotrotz versprechen kontinuierliche Fortschritte in der Bildgebungstechnologie eine aufregende Zukunft bei der Entschlüsselung zellulärer Verhaltensweisen, die die Schneidezahn-SC-Nische ausmachen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Diese Studie wurde von der Jane and Aatos Erkko Foundation unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
