Summary
Метод культуры органов типа Троуэлла был использован для разгадки сложных сигнальных сетей, которые управляют развитием зубов, и, в последнее время, для изучения регуляции, связанной со стволовыми клетками постоянно растущего мышиного резца. Флуоресцентно-репортерные животные модели и методы визуализации в реальном времени облегчают углубленный анализ стоматологических стволовых клеток и их конкретной нишевой микросреды.
Abstract
Развитие, функция и регенерация органов зависят от стволовых клеток, которые находятся в дискретных анатомических пространствах, называемых нишами стволовых клеток. Постоянно растущий мышиный резец обеспечивает отличную модель для изучения тканеспецифических стволовых клеток. Эпителиальные тканеспецифические стволовые клетки резца расположены на проксимальном конце зуба в нише, называемой шейной петлей. Они обеспечивают непрерывный приток клеток для уравновешивания постоянного истирания самозатачивающегося кончика зуба. Здесь представлен подробный протокол выделения и культивирования проксимального конца мышиного резца, в котором находятся стволовые клетки и их ниша. Это модифицированный протокол посева органов типа Trowell, который позволяет выращивать in vitro кусочки ткани (экспланты), а также толстые срезы ткани на границе раздела жидкость/воздух на фильтре, поддерживаемом металлической сеткой. Протокол посева органов, описанный здесь, позволяет проводить манипуляции с тканями, невозможные in vivo, и в сочетании с использованием флуоресцентного репортера (репортеров) он обеспечивает платформу для идентификации и отслеживания дискретных популяций клеток в живых тканях с течением времени, включая стволовые клетки. Различные регуляторные молекулы и фармакологические соединения могут быть протестированы в этой системе на предмет их влияния на стволовые клетки и их ниши. Это в конечном итоге обеспечивает ценный инструмент для изучения регуляции и поддержания стволовых клеток.
Introduction
Мышиные резцы непрерывно растут благодаря пожизненному сохранению стволовых клеток (SC), которые поддерживают непрерывное производство компонентов зуба. К ним относятся эпителиальные СК, которые генерируют эмал-продуцирующие амелобласты, и мезенхимальные стволовые клетки (МСК), которые генерируют дентин-продуцирующие одонтобласты, среди других клеток1. Эпителиальные СК в непрерывно растущих резцах были первоначально идентифицированы как клетки, удерживающие метку 2,3, и с тех пор было показано, что они экспрессируют ряд хорошо известных генов стволовости, включая Sox24. Эти клетки имеют общие черты с эпителиальными СК в других органах и находятся в нише SC, называемой шейной петлей, расположенной на губной стороне резца. Ниша представляет собой динамическую сущность, состоящую из клеток и внеклеточного матрикса, которые контролируют активность SC5. Исследования по отслеживанию линии показали, что эпителиальные СК Sox2+ могут регенерировать весь эпителиальный компартмент зуба и что они имеют решающее значение для формирования сукцессионного зуба 6,7. МСК с репаративным или регенеративным потенциалом дентина в значительной степени набираются извне органа через кровеносные сосуды и нервы 8,9,10,11, что обеспечивает подходящую модель для изучения вербовки, миграции и жилья популяции MSC.
Изучить СК in vivo не всегда возможно, так как многие генетические и/или фармакологические манипуляции могут влиять на гомеостаз органов и/или иметь летальные последствия. Поэтому органная культура является отличным инструментом для изучения регуляции СК и их ниш in vitro. Система культуры органов, которая использует металлическую сетку, была первоначально разработана Trowell12 для изучения развития органов и была дополнительно модифицирована Saxen13 для изучения индуктивных сигналов в развитии почек. С тех пор этот метод культивирования всего или части органа in vitro успешно применяется в разных областях. В области развития зубов этот метод широко используется для изучения эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые управляют развитием зуба14 и сукцессионным формированием зубов15. Работа лаборатории Thesleff продемонстрировала полезность этой системы для временного анализа роста и морфогенеза зубов, для анализа влияния различных молекул и факторов роста на рост зубов, а также для покадровой живой визуализации развития зубов16,17. Совсем недавно этот метод был использован для изучения регулирования резцовых СК и их ниши18,19, которая подробно описана здесь.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Этот протокол включает в себя использование животных, и все процедуры были одобрены Этическими комитетами по использованию и уходу за животными и Учреждением по защите животных в Университете Хельсинки.
1. Приготовление блюда для органной культуры
- Выполняйте все процедуры в ламинарной вытяжке. Очищайте рабочие поверхности 70% этанолом и используйте инструменты и растворы из автоклавного стекла. Стерилизуйте ножницы и другое металлическое оборудование в стерилизаторе из стеклянных шариков.
- Подготовьте фильтры, обычно хранящиеся в 70% этаноле, промыв их три раза в 1x PBS для удаления этанола (рисунок 1). Нарежьте фильтры на прямоугольные куски (3 x 3-5 x 5 мм).
ПРИМЕЧАНИЕ: Промытые части фильтра могут храниться в течение нескольких дней в 1x PBS при 4 °C. - Готовят культуральную среду (1:1 DMEM:F12 с добавлением 1% [v/v] 200 мМ L-аланил-L-глутамина дипептида в 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 мкг/мл аскорбиновой кислоты и 0,2% [v/v] пенициллина [10 000 I.U./мл] и стрептомицина [10 000 мкг/мл]). Хранить при температуре 4 °C.
- Поместите металлические сетки диаметром 30 мм (с отверстиями диаметром 1-2 мм, которые позволяют визуализировать ткани) в чашку Петри толщиной 35 мм. Добавьте достаточное количество среды, чтобы достичь поверхности сетки без образования пузырьков воздуха. Предварительно разогрейте приготовленную чашку для культивирования при 37 °C до тех пор, пока ткань не будет выделена и готова к культивированию (в стандартном инкубаторе с 5%CO2 и влажностью 90%-95%).
2. Рассечение резца и изоляция проксимального конца
- Приносите в жертву животных в соответствии с утвержденным протоколом ухода за животными.
- Обезглавить мышь и рассечь нижнюю челюсть. Для этого сначала удалите кожу, чтобы обнажить нижнюю челюсть и прорежьте мышцы массажера, чтобы отделить ее от верхней челюсти и остальной части головы.
- Как только нижняя челюсть выделена, удалите язык и как можно больше мягких тканей.
- Соберите все нижние челюсти и храните их в чашке Петри, содержащей PBS на льду, так как это повышает жизнеспособность тканей.
- Переложите одну нижнюю челюсть в стеклянную чашку Петри и используйте одноразовые иглы для подкожных инъекций 20/26 г для рассечения резца под стереомикроскопом. Расколите нижнюю челюсть по средней линии, разрезав симфиз. Очистите мягкую и мышечную ткань от поверхности кости для лучшей визуализации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянная чашка Петри необходима, так как это не притупит иглы. - Нижние челюсти, полученные от животных моложе 10 дней, мягче и хрупче, поэтому используйте одноразовые иглы для подкожных инъекций 20/26 г, чтобы открыть каждую половину нижней челюсти продольно, чтобы обнажить резцовый зуб. Для мышей старше 10 дней используйте пинцет, чтобы схватить нижнюю челюсть и сломать кость, чтобы обнажить зуб.
- Аккуратно отсоедините резец от окружающей кости и отрежьте проксимальный конец, в котором находится шейная петля.
- Вырежьте проксимальный конец и удалите минерализованную эмаль и дентиновый матрикс.
- Храните собранные проксимальные концы в PBS Дульбекко на льду до тех пор, пока они не будут готовы к культуре.
3. Культура
- Аккуратно поместите прямоугольник фильтра поверх сетки в предварительно подогретую культурную посуду.
- Используйте стереомикроскоп, чтобы правильно сориентировать кусочки ткани.
- Поместите в стандартный инкубатор при температуре 37 °C с влажностью 5% CO2 и влажностью 90-95%.
- Меняйте среду через день и заменяйте свежей средой, тщательно избегая образования пузырьков воздуха. Следите за ростом тканей и ежедневно фотографируйте с помощью камеры, прикрепленной к стереомикроскопу.
4. Добавление растворимых факторов в культуру
- Дополнить питательную среду растворимыми факторами и молекулами, представляющими интерес, для изучения их влияния на регуляцию СК.
ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол введения для любой молекулы (факторы роста, сигнальные молекулы, блокирующие антитела, фармакологические соединения, такие как ингибиторы или активаторы, векторы и т.д.) зависит от ее периода полувыведения и растворимости. Эти параметры также определяют соответствующий элемент управления, который будет использоваться.
5. Молекулярный и гистологический анализ
- Удалите культуральную среду.
- Осторожно добавляйте ледяной метанол в ткани, чтобы предотвратить отслоение от фильтров.
- Оставить метанол на 5 мин.
- Перенос фильтров, несущих тканевые экспланты, в пробоотборные пробирки.
- Зафиксируйте экспланты в 4% параформальдегиде в PBS в течение 10-24 ч при 4 °C.
- Приступают к установленным протоколам гистологической обработки (парафин, замороженность и т.д.) или иммуноокрашениям.
6. Культивирование срезов тканей
ПРИМЕЧАНИЕ: Существует несколько вариантов этого протокола, которые все одинаково успешны и являются вопросом личного выбора, в зависимости от скорости и мастерства пользователя. Они относятся к буферу, используемому для сбора и поддержания жизнеспособности тканей. Для этого можно использовать буфер Кребса, PBS, дополненный 2% глюкозой и антибиотиками, или PBS. Если используется буфер Кребса, его следует сделать за 1 день и держать при 4 °C.
- Перед экспериментом готовят 4%-5% агарозу с низкой температурой плавления путем растворения 2-2,5 г агарозы с низкой температурой плавления в 50 мл кипячения 2% глюкозы/ПБС, после чего раствор следует поместить на водяную баню при температуре 45 °С.
- Установите вибратом, промыть 70% этанолом и наполнить ледяным холодом 2% глюкозы / PBS, дополненным антибиотиками (100 ЕД / мл пенициллина, 100 мг / мл стрептомицина).
- Рассекните проксимальные концы резца и соберите их в ледяной 2% глюкозы / PBS, дополненной антибиотиками.
- Поместите один проксимальный конец резца в форму, содержащую 4%-5% агарозу с низкой температурой плавления. Под стереомикроскопом сориентируйте кусок в нужном направлении и оставьте на льду, чтобы агароза затвердела.
- Обрежьте затвердевший блок агарозы и поместите его в вибратом. Нарезать толстыми ломтиками (150-300 мкм).
- Соберите ломтики в чашку Петри, содержащую холодные 2% глюкозы / PBS, дополненные антибиотиками.
- Используйте шпатель для переноса толстых ломтиков на фильтрующий прямоугольник, помещенный на предварительно нагретую сетку, подготовленную, как в разделе 1.3.
- Инкубируйте толстые срезы в инкубаторе и приступайте к визуализации (рисунок 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Эпителиальные СК находятся в нише, называемой шейной петлей, которая расположена на проксимальном конце резца (рисунок 3А). Шейные петли представляют собой морфологически различные структуры, состоящие из внутреннего и наружного эпителия эмали, которые заключают в себе звездчатый ретикулум, ядро слабо расположенных эпителиальных клеток (рисунок 3B, C). В каждом резце есть две шейные петли (рисунок 3A), но только лабиальная шейная петля содержит SC. Эпителиальные СК локализуются к звездчатому сетчатому и соседнему эмалевому эпителию на кончике шейного цикла 20,21. Они генерируют потомство, характеризующееся экспрессией Sfrp5, которое дифференцируется в высокопролиферативные транзит-амплифицирующие клетки, которые продуцируют различные клетки, включая эмал-секретирующие амелобласты 2,7. Дифференцировка амелобласта от СК может быть рекапитулирована в системе культуры органов, описанной здесь2.
В последние годы мыши-репортеры, у которых флуоресцентный белок (такой как GFP) находится под контролем специфических регуляторных элементов генов, стали широко используемым инструментом для идентификации и выделения клеток из различных тканей и отслеживания судьбы клеток и прогрессирования линии in vivo и in vitro22,23. Использование этих животных моделей полезно для анализа влияния различных регуляторных молекул, поскольку интенсивность и характер экспрессии флуоресцентного репортера могут быть использованы в качестве считывания эндогенной активности генов или в качестве репортера статуса пролиферации (т. Е. Модель мыши-репортера Fucci).
Трансгенная модель24 мыши-репортера Sox2-GFP, в которой расширенная экспрессия GFP (EGFP) находится под контролем фрагмента 5,5 кб восходящего регуляторного элемента промотора Sox2, позволяет идентифицировать и визуализировать эпителиальные стволовые клетки Sox2-экспрессирующего резца (рисунок 4A-C). Поколение мышей, которые несут несколько флуоресцентных репортеров, может быть полезно для идентификации более чем одной популяции клеток. Например, в шейных петлях от Sox2-GFP; Могут быть идентифицированы трансгенные стволовые клетки животных Fucci-mKO (GFP+, зеленый, рисунок 4D) и непролиферативные клетки (Fucci-mKO+, красный, рисунок 4D). Кроме того, экспрессия Sox2-GFP может быть использована в качестве репортера при анализе влияния различных молекул. Добавление сигнального активатора Wnt/β-катенина BIO отрицательно влияет на Sox2-экспрессирующие стволовые клетки и, следовательно, на экспрессию GFP (рисунок 4E).
Рисунок 1: Подготовка культуральной камеры. (А) Промыть фильтр в 1x PBS. (B) Разрежьте фильтр на прямоугольные куски. (C) Подготовьте среду в вытяжке и пропустите ее через сетку. Избегайте образования пузырьков воздуха. (D) Предварительно прогреть предварительно приготовленное блюдо для культивирования при 37 °C перед добавлением тканевых эксплантов на фильтр, помещенный на сетку. E) Карикатурное изображение культурной палаты. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Культивирование срезов тканей. Проксимальный конец 2-дневного постнатального (2PN) мышиного резца был рассечен и разделен вибратомом. Срезы (толщиной 150 мкм) культивировали и наблюдали формирование твердых тканей (стрелок) после 6-дневной культуры. Масштаб 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Цервикальная петля. (А) Проксимальный конец резца, содержащий губные (очерченные черной пунктирной линией) и лингвальные (очерченные серой пунктирной линией) шейные петли. (B) Гистологический участок губной шейной петли, который представляет собой нишу для эпителиальных стволовых клеток. (C) Карикатурное изображение лабиальной шейной петли и ее компонентов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Использование флуоресцентных репортерных моделей мыши в системе культуры органов. (A) Brightfield, (B) флуоресцентное и (C) наложенное изображение проксимального конца резца, выделенного у 2-дневных постнатальных мышей Sox2-GFP. (D) экспрессия Sox2-GFP и Fucci-mKO в проксимальном конце резца, выделенная из 2-дневного постнатального Sox2-GFP; Мыши Фуччи-мко. (E) Влияние BIO на стволовые клетки, экспрессирующие Sox2-GFP, и нишу стволовых клеток (шейная петля, очерченная желтой пунктирной линией). Масштаб 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Культура органов in vitro широко используется для изучения индуктивного потенциала и эпителиально-мезенхимальных взаимодействий, которые управляют ростом органов и морфогенезом. Лаборатория Thesleff продемонстрировала, как адаптировать саксенскую модификацию культуры органов типа Троуэлла и использовать ее для изучения развития зубов14. Воспроизводимые условия и достижения в области флуоресцентных репортеров сделали это полезным методом для мониторинга морфогенеза зубов и различных клеточных популяций внутри. В этой статье описано, как применять этот протокол для изучения эпителиальных стволовых клеток и микросреды, в которой они находятся.
Здесь был описан метод выделения проксимального конца резца, который содержит нишу SC от послеродовых детенышей и от более старых животных. Успех этого метода зависит от времени выделения (которое напрямую влияет на жизнеспособность тканей) и от способности изолировать неповрежденный проксимальный конец неповрежденной губной шейной петлей. Это особенно сложно у пожилых животных с минерализованной костью. Протокол показывает, как использовать контролируемую механическую силу для разрушения минерализованной кости и выделения полностью неповрежденных и жизнеспособных мягких тканей за значительно более короткое время по сравнению с другими опубликованными протоколами25. После выделения ткань можно культивировать in vitro, либо целиком, либо толстым срезом. Недостатком метода нарезки толстой ткани является то, что в каждом срезе присутствует только часть шейной петли; таким образом, получение воспроизводимо идентичного участка шейной петли в разных отделах невозможно. Культура органов обеспечивает простой и воспроизводимый метод изучения молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют СК и их нишу с течением времени. Однако существуют ограничения общего периода культивирования, в основном из-за прогрессирующей потери мезенхимы после начальных 3-4 дней культивирования.
Изолированную ткань также можно дополнительно обработать с получением одноклеточной суспензии, обогащенной резцовыми эпителиальными SCs26. Ферментативное отделение шейной петли от остальной части проксимального конца и использование специфических флуоресцентных репортеров позволяет проводить более детальный анализ мРНК и белка (такой как qPCR, секвенирование одноклеточной РНК) и лучшее понимание конкретных клеточных популяций в нише.
Культура in vitro обеспечивает подходящую платформу для скрининга различных генетических и фармакологических манипуляций на предмет их регуляторного влияния на эпителиальные СК зуба и их ниши. Следует отметить, что успех фармакологического лечения зависит от свойств тестируемых молекул, таких как период полувыведения, растворимость, метаболическая стабильность, дозировка и клеточная токсичность. В сочетании с флуоресцентным репортером регуляторный эффект может быть назначен определенной клеточной популяции в ткани, обеспечивая тем самым мощный инструмент для раскрытия молекулярных и клеточных механизмов, которые регулируют эпителиальные СК зуба и их нишу.
С использованием специфических флуоресцентных репортерных мышей можно идентифицировать и отслеживать конкретные клеточные популяции в живой ткани с течением времени. Недавно было продемонстрировано, что культура органов in vitro может быть использована для живой визуализации развития зубов16. Кроме того, поведение клеток может быть визуализировано в течение короткого периода времени с использованием культуры in vitro толстых срезов ткани7. Как указывалось ранее, только часть ниши SC может быть изображена, а продолжительность изображения коротка. В идеале должна быть изображена вся ниша SC. Тем не менее, 4D-покадровая визуализация этой структуры является сложной задачей, в основном из-за толщины ниши и ограничений доступных в настоящее время методов визуализации. Тем не менее, непрерывные достижения в области технологий визуализации обещают захватывающее будущее в разгадке клеточного поведения, которое составляет нишу резца SC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Фондом Джейн и Аатоса Эркко.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
