Summary
La méthode de culture d’organes de type Trowell a été utilisée pour démêler les réseaux de signalisation complexes qui régissent le développement des dents et, plus récemment, pour étudier la régulation impliquée dans les cellules souches de l’incisive de souris en croissance continue. Les modèles animaux fluorescents-rapporteurs et les méthodes d’imagerie en direct facilitent les analyses approfondies des cellules souches dentaires et de leur microenvironnement de niche spécifique.
Abstract
Le développement, la fonction et la régénération des organes dépendent des cellules souches, qui résident dans des espaces anatomiques discrets appelés niches de cellules souches. L’incisive de souris à croissance continue fournit un excellent modèle pour étudier les cellules souches spécifiques aux tissus. Les cellules souches spécifiques du tissu épithélial de l’incisive sont situées à l’extrémité proximale de la dent dans une niche appelée boucle cervicale. Ils fournissent un afflux continu de cellules pour contrebalancer l’abrasion constante de la pointe auto-affûtante de la dent. Un protocole détaillé pour l’isolement et la culture de l’extrémité proximale de l’incisive de souris qui abrite les cellules souches et leur niche est présenté ici. Il s’agit d’un protocole modifié de culture d’organes de type Trowell qui permet la culture in vitro de morceaux de tissus (explants), ainsi que les tranches de tissu épaisses à l’interface liquide/air sur un filtre soutenu par une grille métallique. Le protocole de culture d’organes décrit ici permet des manipulations tissulaires impossibles in vivo et, lorsqu’il est combiné à l’utilisation d’un ou de plusieurs rapporteurs fluorescents, il fournit une plate-forme pour l’identification et le suivi de populations cellulaires discrètes dans les tissus vivants au fil du temps, y compris les cellules souches. Diverses molécules régulatrices et composés pharmacologiques peuvent être testés dans ce système pour leur effet sur les cellules souches et leurs niches. Cela fournit en fin de compte un outil précieux pour étudier la régulation et le maintien des cellules souches.
Introduction
Les incisives de souris se développent continuellement en raison de la préservation à vie des cellules souches (SC) qui soutiennent la production incessante de composants dentaires. Il s’agit notamment des SC épithéliales, qui génèrent des améloblastes producteurs d’émail, et des cellules souches mésenchymateuses (CSM), qui génèrent des odontoblastes producteurs de dentine, entre autres cellules1. Les SC épithéliaux dans les incisives en croissance continue ont été initialement identifiés comme des cellules retenant le marquage2,3 et il a depuis été démontré qu’ils expriment un certain nombre de gènes souches bien connus, y compris Sox24. Ces cellules partagent des caractéristiques communes avec les SC épithéliaux dans d’autres organes et résident dans la niche SC appelée la boucle cervicale située sur le côté labial de l’incisive. La niche est une entité dynamique composée de cellules et de matrice extracellulaire qui contrôlent l’activité SC5. Des études de traçage de lignée ont démontré que les SC épithéliales Sox2+ peuvent régénérer tout le compartiment épithélial de la dent et qu’ils sont cruciaux pour la formation des dents successives 6,7. Les CSM ayant un potentiel réparateur ou régénérateur de la dentine sont en grande partie recrutées à l’extérieur de l’organe par les vaisseaux sanguins et les nerfs 8,9,10,11, fournissant ainsi un modèle approprié pour étudier le recrutement, la migration et le logement de la population des CSM.
Il n’est pas toujours possible d’étudier les SC in vivo, car de nombreuses manipulations génétiques et/ou pharmacologiques peuvent affecter l’homéostasie des organes et/ou avoir des conséquences mortelles. Par conséquent, la culture d’organes fournit un excellent outil pour étudier la régulation des SC et de leurs niches in vitro. Le système de culture d’organes qui utilise une grille métallique a été initialement développé par Trowell12 pour étudier le développement des organes et a été modifié par Saxen13 pour étudier les signaux inductifs dans le développement des reins. Depuis lors, cette méthode in vitro de culture de tout ou partie de l’organe a été appliquée avec succès dans différents domaines. Dans le domaine du développement dentaire, cette méthode a été largement utilisée pour étudier les interactions épithéliales-mésenchymateuses qui régissent le développement des dents14 et la formation des dents successives15. Les travaux du laboratoire de Thesleff ont démontré l’utilité de ce système pour l’analyse temporelle de la croissance et de la morphogenèse des dents, pour l’analyse de l’effet de diverses molécules et facteurs de croissance sur la croissance des dents, et pour l’imagerie en direct du développement des dentsen accéléré 16,17. Plus récemment, cette méthode a été utilisée pour étudier la régulation des SC incisives et de leur créneau18,19, qui est décrit en détail ici.
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Protocol
Ce protocole implique l’utilisation d’animaux et toutes les procédures ont été approuvées par les comités d’éthique sur l’utilisation et le soin des animaux et l’animalerie de l’Université d’Helsinki.
1. Préparation du plat de culture d’organes
- Effectuer toutes les procédures dans une hotte à flux laminaire. Nettoyez les surfaces de travail avec 70 % d’éthanol et utilisez des instruments et des solutions en verre autoclavé. Stérilisez les ciseaux et autres équipements métalliques dans un stérilisateur à billes de verre.
- Préparer les filtres normalement stockés dans de l’éthanol à 70 % en les lavant trois fois dans 1x PBS pour éliminer l’éthanol (figure 1). Couper les filtres en morceaux rectangulaires (3 x 3-5 x 5 mm).
REMARQUE: Les morceaux filtrants lavés peuvent être stockés pendant plusieurs jours dans 1x PBS à 4 ° C. - Préparer le milieu de culture (DMEM:F12 1:1 supplémenté avec 1 % [v/v] 200 mM de L-alanyl-L-glutamine dipeptide dans 0,85 % de NaCl, 10 % [v/v] FBS, 150 μg/mL d’acide ascorbique et 0,2 % [v/v] de pénicilline [10 000 UI/mL] et de streptomycine [10 000 μg/mL]). Conserver à 4 °C.
- Placez les grilles métalliques de 30 mm (avec des trous de 1 à 2 mm de diamètre qui permettent l’imagerie tissulaire) dans une boîte de Petri de 35 mm. Ajoutez suffisamment de média pour atteindre la surface du réseau sans produire de bulles d’air. Préchauffer la capsule de culture préparée à 37 °C jusqu’à ce que le tissu soit isolé et prêt pour la culture (dans un incubateur standard avec 5% de CO2 et 90% - 95% d’humidité).
2. Dissection incisive et isolement de l’extrémité proximale
- Sacrifiez les animaux en suivant un protocole de soins aux animaux approuvé.
- Décapitaisez la souris et disséquez la mandibule. Pour ce faire, retirez d’abord la peau pour exposer la mandibule et coupez à travers les muscles masséters pour la séparer du maxillaire et du reste de la tête.
- Une fois la mandibule isolée, retirez la langue et autant de tissus mous que possible.
- Rassemblez toutes les mandibules et conservez-les dans une boîte de Petri contenant du PBS sur de la glace, car cela améliore la viabilité des tissus.
- Transférer une mandibule dans une boîte de Petri en verre et utiliser des aiguilles hypodermiques jetables de 20/26 G pour disséquer l’incisive au stéréomicroscope. Fendez la mandibule à la ligne médiane, coupant à travers la symphyse. Nettoyez le tissu mou et musculaire loin de la surface osseuse pour une meilleure visualisation.
REMARQUE: Une boîte de Petri en verre est essentielle, car cela n’émoussera pas les aiguilles. - Les mandibules obtenues à partir d’animaux de moins de 10 jours sont plus molles et plus fragiles, par conséquent, utilisez des aiguilles hypodermiques jetables de 20/26 G pour ouvrir chaque moitié de la mandibule longitudinalement afin d’exposer la dent incisive. Pour les souris de plus de 10 jours, utilisez une pince à épiler pour saisir la mandibule et casser l’os pour exposer la dent.
- Détachez doucement l’incisive de l’os environnant et coupez l’extrémité proximale, qui contient la boucle cervicale.
- Couper l’extrémité proximale et enlever l’émail minéralisé et la matrice dentine.
- Conservez les extrémités proximales collectées dans le PBS de Dulbecco sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la culture.
3. La culture
- Placez soigneusement un rectangle filtrant sur le dessus d’une grille dans un plat de culture préchauffé.
- Utilisez un stéréomicroscope pour bien orienter les morceaux de tissu.
- Placer dans un incubateur standard à 37 °C avec 5% de CO2 et 90%-95% d’humidité.
- Changez le milieu tous les deux jours et remplacez-le par un milieu frais, en évitant soigneusement la formation de bulles d’air. Surveillez la croissance des tissus et photographiez quotidiennement à l’aide d’une caméra fixée au stéréomicroscope.
4. Ajout de facteurs solubles à la culture
- Compléter le milieu de culture avec des facteurs solubles et des molécules d’intérêt pour étudier leur effet sur la régulation des SC.
NOTE: Le protocole d’administration de toute molécule (facteurs de croissance, molécules de signalisation, anticorps bloquants, composés pharmacologiques tels que inhibiteurs ou activateurs, vecteurs, etc.) dépend de sa demi-vie et de sa solubilité. Ces paramètres déterminent également le contrôle approprié à utiliser.
5. Analyses moléculaires et histologiques
- Retirez le milieu de culture.
- Ajoutez soigneusement du méthanol glacé aux tissus pour éviter le détachement des filtres.
- Laisser agir le méthanol pendant 5 min.
- Transférer les filtres transportant les explants de tissus dans des tubes de prélèvement.
- Fixer les explants dans du paraformaldéhyde à 4% dans du PBS pendant 10-24 h à 4 °C.
- Procéder avec les protocoles établis pour le traitement histologique (paraffine, congelé, etc.) ou les immunocolorations.
6. Culture de tranches de tissu
REMARQUE: Il existe plusieurs variantes de ce protocole, qui sont toutes aussi réussies et sont une question de choix personnel, en fonction de la vitesse et de la compétence de l’utilisateur. Ceux-ci se réfèrent au tampon utilisé pour recueillir et maintenir la viabilité des tissus. À cette fin, le tampon Krebs, le PBS complété par 2% de glucose et d’antibiotiques, ou PBS peuvent être utilisés. Si un tampon Krebs est utilisé, il doit être fabriqué 1 jour à l’avance et maintenu à 4 °C.
- Avant l’expérience, préparer de l’agarose à bas point de fusion à 4 % à 5 % en dissolvant 2 à 2,5 g d’agarose à bas point de fusion dans 50 mL de glucose à 2 % bouillant/PBS, après quoi la solution doit être placée dans un bain-marie à 45 °C.
- Installez le vibratome, lavez avec de l’éthanol à 70 % et remplissez de glucose / PBS à 2% glacé complété par des antibiotiques (100 U/mL de pénicilline, 100 mg / mL de streptomycine).
- Disséquez les extrémités proximales de l’incisive et recueillez-les dans le froid glacé 2% de glucose / PBS supplémenté en antibiotiques.
- Placer une extrémité proximale de l’incisive dans le moule contenant 4% à 5% de bas point de fusion agarose. Sous un stéréomicroscope, orienter la pièce dans la direction souhaitée et laisser sur la glace pour que l’agarose durcisse.
- Coupez le bloc d’agarose durci et placez-le dans le vibratome. Couper des tranches épaisses (150-300 μm).
- Recueillir les tranches dans une boîte de Petri contenant 2% de glucose / PBS glacé complété par des antibiotiques.
- Utiliser une spatule pour transférer les tranches épaisses sur un filtre rectangulaire placé sur la grille préchauffée préparée comme au point 1.3.
- Incuber les tranches épaisses dans l’incubateur et procéder à l’imagerie (Figure 2).
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Representative Results
Les SC épithéliaux résident dans une niche appelée anse cervicale, située à l’extrémité proximale de l’incisive (Figure 3A). Les anses cervicales sont des structures morphologiquement distinctes composées d’épithélium d’émail interne et externe qui enveloppent le réticulum étoilé, un noyau de cellules épithéliales disposées de manière lâche (Figure 3B,C). Il y a deux anses cervicales dans chaque incisive (Figure 3A), mais seule la boucle cervicale labiale contient des SC. Les SC épithéliaux sont localisés au réticulum étoilé et à l’épithélium de l’émail adjacent à l’extrémité de la boucle cervicale20,21. Ils génèrent une descendance caractérisée par l’expression de Sfrp5, qui se différencie en cellules amplifiant le transit hautement prolifératives qui produisent diverses cellules, y compris des améloblastes sécrétant de l’émail 2,7. La différenciation des améloblastes par rapport aux SC peut être récapitulée dans le système de culture d’organes décrit ici2.
Au cours des dernières années, les souris rapporteures chez lesquelles une protéine fluorescente (telle que la GFP) est sous le contrôle d’éléments régulateurs de gènes spécifiques sont devenues un outil largement utilisé pour identifier et isoler des cellules de divers tissus et pour suivre le devenir cellulaire et la progression de la lignée in vivo et in vitro22,23. L’utilisation de ces modèles animaux est bénéfique pour analyser l’effet de diverses molécules régulatrices, car l’intensité et le modèle d’expression du rapporteur fluorescent peuvent être utilisés comme lecture de l’activité des gènes endogènes ou comme rapporteur du statut de prolifération (c.-à-d. modèle murin rapporteur Fucci).
La souris rapporteure transgénique Sox2-GFP modèle24, dans laquelle l’expression améliorée de la GFP (EGFP) est sous le contrôle d’un fragment de 5,5 kb de l’élément régulateur en amont du promoteur Sox2, permet l’identification et la visualisation des cellules souches épithéliales incisives exprimant Sox2 (Figure 4A-C). La génération de souris porteuses de plusieurs rapporteurs fluorescents peut être utile pour l’identification de plus d’une population cellulaire. Par exemple, dans les boucles cervicales de Sox2-GFP; Les cellules souches animales transgéniques Fucci-mKO (GFP+, vert, Figure 4D) et les cellules non prolifératives (Fucci-mKO+, rouge, Figure 4D) peuvent être identifiées. En outre, l’expression de Sox2-GFP peut être utilisée comme rapporteur lors de l’analyse de l’effet de diverses molécules. L’ajout de l’activateur de signalisation Wnt/β-caténine BIO affecte négativement les cellules souches exprimant Sox2 et, par conséquent, l’expression de la GFP (Figure 4E).
Figure 1 : Préparation de la chambre de culture. (A) Lavez le filtre dans 1x PBS. (B) Couper le filtre en morceaux rectangulaires. (C) Préparer le fluide dans la hotte et le faire passer à travers la grille. Évitez la formation de bulles d’air. D) Préchauffer la capsule de culture préparée à l’avance à 37 °C avant d’ajouter des explants de tissu sur un filtre placé sur la grille. E) Représentation caricaturale de la chambre de la culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Culture de tranches de tissu. L’extrémité proximale d’une incisive de souris postnatale de 2 jours (2PN) a été disséquée et sectionnée par vibratome. Des tranches (150 μm d’épaisseur) ont été cultivées et la formation de tissus durs (flèches) a été observée après une culture de 6 jours. Échelle 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Boucle cervicale. (A) Extrémité proximale de l’anse cervicale contenant des incisives (délimitée par une ligne pointillée noire) et linguale (délimitée par une ligne pointillée grise). (B) Coupe histologique de la boucle cervicale labiale, qui représente une niche pour les cellules souches épithéliales. (C) Représentation en bande dessinée de la boucle cervicale labiale et de ses composants. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Utilisation de modèles de souris rapporteures fluorescentes dans un système de culture d’organes. (A) image en fond clair, (B) fluorescente et (C) image superposée de l’extrémité proximale de l’incisive isolée chez des souris Sox2-GFP postnatales de 2 jours. (D) Expression de Sox2-GFP et Fucci-mKO dans l’extrémité proximale de l’incisive isolée de Sox2-GFP postnatal de 2 jours; Souris Fucci-mKO. (E) Effet de BIO sur les cellules souches exprimant Sox2-GFP et la niche des cellules souches (boucle cervicale, délimitée par une ligne pointillée jaune). Échelle 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La culture d’organes in vitro a été largement utilisée pour étudier le potentiel inductif et les interactions épithélio-mésenchymateuses qui régissent la croissance et la morphogenèse des organes. Le laboratoire de Thesleff a montré comment adapter la modification Saxén de la culture d’organes de type Trowell et l’utiliser pour étudier le développement des dents14. Les conditions reproductibles et les progrès dans les rapporteurs fluorescents en ont fait une méthode utile pour surveiller la morphogenèse des dents et les populations cellulaires distinctes qu’elle contient. Cet article décrit comment appliquer ce protocole pour étudier les cellules souches épithéliales et le microenvironnement dans lequel elles résident.
Une technique pour isoler l’extrémité proximale de l’incisive qui contient la niche SC des petits postnataux et des animaux plus âgés a été décrite ici. Le succès de cette méthode dépend du temps d’isolement (qui a un impact direct sur la viabilité tissulaire) et de la capacité d’isoler une extrémité proximale intacte avec une anse cervicale labiale intacte. Ceci est particulièrement difficile chez les animaux plus âgés avec des os minéralisés. Le protocole montre comment utiliser une force mécanique contrôlée pour briser l’os minéralisé et isoler les tissus mous entièrement intacts et viables dans un temps significativement plus court par rapport aux autres protocoles publiés25. Une fois isolé, le tissu peut être cultivé in vitro, soit dans son ensemble, soit sous forme de tranche épaisse. L’inconvénient de la méthode de tranchage des tissus épais est que seule une partie de la boucle cervicale est présente dans chaque tranche; Ainsi, il n’est pas possible d’obtenir une partie identique reproductible de la boucle cervicale dans différentes sections. La culture d’organes fournit une méthode facile et reproductible pour étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent les SC et leur niche au fil du temps. Cependant, il y a des limites à la période totale de culture, principalement en raison de la perte progressive du mésenchyme après les 3-4 premiers jours de culture.
Le tissu isolé peut également être traité ultérieurement pour obtenir une suspension unicellulaire enrichie en SCs épithéliales incisives26. La séparation enzymatique de la boucle cervicale du reste de l’extrémité proximale et l’utilisation de rapporteurs fluorescents spécifiques permettent des analyses plus détaillées de l’ARNm et des protéines (telles que la qPCR, le séquençage de l’ARN unicellulaire) et une meilleure compréhension des populations cellulaires spécifiques dans la niche.
La culture in vitro fournit une plate-forme appropriée pour le dépistage de diverses manipulations génétiques et pharmacologiques pour leur effet régulateur sur les SC épithéliales dentaires et leurs niches. Il convient de noter que le succès des traitements pharmacologiques dépend des propriétés des molécules testées, telles que la demi-vie, la solubilité, la stabilité métabolique, le dosage et la toxicité cellulaire. En combinaison avec un rapporteur fluorescent, l’effet régulateur peut être attribué à une population cellulaire spécifique dans un tissu, fournissant ainsi un outil puissant pour découvrir les mécanismes moléculaires et cellulaires qui régulent les SC épithéliales dentaires et leur niche.
Avec l’utilisation de souris rapporteures fluorescentes spécifiques, il est possible d’identifier et de suivre des populations cellulaires spécifiques dans les tissus vivants au fil du temps. Récemment, il a été démontré que la culture d’organes in vitro peut être utilisée pour l’imagerie en direct du développement des dents16. De plus, le comportement cellulaire peut être imagé sur une courte période de temps en utilisant la culture in vitro de tranches de tissu épaisses7. Comme indiqué précédemment, seule une partie du créneau SC peut être imagée et la durée d’imagerie est brève. Idéalement, l’ensemble du créneau SC devrait être imagée. Cependant, l’imagerie 4D time-lapse de cette structure est difficile, principalement en raison de l’épaisseur de la niche et des limites des méthodes d’imagerie actuellement disponibles. Néanmoins, les progrès continus de la technologie d’imagerie promettent un avenir passionnant dans la découverte des comportements cellulaires qui constituent la niche SC incisive.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Cette étude a été soutenue par la Fondation Jane et Aatos Erkko.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
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