Summary
Trowell-typ organodlingsmetod har använts för att avslöja komplexa signalnätverk som styr tandutveckling och, på senare tid, för att studera reglering involverad i stamceller i den kontinuerligt växande musens framtänd. Fluorescerande reporterdjurmodeller och levande avbildningsmetoder underlättar djupgående analyser av tandstamceller och deras specifika nischmikromiljö.
Abstract
Organutveckling, funktion och regenerering beror på stamceller, som finns i diskreta anatomiska utrymmen som kallas stamcellsnischer. Den kontinuerligt växande mussnittet ger en utmärkt modell för att studera vävnadsspecifika stamceller. De epitelvävnadsspecifika stamcellerna i snittet är belägna vid den proximala änden av tanden i en nisch som kallas livmoderhalsslingan. De ger en kontinuerlig tillströmning av celler för att motverka den konstanta nötningen av tandens självslipande spets. Här presenteras ett detaljerat protokoll för isolering och odling av den proximala änden av mussnittet som rymmer stamceller och deras nisch. Detta är ett modifierat organodlingsprotokoll av Trowell-typ som möjliggör in vitro-odling av vävnadsbitar (explanter), liksom de tjocka vävnadsskivorna vid vätske- / luftgränssnittet på ett filter som stöds av ett metallgaller. Organodlingsprotokollet som beskrivs här möjliggör vävnadsmanipulationer som inte är genomförbara in vivo , och i kombination med användning av fluorescerande rapportörer ger det en plattform för identifiering och spårning av diskreta cellpopulationer i levande vävnader över tid, inklusive stamceller. Olika regulatoriska molekyler och farmakologiska föreningar kan testas i detta system för deras effekt på stamceller och deras nischer. Detta ger i slutändan ett värdefullt verktyg för att studera stamcellsreglering och underhåll.
Introduction
Musframtänder växer kontinuerligt på grund av livslångt bevarande av stamcellerna (SC) som stöder den oupphörliga produktionen av tandkomponenter. Dessa inkluderar epitel-SC, som genererar emaljproducerande ameloblaster, och mesenkymala stamceller (MSC), som genererar dentinproducerande odontoblaster, bland andra celler1. Epitel-SCs i de kontinuerligt växande framtänderna identifierades ursprungligen som etiketthållande celler2,3 och har sedan dess visat sig uttrycka ett antal välkända stamhetsgener, inklusive Sox24. Dessa celler delar gemensamma drag med epitel-SC i andra organ och ligger inom SC-nischen som kallas livmoderhalsslingan som ligger på labialsidan av snittet. Nischen är en dynamisk enhet som består av celler och extracellulär matris som styr SC-aktivitet5. Lineage-tracing-studier har visat att Sox2+ epitel-SCs kan regenerera hela epitelfacket i tanden och att de är avgörande för successionell tandbildning 6,7. MSC med dentinreparativ eller regenerativ potential rekryteras till stor del utanför organet genom blodkärl och nerver 8,9,10,11, vilket ger en lämplig modell för att studera rekrytering, migration och boende av MSC-befolkningen.
Att studera SCs in vivo är inte alltid genomförbart, eftersom många av de genetiska och/eller farmakologiska manipulationerna kan påverka organhomeostas och/eller få dödliga konsekvenser. Därför ger organkultur ett utmärkt verktyg för att studera reglering av SCs och deras nischer in vitro. Orgelodlingssystemet som använder ett metallnät utvecklades ursprungligen av Trowell12 för att studera organutveckling och har modifierats ytterligare av Saxen13 för att studera induktiva signaler vid njurutveckling. Sedan dess har denna in vitro-metod för odling av hela eller delar av organet framgångsrikt tillämpats inom olika områden. Inom tandutveckling har denna metod använts i stor utsträckning för att studera epitelial-mesenkymala interaktioner som styr tandutveckling14 och successionell tandbildning15. Thesleff-laboratoriets arbete har visat nyttan av detta system för tidsanalys av tandtillväxt och morfogenes, för analys av effekten av olika molekyler och tillväxtfaktorer på tandtillväxt och för time-lapse live imaging av tandutveckling16,17. På senare tid har denna metod använts för att studera reglering av snitt-SCs och deras nisch18,19, som beskrivs i detalj här.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll omfattar användning av djur och alla förfaranden har godkänts av etiska kommittéer för användning och skötsel av djur och djuranläggningen vid Helsingfors universitet.
1. Beredning av orgelodlingsskålen
- Utför alla procedurer i en laminär flödeshuv. Rengör arbetsytor med 70% etanol och använd autoklaverade glasinstrument och lösningar. Sterilisera sax och annan metallutrustning i en glaspärlsterilisator.
- Förbered filter som normalt lagras i 70% etanol genom att tvätta dem tre gånger i 1x PBS för att avlägsna etanol (figur 1). Skär filter i rektangulära bitar (3 x 3-5 x 5 mm).
OBS: Tvättade filterbitar kan förvaras i flera dagar i 1x PBS vid 4 °C. - Förbered odlingsmediet (1:1 DMEM:F12 kompletterat med 1% [v/v] 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/ml askorbinsyra och 0,2% [v/v] penicillin [10 000 I.U./ml] och streptomycin [10 000 μg/ml]). Förvaras vid 4 °C.
- Placera 30 mm metallgaller (med hål med en diameter på 1-2 mm som möjliggör vävnadsavbildning) i en 35 mm petriskål. Lägg till tillräckligt med media för att nå gallerytan utan att producera luftbubblor. Förvärm den beredda odlingsskålen vid 37 ° C tills vävnaden är isolerad och klar för odling (i en standardinkubator med 5%CO2 och 90% -95% fuktighet).
2. Incisor dissektion och isolering av den proximala änden
- Avliva djuren enligt ett godkänt djurvårdsprotokoll.
- Halshugga musen och dissekera underkäken. För att göra det, ta först bort huden för att exponera underkäken och skär genom massörmusklerna för att skilja den från maxillan och resten av huvudet.
- När underkäken är isolerad, ta bort tungan och så mycket mjukvävnad som möjligt.
- Samla alla mandiblar och förvara dem i en petriskål som innehåller PBS på is, eftersom detta ökar vävnadens livskraft.
- Överför en underkäke till en petriskål i glas och använd engångsnålar på 20/26 G för att dissekera snittet under ett stereomikroskop. Dela underkäken vid mittlinjen och skär genom symfysen. Rengör mjuk- och muskelvävnaden bort från benytan för bättre visualisering.
OBS: En petriskål i glas är nödvändig, eftersom detta inte kommer att trubba av nålarna. - Mandibles erhållna från djur yngre än 10 dagar är mjukare och mer ömtåliga, använd därför engångs 20/26 G hypodermiska nålar för att öppna varje hälft av underkäken i längdriktningen för att exponera snitttanden. För möss äldre än 10 dagar, använd pincett för att greppa underkäken och bryta benet för att exponera tanden.
- Lossa försiktigt snittet från det omgivande benet och skär av den proximala änden, som innehåller livmoderhalsslingan.
- Skär den proximala änden och ta bort den mineraliserade emaljen och dentinmatrisen.
- Håll de uppsamlade proximala ändarna i Dulbeccos PBS på is tills de är redo för kultur.
3. Kultur
- Placera försiktigt en filterrektangel på toppen av ett galler i en förvärmd kulturskål.
- Använd ett stereomikroskop för att orientera vävnadsbitarna ordentligt.
- Placera i en standardinkubator vid 37 °C med 5% CO2och 90% -95% luftfuktighet.
- Byt medium varannan dag och ersätt med färskt medium, försiktigt undvika bildandet av luftbubblor. Övervaka vävnadstillväxt och fotografera dagligen med en kamera ansluten till stereomikroskopet.
4. Lägga till lösliga faktorer i kulturen
- Komplettera odlingsmediet med lösliga faktorer och molekyler av intresse för att studera deras effekt på reglering av SC.
OBS: Administreringsprotokollet för vilken molekyl som helst (tillväxtfaktorer, signalmolekyler, blockerande antikroppar, farmakologiska föreningar såsom hämmare eller aktivatorer, vektorer etc.) beror på dess halveringstid och löslighet. Dessa parametrar bestämmer också lämplig kontroll som ska användas.
5. Molekylära och histologiska analyser
- Ta bort odlingsmediet.
- Tillsätt försiktigt iskall metanol i vävnaderna för att förhindra att den lossnar från filtren.
- Låt metanol stå i 5 min.
- Överför filter som bär vävnadsutväxter till provtagningsrör.
- Fixera explanterna i 4% paraformaldehyd i PBS i 10-24 timmar vid 4 °C.
- Fortsätt med etablerade protokoll för histologisk bearbetning (paraffin, frusen, etc.) eller immunfärgningar.
6. Kultur av vävnadsskivor
OBS: Det finns flera varianter av detta protokoll, som alla är lika framgångsrika och är en fråga om personligt val, beroende på användarens hastighet och skicklighet. Dessa hänvisar till den buffert som används för att samla in och upprätthålla vävnadens livskraft. För detta ändamål kan Krebs-buffert, PBS kompletterad med 2% glukos och antibiotika eller PBS användas. Om Krebs-buffert används ska den göras 1 dag i förväg och förvaras vid 4 °C.
- Före experimentet, förbered 4% -5% lågsmältpunkt agaros genom att lösa upp 2-2,5 g lågsmältpunkt agaros i 50 ml kokande 2% glukos / PBS, varefter lösningen ska placeras i ett 45 ° C vattenbad.
- Ställ in vibratomet, tvätta med 70% etanol och fyll med iskall 2% glukos / PBS kompletterat med antibiotika (100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin).
- Dissekera de proximala ändarna av snittet och samla dem i den iskalla 2% glukos / PBS kompletterad med antibiotika.
- Placera en proximal ände av snittet i formen som innehåller 4% -5% lågsmältpunkt agaros. Under ett stereomikroskop, orientera biten i önskad riktning och lämna på is för att agarosen ska härda.
- Trimma det härdade agarosblocket och placera det i vibratomet. Skär tjocka skivor (150-300 μm).
- Samla skivorna i en petriskål som innehåller iskall 2% glukos/PBS kompletterat med antibiotika.
- Använd en spatel för att överföra de tjocka skivorna på en filterrektangel placerad på det förvärmda rutnätet som förberetts enligt avsnitt 1.3.
- Inkubera de tjocka skivorna i inkubatorn och fortsätt med avbildning (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Epitel-SC: erna finns i en nisch som kallas livmoderhalsslingan, som ligger vid den proximala änden av snittet (figur 3A). Cervikala slingor är morfologiskt distinkta strukturer som består av inre och yttre emaljepitel som omsluter stellatretikulum, en kärna av löst arrangerade epitelceller (figur 3B, C). Det finns två livmoderhalsslingor i varje framtand (figur 3A), men endast den labiala livmoderhalsslingan innehåller SC. Epitel-SCs är lokaliserade till stellatretikulum och det intilliggande emaljepitelet vid spetsen av livmoderhalsslingan20,21. De genererar avkomma som kännetecknas av Sfrp5-uttryck, som differentieras till mycket proliferativa transitförstärkande celler som producerar olika celler, inklusive emaljutsöndrande ameloblaster 2,7. Ameloblastdifferentiering från SCs kan rekapituleras i det organodlingssystem som beskrivs här2.
Under de senaste åren har reportermöss där ett fluorescerande protein (såsom GFP) är under kontroll av specifika genreglerande element blivit ett allmänt använt verktyg för att identifiera och isolera celler från olika vävnader och för att följa cellens öde och härstamningsprogression in vivo och in vitro22,23. Användningen av dessa djurmodeller är fördelaktig för att analysera effekten av olika reglerande molekyler, eftersom intensiteten och mönstret för fluorescerande reporteruttryck kan användas som en avläsning av endogen genaktivitet eller som en reporter av spridningsstatus (dvs. Fucci reporter musmodell).
Sox2-GFP transgen reportermusmodell24, där det förbättrade GFP-uttrycket (EGFP) kontrolleras av ett 5,5 kb-fragment av uppströms regleringselementet i Sox2-promotorn, möjliggör identifiering och visualisering av Sox2-uttryckande framtändsepitelstamceller (figur 4A-C). Generering av möss som bär flera fluorescerande reportrar kan vara användbar för identifiering av mer än en cellpopulation. Till exempel i livmoderhalsslingor från Sox2-GFP; Fucci-mKO transgena djurstamceller (GFP+, grönt, figur 4D) och icke-proliferativa celler (Fucci-mKO+, rött, figur 4D) kan identifieras. Dessutom kan Sox2-GFP-uttryck användas som reporter vid analys av effekten av olika molekyler. Tillägg av Wnt/β-catenin-signalaktivatorn BIO påverkar Sox2-uttryckande stamceller negativt och följaktligen GFP-uttryck (figur 4E).
Figur 1: Beredning av odlingskammaren . (A) Tvätta filtret i 1x PBS. (B) Skär filtret i rektangulära bitar. (C) Förbered media i huven och pipa det genom gallret. Undvik luftbubbelbildning. D) Förvärm den förberedda odlingsskålen vid 37 °C innan vävnadsutplantorna läggs till på ett filter som placerats på gallret. (E) Tecknad representation av kulturkammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Odla vävnadsskivor. Den proximala änden av en 2-dagars postnatal (2PN) musscisor dissekerades och sektionerades av vibratom. Skivor (150 μm tjocka) odlades och hårdvävnadsbildning (pilar) observerades efter en 6-dagars kultur. Skala 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Cervikal slinga. (A) Proximal ände av den snitt som innehåller labial (skisserad av svart streckad linje) och lingual (skisserad av grå streckad linje) cervikala slingor. (B) Histologisk del av labial cervikal slinga, som representerar en nisch för epitelstamceller. (C) Tecknad representation av labial cervikal slinga och dess komponenter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Användning av fluorescerande reportermusmodeller i ett organodlingssystem. (A) Brightfield, (B) fluorescerande och (C) överlagringsbild av den proximala änden av snittet isolerad från 2-dagars postnatal Sox2-GFP-möss. D) Sox2-GFP- och Fucci-mKO-uttryck i den proximala änden av snittet isolerat från 2-dagars postnatal Sox2-GFP. Fucci-mKO-möss. (E) Effekten av BIO på stamcellerna som uttrycker Sox2-GFP och stamcellsnischen (cervikal slinga, skisserad av gul streckad linje). Skala 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro-organodling har använts i stor utsträckning för att studera induktiv potential och epitel-mesenkymala interaktioner som styr organtillväxt och morfogenes. Thesleff-laboratoriet har visat hur man kan anpassa Saxén-modifieringen av orgelkulturen av Trowell-typ och använda den för att studera tandutveckling14. De reproducerbara förhållandena och framstegen hos fluorescerande reportrar har gjort detta till en användbar metod för övervakning av tandmorfogenes och de distinkta cellpopulationerna inom. Detta dokument beskrev hur man tillämpar detta protokoll för att studera epitelstamceller och mikromiljön där de bor.
En teknik för att isolera den proximala änden av snittet som innehåller SC-nischen från postnatala valpar och från äldre djur beskrivs här. Framgången för denna metod beror på isoleringstiden (som direkt påverkar vävnadens livskraft) och på förmågan att isolera en oskadad proximal ände med en intakt labial livmoderhalsslinga. Detta är särskilt utmanande hos äldre djur med mineraliserat ben. Protokollet visar hur man använder kontrollerad mekanisk kraft för att bryta det mineraliserade benet och isolera helt intakt och livskraftig mjukvävnad på betydligt kortare tid jämfört med andra publicerade protokoll25. När den är isolerad kan vävnaden odlas in vitro, antingen som helhet eller som en tjock skiva. Nackdelen med den tjocka vävnadsskivningsmetoden är att endast en del av livmoderhalsslingan är närvarande i varje skiva; Således är det inte möjligt att erhålla en reproducerbart identisk del av livmoderhalsslingan i olika sektioner. Organkultur ger en enkel och reproducerbar metod för att studera de molekylära och cellulära mekanismerna som reglerar SCs och deras nisch över tid. Det finns emellertid begränsningar för den totala kulturperioden, främst på grund av den progressiva förlusten av mesenkym efter de första 3-4 dagarna av kulturen.
Den isolerade vävnaden kan också bearbetas ytterligare för att erhålla en enda cellsuspension berikad i framtändsepitelial SCs26. Enzymatisk separation av livmoderhalsslingan från resten av den proximala änden och användningen av specifika fluorescerande reportrar möjliggör mer detaljerade mRNA- och proteinanalyser (såsom qPCR, encells RNA-sekvensering) och en större inblick i specifika cellpopulationer inom nischen.
In vitro-odling ger en lämplig plattform för screening av olika genetiska och farmakologiska manipuleringar för deras reglerande effekt på tandepitel-SCs och deras nischer. Det bör noteras att framgången för de farmakologiska behandlingarna beror på egenskaperna hos de testade molekylerna, såsom halveringstid, löslighet, metabolisk stabilitet, dosering och celltoxicitet. I kombination med en fluorescerande reporter kan den regulatoriska effekten tilldelas en specifik cellpopulation i en vävnad, vilket ger ett kraftfullt verktyg för att avslöja de molekylära och cellulära mekanismerna som reglerar tandepitel-SCs och deras nisch.
Med hjälp av specifika fluorescerande reportermöss är det möjligt att identifiera och följa specifika cellpopulationer inom levande vävnad över tid. Nyligen har det visats att in vitro-organodling kan användas för levande avbildning av tandutveckling16. Dessutom kan cellbeteende avbildas under en kort tidsperiod med hjälp av in vitro-odling av tjocka vävnadsskivor7. Som tidigare angivits kan endast en del av SC-nischen avbildas och bildlängden är kort. Helst bör hela SC-nischen avbildas. 4D-tidsfördröjningsavbildning av denna struktur är dock utmanande, främst på grund av nischens tjocklek och begränsningarna hos för närvarande tillgängliga bildmetoder. Ändå lovar kontinuerliga framsteg inom bildteknik en spännande framtid när det gäller att avslöja cellulära beteenden som utgör den snedställda SC-nischen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Studien stöddes av Jane och Aatos Erkkos stiftelse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
