Summary
Trowell-type organkulturmetode har blitt brukt til å avdekke komplekse signalnettverk som styrer tannutvikling og, mer nylig, for å studere regulering involvert i stamceller i det kontinuerlig voksende musesnittet. Fluorescerende reporter dyremodeller og live-imaging metoder muliggjør grundige analyser av dental stamceller og deres spesifikke nisje mikromiljø.
Abstract
Organutvikling, funksjon og regenerering er avhengig av stamceller, som ligger innenfor diskrete anatomiske rom kalt stamcellenisjer. Det kontinuerlig voksende musefortennet gir en utmerket modell for å studere vevsspesifikke stamceller. De epitelvevsspesifikke stamcellene i snittet befinner seg i den proksimale enden av tannen i en nisje kalt livmorhalssløyfen. De gir en kontinuerlig tilstrømning av celler for å motvirke den konstante slitasjen av tannens selvslipende spiss. Presentert her er en detaljert protokoll for isolasjon og kultur av den proksimale enden av musesnittet som huser stamceller og deres nisje. Dette er en modifisert Trowell-type organkulturprotokoll som muliggjør in vitro-kultur av vevsstykker (eksplanter), samt de tykke vevsskivene ved væske/luft-grensesnittet på et filter støttet av et metallgitter. Organkulturprotokollen som er beskrevet her, muliggjør vevsmanipulasjoner som ikke er gjennomførbare in vivo , og når den kombineres med bruk av en fluorescerende reporter (er), gir den en plattform for identifisering og sporing av diskrete cellepopulasjoner i levende vev over tid, inkludert stamceller. Ulike regulatoriske molekyler og farmakologiske forbindelser kan testes i dette systemet for deres effekt på stamceller og deres nisjer. Dette gir til slutt et verdifullt verktøy for å studere stamcelleregulering og vedlikehold.
Introduction
Musens fortenner vokser kontinuerlig på grunn av livslang bevaring av stamceller (SC) som støtter uopphørlig produksjon av tannkomponenter. Disse inkluderer epiteliale SCs, som genererer emaljeproduserende ameloblaster, og mesenkymale stamceller (MSCs), som genererer dentinproduserende odontoblaster, blant andre celler1. Epiteliale SCs i de kontinuerlig voksende snittene ble opprinnelig identifisert som etikettbevarende celler2,3 og har siden vist seg å uttrykke en rekke kjente stammegener, inkludert Sox24. Disse cellene deler fellestrekk med epiteliale SCs i andre organer og ligger innenfor SC-nisjen kalt livmorhalssløyfen som ligger på labialsiden av snittet. Nisjen er en dynamisk enhet sammensatt av celler og ekstracellulær matrise som styrer SC-aktivitet5. Lineage-tracing-studier har vist at Sox2+ epiteliale SCs kan regenerere hele epitelrommet i tannen, og at de er avgjørende for suksessiv tanndannelse 6,7. MSC-er med dentinreparativt eller regenerativt potensial rekrutteres i stor grad fra utsiden av organet gjennom blodkar og nerver 8,9,10,11, og gir derfor en passende modell for å studere rekruttering, migrasjon og bolig for MSC-befolkningen.
Å studere SCs in vivo er ikke alltid mulig, siden mange av de genetiske og / eller farmakologiske manipulasjonene kan påvirke organhomeostase og / eller ha dødelige konsekvenser. Derfor er organkultur et utmerket verktøy for å studere regulering av SCs og deres nisjer in vitro. Organkultursystemet som benytter et metallgitter ble opprinnelig utviklet av Trowell12 for å studere organutvikling og har blitt ytterligere modifisert av Saxen13 for å studere induktive signaler i nyreutvikling. Siden da har denne in vitro-metoden for dyrking av hele eller deler av orgelet blitt brukt på forskjellige felt. Innen tannutvikling har denne metoden blitt mye brukt til å studere epithelial-mesenkymale interaksjoner som styrer tannutvikling14 og suksessional tanndannelse15. Arbeidet til Thesleff-laboratoriet har vist nytten av dette systemet for tidsmessig analyse av tannvekst og morfogenese, for analyse av effekten av forskjellige molekyler og vekstfaktorer på tannvekst, og for time-lapse levende avbildning av tannutvikling16,17. Mer nylig har denne metoden blitt brukt til å studere regulering av snitt SCs og deres nisje18,19, som er beskrevet i detalj her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen innebærer bruk av dyr og alle prosedyrene ble godkjent av etiske komiteer for bruk og stell av dyr og dyreavdelingen ved Helsingfors universitet.
1. Tilberedning av organkulturretten
- Utfør alle prosedyrer i en laminær strømningshette. Rengjør arbeidsflater med 70% etanol og bruk autoklaverte glassinstrumenter og løsninger. Steriliser saks og annet metallutstyr i en glassperlesterilisator.
- Forbered filtre som normalt lagres i 70% etanol ved å vaske dem tre ganger i 1x PBS for å fjerne etanol (figur 1). Skjær filtre i rektangulære stykker (3 x 3-5 x 5 mm).
MERK: Vaskede filterbiter kan oppbevares i flere dager i 1x PBS ved 4 °C. - Forbered kulturmediet (1: 1 DMEM: F12 supplert med 1% [v / v] 200 mM L-alanyl-L-glutamindipeptid i 0,85% NaCl, 10% [v / v] FBS, 150 μg / ml askorbinsyre og 0,2% [v / v] penicillin [10,000 IE / ml] og streptomycin [10,000 μg / ml]). Oppbevares ved 4 °C.
- Plasser 30 mm metallgitter (med hull på 1-2 mm diameter som muliggjør vevsavbildning) i en 35 mm petriskål. Legg til tilstrekkelig media for å nå rutenettoverflaten uten å produsere luftbobler. Forvarm den tilberedte kulturskålen ved 37 ° C til vevet er isolert og klart for kultur (i en standard inkubator med 5% CO2 og 90% -95% fuktighet).
2. Snittdisseksjon og isolering av den proksimale enden
- Ofre dyrene etter en godkjent dyrepleieprotokoll.
- Halshugg musen og disseker mandibelen. For å gjøre det, fjern først huden for å eksponere mandibelen og skjær gjennom massetermusklene for å skille den fra maxillaen og resten av hodet.
- Når mandibelen er isolert, fjern tungen og så mye bløtvev som mulig.
- Samle alle mandiblene og oppbevar dem i en petriskål som inneholder PBS på is, da dette forbedrer vevets levedyktighet.
- Overfør en mandibel til en petriskål i glass og bruk engangs 20/26 G hypodermiske nåler for å dissekere snittet under et stereomikroskop. Del mandibelen på midtlinjen, skjær gjennom symfysen. Rengjør bløt- og muskelvevet vekk fra beinoverflaten for bedre visualisering.
MERK: En petriskål av glass er viktig, da dette ikke vil stumpe nålene. - Mandibler hentet fra dyr yngre enn 10 dager er mykere og skjørere, bruk derfor engangs 20/26 G hypodermiske nåler for å åpne hver halvdel av mandibelen i lengderetningen for å eksponere snittetannen. For mus eldre enn 10 dager, bruk pinsett for å gripe mandibelen og bryte beinet for å eksponere tannen.
- Løsne forsiktig snittet fra det omkringliggende beinet og kutt av den proksimale enden, som inneholder livmorhalssløyfen.
- Klipp den proksimale enden og fjern den mineraliserte emalje- og dentinmatrisen.
- Hold de oppsamlede proksimale endene i Dulbeccos PBS på is til de er klare for kultur.
3. Kultur
- Plasser forsiktig et filterrektangel på toppen av et rutenett i en forvarmet kulturskål.
- Bruk et stereomikroskop for å orientere vevsstykkene riktig.
- Plasser i en standard inkubator ved 37 °C med 5% CO2 og 90% -95% fuktighet.
- Bytt medium annenhver dag og erstatt med friskt medium, og unngå forsiktig dannelse av luftbobler. Overvåk vevsvekst og fotografer daglig ved hjelp av et kamera festet til stereomikroskopet.
4. Legge til løselige faktorer til kulturen
- Suppler kulturmediet med løselige faktorer og molekyler av interesse for å studere deres effekt på regulering av SCs.
MERK: Administrasjonsprotokollen for ethvert molekyl (vekstfaktorer, signalmolekyler, blokkerende antistoffer, farmakologiske forbindelser som hemmere eller aktivatorer, vektorer, etc.) avhenger av halveringstid og oppløselighet. Disse parametrene bestemmer også riktig kontroll som skal brukes.
5. Molekylære og histologiske analyser
- Fjern kulturmediet.
- Tilsett forsiktig iskald metanol i vevet for å forhindre løsrivelse fra filtrene.
- La metanol stå i 5 min.
- Overfør filtre som bærer vevseksplanter til prøvetakingsrør.
- Fest eksplantene i 4% paraformaldehyd i PBS i 10-24 timer ved 4 °C.
- Fortsett med etablerte protokoller for histologisk behandling (paraffin, frossen, etc.) eller immunostainings.
6. Kultur av vevskiver
MERK: Det er flere varianter av denne protokollen, som alle er like vellykkede og er et spørsmål om personlig valg, avhengig av hastigheten og ferdighetene til brukeren. Disse refererer til bufferen som brukes til å samle og opprettholde vevets levedyktighet. Til dette formål kan Krebs buffer, PBS supplert med 2% glukose og antibiotika, eller PBS brukes. Hvis Krebs buffer brukes, bør den lages 1 dag i forveien og oppbevares ved 4 °C.
- Før forsøket, tilbered 4% -5% lavsmeltepunkt agarose ved å oppløse 2-2,5 g lavsmeltepunktagarose i 50 ml kokende 2% glukose / PBS, hvorpå løsningen skal plasseres i et 45 ° C vannbad.
- Sett opp vibratomen, vask med 70% etanol og fyll med iskald 2% glukose / PBS supplert med antibiotika (100 U / ml penicillin, 100 mg / ml streptomycin).
- Disseker de proksimale endene av snittet og samle dem i iskald 2% glukose / PBS supplert med antibiotika.
- Plasser en proksimal ende av snittet i formen som inneholder 4% -5% lavsmeltepunkt agarose. Under et stereomikroskop, orienter stykket i ønsket retning og la det stå på is for at agarosen skal herdes.
- Trim den herdede agaroseblokken og legg den i vibratomen. Skjær tykke skiver (150-300 μm).
- Samle skivene i en petriskål som inneholder iskald 2% glukose/PBS supplert med antibiotika.
- Bruk en slikkepott til å overføre de tykke skivene på et filterrektangel plassert på det forvarmede gitteret tilberedt som i avsnitt 1.3.
- Inkuber de tykke skivene i inkubatoren og fortsett med avbildning (figur 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Epiteliale SCs ligger i en nisje kalt cervical loop, som ligger i den proksimale enden av snittet (figur 3A). Cervikale sløyfer er morfologisk distinkte strukturer sammensatt av indre og ytre emaljeepitel som omslutter stellatretikulumet, en kjerne av løst arrangerte epitelceller (figur 3B, C). Det er to cervikale sløyfer i hvert fortenn (figur 3A), men bare labial cervikal sløyfe inneholder SCs. Epiteliale SCs er lokalisert til stellatretikulum og det tilstøtende emaljeepitelet på spissen av livmorhalssløyfen20,21. De genererer avkom preget av Sfrp5-uttrykk, som skiller seg ut i svært proliferative transittforsterkende celler som produserer forskjellige celler, inkludert emaljeutskillende ameloblaster 2,7. Ameloblastdifferensiering fra SCs kan rekapituleres i organkultursystemet beskrevet her2.
I de senere år har reportermus der et fluorescerende protein (som GFP) er under kontroll av spesifikke genregulerende elementer, blitt et mye brukt verktøy for å identifisere og isolere celler fra forskjellige vev og å følge celleskjebne og avstamningsprogresjon in vivo og in vitro22,23. Bruken av disse dyremodellene er gunstig for å analysere effekten av ulike regulatoriske molekyler, siden intensiteten og mønsteret av fluorescerende reporteruttrykk kan brukes som en avlesning av endogen genaktivitet, eller som reporter av spredningsstatus (dvs. Fucci reporter musemodell).
Sox2-GFP transgen reporter musemodell24, der det forbedrede GFP (EGFP) uttrykket er under kontroll av et 5.5 kb fragment av oppstrøms reguleringselement i Sox2-promotoren, muliggjør identifisering og visualisering av Sox2-uttrykkende incisor epiteliale stamceller (figur 4A-C). Generering av mus som bærer flere fluorescerende reportere kan være nyttig for identifisering av mer enn en cellepopulasjon. For eksempel i livmorhalssløyfer fra Sox2-GFP; Fucci-mKO transgene dyr stamceller (GFP+, grønn, figur 4D) og ikke-proliferative celler (Fucci-mKO+, rød, figur 4D) kan identifiseres. I tillegg kan Sox2-GFP-uttrykk brukes som reporter når man analyserer effekten av forskjellige molekyler. Tilsetning av Wnt/β-catenin-signalaktivatoren BIO påvirker Sox2-uttrykkende stamceller og følgelig GFP-uttrykk negativt (figur 4E).
Figur 1: Klargjøring av kulturkammeret . (A) Vask filteret i 1x PBS. (B) Skjær filteret i rektangulære stykker. (C) Forbered media i hetten og pipet det gjennom rutenettet. Unngå dannelse av luftbobler. (D) Forvarm den ferdig tilberedte kulturskålen ved 37 °C før du tilsetter vevseksplanter på et filter plassert på rutenettet. (E) Tegneseriefremstilling av kulturkammeret. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Dyrking av vevsskiver. Den proksimale enden av et 2-dagers postnatalt (2PN) musefortenner ble dissekert og snittet av vibratome. Skiver (150 μm tykke) ble dyrket og hard vevsdannelse (piler) ble observert etter en 6-dagers kultur. Skala 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Cervikal sløyfe . (A) Proksimal ende av de fortennholdige labiale (skissert med svart stiplet linje) og lingual (skissert av grå stiplet linje) cervikale løkker. (B) Histologisk del av labial cervical loop, som representerer en nisje for epitelstamceller. (C) Tegneserie representasjon av labial cervical loop og dens komponenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Bruk av fluorescerende reportermusmodeller i et organkultursystem. (A) Brightfield, (B) fluorescerende og (C) overleggsbilde av den proksimale enden av snittet isolert fra 2-dagers postnatale Sox2-GFP-mus. (D) Sox2-GFP og Fucci-mKO-uttrykk i den proksimale enden av snittet isolert fra 2-dagers postnatal Sox2-GFP; Fucci-mKO mus. (E) Effekt av BIO på stamceller som uttrykker Sox2-GFP og stamcelle nisje (cervical loop, skissert av gul stiplet linje). Skala 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vitro organkultur har blitt mye brukt til å studere induktivt potensial og epitel-mesenkymale interaksjoner som styrer organvekst og morfogenese. Thesleff-laboratoriet har vist hvordan man kan tilpasse Saxén-modifikasjonen av Trowell-typen organkultur og bruke den til å studere tannutvikling14. De reproduserbare forholdene og fremskrittene i fluorescerende reportere har gjort dette til en nyttig metode for overvåking av tannmorfogenese og de forskjellige cellepopulasjonene innenfor. Dette papiret beskrev hvordan man bruker denne protokollen til å studere epitelstamceller og mikromiljøet de bor i.
En teknikk for å isolere den proksimale enden av snittet som inneholder SC-nisjen fra barselvalper og fra eldre dyr ble beskrevet her. Suksessen til denne metoden avhenger av isolasjonstiden (som direkte påvirker vevets levedyktighet) og på evnen til å isolere en uskadet proksimal ende med en intakt labial cervikal sløyfe. Dette er spesielt utfordrende hos eldre dyr med mineralisert bein. Protokollen viser hvordan man bruker kontrollert mekanisk kraft til å bryte det mineraliserte beinet og isolere helt intakt og levedyktig bløtvev på betydelig kortere tid sammenlignet med andre publiserte protokoller25. Når det er isolert, kan vevet dyrkes in vitro, enten som helhet eller som en tykk skive. Ulempen med den tykke vevskuttingsmetoden er at bare en del av livmorhalssløyfen er tilstede i hver skive; Dermed er det ikke mulig å oppnå en reproduserbar identisk del av livmorhalssløyfen i forskjellige seksjoner. Organkultur gir en enkel og reproduserbar metode for å studere de molekylære og cellulære mekanismene som regulerer SCs og deres nisje over tid. Imidlertid er det begrensninger i den totale kulturperioden, hovedsakelig på grunn av det progressive tapet av mesenkym etter de første 3-4 dagene av kulturen.
Det isolerte vevet kan også viderebehandles for å oppnå en enkeltcellesuspensjon beriket i incisor epiteliale SCs26. Enzymatisk separasjon av livmorhalssløyfen fra resten av den proksimale enden og bruk av spesifikke fluorescerende reportere muliggjør mer detaljerte mRNA- og proteinanalyser (som qPCR, encellet RNA-sekvensering) og større innsikt i spesifikke cellepopulasjoner innenfor nisjen.
In vitro-kultur gir en egnet plattform for screening av ulike genetiske og farmakologiske manipulasjoner for deres regulatoriske effekt på tannepitel-SCs og deres nisjer. Det skal bemerkes at suksessen til farmakologiske behandlinger avhenger av egenskapene til de testede molekylene, som halveringstid, oppløselighet, metabolsk stabilitet, dosering og celletoksisitet. I kombinasjon med en fluorescerende reporter kan den regulatoriske effekten tildeles en bestemt cellepopulasjon i et vev, og dermed gi et kraftig verktøy for å avdekke molekylære og cellulære mekanismer som regulerer tannepitel SCs og deres nisje.
Ved bruk av spesifikke fluorescerende reportermus er det mulig å identifisere og følge spesifikke cellepopulasjoner i levende vev over tid. Nylig har det vist seg at in vitro organkultur kan brukes til levende avbildning av tannutvikling16. I tillegg kan celleoppførsel avbildes over en kort periode ved bruk av in vitro-kultur av tykke vevsskiver7. Som tidligere angitt, kan bare en del av SC-nisjen avbildes, og bildevarigheten er kort. Ideelt sett bør hele SC-nisjen avbildes. Imidlertid er 4D time-lapse-avbildning av denne strukturen utfordrende, hovedsakelig på grunn av tykkelsen på nisjen og begrensningene i dagens tilgjengelige bildebehandlingsmetoder. Likevel lover kontinuerlige fremskritt innen bildeteknologi en spennende fremtid i å avdekke cellulær atferd som utgjør incisor SC-nisjen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av Jane og Aatos Erkko Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
