Summary
Trowell tipi organ kültürü yöntemi, diş gelişimini yöneten karmaşık sinyal ağlarını çözmek ve daha yakın zamanlarda, sürekli büyüyen fare kesici dişinin kök hücrelerinde yer alan düzenlemeleri incelemek için kullanılmıştır. Floresan muhabir hayvan modelleri ve canlı görüntüleme yöntemleri, dental kök hücrelerin ve bunların spesifik niş mikro çevrelerinin derinlemesine analizini kolaylaştırır.
Abstract
Organ gelişimi, işlevi ve yenilenmesi, kök hücre nişleri adı verilen ayrı anatomik boşluklarda bulunan kök hücrelere bağlıdır. Sürekli büyüyen fare kesici dişi, dokuya özgü kök hücreleri incelemek için mükemmel bir model sağlar. Kesici dişin epitel dokusuna özgü kök hücreleri, dişin proksimal ucunda, servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur. Dişin kendiliğinden keskinleşen ucunun sürekli aşınmasını dengelemek için sürekli bir hücre akışı sağlarlar. Burada, kök hücreleri ve nişlerini barındıran fare kesici dişinin proksimal ucunun izolasyonu ve kültürü için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Bu, doku parçalarının (eksplantlar) in vitro kültürünün yanı sıra metal bir ızgara tarafından desteklenen bir filtre üzerindeki sıvı/hava arayüzündeki kalın doku dilimlerini sağlayan modifiye edilmiş bir Trowell tipi organ kültürü protokolüdür. Burada açıklanan organ kültürü protokolü , in vivo olarak mümkün olmayan doku manipülasyonlarına olanak tanır ve floresan muhabir (ler) in kullanımı ile birleştirildiğinde, kök hücreler de dahil olmak üzere zaman içinde canlı dokulardaki ayrık hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izlenmesi için bir platform sağlar. Bu sistemde çeşitli düzenleyici moleküller ve farmakolojik bileşikler, kök hücreler ve nişleri üzerindeki etkileri açısından test edilebilir. Bu sonuçta kök hücre düzenleme ve bakımını incelemek için değerli bir araç sağlar.
Introduction
Fare kesici dişleri, diş bileşenlerinin kesintisiz üretimini destekleyen kök hücrelerin (SC) ömür boyu korunması nedeniyle sürekli büyür. Bunlar, diğer hücrelerin yanı sıra emaye üreten ameloblastlar üreten epitel SC'leri ve dentin üreten odontoblastlar üreten mezenkimal kök hücreleri (MSC'ler) içerir1. Sürekli büyüyen kesici dişlerdeki epitel SC'leri başlangıçta etiket tutucu hücreler 2,3 olarak tanımlandı ve o zamandan beri Sox24 de dahil olmak üzere bir dizi iyi bilinen kök genini ifade ettiği gösterildi. Bu hücreler, diğer organlardaki epitel SC'leri ile ortak özellikleri paylaşır ve kesici dişin labial tarafında bulunan servikal döngü adı verilen SC nişi içinde bulunur. Niş, SC aktivitesini kontrol eden hücrelerden ve hücre dışı matristen oluşan dinamik bir varlıktır5. Soy izleme çalışmaları, Sox2+ epitel SC'lerinin dişin tüm epitel bölmesini yenileyebildiğini ve ardışık diş oluşumu için çok önemli olduğunu göstermiştir 6,7. Dentin onarıcı veya rejeneratif potansiyeli olan MSC'ler büyük ölçüde organ dışından kan damarları ve sinirler yoluyla işe alınır 8,9,10,11, bu nedenle MSC popülasyonunun işe alımını, göçünü ve barınmasını incelemek için uygun bir model sağlar.
SC'leri in vivo olarak incelemek her zaman mümkün değildir, çünkü genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonların çoğu organ homeostazını etkileyebilir ve / veya ölümcül sonuçlara neden olabilir. Bu nedenle, organ kültürü, SC'lerin ve nişlerinin in vitro olarak düzenlenmesini incelemek için mükemmel bir araç sağlar. Metal bir ızgara kullanan organ kültürü sistemi başlangıçta organ gelişimini incelemek için Trowell12 tarafından geliştirildi ve böbrek gelişiminde endüktif sinyalleri incelemek için Saxen13 tarafından daha da değiştirildi. O zamandan beri, organın tamamını veya bir kısmını kültürlemek için bu in vitro yöntem, farklı alanlarda başarıyla uygulanmıştır. Diş gelişimi alanında, bu yöntem diş gelişimini yöneten epitel-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır14 ve ardışık diş oluşumu15. Thesleff laboratuvarının çalışması, bu sistemin diş büyümesi ve morfogenezinin zamansal analizi, çeşitli moleküllerin ve büyüme faktörlerinin diş büyümesi üzerindeki etkisinin analizi ve diş gelişiminin hızlandırılmış canlı görüntülenmesi için faydasını göstermiştir16,17. Daha yakın zamanlarda, bu yöntem kesici SC'lerin ve burada ayrıntılı olarak açıklanan niş18,19'un düzenlenmesini incelemek için kullanılmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol hayvanların kullanımını içerir ve tüm prosedürler Helsinki Üniversitesi Hayvanların Kullanımı ve Bakımı Etik Kurulları ve Hayvan Tesisi tarafından onaylanmıştır.
1. Organ kültürü yemeğinin hazırlanması
- Tüm prosedürleri laminer bir akış davlumbazında gerçekleştirin. Çalışma yüzeylerini %70 etanol ile temizleyin ve otoklavlanmış cam aletler ve çözeltiler kullanın. Makası ve diğer metal ekipmanları bir cam boncuk sterilizatöründe sterilize edin.
- Etanol çıkarmak için normalde %70 etanolde depolanan filtreleri, 1x PBS'de üç kez yıkayarak hazırlayın (Şekil 1). Filtreleri dikdörtgen parçalar halinde kesin (3 x 3-5 x 5 mm).
NOT: Yıkanmış filtre parçaları 4 °C'de 1x PBS'de birkaç gün saklanabilir. - Kültür ortamını hazırlayın (1:1 DMEM:F12, %0,85 NaCl'de %1 [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutamin dipeptid, %10 [v/v] FBS, 150 μg/mL askorbik asit ve %0,2 [v/v] penisilin [10.000 I.U./mL] ve streptomisin [10.000 μg/mL]) ile desteklenir). 4 °C'de saklayın.
- 30 mm'lik metal ızgaraları (doku görüntülemeyi mümkün kılan 1-2 mm çaplı deliklerle) 35 mm'lik bir Petri kabına yerleştirin. Hava kabarcıkları üretmeden ızgara yüzeyine ulaşmak için yeterli ortam ekleyin. Hazırlanan kültür kabını, doku izole edilinceye ve kültüre hazır olana kadar 37 ° C'de önceden ısıtın (% 5 CO2 ve% 90 -% 95 nem oranına sahip standart bir inkübatörde).
2. İnsizör diseksiyonu ve proksimal ucun izolasyonu
- Onaylanmış bir hayvan bakım protokolünü izleyerek hayvanları kurban edin.
- Farenin kafasını kesin ve mandibulayı parçalara ayırın. Bunu yapmak için, önce mandibulayı açığa çıkarmak için cildi çıkarın ve maksilladan ve başın geri kalanından ayırmak için masseter kaslarını kesin.
- Mandibula izole edildikten sonra, dili ve mümkün olduğunca yumuşak dokuyu çıkarın.
- Tüm mandibulaları toplayın ve buz üzerinde PBS içeren bir Petri kabında saklayın, çünkü bu dokuların yaşayabilirliğini arttırır.
- Bir mandibulayı bir cam Petri kabına aktarın ve kesici parçayı bir stereomikroskop altında incelemek için tek kullanımlık 20/26 G hipodermik iğneler kullanın. Mandibulayı orta hatta bölün, simfizi kesin. Daha iyi görselleştirme için yumuşak ve kas dokusunu kemik yüzeyinden uzaklaştırın.
NOT: Bir cam Petri kabı gereklidir, çünkü bu iğneleri köreltmez. - 10 günden küçük hayvanlardan elde edilen mandibulalar daha yumuşak ve daha kırılgandır, bu nedenle, kesici dişi açığa çıkarmak için mandibulanın her yarısını uzunlamasına açmak için tek kullanımlık 20/26 G hipodermik iğneler kullanın. 10 günden eski fareler için, mandibulayı kavramak için cımbız kullanın ve dişi açığa çıkarmak için kemiği kırın.
- Kesici kesiciyi çevreleyen kemikten yavaşça ayırın ve servikal döngüyü içeren proksimal ucu kesin.
- Proksimal ucu kesin ve mineralize emaye ve dentin matrisini çıkarın.
- Dulbecco'nun PBS'sinde toplanan proksimal uçları kültüre hazır olana kadar buz üzerinde tutun.
3. Kültür
- Önceden ısıtılmış bir kültür kabına ızgaranın üstüne dikkatlice bir filtre dikdörtgeni yerleştirin.
- Doku parçalarını düzgün bir şekilde yönlendirmek için bir stereomikroskop kullanın.
- 37 °C'de %5 CO2 ve %90-%95 nem oranına sahip standart bir inkübatöre yerleştirin.
- Ortamı her gün değiştirin ve hava kabarcığı oluşumunu dikkatlice önleyerek taze ortamla değiştirin. Doku büyümesini izleyin ve stereomikroskopa bağlı bir kamera kullanarak günlük olarak fotoğraf çekin.
4. Kültüre çözünür faktörler eklemek
- Kültür ortamını, SC'lerin düzenlenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için çözünür faktörler ve ilgilenilen moleküllerle destekleyin.
NOT: Herhangi bir molekül için uygulama protokolü (büyüme faktörleri, sinyal molekülleri, bloke edici antikorlar, inhibitörler veya aktivatörler gibi farmakolojik bileşikler, vektörler, vb.) yarı ömrüne ve çözünürlüğüne bağlıdır. Bu parametreler aynı zamanda kullanılacak uygun kontrolü de belirler.
5. Moleküler ve histolojik analizler
- Kültür ortamını kaldırın.
- Filtrelerden ayrılmayı önlemek için dokulara buz gibi soğuk metanol ekleyin.
- Metanolü 5 dakika bekletin.
- Doku eksplantlarını numune alma tüplerine taşıyan filtreleri aktarın.
- Eksplantları PBS'de% 4 paraformaldehit içinde 4 ° C'de 10-24 saat sabitleyin.
- Histolojik işlem (parafin, dondurulmuş, vb.) veya immün boyama için belirlenmiş protokollerle devam edin.
6. Doku dilimlerinin kültürü
NOT: Bu protokolde, hepsi eşit derecede başarılı olan ve kullanıcının hızına ve becerisine bağlı olarak kişisel seçim meselesi olan birkaç varyasyon vardır. Bunlar, doku canlılığını toplamak ve korumak için kullanılan tamponu ifade eder. Bu amaçla Krebs tamponu, %2 glikoz ve antibiyotik takviyeli PBS veya PBS kullanılabilir. Krebs tamponu kullanılıyorsa 1 gün önceden yapılmalı ve 4 °C'de tutulmalıdır.
- Deneyden önce, 50 mL kaynama% 2 glikoz / PBS içinde 2-2.5 g düşük erime noktası agarozunu çözerek% 4-5 düşük erime noktası agarozu hazırlayın, daha sonra çözelti 45 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirilmelidir.
- Vibratomu ayarlayın,% 70 etanol ile yıkayın ve antibiyotiklerle desteklenmiş buz gibi soğuk% 2 glikoz / PBS ile doldurun (100 U / mL penisilin, 100 mg / mL streptomisin).
- Kesici dişin proksimal uçlarını inceleyin ve bunları antibiyotiklerle desteklenmiş buz soğuk% 2 glikoz / PBS'de toplayın.
- Kesici dişin bir proksimal ucunu% 4 -% 5 düşük erime noktası agarozu içeren kalıba yerleştirin. Bir stereomikroskop altında, parçayı istenen yöne yönlendirin ve agarozun sertleşmesi için buz üzerinde bırakın.
- Sertleştirilmiş agaroz bloğunu kesin ve vibratoma yerleştirin. Kalın dilimleri (150-300 μm) kesin.
- Dilimleri, antibiyotiklerle desteklenmiş% 2 glikoz / PBS içeren buz gibi soğuk% 2 glikoz / PBS içeren bir Petri kabında toplayın.
- Kalın dilimleri, bölüm 1.3'te olduğu gibi hazırlanmış önceden ısıtılmış ızgara üzerine yerleştirilmiş bir filtre dikdörtgeni üzerine aktarmak için bir spatula kullanın.
- İnkübatördeki kalın dilimleri inkübe edin ve görüntülemeye devam edin (Şekil 2).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Epitel SC'leri, kesici dişin proksimal ucunda bulunan servikal döngü adı verilen bir niş içinde bulunur (Şekil 3A). Servikal döngüler, gevşek düzenlenmiş epitel hücrelerinin bir çekirdeği olan stellat retikulumu çevreleyen iç ve dış emaye epitelinden oluşan morfolojik olarak farklı yapılardır (Şekil 3B, C). Her kesici dişte iki servikal döngü vardır (Şekil 3A), ancak sadece labial servikal döngü SC'leri içerir. Epitel SC'leri servikal döngünün ucundaki stellat retikuluma ve bitişik mine epiteline lokalize olur20,21. Emaye salgılayan ameloblastlar 2,7 dahil olmak üzere çeşitli hücreler üreten yüksek proliferatif transit-amplifying hücrelere farklılaşan Sfrp5 ekspresyonu ile karakterize edilen soy üretirler. Ameloblastın SC'lerden farklılaşması burada tarif edilen organ kültürü sisteminde özetlenebilir2.
Son yıllarda, bir floresan proteinin (GFP gibi) spesifik gen düzenleyici elementlerin kontrolü altında olduğu muhabir fareler, hücreleri çeşitli dokulardan tanımlamak ve izole etmek ve in vivo ve in vitro22,23 hücre kaderini ve soy ilerlemesini takip etmek için yaygın olarak kullanılan bir araç haline gelmiştir. Bu hayvan modellerinin kullanımı, çeşitli düzenleyici moleküllerin etkisini analiz etmek için yararlıdır, çünkü floresan muhabir ekspresyonunun yoğunluğu ve paterni, endojen gen aktivitesinin bir okuması veya çoğalma durumunun bir muhabiri olarak kullanılabilir (yani, Fucci muhabir fare modeli).
Gelişmiş GFP (EGFP) ekspresyonunun, Sox2 promotörünün yukarı akış düzenleyici elemanının 5,5 kb'lik bir parçasının kontrolü altında olduğu Sox2-GFP transgenik raporlayıcı fare modeli24, Sox2 eksprese eden kesici epitel kök hücrelerinin tanımlanmasını ve görselleştirilmesini sağlar (Şekil 4A-C). Birkaç floresan muhabiri taşıyan farelerin üretilmesi, birden fazla hücre popülasyonunun tanımlanması için yararlı olabilir. Örneğin, Sox2-GFP'den servikal döngülerde; Fucci-mKO transgenik hayvan kök hücreleri (GFP +, yeşil, Şekil 4D) ve proliferatif olmayan hücreler (Fucci-mKO +, kırmızı, Şekil 4D) tanımlanabilir. Ek olarak, Sox2-GFP ifadesi, çeşitli moleküllerin etkisini analiz ederken bir muhabir olarak kullanılabilir. Wnt/β-katenin sinyal aktivatörü BIO'nun eklenmesi Sox2 ekspresyonu kök hücreleri ve dolayısıyla GFP ekspresyonunu olumsuz yönde etkilemektedir (Şekil 4E).
Resim 1: Kültür odasının hazırlanması . (A) Filtreyi 1x PBS içinde yıkayın. (B) Filtreyi dikdörtgen parçalar halinde kesin. (C) Kaputtaki ortamı hazırlayın ve ızgaradan pipetleyin. Hava kabarcığı oluşumundan kaçının. (D) Önceden hazırlanmış kültür kabını, ızgaraya yerleştirilen bir filtre üzerine doku eksplantları eklemeden önce 37 °C'de önceden ısıtın. (E) Kültür odasının karikatür temsili. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 2: Doku dilimlerinin kültürlenmesi. 2 günlük doğum sonrası (2PN) fare kesici dişinin proksimal ucu vibratom ile diseke edildi ve kesitlendi. Dilimler (150 μm kalınlığında) kültürlendi ve 6 günlük bir kültürden sonra sert doku oluşumu (oklar) gözlendi. Ölçek 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Servikal döngü . (A) Kesici diş içeren labial (siyah kesikli çizgi ile özetlenmiş) ve lingual (gri kesikli çizgi ile özetlenmiş) servikal döngülerin proksimal ucu. (B) Epitel kök hücreleri için bir niş temsil eden labial servikal döngünün histolojik bölümü. (C) Labial servikal döngünün ve bileşenlerinin karikatür gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bir organ kültürü sisteminde floresan muhabir fare modellerinin kullanımı . (A) Brightfield, (B) floresan ve (C) 2 günlük doğum sonrası Sox2-GFP farelerinden izole edilen kesici ucun proksimal ucunun bindirme görüntüsü. (D) 2 günlük postnatal Sox2-GFP'den izole edilen kesici dişin proksimal ucundaki Sox2-GFP ve Fucci-mKO ekspresyonu; Fucci-mKO fareleri. (E) BIO'nun Sox2-GFP'yi eksprese eden kök hücreler ve kök hücre nişi (sarı kesikli çizgi ile özetlenen servikal döngü) üzerindeki etkisi. Ölçek 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İn vitro organ kültürü, organ büyümesini ve morfogenezi yöneten endüktif potansiyeli ve epitelyal-mezenkimal etkileşimleri incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Thesleff laboratuvarı, Trowell tipi organ kültürünün Saxén modifikasyonunun nasıl uyarlanacağını ve diş gelişimini incelemek için nasıl kullanılacağını göstermiştir14. Floresan muhabirlerindeki tekrarlanabilir koşullar ve ilerlemeler, bunu diş morfogenezini ve içindeki farklı hücre popülasyonlarını izlemek için yararlı bir yöntem haline getirmiştir. Bu makalede, epitel kök hücrelerini ve içinde bulundukları mikro çevreyi incelemek için bu protokolün nasıl uygulanacağı açıklanmaktadır.
SC nişini içeren kesici dişin proksimal ucunu doğum sonrası yavrulardan ve yaşlı hayvanlardan izole etmek için bir teknik burada açıklanmıştır. Bu yöntemin başarısı, izolasyon süresine (doku canlılığını doğrudan etkileyen) ve hasarsız bir proksimal ucu sağlam bir labial servikal döngü ile izole etme yeteneğine bağlıdır. Bu özellikle mineralize kemikli yaşlı hayvanlarda zordur. Protokol, mineralize kemiği kırmak ve tamamen sağlam ve canlı yumuşak dokuyu diğer yayınlanmış protokollere kıyasla önemli ölçüde daha kısa sürede izole etmek için kontrollü mekanik kuvvetin nasıl kullanılacağını göstermektedir25. İzole edildikten sonra, doku bir bütün olarak veya kalın bir dilim halinde in vitro olarak kültürlenebilir. Kalın doku dilimleme yönteminin dezavantajı, her dilimde servikal döngünün sadece bir kısmının bulunmasıdır; Bu nedenle, servikal döngünün farklı bölümlerde tekrarlanabilir olarak aynı kısmının elde edilmesi mümkün değildir. Organ kültürü, SC'leri ve zaman içinde nişlerini düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için kolay ve tekrarlanabilir bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, esas olarak kültürün ilk 3-4 gününden sonra ilerleyici mezenkim kaybı nedeniyle toplam kültür periyodunda sınırlamalar vardır.
İzole doku ayrıca kesici epitel SC'leri26 ile zenginleştirilmiş tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için daha fazla işlenebilir. Servikal döngünün proksimal ucun geri kalanından enzimatik olarak ayrılması ve spesifik floresan muhabirlerin kullanılması, daha ayrıntılı mRNA ve protein analizleri (qPCR, tek hücreli RNA dizilimi gibi) ve niş içindeki spesifik hücre popülasyonları hakkında daha fazla bilgi sağlar.
In vitro kültür, diş epitel SC'leri ve nişleri üzerindeki düzenleyici etkileri için çeşitli genetik ve farmakolojik manipülasyonların taranması için uygun bir platform sağlar. Farmakolojik tedavilerin başarısının, test edilen moleküllerin yarı ömür, çözünürlük, metabolik stabilite, dozaj ve hücre toksisitesi gibi özelliklerine bağlı olduğu belirtilmelidir. Bir floresan muhabiri ile kombinasyon halinde, düzenleyici etki bir doku içindeki belirli bir hücre popülasyonuna atanabilir, böylece diş epitel SC'lerini ve nişlerini düzenleyen moleküler ve hücresel mekanizmaları ortaya çıkarmak için güçlü bir araç sağlar.
Spesifik floresan muhabir farelerin kullanılmasıyla, zaman içinde canlı doku içindeki spesifik hücre popülasyonlarını tanımlamak ve takip etmek mümkündür. Son zamanlarda, in vitro organ kültürünün diş gelişiminin canlı görüntülenmesinde kullanılabileceği gösterilmiştir16. Ek olarak, hücre davranışı, kalın doku dilimlerinin in vitro kültürü kullanılarak kısa bir süre içinde görüntülenebilir7. Daha önce de belirtildiği gibi, SC nişinin sadece bir kısmı görüntülenebilir ve görüntüleme süresi kısadır. İdeal olarak, tüm SC nişi görüntülenmelidir. Bununla birlikte, bu yapının 4D hızlandırılmış görüntülemesi, esas olarak nişin kalınlığı ve şu anda mevcut görüntüleme yöntemlerinin sınırlamaları nedeniyle zordur. Bununla birlikte, görüntüleme teknolojisindeki sürekli gelişmeler, kesici SC nişini oluşturan hücresel davranışların çözülmesinde heyecan verici bir gelecek vaat etmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.
Acknowledgments
Bu çalışma Jane ve Aatos Erkko Vakfı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
- Balic, A. Biology explaining tooth repair and regeneration: A mini-review. Gerontology. 64 (4), 382-388 (2018).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Scadden, D. T. The stem-cell niche as an entity of action. Nature. 441 (7097), 1075-1079 (2006).
- Juuri, E., et al. Sox2 marks epithelial competence to generate teeth in mammals and reptiles. Development. 140 (7), 1424-1432 (2013).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Kaukua, N., et al. Glial origin of mesenchymal stem cells in a tooth model system. Nature. 513 (7519), 551-554 (2014).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Vidovic, I., et al. alphaSMA-expressing perivascular cells represent dental pulp progenitors in vivo. Journal of Dental Research. 96 (3), 323-330 (2017).
- Trowell, O. A. A modified technique for organ culture in vitro. Experimental Cell Research. 6 (1), 246-248 (1954).
- Saxen, L., Vainio, T., Toivonen, S. Effect of polyoma virus on mouse kidney rudiment in vitro. Journal of the National Cancer Institute. 29, 597-631 (1962).
- Thesleff, I., Sahlberg, C. Organ culture in the analysis of tissue interactions. Methods in Molecular Biology. 461, 23-30 (2008).
- Jarvinen, E., Shimomura-Kuroki, J., Balic, A., Jussila, M., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-catenin signaling limits tooth number. Development. 145 (4), (2018).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Narhi, K., Thesleff, I. Explant culture of embryonic craniofacial tissues: analyzing effects of signaling molecules on gene expression. Methods in Molecular Biology. 666, 253-267 (2010).
- Yang, Z., Balic, A., Michon, F., Juuri, E., Thesleff, I. Mesenchymal Wnt/beta-Catenin signaling controls epithelial stem cell homeostasis in teeth by inhibiting the antiapoptotic effect of Fgf10. Stem Cells. 33 (5), 1670-1681 (2015).
- Binder, M., et al. Functionally distinctive Ptch receptors establish multimodal hedgehog signaling in the tooth epithelial stem cell niche. Stem Cells. 37 (9), 1238-1248 (2019).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and FGF signaling. The Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Hadjantonakis, A. K., Nagy, A. FACS for the isolation of individual cells from transgenic mice harboring a fluorescent protein reporter. Genesis. 27 (3), 95-98 (2000).
- Yu, Y. A., Szalay, A. A., Wang, G., Oberg, K. Visualization of molecular and cellular events with green fluorescent proteins in developing embryos: a review. Luminescence. 18 (1), 1-18 (2003).
- D'Amour, K. A., Gage, F. H. Genetic and functional differences between multipotent neural and pluripotent embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, Suppl 1 11866-11872 (2003).
- Chavez, M. G., et al. Isolation and culture of dental epithelial stem cells from the adult mouse incisor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), (2014).
- Binder, M., et al. Novel strategies for expansion of tooth epithelial stem cells and ameloblast generation. Science Reports. 10 (1), 4963 (2020).
