Summary
Trowell型器官培养方法已被用于解开控制牙齿发育的复杂信号网络,最近还用于研究与持续生长的小鼠门牙干细胞有关的调节。荧光报告动物模型和实时成像方法有助于对牙科干细胞及其特定的生态位微环境进行深入分析。
Abstract
器官发育、功能和再生取决于干细胞,干细胞存在于称为干细胞生态位的离散解剖空间内。不断生长的小鼠门牙为研究组织特异性干细胞提供了一个极好的模型。门牙的上皮组织特异性干细胞位于牙齿的近端,位于称为颈环的壁龛中。它们提供持续的细胞流入,以抵消牙齿自锐尖端的持续磨损。这里介绍的是小鼠门牙近端分离和培养的详细方案,该门牙容纳干细胞及其生态位。这是一种改进的Trowell型器官培养方案,可以对组织碎片(外植体)以及由金属网格支撑的过滤器上的液体/空气界面处的厚组织切片进行 体外 培养。这里描述的器官培养方案使组织操作在 体内 不可行,并且当与荧光报告基因结合使用时,它为随着时间的推移鉴定和跟踪活组织中的离散细胞群(包括干细胞)提供了一个平台。可以在该系统中测试各种调节分子和药理化合物对干细胞及其生态位的影响。这最终为研究干细胞调控和维持提供了有价值的工具。
Introduction
由于干细胞(SC)的终身保存,小鼠门牙持续生长,这些干细胞支持牙齿成分的不断生产。这些包括产生产生牙釉质的釉质母细胞的上皮SCs和产生产生牙本质的牙母细胞的间充质干细胞(MSCs)以及其他细胞1。连续生长的门牙中的上皮SCs最初被鉴定为标记保留细胞2,3,此后已被证明表达许多众所周知的干性基因,包括Sox24。这些细胞与其他器官中的上皮SC具有共同特征,并且位于门牙唇侧称为颈环的SC壁龛内。生态位是由细胞和细胞外基质组成的动态实体,控制SC活性5。谱系追踪研究表明,Sox2+上皮SCs可以再生牙齿的整个上皮隔室,并且它们对于连续牙齿的形成至关重要6,7。具有牙本质修复或再生潜力的间充质干细胞主要通过血管和神经从器官外部招募8,9,10,11,因此,为研究MSC人群的招募,迁移和住房提供了合适的模型。
在体内研究SCs并不总是可行的,因为许多遗传和/或药物操作会影响器官稳态和/或具有致命的后果。因此,器官培养为体外研究SCs及其生态位的调控提供了极好的工具。利用金属网格的器官培养系统最初由Trowell12开发,用于研究器官发育,并由Saxen13进一步修改以研究肾脏发育中的感应信号。从那时起,这种培养整个或部分器官的体外方法已成功应用于不同领域。在牙齿发育领域,该方法已被广泛用于研究控制牙齿发育14和连续牙齿形成的上皮 - 间充质相互作用15。Thesleff实验室的工作已经证明了该系统在牙齿生长和形态发生的时间分析,分析各种分子和生长因子对牙齿生长的影响以及牙齿发育的延时实时成像方面的实用性16,17。最近,该方法已被用于研究门牙SC及其生态位18,19的调节,本文对此进行了详细描述。
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Protocol
该协议涉及动物的使用,所有程序均已获得赫尔辛基大学动物使用和护理伦理委员会以及动物设施的批准。
1. 器官培养皿的制备
- 在层流罩中执行所有程序。用70%乙醇清洁工作表面,并使用高压灭菌的玻璃仪器和溶液。在玻璃珠消毒器中对剪刀和其他金属设备进行消毒。
- 通过在1x PBS中洗涤三次来制备通常储存在70%乙醇中的过滤器以除去乙醇(图1)。将过滤器切成矩形块(3 x 3-5 x 5 毫米)。
注意:清洗过的滤片可以在4°C的1x PBS中储存数天。 - 制备培养基(1:1 DMEM:F12 补充有 1% [v/v] 200 mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽,加入 0.85% NaCl、10% [v/v] FBS、150 μg/mL 抗坏血酸和 0.2% [v/v] 青霉素 [10,000 国际单位/mL] 和链霉素 [10,000 μg/mL])。储存在4°C。
- 将30 mm金属网格(具有1-2 mm直径的孔,可实现组织成像)置于35 mm培养皿中。添加足够的介质以到达网格表面而不会产生气泡。将制备好的培养皿在37°C下预热,直到组织被分离并准备培养(在具有5%CO2 和90%-95%湿度的标准培养箱中)。
2.门牙解剖和近端隔离
- 按照批准的动物护理方案牺牲动物。
- 斩首鼠标并解剖下颌骨。为此,首先去除皮肤以露出下颌骨,并切开咬肌以将其与上颌骨和头部其余部分分开。
- 一旦下颌骨被分离,请尽可能多地去除舌头和软组织。
- 收集所有下颌骨并将它们保存在含有PBS的培养皿中,因为这可以增强组织的活力。
- 将一个下颌骨转移到玻璃培养皿中,并使用一次性20/26 G皮下注射针在体视显微镜下解剖门牙。在中线分开下颌骨,切开联合。清洁骨骼表面的柔软组织和肌肉组织,以获得更好的可视化效果。
注意:玻璃培养皿是必不可少的,因为这不会使针头变钝。 - 从10天以下的动物获得的下颌骨更柔软,更脆弱,因此,使用一次性20/26 G皮下注射针纵向打开下颌骨的每一半以露出门牙。对于10天以上的小鼠,用镊子夹住下颌骨并折断骨头以露出牙齿。
- 轻轻地将门牙与周围的骨头分离,并切断包含颈环的近端。
- 切开近端,去除矿化牙釉质和牙本质基质。
- 将收集的近端保存在Dulbecco的PBS中,直到准备好培养。
3. 文化
- 小心地将一个过滤器矩形放在预热培养皿中的网格顶部。
- 使用体视显微镜正确定位组织碎片。
- 置于37°C的标准培养箱中,CO2 为5%,湿度为90%-95%。
- 每隔一天更换一次培养基,并更换为新鲜培养基,小心避免形成气泡。监测组织生长并使用连接到体视显微镜的相机每天拍照。
4. 在培养物中添加可溶性因子
- 用感兴趣的可溶性因子和分子补充培养基,以研究它们对SC调节的影响。
注意:任何分子(生长因子,信号分子,封闭抗体,药理化合物(例如抑制剂或激活剂,载体等)的给药方案取决于其半衰期和溶解度。这些参数还确定要使用的相应控件。
5. 分子和组织学分析
- 取出培养基。
- 小心地将冰冷的甲醇添加到组织中,以防止从过滤器上脱落。
- 将甲醇放置5分钟。
- 将携带组织外植体的过滤器转移到采样管中。
- 将外植体固定在PBS中的4%多聚甲醛中,在4°C下10-24小时。
- 继续进行已建立的组织学处理方案(石蜡、冷冻等)或免疫染色。
6. 组织切片培养
注意:此协议有几种变体,它们都同样成功,并且是个人选择的问题,具体取决于用户的速度和技能。这些是指用于收集和维持组织活力的缓冲液。为此,可以使用克雷布斯缓冲液,补充有2%葡萄糖和抗生素的PBS或PBS。如果使用克雷布斯缓冲液,应提前1天制作并保持在4°C。
- 实验前,将2-2.5g低熔点琼脂糖溶解在50mL沸腾的2%葡萄糖/ PBS中制备4%-5%低熔点琼脂糖,然后将溶液置于45°C水浴中。
- 设置振动切片机,用 70% 乙醇洗涤,并填充补充抗生素(100 U/mL 青霉素、100 mg/mL 链霉素)的冰冷的 2% 葡萄糖/PBS。
- 解剖门牙的近端,并将它们收集在补充抗生素的冰冷的2%葡萄糖/ PBS中。
- 将门牙的一个近端放入含有4%-5%低熔点琼脂糖的模具中。在体视显微镜下,将工件定向到所需方向,并留在冰上让琼脂糖硬化。
- 修剪硬化的琼脂糖块并将其放入振动切开器中。切厚片(150-300μm)。
- 将切片收集在含有补充抗生素的冰冷 2% 葡萄糖/PBS 的培养皿中。
- 使用刮刀将厚切片转移到放置在预热网格上的过滤器矩形上,如第 1.3 节所述。
- 在培养箱中孵育厚切片并继续成像(图2)。
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Representative Results
上皮SCs位于称为颈环的壁龛中,该壁龛位于门牙的近端(图3A)。颈袢是形态上不同的结构,由内部和外部牙釉质上皮组成,包裹着星状网,星状网是松散排列的上皮细胞的核心(图3B,C)。每个门牙有两个颈袢(图3A),但只有唇颈袢包含SC。上皮SCs定位于星状网和颈袢尖端的相邻珐琅质上皮20,21。它们产生以 Sfrp5 表达为特征的后代,其分化成高度增殖的转运扩增细胞,产生各种细胞,包括分泌牙釉质的釉质母细胞2,7。与SC的釉母细胞分化可以在此处描述的器官培养系统中重现2。
近年来,荧光蛋白(如GFP)受特定基因调控元件控制的报告小鼠已成为从各种组织中识别和分离细胞以及跟踪体内和体外细胞命运和谱系进展的广泛使用的工具22,23。使用这些动物模型有利于分析各种调节分子的作用,因为荧光报告基因表达的强度和模式可以用作内源性基因活性的读数,或作为增殖状态的报告基因(即Fucci报告小鼠模型)。
Sox2-GFP转基因报告小鼠模型24,其中增强的GFP(EGFP)表达在Sox2启动子上游调节元件的5.5kb片段的控制下,能够鉴定和可视化表达Sox2的切牙上皮干细胞(图4A-C)。携带多个荧光报告基因的小鼠的产生可用于鉴定多个细胞群。例如,在来自Sox2-GFP的颈椎环中;可以鉴定Fucci-mKO转基因动物干细胞(GFP+,绿色,图4D)和非增殖细胞(Fucci-mKO+,红色,图4D)。 此外,Sox2-GFP表达在分析各种分子的作用时可以用作报告基因。添加Wnt/β-连环蛋白信号激活剂BIO会对表达Sox2的干细胞产生负面影响,从而影响GFP表达(图4E)。
图1:培养室的制备 。 (A)在1x PBS中清洗过滤器。(B)将过滤器切成矩形块。(C)在引擎盖中准备培养基并将其移液通过网格。避免形成气泡。(D)在37°C下预热预先制备的培养皿,然后再将组织外植体添加到放置在网格上的过滤器上。(E) 文化室的卡通形象。 请点击此处查看此图的大图。
图2:培养组织切片。 解剖出生后2天(2PN)小鼠门牙的近端,并通过振动切片机切片。培养切片(150μm厚),并在6天培养后观察硬组织形成(箭头)。规模 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图3:颈环 。 (A)含门牙的阴唇(用黑色虚线勾勒)和舌(用灰色虚线勾勒)颈环的近端。(B)唇颈袢的组织学部分,代表上皮干细胞的生态位。(C) 唇颈袢及其组成部分的卡通表现。 请点击此处查看此图的大图。
图4:荧光报告小鼠模型在器官培养系统中的使用 。 (A)明场,(B)荧光和(C)从出生后2天Sox2-GFP小鼠中分离的门牙近端的叠加图像。(D)从出生后2天Sox2-GFP分离的门牙近端的Sox2-GFP和 Fucci-mKO表达; 富奇-mKO小鼠。(E)BIO对表达Sox2-GFP的干细胞和干细胞生态位(宫颈环,用黄色虚线勾勒)的影响。规模 100 μm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
体外 器官培养已被广泛用于研究控制器官生长和形态发生的诱导电位和上皮-间充质相互作用。Thesleff实验室已经展示了如何适应Trowell型器官培养的Saxén修饰,并将其用于研究牙齿发育14。荧光报告基因的可重复条件和进步使其成为监测牙齿形态发生和其中不同细胞群的有用方法。本文描述了如何应用该协议来研究上皮干细胞及其所在的微环境。
本文描述了一种将包含SC壁龛的门牙近端与出生后幼崽和老年动物隔离的技术。这种方法的成功取决于分离时间(直接影响组织活力)以及分离具有完整唇颈袢的未受损近端的能力。这对于具有矿化骨骼的老年动物尤其具有挑战性。与其他已发表的方案相比,该协议显示了如何使用受控的机械力来破坏矿化骨并在更短的时间内分离出完全完整和有活力的软组织25。一旦分离,组织可以在 体外培养,无论是作为一个整体还是作为一个厚片。厚组织切片法的缺点是每个切片中仅存在颈袢的一部分;因此,不可能在不同部分获得可重复的颈环相同部分。器官培养提供了一种简单且可重复的方法来研究随着时间的推移调节SC及其生态位的分子和细胞机制。然而,总培养期存在局限性,主要是由于培养最初3-4天后间充质逐渐丧失。
分离的组织还可以进一步处理以获得富集在门牙上皮SCs26中的单细胞悬液。宫颈环与近端其余部分的酶促分离和使用特异性荧光报告基因可实现更详细的mRNA和蛋白质分析(例如qPCR,单细胞RNA测序),并更深入地了解生态位内的特定细胞群。
体外 培养为筛选各种遗传和药理操作对牙齿上皮SC及其生态位的调节作用提供了一个合适的平台。应该注意的是,药物治疗的成功取决于测试分子的性质,例如半衰期,溶解度,代谢稳定性,剂量和细胞毒性。与荧光报告基因结合使用,调节作用可以分配给组织内的特定细胞群,从而为揭示调节牙齿上皮SC及其生态位的分子和细胞机制提供了强大的工具。
通过使用特定的荧光报告小鼠,可以随着时间的推移识别和跟踪活组织中的特定细胞群。最近,已经证明体 外 器官培养可用于牙齿发育的实时成像16。此外,可以使用厚组织切片的 体外 培养物在短时间内对细胞行为进行成像7。如前所述,只能对SC壁龛的一部分进行成像,并且成像持续时间很短。理想情况下,应该对整个SC利基进行成像。然而,这种结构的4D延时成像具有挑战性,主要是由于壁龛的厚度和当前可用成像方法的局限性。然而,成像技术的不断进步有望在揭示构成门牙SC生态位的细胞行为方面带来令人兴奋的未来。
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Disclosures
作者声明不存在利益冲突。
Acknowledgments
这项研究得到了Jane和Aatos Erkko基金会的支持。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-mL plastic syringes | |||
Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
DMEM | Gibco | 61965-026 | |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
F-12 | Gibco | 31765-027 | |
FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
Small scissors |
References
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