Summary
Il metodo di coltura degli organi di tipo Trowell è stato utilizzato per svelare complesse reti di segnalazione che governano lo sviluppo dei denti e, più recentemente, per studiare la regolazione coinvolta nelle cellule staminali dell'incisivo di topo in continua crescita. I modelli animali fluorescenti e i metodi di imaging dal vivo facilitano analisi approfondite delle cellule staminali dentali e del loro specifico microambiente di nicchia.
Abstract
Lo sviluppo, la funzione e la rigenerazione degli organi dipendono dalle cellule staminali, che risiedono all'interno di spazi anatomici discreti chiamati nicchie di cellule staminali. L'incisivo di topo in continua crescita fornisce un modello eccellente per studiare le cellule staminali tessuto-specifiche. Le cellule staminali epiteliali tessuto-specifiche dell'incisivo si trovano all'estremità prossimale del dente in una nicchia chiamata ansa cervicale. Forniscono un afflusso continuo di cellule per controbilanciare la costante abrasione della punta autoaffilante del dente. Presentato qui è un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura dell'estremità prossimale dell'incisivo del topo che ospita le cellule staminali e la loro nicchia. Si tratta di un protocollo di coltura di organi di tipo Trowell modificato che consente la coltura in vitro di pezzi di tessuto (espianti), nonché le fette di tessuto spesso all'interfaccia liquido / aria su un filtro supportato da una griglia metallica. Il protocollo di coltura degli organi qui descritto consente manipolazioni tissutali non fattibili in vivo e, se combinato con l'uso di uno o più reporter fluorescenti, fornisce una piattaforma per l'identificazione e il monitoraggio di popolazioni cellulari discrete nei tessuti vivi nel tempo, comprese le cellule staminali. Varie molecole regolatorie e composti farmacologici possono essere testati in questo sistema per il loro effetto sulle cellule staminali e le loro nicchie. Questo in definitiva fornisce uno strumento prezioso per studiare la regolazione e il mantenimento delle cellule staminali.
Introduction
Gli incisivi di topo crescono continuamente grazie alla conservazione permanente delle cellule staminali (SC) che supportano la produzione incessante di componenti dentali. Questi includono SC epiteliali, che generano ameloblasti che producono smalto, e cellule staminali mesenchimali (MSC), che generano odontoblasti che producono dentina, tra le altre cellule1. Le SC epiteliali negli incisivi a crescita continua sono state inizialmente identificatecome cellule 2,3 che mantengono l'etichetta e da allora hanno dimostrato di esprimere un certo numero di geni staminali ben noti, tra cui Sox24. Queste cellule condividono caratteristiche comuni con SC epiteliali in altri organi e risiedono all'interno della nicchia SC chiamata ansa cervicale situata sul lato labiale dell'incisivo. La nicchia è un'entità dinamica composta da cellule e matrice extracellulare che controllano l'attività SC5. Studi di lineage tracing hanno dimostrato che le SC epiteliali Sox2+ possono rigenerare l'intero compartimento epiteliale del dente e che sono cruciali per la formazione dei denti di successione 6,7. Le MSC con potenziale riparativo o rigenerativo della dentina sono in gran parte reclutate dall'esterno dell'organo attraverso i vasi sanguigni e i nervi 8,9,10,11, fornendo quindi un modello adatto per studiare il reclutamento, la migrazione e l'alloggiamento della popolazione MSC.
Studiare le SC in vivo non è sempre fattibile, poiché molte delle manipolazioni genetiche e/o farmacologiche possono influenzare l'omeostasi degli organi e/o avere conseguenze letali. Pertanto, la coltura di organi fornisce uno strumento eccellente per studiare la regolazione delle SC e delle loro nicchie in vitro. Il sistema di coltura degli organi che utilizza una griglia metallica è stato inizialmente sviluppato da Trowell12 per studiare lo sviluppo degli organi ed è stato ulteriormente modificato da Saxen13 per studiare i segnali induttivi nello sviluppo renale. Da allora, questo metodo in vitro di coltura dell'intero organo o parte di esso è stato applicato con successo in diversi campi. Nel campo dello sviluppo dei denti, questo metodo è stato ampiamente utilizzato per studiare le interazioni epiteliali-mesenchimali che governano lo sviluppo dei denti14 e la formazione dei denti di successione15. Il lavoro del laboratorio Thesleff ha dimostrato l'utilità di questo sistema per l'analisi temporale della crescita e della morfogenesi dei denti, per l'analisi dell'effetto di varie molecole e fattori di crescita sulla crescita dei denti e per l'imaging live time-lapse dello sviluppo dei denti16,17. Più recentemente, questo metodo è stato utilizzato per studiare la regolazione degli incisivi SC e la loro nicchia18,19, che è descritta in dettaglio qui.
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Protocol
Questo protocollo prevede l'uso di animali e tutte le procedure sono state approvate dai comitati etici per l'uso e la cura degli animali e dalla struttura per animali dell'Università di Helsinki.
1. Preparazione del piatto di coltura dell'organo
- Eseguire tutte le procedure in una cappa a flusso laminare. Pulire le superfici di lavoro con etanolo al 70% e utilizzare strumenti e soluzioni in vetro autoclavato. Sterilizzare le forbici e altre attrezzature metalliche in uno sterilizzatore a perline di vetro.
- Preparare i filtri normalmente conservati in etanolo al 70% lavandoli tre volte in 1x PBS per rimuovere l'etanolo (Figura 1). Tagliare i filtri in pezzi rettangolari (3 x 3-5 x 5 mm).
NOTA: I pezzi filtranti lavati possono essere conservati per diversi giorni in 1x PBS a 4 °C. - Preparare il terreno di coltura (1:1 DMEM:F12 integrato con 1% [v/v] 200 mM L-alanil-L-glutammina dipeptide in 0,85% NaCl, 10% [v/v] FBS, 150 μg/mL acido ascorbico e 0,2% [v/v] penicillina [10.000 UI/mL] e streptomicina [10.000 μg/mL]). Conservare a 4 °C.
- Posizionare le griglie metalliche da 30 mm (con fori di 1-2 mm di diametro che consentono l'imaging dei tessuti) in una capsula di Petri da 35 mm. Aggiungere un supporto sufficiente per raggiungere la superficie della griglia senza produrre bolle d'aria. Preriscaldare il piatto di coltura preparato a 37 °C fino a quando il tessuto non è isolato e pronto per la coltura (in un'incubatrice standard con 5% di CO2 e 90%-95% di umidità).
2. Dissezione incisiva e isolamento dell'estremità prossimale
- Sacrificare gli animali seguendo un protocollo di cura degli animali approvato.
- Decapitare il topo e sezionare la mandibola. Per fare ciò, prima rimuovere la pelle per esporre la mandibola e tagliare i muscoli masseteri per separarla dalla mascella e dal resto della testa.
- Una volta isolata la mandibola, rimuovere la lingua e quanto più tessuto molle possibile.
- Raccogliere tutte le mandibole e tenerle in una capsula di Petri contenente PBS sul ghiaccio, in quanto ciò migliora la vitalità dei tessuti.
- Trasferire una mandibola su una capsula di Petri di vetro e utilizzare aghi ipodermici monouso da 20/26 G per sezionare l'incisivo sotto uno stereomicroscopio. Dividere la mandibola sulla linea mediana, tagliando la sinfisi. Pulire il tessuto molle e muscolare lontano dalla superficie ossea per una migliore visualizzazione.
NOTA: Una capsula di Petri di vetro è essenziale, in quanto ciò non smusserà gli aghi. - Le mandibole ottenute da animali di età inferiore ai 10 giorni sono più morbide e fragili, quindi utilizzare aghi ipodermici monouso da 20/26 G per aprire longitudinalmente ogni metà della mandibola per esporre il dente incisivo. Per i topi di età superiore a 10 giorni, utilizzare una pinzetta per afferrare la mandibola e rompere l'osso per esporre il dente.
- Staccare delicatamente l'incisivo dall'osso circostante e tagliare l'estremità prossimale, che contiene l'ansa cervicale.
- Tagliare l'estremità prossimale e rimuovere lo smalto mineralizzato e la matrice dentinica.
- Tenere le estremità prossimali raccolte nel PBS di Dulbecco sul ghiaccio fino a quando non sono pronte per la cultura.
3. Cultura
- Posizionare con attenzione un rettangolo di filtro sulla parte superiore di una griglia in un piatto di coltura preriscaldato.
- Utilizzare uno stereomicroscopio per orientare correttamente i pezzi di tessuto.
- Collocare in un'incubatrice standard a 37 °C con 5% di CO2 e 90%-95% di umidità.
- Cambiare il terreno a giorni alterni e sostituirlo con un terreno fresco, evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Monitorare la crescita dei tessuti e fotografare quotidianamente utilizzando una fotocamera collegata allo stereomicroscopio.
4. Aggiunta di fattori solubili alla coltura
- Integrare il terreno di coltura con fattori solubili e molecole di interesse per studiare il loro effetto sulla regolazione delle SC.
NOTA: Il protocollo di somministrazione di qualsiasi molecola (fattori di crescita, molecole di segnalazione, anticorpi bloccanti, composti farmacologici come inibitori o attivatori, vettori, ecc.) dipende dalla sua emivita e solubilità. Questi parametri determinano anche il controllo appropriato da utilizzare.
5. Analisi molecolari e istologiche
- Rimuovere il terreno di coltura.
- Aggiungere con attenzione metanolo ghiacciato ai tessuti per evitare il distacco dai filtri.
- Lasciare metanolo per 5 min.
- Trasferire i filtri che trasportano gli espianti di tessuto alle provette di campionamento.
- Fissare gli espianti in paraformaldeide al 4% in PBS per 10-24 h a 4 °C.
- Procedere con protocolli stabiliti per l'elaborazione istologica (paraffina, congelati, ecc.) o immunocolorazioni.
6. Coltura di fette di tessuto
NOTA: Esistono diverse varianti a questo protocollo, che hanno tutte lo stesso successo e sono una questione di scelta personale, a seconda della velocità e dell'abilità dell'utente. Questi si riferiscono al tampone utilizzato per raccogliere e mantenere la vitalità dei tessuti. A tale scopo è possibile utilizzare il tampone di Krebs, PBS integrato con glucosio al 2% e antibiotici o PBS. Se si utilizza il tampone Krebs, deve essere preparato con 1 giorno di anticipo e mantenuto a 4 °C.
- Prima dell'esperimento, preparare l'agarosio a basso punto di fusione al 4%-5% sciogliendo 2-2,5 g di agarosio a basso punto di fusione in 50 ml di glucosio/PBS bollente al 2%, dopodiché la soluzione deve essere posta a bagnomaria a 45 °C.
- Impostare il vibratomo, lavare con etanolo al 70% e riempire con glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici (100 U / mL di penicillina, 100 mg / mL di streptomicina).
- Sezionare le estremità prossimali dell'incisivo e raccoglierle nel glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici.
- Posizionare un'estremità prossimale dell'incisivo nello stampo contenente il 4% -5% di agarosio a basso punto di fusione. Sotto uno stereomicroscopio, orientare il pezzo nella direzione desiderata e lasciare sul ghiaccio per l'agarosio per indurirsi.
- Rifilate il blocco di agarosio indurito e posizionatelo nel vibratomo. Tagliare fette spesse (150-300 μm).
- Raccogliere le fette in una capsula di Petri contenente glucosio ghiacciato al 2% / PBS integrato con antibiotici.
- Utilizzare una spatola per trasferire le fette spesse su un rettangolo di filtro posto sulla griglia preriscaldata preparata come al punto 1.3.
- Incubare le fette spesse nell'incubatore e procedere con l'imaging (Figura 2).
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Representative Results
Le SC epiteliali risiedono in una nicchia chiamata ansa cervicale, che si trova all'estremità prossimale dell'incisivo (Figura 3A). Le anse cervicali sono strutture morfologicamente distinte composte da epitelio smaltato interno ed esterno che racchiudono il reticolo stellato, un nucleo di cellule epiteliali disposte liberamente (Figura 3B,C). Ci sono due anse cervicali in ogni incisivo (Figura 3A), ma solo l'ansa cervicale labiale contiene SC. I SC epiteliali sono localizzati al reticolo stellato e all'epitelio dello smalto adiacente sulla punta dell'ansa cervicale20,21. Generano progenie caratterizzata dall'espressione di Sfrp5, che si differenzia in cellule altamente proliferative che amplificano il transito che producono varie cellule, tra cui ameloblasti secernenti smalto 2,7. La differenziazione degli ameloblasti dalle SC può essere ricapitolata nel sistema di coltura d'organo descritto qui2.
Negli ultimi anni, topi reporter in cui una proteina fluorescente (come la GFP) è sotto il controllo di specifici elementi regolatori genici sono diventati uno strumento ampiamente utilizzato per identificare e isolare le cellule da vari tessuti e per seguire il destino cellulare e la progressione del lignaggio in vivo e in vitro22,23. L'uso di questi modelli animali è utile per analizzare l'effetto di varie molecole regolatorie, poiché l'intensità e il modello di espressione del reporter fluorescente possono essere utilizzati come lettura dell'attività genica endogena o come reporter dello stato di proliferazione (ad esempio, modello murino reporter di Fucci).
Il modello murino reporter transgenico Sox2-GFP24, in cui l'espressione GFP potenziata (EGFP) è sotto il controllo di un frammento di 5,5 kb dell'elemento regolatore a monte del promotore Sox2, consente l'identificazione e la visualizzazione di cellule staminali epiteliali incisive che esprimono Sox2 (Figura 4A-C). La generazione di topi che trasportano diversi reporter fluorescenti può essere utile per l'identificazione di più di una popolazione cellulare. Ad esempio, nelle anse cervicali di Sox2-GFP; È possibile identificare le cellule staminali transgeniche di animali Fucci-mKO (GFP+, verde, Figura 4D) e le cellule non proliferative (Fucci-mKO+, rosso, Figura 4D). Inoltre, l'espressione di Sox2-GFP può essere utilizzata come reporter quando si analizza l'effetto di varie molecole. L'aggiunta dell'attivatore di segnalazione Wnt/β-catenina BIO influenza negativamente le cellule staminali che esprimono Sox2 e di conseguenza l'espressione della GFP (Figura 4E).
Figura 1: Preparazione della camera di coltura . (A) Lavare il filtro in 1x PBS. (B) Tagliare il filtro in pezzi rettangolari. (C) Preparare il supporto nel cofano e incanalarlo attraverso la griglia. Evitare la formazione di bolle d'aria. D) Preriscaldare il piatto di coltura preparato preconfezionato a 37 °C prima di aggiungere espianti di tessuto su un filtro posto sulla griglia. (E) Rappresentazione a fumetti della camera della cultura. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Coltura di fette di tessuto. L'estremità prossimale di un incisivo di topo postnatale (2PN) di 2 giorni è stata sezionata e sezionata da vibratomo. Le fette (150 μm di spessore) sono state coltivate e la formazione di tessuti duri (frecce) è stata osservata dopo una coltura di 6 giorni. Scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Ansa cervicale. (A) Estremità prossimale delle anse cervicali labiali contenenti incisivi (delineate da una linea tratteggiata nera) e linguali (delineate da una linea tratteggiata grigia). (B) Sezione istologica dell'ansa cervicale labiale, che rappresenta una nicchia per le cellule staminali epiteliali. (C) Rappresentazione a fumetti dell'ansa cervicale labiale e dei suoi componenti. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Uso di modelli murini reporter fluorescenti in un sistema di coltura di organi . (A) Brightfield, (B) fluorescente e (C) immagine sovrapposta dell'estremità prossimale dell'incisivo isolata da topi Sox2-GFP postnatali di 2 giorni. (D) espressione di Sox2-GFP e Fucci-mKO nell'estremità prossimale dell'incisivo isolata dalla Sox2-GFP postnatale di 2 giorni; Mouse Fucci-mKO. (E) Effetto del BIO sulle cellule staminali che esprimono Sox2-GFP e sulla nicchia delle cellule staminali (ansa cervicale, delineata da una linea tratteggiata gialla). Scala 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
La coltura d'organo in vitro è stata ampiamente utilizzata per studiare il potenziale induttivo e le interazioni epiteliali-mesenchimali che governano la crescita e la morfogenesi degli organi. Il laboratorio Thesleff ha dimostrato come adattare la modifica di Saxén della coltura di organi di tipo Trowell e usarla per studiare lo sviluppo dei denti14. Le condizioni riproducibili e i progressi nei reporter fluorescenti hanno reso questo un metodo utile per monitorare la morfogenesi dei denti e le distinte popolazioni cellulari all'interno. Questo articolo ha descritto come applicare questo protocollo per studiare le cellule staminali epiteliali e il microambiente in cui risiedono.
Qui è stata descritta una tecnica per isolare l'estremità prossimale dell'incisivo che contiene la nicchia SC dai cuccioli postnatali e dagli animali più anziani. Il successo di questo metodo dipende dal tempo di isolamento (che influisce direttamente sulla vitalità dei tessuti) e dalla capacità di isolare un'estremità prossimale non danneggiata con un'ansa cervicale labiale intatta. Ciò è particolarmente impegnativo negli animali più anziani con osso mineralizzato. Il protocollo mostra come utilizzare la forza meccanica controllata per rompere l'osso mineralizzato e isolare i tessuti molli completamente intatti e vitali in un tempo significativamente più breve rispetto ad altri protocolli pubblicati25. Una volta isolato, il tessuto può essere coltivato in vitro, sia come intero che come fetta spessa. Lo svantaggio del metodo di affettatura dei tessuti spessi è che solo una parte dell'ansa cervicale è presente in ogni fetta; Pertanto, non è possibile ottenere una porzione riproducibilmente identica dell'ansa cervicale in sezioni diverse. La coltura di organi fornisce un metodo facile e riproducibile per studiare i meccanismi molecolari e cellulari che regolano le SC e la loro nicchia nel tempo. Tuttavia, ci sono limitazioni al periodo di coltura totale, principalmente a causa della progressiva perdita di mesenchima dopo i primi 3-4 giorni di coltura.
Il tessuto isolato può anche essere ulteriormente elaborato per ottenere una sospensione monocellulare arricchita in SCs26 epiteliali incisivi. La separazione enzimatica dell'ansa cervicale dal resto dell'estremità prossimale e l'uso di specifici reporter fluorescenti consente analisi più dettagliate di mRNA e proteine (come qPCR, sequenziamento dell'RNA a singola cellula) e una maggiore comprensione di specifiche popolazioni cellulari all'interno della nicchia.
La coltura in vitro fornisce una piattaforma adatta per lo screening di varie manipolazioni genetiche e farmacologiche per il loro effetto regolatore sulle SC epiteliali dei denti e sulle loro nicchie. Va notato che il successo dei trattamenti farmacologici dipende dalle proprietà delle molecole testate, come emivita, solubilità, stabilità metabolica, dosaggio e tossicità cellulare. In combinazione con un reporter fluorescente, l'effetto regolatore può essere assegnato a una specifica popolazione cellulare all'interno di un tessuto, fornendo così un potente strumento per scoprire i meccanismi molecolari e cellulari che regolano le SC epiteliali dei denti e la loro nicchia.
Con l'uso di specifici topi reporter fluorescenti, è possibile identificare e seguire specifiche popolazioni cellulari all'interno di tessuti vivi nel tempo. Recentemente, è stato dimostrato che la coltura di organi in vitro può essere utilizzata per l'imaging dal vivo dello sviluppo dei denti16. Inoltre, il comportamento cellulare può essere visualizzato in un breve periodo di tempo utilizzando la coltura in vitro di fette di tessuto spesso7. Come indicato in precedenza, solo una parte della nicchia SC può essere ripresa e la durata dell'imaging è breve. Idealmente, l'intera nicchia SC dovrebbe essere fotografata. Tuttavia, l'imaging time-lapse 4D di questa struttura è impegnativo, principalmente a causa dello spessore della nicchia e dei limiti dei metodi di imaging attualmente disponibili. Tuttavia, i continui progressi nella tecnologia di imaging promettono un futuro entusiasmante nel dipanare i comportamenti cellulari che costituiscono la nicchia dell'incisivo SC.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dalla Jane and Aatos Erkko Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-mL plastic syringes | |||
| Disposable 20/26 gauge hypodermic needles | Terumo | ||
| DMEM | Gibco | 61965-026 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 14287 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T. | 14084-08 | |
| F-12 | Gibco | 31765-027 | |
| FBS South American (CE) | LifeTechn. | 10270106 | divide in aliquotes, store at -20°C |
| Glass bead sterilizer, Steri 250 Seconds-Sterilizer | Simon Keller Ltd | 4AJ-6285884 | |
| GlutaMAX-1 (200 mM L-alanyl-L-glutamine dipeptide) | Gibco | 35050-038 | |
| Isopore Polycarb.Filters, 0,1 um 25-mm diameter | MerckMillipore | VCTP02500 | Store in 70% ethanol at room temperature. |
| L-Ascobic Acid | Sigma | A4544-25g | diluted 100 mg/ml in MilliQ, filter strerilized and divided in 20μl aliquotes, store at dark, -20°C |
| Low melting agarose | TopVision | R0801 | |
| Metal grids | Commercially available, or self-made from stainless-steel mesh (corrosion resistant, size of mesh 0.7 mm). Cut approximately 30 mm diameter disk and bend the edges to give 3 mm height. Use nails to make holes. | ||
| Micro forceps | Medicon | 07.60.03 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | ||
| Penicillin-Streptomycin (10,000U/ml) sol. | Gibco | 15140-148 | |
| Petri dishes, Soda-Lime glass | DWK Life Sciences | 9170442 | |
| Petridish 35 mm, with vent | Duran | 237554008 | |
| Petridish 90 mm, no vent classic | Thermo Fisher | 101RT/C | |
| Small scissors |
References
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